CN109734808A - 针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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CN109734808A CN201811634833.8A CN201811634833A CN109734808A CN 109734808 A CN109734808 A CN 109734808A CN 201811634833 A CN201811634833 A CN 201811634833A CN 109734808 A CN109734808 A CN 109734808A
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Abstract

本发明公开了针对HDAC6‑cat1区域的纳米抗体及其应用，具体涉及针对组蛋白脱乙酰基酶6过氧化氢酶1区域（HDAC6‑cat1）区域的纳米抗体及其应用，公开了其VHH链的框架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列，同时还公布了编码该重链纳米抗体的基因序列以及其表达纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公布的单域重链纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，该纳米抗体经表达纯化后可与目标抗原进行识别及特异性鉴定，并可用于目标抗原的表位的分析。同时构建了pcDNA5/FRT重组质粒，以此来探究该纳米抗体对组蛋白脱乙酰基酶6(HDAC6)生物学功能的影响。

Description

针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术或生物医学领域，涉及针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体及其应用。
背景技术
抗体(Ab)，也称为免疫球蛋白(Ig)，是主要由免疫系统用于中和致病菌和病毒等病原体的浆细胞产生的大型Y型蛋白质。抗体由适应性免疫系统的B细胞分泌，大部分由称为浆细胞的分化B细胞分泌，属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白，它们构成血液蛋白质的大部分γ球蛋白部分。我们目前最常用的是IgG型抗体，这类抗体在人体内也是含量最高的抗体，约9.5-12.5g/L。常规抗体通常由两条大的重链和两条小的轻链构成，重链与轻链之间通过二硫键结合形成对称的Y型抗体。由于抗体可以高效地与体内和体外各种抗原特异性结合，使得抗体不仅应用于调节免疫系统方面，还能够用作医学治疗的生物工具和医学诊断方面的高灵敏的检测工具。目前，抗体药物的开发是生物技术药物研发的重要组成部分，抗体试剂的应用也是生物学实验中最常用的研究方法。因此，抗体相关产品的开发具有很大的应用前景和商业价值。
组蛋白脱乙酰基酶6(HDAC6)是组蛋白去乙酰化酶家族中的一员。区别于其他家族成员，HDAC6具有两个串联的催化活性结构域，并且在细胞质滞留信号(SE14)和核输出信号(NES)的作用下，HDAC6主要定位在胞浆中。HDAC6具有非组蛋白的底物特异性，可以催化多种胞质蛋白的去乙酰化反应，具有重要的生理功能。HDAC6表达或活性的异常与许多疾病的发生相关。针对HDAC6的研究集中在HDAC6催化区域晶体结构的解析及HDAC6选择性抑制剂的研究上，有研究已对HDAC6催化区域的晶体结构进行了解析，目前开发出针对HDAC6的选择性抑制剂，都是一些小分子化学类药物，抗体类药物还未见报道。
研究表明，骆驼的血液中存在一种天然缺失轻链只含重链的抗体，称为重链抗体。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体。VHH抗体的晶体直径仅有2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体(Nanobody)。纳米抗体的大小约为12-15KDa，只有传统IgG型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米抗体因其独特的结构特征和特性，相比于小分子药物特异性更高。相比于单抗类药物研发周期长，生产成本高，易降解等难题。纳米抗体具有良好的环境耐受性，稳定性高，易表达，分子量小，组织渗透性高等特性，使其具备更好的临床应用效果，在生物医疗应用方面具有很好的发展前景。
发明内容
为了解决现有技术中缺少针对HDAC6的选择性抑制剂(抗体类药物)的问题，本发明制备并筛选出能识别HDAC6的特异性纳米抗体，基于纳米抗体相对于普通抗体的优势，为HDAC6在药物开发及疾病治疗领域提供有效的理论支持。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，所述的纳米抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
所述的纳米抗体的互补决定区CDR的序列包括下述(1)-(16)中的至少一种：
(1)SEQ ID NO:5所示CDR1，SEQ ID NO:6所示CDR2，SEQ ID NO:7所示CDR3；
(2)SEQ ID NO:11所示CDR1，SEQ ID NO:12所示CDR2，SEQ ID NO:13所示CDR3；
(3)SEQ ID NO:17所示CDR1，SEQ ID NO:18所示CDR2，SEQ ID NO:19所示CDR3；
(4)SEQ ID NO:23所示CDR1，SEQ ID NO:24所示CDR2，SEQ ID NO:25所示CDR3；
(5)SEQ ID NO:29所示CDR1，SEQ ID NO:30所示CDR2，SEQ ID NO:31所示CDR3；
(6)SEQ ID NO:35所示CDR1，SEQ ID NO:36所示CDR2，SEQ ID NO:37所示CDR3；
(7)SEQ ID NO:41所示CDR1，SEQ ID NO:42所示CDR2，SEQ ID NO:43所示CDR3；
(8)SEQ ID NO:47所示CDR1，SEQ ID NO:48所示CDR2，SEQ ID NO:49所示CDR3；
(9)SEQ ID NO:53所示CDR1，SEQ ID NO:54所示CDR2，SEQ ID NO:55所示CDR3；
(10)SEQ ID NO:59所示CDR1，SEQ ID NO:60所示CDR2，SEQ ID NO:61所示CDR3；
(11)SEQ ID NO:64所示CDR1，SEQ ID NO:65所示CDR2，SEQ ID NO:66所示CDR3；
(12)SEQ ID NO:69所示CDR1，SEQ ID NO:70所示CDR2，SEQ ID NO:71所示CDR3；
(13)SEQ ID NO:74所示CDR1，SEQ ID NO:75所示CDR2，SEQ ID NO:76所示CDR3；
(14)SEQ ID NO:80所示CDR1，SEQ ID NO:81所示CDR2，SEQ ID NO:82所示CDR3；
(15)SEQ ID NO:85所示CDR1，SEQ ID NO:86所示CDR2，SEQ ID NO:87所示CDR3；
(16)SEQ ID NO:91所示CDR1，SEQ ID NO:92所示CDR2，SEQ ID NO:93所示CDR3。
上述(1)-(16)的所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。
所述纳米抗体具有SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的VHH链，其编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125所示。所述的纳米抗体为VHH。
作为优选，所述VHH链包括框架去FR和互补决定去CDR；
所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为(分别与上述的(1)-(16)对应)：
SEQ ID NO:1所示FR1，SEQ ID NO:2所示FR2，SEQ ID NO:3所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:8所示FR1，SEQ ID NO:9所示FR2，SEQ ID NO:10所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:14所示FR1，SEQ ID NO:15所示FR2，SEQ ID NO:16所示FR3,，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:20所示FR1，SEQ ID NO:21所示FR2，SEQ ID NO:22所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:20所示FR1，SEQ ID NO:21所示FR2，SEQ ID NO:22所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:26所示FR1，SEQ ID NO:27所示FR2，SEQ ID NO:28所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:32所示FR1，SEQ ID NO:33所示FR2，SEQ ID NO:34所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:38所示FR1，SEQ ID NO:39所示FR2，SEQ ID NO:40所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:44所示FR1，SEQ ID NO:45所示FR2，SEQ ID NO:46所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:50所示FR1，SEQ ID NO:51所示FR2，SEQ ID NO:52所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:56所示FR1，SEQ ID NO:57所示FR2，SEQ ID NO:58所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:62所示FR1，SEQ ID NO:63所示FR2，SEQ ID NO:46所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:62所示FR1，SEQ ID NO:67所示FR2，SEQ ID NO:68所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:56所示FR1，SEQ ID NO:72所示FR2，SEQ ID NO:73所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:77所示FR1，SEQ ID NO:78所示FR2，SEQ ID NO:79所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:56所示FR1，SEQ ID NO:83所示FR2，SEQ ID NO:84所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:88所示FR1，SEQ ID NO:89所示FR2，SEQ ID NO:90所示FR3，SEQ IDNO:4所示FR4。
上述所有FR1、FR2、FR3和FR4的序列可替换为其保守序列变体。
