CN114262377A

CN114262377A - 一种阻断cd70与其配体cd27结合的抗人cd70纳米抗体的制备方法及其编码序列

Info

Publication number: CN114262377A
Application number: CN202111259820.9A
Authority: CN
Inventors: 李江伟
Original assignee: Xinjiang Youmai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xinjiang Youmai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN114262377B

Abstract

本发明公开了一种抗人CD70纳米抗体以及其VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR区，框架区选自FR1‑FR4的氨基酸序列，CDR区选自CDR1‑CDR3氨基酸序列。同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列和表达该纳米抗体的宿主细胞。该CD70纳米抗体分子量小，特异性强，且具有较显著阻断CD70‑CD27结合的特异性。该纳米抗体能在大肠杆菌内可溶性表达蛋白，制备方法简单，成本低廉，在对人CD70检测方面以及在抗肿瘤药物中具有良好的应用前景。

Description

一种阻断CD70与其配体CD27结合的抗人CD70纳米抗体的制备方法及其编码序列

技术领域

本发明涉及医药生物领域，公开了针对CD70的单域抗体及其衍生蛋白。具体而言，本发明公开了一种阻断CD70与CD27结合的抗人CD70纳米抗体的制备方法及其编码序列和用途，特别是在治疗和/或预防、或诊断CD70 相关疾病例如肿瘤中的用途。

背景技术

近年来，新的癌症治疗方法的发展集中于分子靶点，特别是与癌症进展相关的蛋白质。与肿瘤生长、侵袭和转移相关的分子靶点列表继续扩大，包括肿瘤细胞过度表达的蛋白质以及与支持肿瘤生长的系统（如血管系统和免疫系统）相关的靶点。设计用于与这些分子靶点相互作用的治疗或抗癌药物的数量也在继续增加。大量靶向癌症药物现已获准用于临床，还有更多药物正在研发中。

由于CD70在多种类型的血液系统恶性肿瘤和实体癌中的组成性表达，它已被确定为一个特别令人感兴趣的分子靶点。CD70是一种属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族的II型跨膜糖蛋白，通过与同源细胞表面受体CD27结合来介导其作用。CD70和CD27均由免疫系统的多种细胞类型表达，CD70-CD27信号通路与免疫应答的几个不同方面的调节有关。这反映在CD70过度表达发生在各种自身免疫疾病中，包括类风湿性和银屑病性关节炎和狼疮。

CD70表达与多种癌症的不良预后有关，包括B细胞淋巴瘤、肾细胞癌和乳腺癌等。CD70在转移组织中的表达率也很高，表明该分子在癌症进展中起着关键作用。造血系肿瘤细胞上CD70及其受体CD27的组成性表达与CD70-CD27信号轴在直接调节肿瘤细胞增殖和存活中的作用有关。

肿瘤，尤其是不共表达CD27的实体瘤上CD70表达上调，也以多种方式促进肿瘤微环境中的免疫抑制。例如，调节性T细胞上的CD70与CD27结合已被证明可增加Treg的频率，减少肿瘤特异性T细胞反应并促进小鼠肿瘤生长。CD70-CD27信号还可以抑制肿瘤诱导的T淋巴细胞凋亡的免疫反应，如肾细胞癌、胶质瘤和胶质母细胞瘤细胞。最后，CD70表达也与T细胞耗竭有关，由此淋巴细胞采用更分化的表型，并且不能杀死肿瘤细胞。

鉴于CD70在癌症发展中的重要性，CD70是一个有吸引力的抗癌治疗靶点，针对这种细胞表面蛋白的抗体正在临床开发中。

目前针对CD70的抗体还很少，如已进入临床试验的AGX5-049单克隆抗体。但是传统的单克隆抗体的制备过程较复杂，生产成本较高。除此之外，单克隆抗体的分子量较大，存在组织穿透能力较差的问题，不能在肿瘤组织处发挥最大的治疗效果。纳米抗体，是目前最小的可以结合抗原的功能性片段，只有单克隆抗体大小的1/10。由于其不同于单抗的独特结构，所以不会造成红细胞和血小板发生凝聚，则在治疗过程中不会产生出血和血小板减少等副作用。除此之外，纳米抗体还具有可溶性好，稳定性较高，在原核表达体系中也能表达，这就克服了传统抗体制备周期长，制造成本较高的问题，是一种非常有应用前景的新型抗体分子。

目前针对CD70靶点的纳米抗体还未见报道和临床应用，所以本领域迫切需要开发新的有效针对CD70靶点的特异性纳米抗体。

发明内容

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。

除非另有说明，否则可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规四链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段 ( 包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如 VHH 结构域或VH/VL 结构域 )。此外，本文所用的术语“序列”( 例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH 序列”或“蛋白序列”等的术语中 ) 一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

如本文所用的术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别

称为“框架区 1”或“FR1”、“框架区 2”或“FR2”、“框架区 3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区 1”或“CDR1”、“互补决定区 2”或“CDR2”、及“互补决定区 3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种可以阻断CD70与其配体CD27结合的抗CD70纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及纳米抗体的制备方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明的第一部分，一种抗人CD70纳米抗体的VHH链，包括框架区（FR区）和抗原互补决定区（CDR区）。所述框架区选自以下的FR1-FR4的氨基酸序列：

SEQ ID No .1所示的FR1，SEQ ID No .2 所示的FR2，SEQ ID No .3 所示的FR3 ，SEQ ID No .4 所示的FR4；

或SEQ ID No .5所示的FR1，SEQ ID No .6 所示的FR2，SEQ ID No .7 所示的FR3 ，SEQ ID No .8 所示的FR4；

所述的抗原互补决定区选自以下的CDR1-CDR3的氨基酸序列：

SEQ ID No .9所示的CDR1，SEQ ID No .10所示的CDR2，SEQ ID No .11所示的CDR3;

或SEQ ID No .12所示的CDR1，SEQ ID No .13所示的CDR2，SEQ ID No .14所示的CDR3;

优选地，它具有SEQ ID No .15，SEQ ID No .16所示的氨基酸序列。

本发明的第二部分，一种抗人CD70纳米抗体（Nb1-B3，Nb2-B6），它是针对人CD70分子表位的纳米抗体，包括具有SEQ ID No .15，SEQ ID No .16所示的氨基酸序列的VHH链。

本发明的第三部分，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所示的抗人CD70纳米抗体的VHH链，或权利3所示的抗人CD70纳米抗体。

优选地，所述的DNA分子，它具有选自下组的DNA序列:SEQ ID No .17，SEQ ID No .18。

本发明的第四部分，提供了一种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID No .19，SEQID No .20所示的核苷酸序列。

本发明的第五部分，提供了一种宿主细胞，其转化了所述的重组表达载体或者基因组上整合了所述的编码所述的抗CD70纳米抗体的核苷酸序列的宿主细胞及其后代细胞。

所述的宿主细胞及其后代细胞指细菌细胞、真菌细胞、动物细胞或者植物细胞及这些宿主细胞的后代。

本发明的第六部分，本发明提供一种制备抗CD70抗体的方法，其包括：

(1)利用人CD70真核蛋白免疫骆驼，制备噬菌体展示文库。

(2)用人CD70蛋白亲和筛选噬菌体展示文库；(3)PE-ELISA鉴定阳性克隆；(4)抗CD70纳米抗体的表达和纯化；（5）抗CD70纳米抗体功能的鉴定。

本发明的第七部分，提供了本发明所述的人CD70纳米抗体用于检测人CD70的用途。

所述抗CD70纳米抗体可用于制备检测样品中CD70的检测试剂盒或诊断试剂盒。

所述的抗CD70纳米抗体在治疗癌症药物中的应用。

所述的抗CD70纳米抗体可作为免疫检查点抑制剂，作为癌症治疗药物单独使用，也可以联合其他抗癌药物。

与现有技术相比较，本发明的技术方案有以下优点：

本发明利用真核人CD70真核蛋白免疫新疆双峰驼，分离骆驼外周血淋巴细胞扩增VHH基因序列，构建纳米抗体噬菌体展示文库。利用固相亲和淘洗的方法筛选文库，最终获得抗人CD70特异性纳米抗体基因序列。

本发明未将筛选得到的阳性克隆序列亚克隆至其他表达载体上，而是直接利用pMECS载体和TG1宿主菌直接表达抗体蛋白，这就大大缩短抗体获得的时间和成本。

本发明构建的噬菌体展示文库库容较大，筛选得到的纳米抗体的多样性较高。

与常规抗体相比较，本发明的抗CD70纳米抗体分子量小(约18kDa)，亲和力高，特异性较好。有开发作为免疫检查点抑制剂的潜力，为肿瘤治疗提供备选方案。

附图说明

图1是分离骆驼外周血中的淋巴细胞后提取总RNA(TRIZOL法)；

图2是第一轮PCR扩增产物切胶回收750bp的DNA片段琼脂糖凝胶电泳图；

图3是第二轮PCR扩增产物切胶回收450bp左右的DNA片段琼脂糖凝胶电泳图；

图4是PE-ELISA筛选CD70特异性单个阳性克隆；

图5是纳米抗体表达纯化后，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色图。泳道3为蛋白分子量Marker，其余是两个抗CD70纳米抗体纯化结果；