本发明还提供DNA分子(即核苷酸)，它用以编码上述针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体的VHH链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ IDNO:124或SEQ ID NO:125所示。
本发明还提供表达载体，其包含前述的核苷酸序列(DNA分子)。
本发明还提供宿主细胞或非人生物体，其表达所述针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，或者包含前述的表达载体。
本发明提供了针对HDAC6-cat1区域纳米抗体与目标抗原在原核水平识别的应用。
本发明提供了针对HDAC6-cat1区域纳米抗体用于HDAC6-cat1区域抗原表位的分析鉴定的应用。
本发明提供了针对HDAC6-cat1区域纳米抗体用于抗HDAC6-cat1纳米抗体的特异性分析的应用。
本发明还提供了将该纳米抗体构建入pcDNA/FRT质粒，用于构建稳定表达抗HDAC6-cat1纳米抗体细胞系，用于抗HDAC6-cat1纳米抗体的功能分析的应用。
本发明还提供了前述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体作为HDAC6的选择性抑制剂的用途。
本发明还提供了前述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体、前述的核苷酸序列、前述的宿主细胞、细胞系或非人生物体在制备HDAC6选择性抑制剂药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明采用HDAC6-cat1区域的片段免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体基因文库，将HDAC6全长的蛋白偶联在酶标板上，以此为抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了针对HDAC6-cat1的高结合能力及高特异性的纳米抗体基因，将此基因转入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，根据序列比对软件分析各个克隆株的基因序列，获得针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体VHH链的氨基酸序列，并证明该纳米抗体可以和HDAC6-cat1特异性结合，同时也获得针对HDAC6-cat1的纳米抗体VHH链的氨基酸序列。并证明该纳米抗体可用于HDAC6-cat1区域抗原表位的分析鉴定，同时也证明该纳米抗体可用于构建稳定表达的细胞系，用于其功能分析的应用。本发明显著的优势为目前开发出的针对HDAC6的选择性抑制剂都是一些小分子化学类药物，抗体类药物还未见报道。而纳米抗体因其独特的结构特征和特性，相比于小分子药物特异性更高，相比于单抗类药物研发周期长，生产成本高，易降解等难题，纳米抗体具有良好的环境耐受性，稳定性高，易表达，分子量小，组织渗透性高等特性，使其具备更好的临床应用效果，在生物医疗应用方面具有很好的发展前景。
附图说明
图1是HDAC6-cat1免疫用抗原表达纯化后SDS-PAGE分析结果图，其中泳道1：Marker；泳道2：复性成功后蛋白质，说明蛋白条带大小正确且纯度高；
图2是免疫后血清效价检测图，免疫后血清效价达到104以上，证明免疫成功；
图3是两轮筛选后文库富集结果统计图，从结果可知阳性克隆数与阴性克隆数比值达到28:1，P/N比值远大于10，投入噬菌体数目与产出噬菌体数目的比值逐渐减小，证明阳性克隆得到有效的富集，筛选成功；
图4是ELISA鉴定阳性克隆结果图，实验设计为一列阳性孔，一列阴性对照孔。可以看出阳性孔显色的同时阴性对照不显色，说明此次ELISA实验结果数值可信；
图5是表达纯化的针对HDAC6-cat1区域纳米抗体SDS-PAGE电泳图，其中两株纳米抗体SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99未纯化成功，其余14株纳米抗体的纯化成功，大小约15kD左右；
图6是纯化出的纳米抗体与HDAC6-WT及HDAC6-cat1识别效果ELISA结果图，其中9株纳米抗体与HDAC6-WT及HDAC6-cat1都有很好的结合效果，分别是SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109；
图7是细胞水平上抗HDAC6-cat1纳米抗体特异性分析免疫荧光结果图，A图为未加药处理的对照组，B图为加药处理的实验组，如图所示：箭头位置为纳米抗体识别HDAC6的位置，蓝色为细胞核位置；
图8是构建成功的pcDNA5/FRT-VHH重组真核质粒转染293FIT细胞系后鉴定稳定表达WB结果示意图，泳道1:Marker；2:SEQ ID NO:95；3:SEQ ID NO:104；4:SEQ ID NO:107；5:SEQ ID NO:108；6:SEQ ID NO:109；7:293FIT细胞阴性对照。
具体实施方式
下面结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体
单域抗体(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(CDR)1(CDR1)、单个CDR2和单个CDR3。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。纳米抗体的分子量仅为约12-15kDa，比由两条重链和两条轻链组成的普通抗体的分子量(150-160kDa)小得多。
在一些实施例中，针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体复合物，其含有两种或两种以上的单链抗体，该复合物是二价抗体或多价抗体，二价或多价可以使抗体以高亲合力结合多聚体抗原。在一些实施例中，针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体只含有(1)-(16)所述的单链抗体。
值得一提的是，本发明中，与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体。在一些实施例中，与(1)-(16)中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现发明目的(即衍生蛋白)。
在一些实施例中，与(1)-(16)中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸的替换，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；(b)极性带正电残基：His、Arg、Lys；(c)芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在CDR1-3区，而框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明采用HDAC6-cat1区域免疫新疆双峰驼，经过6次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并建立针对HDAC6-cat1区域特异的纳米抗体文库。将HDAC6全长抗原偶联在酶标板上，展示正确的空间结构，使得HDAC6-cat1区域的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选HDAC6-cat1区域免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体文库的构建：
(1)将200μg HDAC6-cat1抗原(图1)与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫6次，免疫过程中刺激B细胞表达特异性的纳米抗体，其中抗体效价在免疫6次结束后测定，结果为104(图2)；(2)6次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA；(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；(4)利用限制性内切酶PstⅠ及NotⅠ酶切20μg pMECS噬菌体展示载体及10μg VHH并连接两种片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建HDAC6-cat1区域纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小约为1.2×108；于此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率，结果显示插入率达到95％。
实施例2：针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体筛选过程：
(1)取200μL重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；(2)将溶解在100mM pH 8.4 NaHCO3中的HDAC6-cat1重组蛋白200μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照；(3)第二天加入100μl的3％BSA，室温封闭2h；(4)2h后，加入100μl扩增噬菌体(2×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，室温作用1h；(5)用PBS+0.05％Tween-20洗掉结合的噬菌体；(6)用终浓度为25mg/ml的胰蛋白酶将与HDAC6-cat1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步到富集(图3)。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆(图4):
(1)从上述3轮筛选后细胞培养板中，挑选175个单菌落分别接种于含100ug/mL氨苄青霉素的TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜；(2)利用渗透胀破法获得粗提抗体，并将抗体转移至经抗原包被的ELISA板上，室温放置1h；(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体)，在室温放置1h；(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的Anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体)，在室温放置1h；(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值；(6)当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100ug/ul氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得16株抗HDAC6-cat1纳米抗体。其纳米抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQID NO:108或SEQ ID NO:109所示的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4区，构成整个VHH。
实施例4：抗HDAC6-cat1纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定