图6是非竞争性ELISA方法测定CD70纳米抗体的结合特性；

图7是细菌表达的抗CD70纳米抗体对CD27-CD70的阻断作用；

图8是CHO细胞表达的含有人Fc的抗CD70纳米抗体对CD27-CD70的阻断作用；

图9是采用 Fortebio分析CD70纳米抗体与重组CD70蛋白结合的亲和力；

图10 是采用FCAS测定CD70纳米抗体与肿瘤细胞的结合

图11 是采用ELISA检测CD70纳米抗体结合抗原的种属交叉反应

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细的说明，但这些具体实施案例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。

本发明首先利用真核人CD70蛋白免疫了一只雌性新疆双峰驼，在连续免疫了六次后，抽取骆驼外周血分离获得该骆驼的外周血淋巴细胞，构建了CD70特异的单域重链抗体免疫文库。然后采用固相亲和淘选的方法利用真核人CD70蛋白对免疫文库进行筛选获得针对人CD70的单域重链抗体，从而获得在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体菌株。

实施案例1：针对人CD70的单域重链抗体免疫文库的构建：

(1)用真核人CD70蛋白免疫新疆双峰驼，每两周免疫一次，共连续免疫了六次。（2）六次免疫结束后，利用间接ELISA检测血清效价。分离骆驼外周血中的淋巴细胞并提取总RNA(TRIZOL法)。（3）按照TAKARA公司的Primescript ^TmRT reagent kit with gDNA Eraser试剂说明书将提取的总RNA，如图1所示。再将RNA反转录为cDNA，然后利用PCR方法扩增VHH链，共包括两轮PCR，第一轮PCR：

上游引物CALL01-Leader：5'-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3'

下游引物CALL02-CH2：5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'

第一轮PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃，10s，56℃，30s，72℃，1min ，20个循环。95℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。

将第一轮PCR扩增产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收大小在750bp处的DNA片段，如图2所示。

第二轮PCR以第一轮切胶回收产物，作为扩增所需的模板，进行第二轮PCR:

上游引物VHH-Back :5'-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3'

下游引物PMCF primer:5'-CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3'

第二轮PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃，30s，56℃，30s，72℃，40s，28个循环，72℃延伸10min。

将第二轮PCR产物利用2%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收大小在450bp左右的DNA片段。如图3所示；（4）将噬菌粒pMECS和第二轮PCR回收产物VHH分别使用限制性内切酶（购买于TAKARA）QuickCut™ Not I 、QuickCut™ PstI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收，经核酸定量后，利用T4连接酶将载体与基因以质量比3:1连接，16℃过夜连接。（5）纯化并浓缩连接产物，将连接产物电转化入感受态TG1细胞中，构建CD70纳米抗体噬菌体展示文库并计算文库库容，库容大小为1.4×10⁸，收集文库分装保存于-80℃中。

实施案例2：抗CD70纳米抗体的筛选、阳性克隆的的鉴定和测序

1.大容量CD70噬菌体纳米抗体文库扩增

在100mL的SB液体培养基(含10% 葡萄糖，100μg/mL 氨苄青霉素)接种文库至OD600为0.1，37 ℃，200 r/min培养至OD600达0 .5，按感染复数20∶1加入辅助噬菌体M13K07，37℃，静置感染30min后，37℃，100r/min 培养30 min。将培养物离心，用50 mL的SB(含100 μg/mL 氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素)重悬沉淀，30℃，220 r/min过夜培养后，4℃，8000rpm离心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液冰上放置2h，12000rpm离心30min，重悬沉淀于磷酸缓冲液（PBS，0 .01 M，pH 7 .4），即得到抗CD70单域重链抗体免疫文库，取10 μL测定扩增文库的滴度。

2.抗CD70纳米抗体的筛选

1. 采用固相亲和淘洗的方法，将真核人CD70-Fc、NP502-Fc抗原蛋白用包被缓冲液稀释至1-100ug/mL，包被至高亲和力ELISA板上，4℃包被过夜。第二天，先用PBS洗包被NP502-Fc抗原孔三遍，每孔加入200uL含3%BSA的PBS，37℃，封闭2 h。同时用PBS稀释噬菌体的滴度至1×10¹²CFU(后面每轮滴度降低),将稀释后的噬菌粒与3%的脱脂奶粉等体积混合，在室温低速旋转混合2h,以中和与BSA结合的噬菌粒。然后使用PBS清洗包被NP502-Fc抗原孔及hCD70-Fc抗原孔，清洗2-3次，每次3min，清洗完毕后，NP502-Fc抗原孔每孔加入100ul封闭后的噬菌粒，hCD70-Fc抗原孔加入200ul 3%脱脂奶粉，37℃孵育2h。使用PBS清洗hCD70-Fc抗原孔，清洗2-3次，每次3min，清洗完毕后，向抗原孔中加入NP502-Fc抗原孔孵育后的100ul噬菌粒，37℃孵育2h（去除噬菌体文库中与Fc结合的纳米抗体）。PBS洗板5次，每孔加入100uL预孵育的噬菌粒，37℃孵育2小时。吸出孔中未结合的噬菌粒，加入PBST洗10-20遍(逐轮增加洗涤次数)，再用PBS洗三遍后加入100ul的PH＝2 .2的甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液，37℃震荡10分钟。轻轻吹打孔将吸附的噬菌体洗下来并转移至新EP管中，加入适量中和液使溶液的PH值在7.0-7.4之间。取10uL测定滴度，其余的扩增后用于下一轮淘选。共经过三轮亲和筛选。

3.PE-ELISA筛选CD70特异性单个阳性克隆

在96孔深孔板中加入200uL SB-AG液体培养基（葡萄糖含量为2%，氨苄为100ug/mL），挑取第三轮筛选后输出平板上的单克隆至各孔中，37℃恒温箱静置过夜培养。第二天在96孔深孔板中加入500ul SB-A（氨苄为100ug/mL），接种20uL/孔前夜培养菌，37℃220rpm培养 2h后，每孔加入IPTG至终浓度为1mM，30℃ 200rpm 过夜培养。96孔深孔板离心弃上清，每孔加入200uLTES高渗缓冲液重悬细胞，4℃振荡2h，再每孔加入300μL TES/4低渗液，4℃振荡2h，离心取上清。包被2 µg/ml CD27；CD27-CD70阳性对照包被2 µg/ml CD27；阴性对照包被BSA；4℃过夜。次日，0 .05％PBST洗板2次，用3％脱脂牛奶室温封闭2h。吸去封闭液，用0 .05％PBST洗板2次。加入100µl CD70-Fc 7µg/ml，37℃孵育2h，使CD27-CD70结合达到饱和。PBST洗板，除阳性对照外每孔加入100µl待筛选克隆的可溶性蛋白，阳性对照孔用3%奶粉封闭，37℃孵育2h。用0 .05％PBST洗板3次。每孔加入100µl抗CD70鼠单抗（1:1500），37℃孵育1h；吸出抗体稀释液，0 .05％PBST洗板3次。每孔加入100µ羊抗鼠-HRP（1:2000），37℃孵育1h。洗板后加入TMB显色，酶标仪测定OD₄₅₀nm。若具有阻断作用，则与CD27-CD70阳性对照相比，OD₄₅₀显著降低，此次筛选得到2株具有阻断作用的克隆，如图4，将所得具有阻断作用的克隆测序。

阳性克隆测序得到DNA序列，通过Vbase软件将DNA翻译为氨基酸序列，根据国际免疫遗传学信息系统(IMGT)对蛋白序列的框架区(FR区)和抗体识别区域(CDR区)进行区分，把CDR1、CDR2、CDR3序列均相同的克隆视为同一抗体株，将CDR序列不同的克隆视为不同抗体株，最终确定所得的2个克隆（TG1-PMECS-B3、TG1-PMECS-B6）具有不同的抗体序列。

抗CD70纳米抗体VHH-B3核苷酸序列（SEQ NO17）：

CTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGATCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGAATCATCGTCAATGACGGCTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGGAATTGTAATCGGTGAATATGGTGGTGGTACTACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAGGGCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATCAGTGGGCGTCAGGGGGATGTACAAGTATTGCGACTTTTAGTGATGAGTTTGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAG

抗CD70纳米抗体VHH-B3氨基酸序列（SEQ ID NO15）：

LQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGIIVNDGCMAWFRQVPGKEREGVAGIVIGEYGGGTTYYADSVKGRFTISRDRAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADQWASGGCTSIATFSDEFDYWGQGTQVTVSS

框架区(FRI-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列:

FR1(SEQ ID NO:1): LQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGII

CDR1 (SEQ ID NO:9): VNDGCMAW

FR2(SEQ ID NO:2): FRQVPGKEREGVAGIVI

CDR2 (SEQ ID NO:10): GEYGGGTT

FR3(SEQ ID NO:3): YYADSVKGRFTISRDRAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC

DR3 (SEQ ID NO:11): AADQWASGGCTSIATFSDEFDY

FR4(SEQ ID NO:4): WGQGTQVTVSS

抗CD70纳米抗体VHH-B6核苷酸序列（SEQ ID NO:18）：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGCGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCGTCTGACCTCATAGTCAATGACGGCTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGTTCCAGGAAAGGAGCACGAGGGGGTCGCACGTATTGCCATTCCAACTACTCCGGGTAGTACACTCTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACGGCGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCGTGTACTACTGTGCGGCAGATCAGTGGGCGTCAAGGGGATGTACAGCCATTGCGACAATTCCTGCTGAGTTCGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAG

抗CD70纳米抗体VHH-B6氨基酸序列（SEQ ID NO:16）：

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVASDLIVNDGCMAWFRQVPGKEHEGVARIAIPTTPGSTLYADSVKGRFTISRDGAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAADQWASRGCTAIATIPAEFDYWGQGTQVTVSS