(1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒点转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在LB+Amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5ml含有岸边青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1mL的过夜培养菌种至330ml TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，1:1000稀释加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，获得高纯度的纳米抗体，如图5所示；(6)将纳米抗体转移至经HDAC6-WT和HDAC6-cat1包被的ELISA板上，室温放置1h；(7)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体)，在室温放置1h；(8)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体(Anti-mouse alkaline phosphatase conjugate)，在室温放置1h；(9)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值，结果如图6所示，其中9株纳米抗体与HDAC6-WT有较好的反应，分别是SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:107、SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109(图6中横坐标10、12、23、43、50、53、54、73、87、119、136、147、156、189分别对应SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109)。
实施例5：抗HDAC6-cat1纳米抗体针对HDAC6-cat1区域抗原表位鉴定的应用
(1)截短蛋白的设计：对于抗原表位的分析，本课题采用在不破坏HDAC6-cat1二级结构的基础上，将该区域进行截短设计，共设计6个截短蛋白，分别为cat1-H1(1-248aa)；cat1-H2(1-160aa)；cat1-H3(1-80aa)；cat1-Q1(222-302aa)；cat1-Q2(142-302aa)；cat1-Q3(62-302aa)。载体为pET28a-GB1，引物设计为：H6-CAT1C1；H6-CAT1C2；H6-CAT1C3；H6-CAT1N1；H6-CAT1N2；H6-CAT1N3；(2)截短蛋白的表达纯化：以全长HDAC6的编码基因为模板，通过PCR获得不同截短蛋白DNA序列，经酶切，酶连，最终获得重组正确的不同截短蛋白质粒；6个截短蛋白中，cat1-H1以可溶的形式表达，选择用Ni-NTA的纯化方式获得；其余截短蛋白及cat1区域的蛋白以包涵体形式存在，选用包涵体复性方式获得；(3)基于ELISA的抗原表位鉴定：因构建的重组质粒中带有GB1标签，GB1标签是Protein G蛋白的一个结构域可以和抗体的Fc结合，所以本实验中ELISA设计如下：(4)包被纳米抗体：阳性孔纳米抗体，PBS稀释，500ng，每孔100μl，阴性对照孔为PBS，4℃结合过夜；(5)封闭：0.5‰PBST清洗5次，5％milk封闭，每孔200μl，室温1h；(6)加入不同的抗原截短蛋白：0.5‰PBST清洗5次，阳性孔加入带有GB1标签的抗原截短蛋白，阴性孔加入带有GB1标签的无关蛋白作对照，500ng，每孔100μl，室温1h；(7)加入HRP标记的二抗：0.5‰PBST清洗10次，每孔加入100μl anti-mouseHRP抗体(1:20000)，室温1h；(8)显色：0.5‰PBST清洗10次，加显色底物，100μl每孔，避光反应10-15min；(9)酶标仪，OD405波长读数；(10)数据处理及分析。使用数据处理软件：PyMOL、Vector NTI。氨基酸序列信息及晶体结构信息来自于NCBI。
对抗HDAC6-cat1纳米抗体识别HDAC6-cat1抗原表位晶体结构区域进行汇总，SEQID NO:107纳米抗体识别抗原表位部位跟其它序列均不同；SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:108纳米抗体识别抗原表位部位位置相同或近似且与其它序列不同；SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104纳米抗体识别抗原表位部位位置相同或近似且与其它序列不同；SEQ ID NO:95纳米抗体识别抗原表位部位跟其它序列均不同；SEQ ID NO:109纳米抗体识别抗原表位部位跟其它序列均不同。而以上序列涉及的纳米抗体识别抗原表位部位位置均不同于催化口袋位置。
实施例6：抗HDAC6-cat1纳米抗体细胞水平特异性鉴定的应用
(1)对于细胞水平亲和力分析(图7)，本专利中采用MG132加药处理诱导A549细胞形成聚集体，之后通过免疫荧光技术观察加药处理实验组与未加药对照组的差别，分析纳米抗体是否识别细胞内部的HDAC6；(2)A549细胞的培养：完全培养基为F12K+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(Penicillin-Streptomycin Solution)；(3).第一天，铺细胞，将12孔板细胞爬片，放入12孔细胞培养板中，加入1ml细胞悬液，细胞密度为35％-40％，待细胞贴壁后，实验组加入1μmMG132，对照组不加；(4)细胞培养24h后，将培养基移除，用PBS小心清洗一遍；(5)加入1ml 4％PFA固定细胞，室温15min；(6)1xPBS洗3遍，一次5min；(7)通透剂(1xPBS+0.2％TritonX-100)处理，每孔1ml，室温静置15min；(8)1xPBS洗3遍，一次5min；(9)10％BSA，室温封闭30min；(10)孵育体外表达的纳米抗体(以1mg/ml为标准，1:1000加)，稀释液为10％BSA+0.2％NaN3，每孔1ml，4℃孵育过夜；(11)孵育一抗：1xPBS洗3遍，一次5min，加入一抗Mouse anti-HA mAb(1:2000)，稀释液10％BSA+0.2％NaN3，每孔加300μl，4℃过夜；(12).孵育荧光二抗：1xPBS洗4遍，一次5min，荧光二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa594)(1:1000)，稀释液为10％BSA，每孔300μl，室温封闭1.5h；(13)DAPI染色：1xPBS洗4遍，一次5min，在载玻片上滴10μl DAPI，将有细胞的一面用小镊子夹起，覆盖在DAPI上，用中性树脂在载玻片的周围封闭一周，4℃避光保存；(14)激光共聚焦显微镜观察。
实施例7：建立抗HDAC6-cat1纳米抗体稳定表达细胞系的应用(图8)
(1)为进一步检测抗HDAC6-cat1纳米抗体的功能，本专利中方利用Flp-In系统构建稳定表达的纳米抗体细胞系，之后将采用质谱分析技术获得与之结合的蛋白信息，进一步验证抗原表位，同时可通过检测HDAC6底物蛋白乙酰化水平的变化，检测纳米抗体对HDAC6活性的影响；(2)构建重组质粒pcDNA5/FRT-VHH，载体：pcDNA5/FRT；(3)转染293T细胞检测目的蛋白是否表达：293T细胞完全培养基为DMEM+10％FBS；(4)第一天，铺细胞，12孔板，细胞密度35％-40％；(5)第二天，一般24h内，细胞密度达到70％-80％左右，进行转染；(6)重组质粒pcDNA5/FRT-VHH：脂质体＝1:3，质粒1μg，脂质体3μl，分别用无血清培养基稀释，室温静止5min，之后将质粒稀释液加入脂质体稀释液中，室温静置15min；(7)将混合液轻轻加入细胞培养基中，37℃细胞培养箱，培养36-48h，20h时换液一次；(8)细胞处理：将培养基移除，用PBS轻轻清洗一遍，之后用100μl细胞裂解液+蛋白酶抑制剂(RIPA+PI)裂解细胞，冰上裂解15min，吸取细胞裂解液进1.5ml离心管中，12000rpm，10min，离心，将细胞裂解上清吸进新的离心管中；加5×loding buffer，用细胞裂解液稀释成1×，煮沸10min；跑SDS-PAGE蛋白胶；转膜，PVDF膜先用纯甲醇处理1min左右，恒流250mA，转膜1h；(9)5％milk室温封闭1h；(10)孵育一抗：0.5‰PBST清洗，一抗Mouse-anti-HAmAb(1:5000)，稀释液3％BSA+0.1％NaN3，4℃孵育过夜；(11)孵育二抗：0.5‰PBST清洗，二抗anti-mouse HRP(1:20000)，PBS稀释，室温缓慢孵育1h；(12)曝光：0.5‰PBST清洗，曝光液A液与B液，1：1混匀，膜放至曝光盒正面朝上，用纸吸净膜上的液体，将配好的曝光液，均匀地敷在膜上曝光室用X光片曝光目的条带，检测纳米抗体是否表达；(13)转染293T-FRT细胞(FLP-IN细胞系)：一个10cm细胞培养皿：重组质粒5μg+pOG44质粒15μg+转染试剂(Lipo2000)10μl；(14)加抗生素药Hygromycin B(潮霉素)筛选阳性单克隆，生成稳定表达细胞系；(15)加Doxycyclinehyclate(盐酸强力霉素)诱导剂诱导目的蛋白表达；(16)WB鉴定蛋白表达；(17)得到稳定表达细胞系，进行功能上的分析实验。
本发明中筛选能够特异性识别HDAC6的纳米抗体，验证其特异性和结合靶抗原的能力及用于目标抗原的表位的分析。通过基因工程技术将纳米抗体基因序列构建入真核质粒载体系统pcDNA 5/FRT中，以此来研究HDAC6的生物学功能，为HDAC6在生物医学领域提供了有效的纳米抗体应用工具。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应当了解，在本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的描述只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 南京融捷康生物科技有限公司
<120> 针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体及其应用
<130> GXM20181229_02
<141> 2018-12-29
<160> 125
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Ala
20 25
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Ala Asp Ser Val Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
1 5 10 15
Arg Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asn Pro Tyr Ser Ser Tyr Ser Leu Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asn Gly Tyr Gly Arg Thr Ser
1 5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ile Gly Ser Arg Trp Trp Tyr Pro Phe Asp Pro Ala Ala Tyr Lys Tyr
1 5 10 15
Trp Gly Gln
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Ser Cys Val Cys Ser Gly
20 25
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
<210> 10
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Tyr Val Asp Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ile Val
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Lys Lys Thr Leu Val Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
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Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Tyr Ile Pro Ser Lys Ala
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Gly Pro Gly Arg Ile Arg
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asn Asn Trp Ser Arg Ala Pro Glu Tyr
1 5 10 15
Arg Tyr Trp Gly Gln
20
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile
1 5 10 15
<210> 16
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
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Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
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Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Glu
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asn Ser Gly Gly Ile Gly Thr Tyr
1 5
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Lys Gly Tyr Gly Asn Met Val Val Ala Gly Ile Thr Ser Asn Tyr Arg
1 5 10 15
Gly Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile
1 5 10 15
<210> 22
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Asn Cys Ala
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Phe Thr Val Ser Arg Thr Ala Met Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Thr Ser Asp Ser Ile Thr Val
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Lys Cys Phe Arg Tyr Cys Pro Pro Pro Leu Thr Pro
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Arg Ile
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Thr Thr
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Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
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Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Ser Leu Phe Gly Ser Thr Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Ala Gly Arg Thr Gly Val Cys Tyr Ser Gly Ser Trp Ser Pro Asp Glu
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
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Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
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Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
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Thr Thr Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Tyr Glu
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Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Thr Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr Tyr Asp Lys Ala Arg Tyr Lys Tyr
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Trp Gly Gln
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
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Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
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Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Thr Tyr Met Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Lys Thr Arg Ala Val Gly Gly Thr Trp Ser Ser Pro Asn Ile Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
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Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
<210> 52
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
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Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35 40
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Ser Ser Asp Asn Tyr Met Gly
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
<210> 58
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
20 25 30
Glu Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35 40
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Gln Thr Ala Phe Met Ala
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Asp Thr Arg Ala Leu Ser
1 5
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Ala Arg Lys Lys Pro Gly Ser Ser Leu Leu Gln Pro Gln Ser Tyr Val
1 5 10 15
Tyr Trp Gly Gln
20
<210> 62
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile
1 5 10 15
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Thr Tyr Ala Tyr Ser Ser Thr Tyr Met Ala
1 5 10
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Tyr Thr Gly Asp Gly Trp
1 5
<210> 66
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Ala Lys Thr Arg Ala Val Gly Gly Thr Trp Ser Ser Pro Asn Ile Tyr
1 5 10 15
Thr Tyr Trp Gly Gln
20
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Trp Phe Arg Gln Arg Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Ile Ala Ile Phe
1 5 10 15
<210> 68
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35 40
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Val Tyr Arg Arg His Asn Tyr Cys Met Gly
1 5 10
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Asp Arg Gly Asp Ser
1 5
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Thr Ser Tyr Pro Arg Val Val Ile Gly Thr Cys Thr Gly Gly Asp Phe
1 5 10 15
Arg Val Trp Gly Gln
20
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
<210> 73