框架区(FRI-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列:

FR1(SEQ ID NO:5): QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVAS

CDR1 (SEQ ID NO:12): DLIVNDGC

FR2(SEQ ID NO:6): MAWFRQVPGKEHEGVAR

CDR2 (SEQ ID NO:13): IAIPTTPGST

FR3(SEQ ID NO:7): LYADSVKGRFTISRDGAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYC

CDR3 (SEQ ID NO:14): AADQWASRGCTAIATIPAEFDY

FR4(SEQ ID NO:8): WGQGTQVTVSS

实施案例3：CD70纳米抗体的表达纯化

1.CD70纳米抗体的表达

本专利将测序鉴定后的2个阳性克隆，未亚克隆至其他表达载体上，而是利用原载体pMECS，原宿主菌TG1进行蛋白表达，克隆命名为TG1-pMECS-VHH。将原始菌种划线至SB-AG固体培养基板上，正放10min后，倒置过夜培养。第二天挑取固体板上的单克隆至含100ug/mL氨苄抗生素的10mL SB-AG液体培养基中，37℃,220rpm震荡培养8h，作为细菌种子液。

将细菌种子液按1%接种至SB-A液体培养基中，37℃，220rpm震荡培养至OD600=0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，30℃，150rpm过夜培养。第二天菌液离心弃上清，用1×PBS洗涤菌体两遍后，菌体沉淀-80℃反复冻溶三次。解冻后，加入适量TES重悬细胞，4℃，200rpm振荡4h。再加入两倍TES体积的TES/4，4℃，200rpm振荡过夜。4℃，12000rpm离心30min，取上清。

2.CD70纳米抗体的纯化

经镍柱离子亲和层析方法纯化抗体蛋白，在得到的纳米抗体溶液中加入PBS缓冲液，4℃，4000rpm离心超滤至所需体积。利用12％SDS-PAGE蛋白电泳检测CD70纳米抗体的分子量大小及纯度：如图5所示，为其中一种纳米抗体从蛋白诱导至纯化超滤的蛋白表达情况，SDS-PAGE电泳结果显示在18kDa附近出现明显条带，与预期相符；超滤后样品泳道条带较单一，说明抗体纯度较高。

实施案例4：CD70纳米抗体与CD70抗原的结合和亲和力

1. 采用非竞争性ELISA方法测定CD70纳米抗体的结合特性

本实施案例中使用的人CD70、人CD27、 BSA蛋白均购买于北京义翘神州生物科技公司。

实验包被缓冲液稀释抗原，包被1 µg/ml CD70；阴性对照包被BSA；4℃过夜。次日，0 .05％PBST洗板2次，用3％脱脂牛奶室温封闭2h。吸去封闭液，用0 .05％PBST洗板2次。加入不同稀释比例的B3、B6蛋白，37℃孵育2h。用0 .05％PBST洗板3次。每孔加入100µ抗HA-HRP（1:4000），37℃孵育1h。0 .05％PBST洗板5次，洗板后加入TMB显色，终止后酶标仪测定OD ₄₅₀nm。可得出所对应的CD70纳米抗体浓度的量。

吸光值反应出抗CD70纳米抗体与抗原CD70以及对照抗原的结合能力。如图6所示，两株抗CD70纳米抗体VHH-B3和VHH-B6的特异性结合结果，结果显示抗CD70纳米抗体与抗原CD70的结合值较高，但是与其他对照抗原基本不结合，说明制备的抗CD70纳米抗体的特异性结合能力较强。

2. 采用Fortebio测定CD70纳米抗体与CD70蛋白结合的亲和力

检测条件：AHC芯片，Buffer： 1*HBS EP buffer。Loading：抗体浓度4ug/ml。Sample：human CD70-His (Cat#CDL-H82D7；lot.#BV3407-9BFF1-QD) 60nm；activetrimer。固定抗体，流动相为CD70-His。

结果表明，VHH-B3和VHH-B6与CD70蛋白结合KD值均在10^-12mol/L以下，具有很高的亲和力。

实施案例5：CD70纳米抗体与肿瘤细胞的结合

采用FACS检测CD70纳米抗体与卵巢癌细胞SKOV3 的结合。检测条件：SKOV3 ，2*10⁵cell/sample），Primary antibody ： Anti-CD70 ,Conc. （ 22nM—3-fold—9points），Second antibody ： Goat Anti human IgG Fc-FITC（1:200）( sigma, F9512) ，对照采用hIgG1，检测MFI值。

结果，VHH-B3和VHH-B6与SKOV3结合的EC50值分别为0.3744和1.736 nM，而hIgG1不与SKOV3结合。表明，VHH-B3和VHH-B6纳米抗体在较低浓度下可以特异结合卵巢癌细胞SKOV3。