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Leu Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Ala Pro Tyr Ser Thr Tyr Ser Met Gly
1 5
<210> 75
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Asp Ser Asp Gly Asn Ile
1 5
<210> 76
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Ala Asp Tyr Pro Ala Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Phe Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu His Lys Tyr Trp Gly Gln
20
<210> 77
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly
20 25
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly Ile
1 5 10 15
<210> 79
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
1 5 10 15
Asp Lys Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Glu Ala Leu Asn Pro Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35 40
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Phe Pro Phe Ser Thr Tyr Cys Met Gly
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Tyr Ile Ser His Gly Gln
1 5
<210> 82
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Ala Gly Asp Arg Trp Tyr Cys Pro Ala Asp Ser Trp Ser Arg Pro Glu
1 5 10 15
Arg Tyr Pro Phe Trp Gly Gln
20
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
1 5 10 15
<210> 84
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
35 40
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Phe Thr Phe Ser Met Asn Gly Met Ser
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Thr Thr Gly Gly Ser Val
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Thr Gly Asn Gln Arg Arg Pro Ala Gln His Val Gly Val Trp Gly Gln
1 5 10 15
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
20 25
<210> 89
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
<210> 90
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Ala Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp
1 5 10 15
Asn Ala Glu Tyr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
35 40
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Tyr Thr Ser Ser Met Gly
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Gly Ile Val Asn
1
<210> 93
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Ala Val Arg Arg Leu Gln Lys Lys Asn Gln Leu Ala Ser Asp Glu Tyr
1 5 10 15
Met Tyr Trp Gly Gln
20
<210> 94
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Ala Asn Pro Tyr Ser Ser Tyr Ser
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
35 40 45
Ala Ile Asn Gly Tyr Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Ser Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Arg Lys Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ile
85 90 95
Gly Ser Arg Trp Trp Tyr Pro Phe Asp Pro Ala Ala Tyr Lys Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 95
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Ser Cys Val Cys Ser Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Ala Trp
20 25 30
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile Asp
35 40 45
Gly Pro Gly Arg Ile Arg Tyr Val Asp Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Ile Val Lys Lys Thr Leu Val Leu Glu Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg
85 90 95
Leu Ser Thr Asn Asn Trp Ser Arg Ala Pro Glu Tyr Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 96
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
1 5 10 15
Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
20 25 30
Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ile Gly Thr Tyr
35 40 45
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
50 55 60
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Tyr Gly Asn Met Val Val Ala Gly
85 90 95
Ile Thr Ser Asn Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ala Ala
115
<210> 97
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Thr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Gly Thr Ser Asp Ser Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr Asn Cys Ala
85 90 95
Lys Cys Phe Arg Tyr Cys Pro Pro Pro Leu Thr Pro Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Ala Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ser Thr Ala Cys Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
20 25 30
Glu Arg Glu Gly Val Ala Arg Ile Arg Ser Leu Phe Gly Ser Thr Trp
35 40 45
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Thr Thr
50 55 60
Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Thr Gly Val Cys Tyr Ser Gly
85 90 95
Ser Trp Ser Pro Asp Glu Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 99
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe
1 5 10 15
Ile Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
20 25 30
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Asp Arg Asp Arg Ser Thr
35 40 45
Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
50 55 60
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
65 70 75 80
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Arg Ser Ser Gly Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ile Ala Gln Trp Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 100
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Val Ser Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Tyr Ser Arg Lys Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
20 25 30
Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Val Tyr Ser Ala Gly Gly Thr Ser Thr
35 40 45
Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp
50 55 60
Thr Thr Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Tyr Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr
85 90 95
Tyr Asp Lys Ala Arg Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 101
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Tyr Ser Ser Thr Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
20 25 30
Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Trp Thr Tyr
35 40 45
Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
50 55 60
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Thr Arg Ala Val Gly Gly Thr Trp
85 90 95
Ser Ser Pro Asn Ile Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 102
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Arg Ser Ser Asp Asn Tyr Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile
35 40 45
Trp Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Phe Leu
85 90 95
Lys Gly Gly Ser Trp Ser Arg Ala Glu Arg Phe His Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 103
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Ala Phe Met Ala Trp
20 25 30
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp
35 40 45
Thr Arg Ala Leu Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Lys Pro Glu Glu Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Lys
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Ser Leu Leu Gln Pro Gln Ser Tyr Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 104
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Ala Tyr Ser Ser Thr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
35 40 45
Ser Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Trp Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Lys Thr Arg Ala Val Gly Gly Thr Trp Ser Ser Pro Asn Ile Tyr
100 105 110
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 105
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Val Tyr Arg Arg His Asn Tyr Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Arg Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Ile Ala
35 40 45
Ile Phe Asp Arg Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr
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Ser Tyr Pro Arg Val Val Ile Gly Thr Cys Thr Gly Gly Asp Phe Arg
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 106
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Pro Tyr Ser Thr Tyr Ser
20 25 30
Met Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ala Val Ala
35 40 45
Ala Ile Asp Ser Asp Gly Asn Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Leu Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Asp Tyr Pro Ala Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Phe Leu Ala Ala Leu
100 105 110
Leu His Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ala Ala
130
<210> 107
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Pro Phe Ser Thr Tyr Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
35 40 45
Gly Ile Tyr Ile Ser His Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Lys Lys Lys Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Glu Ala Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Asp Arg Trp Tyr Cys Pro Ala Asp Ser Trp Ser Arg Pro Glu
100 105 110
Arg Tyr Pro Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ala Ala
130
<210> 108
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Asn Gly
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
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Ala Ile Thr Thr Gly Gly Ser Val Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Thr Gly Asn Gln Arg Arg Pro Ala Gln His Val Gly Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 109
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Ser Met Gly Trp
20 25 30
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Gly
35 40 45
Ile Val Asn Ala Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Lys Asp Asn Ala Glu Tyr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Arg Arg Leu
85 90 95
Gln Lys Lys Asn Gln Leu Ala Ser Asp Glu Tyr Met Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 110
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
gtgcagctgc aggagtctgg gggaggctcg gtgcaggtcg gagggtctct gagactctcc 60
tgtgcctcct ctgcaaaccc ctacagcagc tactcactgg gctggttccg ccaggctccg 120
ggtaaggagc gcgagggagt cgcggctatt aatggttatg gtaggacaag ttacgcagac 180
tccgtgagcg gccgattcac catctcccaa gacaacgccc ggaagactct gtatctgcaa 240
atgaacagcc tgaaacctga ggacactgcc atgtactact gtgcaattgg gtcgaggtgg 300
tggtatccat tcgatcccgc ggcgtataag tactggggcc aagggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcagcgg ccgca 375
<210> 111
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gtgcagctgc aggagtctgg aggaggctcg gtgcaggctg gagggtctct gacactctcc 60
tgtgtatgct ctggatacat acccagtaag gcctggttcc gccaggctcc agggaaggag 120
cgcgaggcgg tcgcagcgat tgatgggcct ggtaggataa ggtacgtaga ctccgtgaac 180
ggccgattca ccatctccca agacattgtc aagaagactc tcgttctcga aatgaacagc 240
ctgaaacctg aggacactgc catgtactac tgtgcggcag atcccaggtt gtctactaat 300
aactggtcgc gagcccccga gtatcgctac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tcagcggccg ca 372
<210> 112
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gtgcagcctg gggggtctct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagtaac 60