实施案例5：抗CD70纳米抗体对CD27-CD70的阻断作用

1. 采用竞争性ELISA方法测定细菌表达的CD70纳米抗体对CD27-CD70的阻断作用。

包被2 µg/ml CD27；CD27-CD70阳性对照包被2 µg/ml CD27；阴性对照包被BSA；4℃过夜。次日，0 .05％PBST洗板2次，用3％脱脂牛奶室温封闭2h。吸去封闭液，用0 .05％PBST洗板2次。加入100µl CD70-Fc 7µg/ml，37℃孵育2h，使CD27-CD70结合达到饱和。PBST洗板，除阳性对照外每孔加入100µl稀释特定比例的B3、B6蛋白；阳性对照孔用3%奶粉封闭，37℃孵育2h。用0 .05％PBST洗板3次。每孔加入100µl抗CD70鼠单抗（1:1500），37℃孵育1h；吸出抗体稀释液，0 .05％PBST洗板3次。每孔加入100µ羊抗鼠-HRP（1:2000），37℃孵育1h。洗板5次后加入TMB显色，终止后酶标仪测定OD 450nm。拟合“S”型曲线，得出2个半数吸光值所对应的CD70纳米抗体浓度(IC50)，结果如图7所示。

由图7可知，随着VHH- B3或VHH- B6浓度增加，CD27与CD70的结合力呈现出递减的趋势，说明B3、B6纳米抗体与CD70的结合表位同CD27与CD70表位重叠或相近，或者纳米抗体与CD70的亲和力高于CD27，能将结合在CD70表面的CD27竞争下来，即VHH- B3或VHH- B6能有效阻断CD27与CD70的结合。

2. 采用竞争性ELISA方法测定CHO细胞表达的含有人IgG-Fc结构域的CD70纳米抗体VHH-B3-Fc和VHH-B6-Fc对CD27-CD70的阻断作用。

检测条件：包板：包被human CD27-His(lot.20180611) ，浓度为0.2ug/ml；每孔100ul；4℃ O/N；封闭：5%BSA in PBS，37℃,120min, PBST洗板4次；加一抗： 100ul 75ng/ml mFc-CD70，加入100ul XJ-B3,XJ-B6, NC（3ug/ml 3倍稀释，12个梯度) ，复孔，略震荡混匀放置40min，加入CD27包被孔，37℃恒温培养箱反应60min ；加二抗：HRP-anti-mouse IgG(1:5000) (Cat:115-035-071，Jackson Immuno Research)，37℃，45min，PBST洗板4次；显色：TMB （Cat:ME142，北京泰天河生物）显色， 37℃，10min；终止：2M HCL 终止反应；读数：读取并记录波长450 nm下孔板的吸光度值。

结果： VHH-B3-Fc和VHH-B6-Fc对CD27-CD70结合的半数抑制浓度IC50分别为0.05998和0.05765 ug/ml. 两株纳米抗体添加Fc结构后均具有明显的阻断作用。

实施案例6：ELISA检测CD70纳米抗体结合抗原的种属交叉

反应条件：包板：包被human CD70-His，mouse CD70-His ,cyno-CD70-His 浓度为0.5ug/ml；每孔100ul；4℃ O/N；封闭：5%BSA in PBS，37℃,120min, PBST洗板4次；

加一抗：加入100ul XJ-B3，XJ-B6，NC（10ug/ml ，3倍稀释，12个梯度) ，略震荡混匀加入包被孔，37℃恒温培养箱反应60min ；加二抗： HRP-anti-human Fc(1:5000) （Cat：109-035-098，Jackson Immuno Research），37℃，45min，PBST洗板4次；显色：TMB （Cat:ME142，北京泰天河生物）显色， 37℃，10min；终止：2M HCL 终止反应；读数：读取并记录波长450 nm下孔板的吸光度值。

结果：VHH-B3和B6结合人和食蟹猴CD70蛋白，但不与鼠CD70结合。B3和B6结合人CD70的EC50为0.02512ug/ml和0.02435 ug/ml; B3和B6结合猴CD70的EC50为0.006054 ug/ml和 0.005709 ug/ml。

序列表

<110> 新疆优迈生物技术有限公司

<120> 一种阻断CD70与其配体CD27结合的抗人CD70纳米抗体的制备方法及其编码序列

<141> 2021-10-26

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile

20 25

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly Ile Val

1 5 10 15

Ile

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu His Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Arg

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Val Asn Asp Gly Cys Met Ala Trp

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Thr Thr

1 5

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Ala Asp Gln Trp Ala Ser Gly Gly Cys Thr Ser Ile Ala Thr Phe

1 5 10 15

Ser Asp Glu Phe Asp Tyr

20

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Leu Ile Val Asn Asp Gly Cys

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ile Ala Ile Pro Thr Thr Pro Gly Ser Thr