tatgccatgg aatgggttcg ccaggctcca gggaagggac tcgagtgggt ctcaggcatt 120
aatagtggag gtattggtac atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc 180
agagacaacg ccaagaacac gctgtatctg cagctgaaca gcctgaaaac tgaggacacg 240
gccatgtatt actgtgcaaa ggggtacggt aatatggtgg tggctggtat cacaagtaac 300
taccgaggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctcagcgg ccgca 345
<210> 113
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gtgcagctgc aggagtctgg gggaggcttg gtgcagcctg gggggtctct gagactctcc 60
tgtgcagcct ctggattcac cgtcagtaga actgccatga gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaagggac tcgagtgggt cgccactatt ggtactagtg atagtatcac agtctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctg 240
caattgaaca gcctgaaaac tgacgacacg gccgtgtata attgtgcaaa atgtttccgt 300
tactgcccac caccccttac cccggggacc caggtcaccg tctcctcagc ggccgca 357
<210> 114
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gcgcaggctg gagggtctct gagactctcc tgtccagcct ctggattgac ttccagtacc 60
gcctgcttgg cctggtttcg ccaggctcca gggaaggagc gcgagggggt cgcacgtata 120
cgttctcttt ttggtagcac atggtatgcc gactccgtga agggccgatt caccatctcc 180
caagacacca ccaagaatat gctgtattta caaatggaca gcctgaaacc tgaggacact 240
gccatgtact actgtgcggc agggcggacg ggagtctgct attcaggctc ttggtcacct 300
gatgagttta actactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctcagc ggccgca 357
<210> 115
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gtgcaggctg gagggtctct gagactctcc tgtgttgcct ctggattcat ctacacctac 60
agtagttact gcatgggctg gttccgccag gctccaggga aggagcgcga gggggtcgca 120
actattgata gagatcgtag cacaacctac gcagactccg tgaagggccg attcaccatc 180
tcccaagaca acgccaagaa cactctgtat ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac 240
actgccatgt actactgtgc ggcagtccgt agtagtggtt actgctacat cgcccagtgg 300
tataagtact ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct cagcggccgc a 351
<210> 116
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
gtgcagactg gagggtctct gagactctcc tgtatagtat ctggatacac ctacagtcgc 60
aagaccgtgg gctggttccg ccaggctcca gggaaggagc gcgagggggt cgcagcggtt 120
tattctgcag gtggtactag tacgacatac tataccgact ccgtgaaggg ccgattcacc 180
atctccctag acaccaccaa gaacacgatt tatctacaaa tgaacagcct gagatatgag 240
gacactgcca tgtactattg tgcgacaggt ttcggcggtg ctaactatta cgacaaagca 300
cggtataagt actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcagcggc cgca 354
<210> 117
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gtgcaggctg gagggtctct gagactctcc tgtgcagcct ctggatacac ctacagtagc 60
acctacatgg cctggttccg ccaggctcca gggaaggagc gcgagggggt cgcaagtatt 120
tatactggtg atggttggac atactatgcc aactccgtga agggccgatt caccatctcc 180
cgagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact 240
gccatgtact actgtgcggc caaaacccgt gcagtcggtg ggacctggtc atccccaaac 300
atatatacgt actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcagcggc cgca 354
<210> 118
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gtgcagctgc aggagtctgg aggaggctcg gtgcaggctg gagggtctct gagactctcc 60
tgtgtagcct ctagatccag cgacaactac atgggatggt tccgccaggc tccagggaag 120
gagcgcgagg gggtcgccgc catttggggt ggcaccgcat actatgccga ctccgtcgag 180
ggccgattca ccatctccca agacaacgcc aagaacacag tgtatctgca aatgaacagc 240
ctgaaacctg aggacactgc catgtactac tgtgcgacag gtttcttgaa aggtggtagt 300
tggtcgaggg cagagaggtt tcattactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
gcggccgca 369
<210> 119
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gtgcagctgc aggagtctgg gggaggctcg gttcaggctg gagggtctct gagactctcc 60
tgtgcagcct ctggacagac cgccttcatg gcctggttcc gccaggctcc agggcaggag 120
cgcgaggggg tcgcagctat tgatactcgt gctttaagca catactatgg cgactccgtg 180
aagggtcgct tcaccatctc caaagacatt ttcaagaaca ctctgtatct gcaaatgaac 240
agcctgaaac ctgaggagac tgccatgtac tactgtgcag cgagaaaaaa accggggagc 300
agcctcttgc aaccgcaatc gtatgtttac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tcagcggccg ca 372
<210> 120
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
gtgcagctgc aggagtctgg gggaggctcg gtgcaggctg gagggtctct gagactctcc 60
tgtgcagcct ctacatacgc ctacagtagc acctacatgg cctggttccg ccaggctcca 120
gggaaggagc gcgagggggt cgcaagtatt tatactggtg atggttggac atactatgcc 180
aactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc caaaacccgt 300
gcagtcggtg ggacctggtc atccccaaac atatatacgt actggggcca ggggacccag 360
gtcaccgtct cctcagcggc cgca 384
<210> 121
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gtgcagctgc aggagtctgg aggaggctcg gtgcaggctg gagggtctct gagactctcc 60
tgtgcagcct ctgtatacag acggcataac tactgcatgg gctggttccg ccagcgtcca 120
gggaaggagc gcgaggagat cgcaattttt gataggggtg atagcacaag ctacgcagac 180
tccgtgaagg gccgattcac catctcccaa gacaacgcca agaatatgtt gtatctgcaa 240
atgaacagcc tgaaacctga ggacactgcc atgtactact gtgcgacatc atacccaagg 300
gtggtaattg gtacctgtac aggtggggac tttcgtgtct ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct cagcggccgc a 381
<210> 122
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gtgcagctgc aggagtctgg gggaggctcg gtgcaggctg gagggtctct gagactctct 60
tgtgcagcct ctggcgctcc ctacagtacc tattctatgg gctggatccg ccaggctcca 120
gggaagcagc gcgaggcggt cgcagctatt gatagtgatg ggaacataag ctacgcagac 180