1 5 10

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ala Ala Asp Gln Trp Ala Ser Arg Gly Cys Thr Ala Ile Ala Thr Ile

1 5 10 15

Pro Ala Glu Phe Asp Tyr

20

<210> 15

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Val Asn Asp Gly Cys Met Ala

20 25 30

Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly Ile

35 40 45

Val Ile Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Gln Trp Ala Ser Gly Gly Cys Thr Ser Ile Ala Thr Phe

100 105 110

Ser Asp Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 16

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Asp Leu Ile Val Asn Asp Gly

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu His Glu Gly Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ala Ile Pro Thr Thr Pro Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Asp Gln Trp Ala Ser Arg Gly Cys Thr Ala Ile Ala

100 105 110

Thr Ile Pro Ala Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 17

<211> 388

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgcaggagt ctggaggagg ctcggtgcag gctggaggat ctctgagact ctcctgtgca 60

gcgtctggaa tcatcgtcaa tgacggctgc atggcctggt tccgccaggt tccagggaag 120

gagcgcgagg gggtcgcagg aattgtaatc ggtgaatatg gtggtggtac tacatactat 180

gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccgagaca gggccaagaa cacgctgtac 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcagatcag 300

tgggcgtcag ggggatgtac aagtattgcg acttttagtg atgagtttga ttactggggc 360

caggggaccc aggtcaccgt ctcctcag 388

<210> 18

<211> 394

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggcgggtc tctgagactc 60

tcctgtgtag cgtctgacct catagtcaat gacggctgca tggcctggtt ccgccaggtt 120

ccaggaaagg agcacgaggg ggtcgcacgt attgccattc caactactcc gggtagtaca 180

ctctatgccg actccgtgaa gggccgattc accatctccc gagacggcgc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggacactg ccgtgtacta ctgtgcggca 300

gatcagtggg cgtcaagggg atgtacagcc attgcgacaa ttcctgctga gttcgattac 360

tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tcag 394

<210> 19

<211> 1190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtgggttacg aactttcaca gcttaaggag acagtacata tgaaatacct attgcctacg 60

gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca tggcccaggt gcagctgcag 120

gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga ggatctctga gactctcctg tgcagcgtct 180

ggaatcatcg tcaatgacgg ctgcatggcc tggttccgcc aggttccagg gaaggagcgc 240

gagggggtcg caggaattgt aatcggtgaa tatggtggtg gtactacata ctatgccgac 300

tccgtgaagg gccgattcac catctcccga gacagggcca agaacacgct gtacctgcaa 360

atgaacagcc tgaaacctga ggacactgcc atgtactact gtgcggcaga tcagtgggcg 420

tcagggggat gtacaagtat tgcgactttt agtgatgagt ttgattactg gggccagggg 480

acccaggtca ccgtctcctc agcggccgca tacccgtacg acgttccgga ctacggttcc 540

caccaccatc accatcacta gactgttgaa agttgtttag caaaacctca tacagaaaat 600

tcatttacta acgtctggaa agacgacaaa actttagatc gttacgctaa ctatgagggc 660

tgtctgtgga atgctacagg cgttgtcgtt tgtactggtg acgaaactca gtgttacggt 720

acatgggttc ctattgggct tgctatccct gaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg 780

gttctgaggg tggcggttct gagggtggcg gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac 840

ctattccggg ctatacttat atcaaccctc tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc 900

aaaaccccgc taatcctaat ccttctcttg aggagtctca gcctctttaa tactttcatg 960

tttcagaata ataggttccg aaataggcag ggtgcattaa actgtttata cgggcactgt 1020

tactcaaggc actgaccccg ttaaaactta ttaccagtac actccctgta tcatcaaaag 1080

ccatgtatga cgctttactg acggtaattc agagactgcg cttcaatctg cctttatgag 1140

atccattcgt gtgatatcaa gctccattcg tctgacctgc cttcaagcct 1190

<210> 20

<211> 1187

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aattgggggg gcggtacatt tccagcttag gagacagtac atatgaaata cctattgcct 60

acggcagccg ctggattgtt attactcgcg gcccagccgg ccatggccca ggtgcagctg 120

caggagtctg gaggaggctc ggtgcaggct ggcgggtctc tgagactctc ctgtgtagcg 180

tctgacctca tagtcaatga cggctgcatg gcctggttcc gccaggttcc aggaaaggag 240

cacgaggggg tcgcacgtat tgccattcca actactccgg gtagtacact ctatgccgac 300

tccgtgaagg gccgattcac catctcccga gacggcgcca agaacacgct gtatctgcaa 360

atgaacagcc tgaaacctga ggacactgcc gtgtactact gtgcggcaga tcagtgggcg 420

tcaaggggat gtacagccat tgcgacaatt cctgctgagt tcgattactg gggccagggg 480

acccaggtca ccgtctcctc agcggccgca tacccgtacg acgttccgga ctacggttcc 540

caccaccatc accatcacta gactgttgaa agttgtttag caaaacctca tacagaaaat 600

tcatttacta acgtctggaa agacgacaaa actttagatc gttacgctaa ctatgagggc 660

tgtctgtgga atgctacagg cgttgtcgtt tgtactggtg acgaaactca gtgttacggt 720

acatgggttc ctattgggct tgctatccct gaaaatgagg gtggtggctc tgagggtggc 780

ggttctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggtactaaac ctcctgagta cggtgataca 840

cctattccgg gctatactta tatcaaccct ctcgacggca cttatccgcc tggtactgag 900

caaaaccccg ctaatcctaa tccttctctt gaggagtctc agcctcttaa tactttcatg 960

tttcagaata ataggttccg aaataggcag ggtgcattaa actgtttata cgggcactgt 1020

tactcaaagg cactgacccc gttaaaactt attaccagta cacctcctgt atcatcaaaa 1080

ggccatgtat gacgctactt gcacggctaa acttcagaga cctgcgctgt acatctggct 1140

tcatgagatc catcgattgt gcatatcagg accattcgtc ttgaaca 1187

Claims

1.一种人CD70（也称TNFSF7, CD27L）的结合分子，包括框架区FR区和抗原互补决定区CDR区，其特征在于，所述框架区FR区选自以下的FR1-FR4的氨基酸序列：

SEQ ID No .1所示的FR1，SEQ ID No .2 所示的FR2，SEQ ID No .3 所示的FR3 ， SEQID No .4 所示的FR4；

SEQ ID No .5所示的FR1， SEQ ID No .6 所示的FR2，SEQ ID No .7 所示的FR3 ，SEQ ID No .8 所示的FR4；

所述的抗原互补决定区CDR区选自以下的CDR1-CDR3氨基酸序列：

SEQ ID No .12所示的CDR1，SEQ ID No .13所示的CDR2，SEQ ID No .14所示的CDR3;

其中所述的CD70结合分子，是源自骆驼的单域抗体VHH或纳米抗体，也包括以此结构为基础的嵌合、人源化、经过亲和力成熟获得的CD70结合分子、包含免疫球蛋白 Fc 区的CD70结合分子。

2.根据权利要求1所述的人CD70纳米抗体VHH链，其特征在于，它具有SEQ ID No .15，SEQ ID No .16所示的氨基酸序列。

3. 一种人CD70纳米抗体，其特征在于，它是针对人CD70分子表位的纳米抗体，包括具有SEQ ID No .17，SEQ ID No .18，所示的氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所示的人CD70纳米抗体的VHH链，或权利要求3所示的人CD70纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自以下组的DNA序列：SEQ IDNo .19，SEQ ID No .20。

6.一种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID No .19，SEQ ID No .20所示的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它表达针对人CD70的纳米抗体。

8.一种制备抗CD70纳米抗体的方法，其包括以下步骤：

（1）人CD70真核蛋白免疫新疆双峰驼，分离外周血淋巴细胞，构建噬菌体展示文库；

（2）利用亲和筛选的方法，通过真核人CD70蛋白筛选噬菌体展示文库；

（3）PE-ELISA的方法挑选结合CD70阳性克隆并测序分析；

（4）CD70重组纳米抗体的表达与纯化；

（5）抗CD70纳米抗体的功能鉴定；

1-5所述的抗人CD70纳米抗体的免疫缀合物，其中所述治疗性部分包括细胞毒素、生物活性蛋白质或放射性同位素。

9.药物组合物，其包含权利要求1-5任一项的CD70结合分子或权利要求8免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。

10. 一种在对象中预防和/或治疗癌症的方法，包括给所述对象施用有效量的权利要求 1-5 任一项的CD70结合分子或权利要求8疫缀合物或权利要求9药物组合物。

11.权利要求10的方法，其中所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、

肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤。

12.一种在对象中预防和/或慢性炎性疾病和自身免疫疾病的方法，包括给所述对象施用有效量的权利要求 1-5任一项的CD70结合分子或权利要求8的免疫缀合物或权利要求9的药物组合物。

13.权利要求12的方法，其中所述慢性炎性疾病和免疫疾病选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病。

14. 检测生物学样品中CD70的存在和/或CD70的表达水平的方法，包括：

在权利要求 1-5 任一项的CD70结合分子与CD70之间能够形成复合物的条件下，使所述生物学样品和对照样品接触权利要求 1-5 任一项的CD70结合分子；检测复合物的形成，其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中CD70的存在和/或CD70的表达水平。

15. 权利要求 1-15 任一项的CD70结合分子在制备用于诊断CD70相关疾病的试剂盒中的用途，所述疾病为CD70高表达相关的肿瘤、慢性炎性疾病、免疫疾病和感染性疾病。