tccgtgaagg gccgattcac catctcccaa gacaacctca agaacactct gtatctacaa 240
ttgaacaaac tgaaacctga ggacactgcc atgtactact gtgcggcaga ttatccagca 300
acctcagggg gtagtggtgg tttcttagcc gcactgcttc ataagtactg gggccagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc agcggccgca 390
<210> 123
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gtgcagctgc aggagtctgg aggaggctcg gtgcaggctg gagggtctct gagactctcc 60
tgtgcaacct ctggatttcc cttcagtact tactgtatgg ggtggttccg ccaggttcca 120
gggaaggagc gcgagggggt cgccggtatt tatattagtc atggtcagac atattatgcc 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacgaca agaagaagac gctgtatcta 240
caaatggaag ccctgaaccc tgaggacact gccatgtatt actgtgcggc aggagaccgg 300
tggtactgcc ccgcggactc atggtcccgg ccagaaaggt atccgttctg gggccagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc agcggccgca 390
<210> 124
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gtgcagctgc aggagtctgg aggaggctcg gtgcaggctg gggggtctct gagactctcc 60
tgtgcagcct ctggattcac attcagtatg aacggcatga gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tcgagtgggt ctcagcgatt actactggtg gtagtgtggc aacgtatgcg 180
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac gctgtatctc 240
caaatgaaca acctgaaaac tgaagacact gccgtgtatt actgcgccac agggaatcaa 300
cgtaggccgg cacagcacgt gggtgtgtgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
gcggccgca 369
<210> 125
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gtgcagctgc aggagtctgg aggaggctcg gtgcaggctg gagggtctct gagactctcc 60
tgtacagcct ctggatacac cagcagtatg ggctggttcc gccaggctcc agggaaggag 120
cgcgaggggg tcgcagctat cggcattgtt aacgcagtct acgcggattc cgtgaagggc 180
cgattcacca tctccaaaga caacgccgag tacactctct atctgcaaat gaacagcctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcggcagtac ggcgcctaca aaaaaaaaac 300
caactggctt cggatgagta tatgtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
gcggccgca 369

Claims (13)

1.针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
所述的纳米抗体的互补决定区CDR的序列包括下述（1）-（16）中的至少一种：
（1）SEQ ID NO:5所示CDR1，SEQ ID NO:6所示CDR2，SEQ ID NO:7所示CDR3；
（2）SEQ ID NO:11所示CDR1，SEQ ID NO:12所示CDR2，SEQ ID NO:13所示CDR3；
（3）SEQ ID NO:17所示CDR1，SEQ ID NO:18所示CDR2，SEQ ID NO:19所示CDR3；
（4）SEQ ID NO:23所示CDR1，SEQ ID NO:24所示CDR2，SEQ ID NO:25所示CDR3；
（5）SEQ ID NO:29所示CDR1，SEQ ID NO:30所示CDR2，SEQ ID NO:31所示CDR3；
（6）SEQ ID NO:35所示CDR1，SEQ ID NO:36所示CDR2，SEQ ID NO:37所示CDR3；
（7）SEQ ID NO:41所示CDR1，SEQ ID NO:42所示CDR2，SEQ ID NO:43所示CDR3；
（8）SEQ ID NO:47所示CDR1，SEQ ID NO:48所示CDR2，SEQ ID NO:49所示CDR3；
（9）SEQ ID NO:53所示CDR1，SEQ ID NO:54所示CDR2，SEQ ID NO:55所示CDR3；
（10）SEQ ID NO:59所示CDR1，SEQ ID NO:60所示CDR2，SEQ ID NO:61所示CDR3；
（11）SEQ ID NO:64所示CDR1，SEQ ID NO:65所示CDR2，SEQ ID NO:66所示CDR3；
（12）SEQ ID NO:69所示CDR1，SEQ ID NO:70所示CDR2，SEQ ID NO:71所示CDR3；
（13）SEQ ID NO:74所示CDR1，SEQ ID NO:75所示CDR2，SEQ ID NO:76所示CDR3；
（14）SEQ ID NO:80所示CDR1，SEQ ID NO:81所示CDR2，SEQ ID NO:82所示CDR3；
（15）SEQ ID NO:85所示CDR1，SEQ ID NO:86所示CDR2，SEQ ID NO:87所示CDR3；
（16）SEQ ID NO:91所示CDR1，SEQ ID NO:92所示CDR2，SEQ ID NO:93所示CDR3。
2.根据权利要求1所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，其特征在于，（1）-（16）的所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80%同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85%同源性”，更优选为“至少90%同源性”，更优选为“至少95%同源性”，最优选为“至少98%同源性”。
3.根据权利要求1所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109中的至少一条所示的抗体链。
4.根据权利要求3所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，其特征在于，纳米抗体链的编码序列如SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125所示。
5.根据权利要求1所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:1所示FR1，SEQ ID NO:2所示FR2，SEQ ID NO:3所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:8所示FR1，SEQ ID NO:9所示FR2，SEQ ID NO:10所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:14所示FR1，SEQ ID NO:15所示FR2，SEQ ID NO:16所示FR3,，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:20所示FR1，SEQ ID NO:21所示FR2，SEQ ID NO:22所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:20所示FR1，SEQ ID NO:21所示FR2，SEQ ID NO:22所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:26所示FR1，SEQ ID NO:27所示FR2，SEQ ID NO:28所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:32所示FR1，SEQ ID NO:33所示FR2，SEQ ID NO:34所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:38所示FR1，SEQ ID NO:39所示FR2，SEQ ID NO:40所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:44所示FR1，SEQ ID NO:45所示FR2，SEQ ID NO:46所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:50所示FR1，SEQ ID NO:51所示FR2，SEQ ID NO:52所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:56所示FR1，SEQ ID NO:57所示FR2，SEQ ID NO:58所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:62所示FR1，SEQ ID NO:63所示FR2，SEQ ID NO:46所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:62所示FR1，SEQ ID NO:67所示FR2，SEQ ID NO:68所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:56所示FR1，SEQ ID NO:72所示FR2，SEQ ID NO:73所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:77所示FR1，SEQ ID NO:78所示FR2，SEQ ID NO:79所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:56所示FR1，SEQ ID NO:83所示FR2，SEQ ID NO:84所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
或SEQ ID NO:88所示FR1，SEQ ID NO:89所示FR2，SEQ ID NO:90所示FR3，SEQ ID NO:4所示FR4；
上述所有FR1、FR2、FR3和FR4的序列可替换为其保守序列变体。
6.根据权利要求1所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体为VHH。
7.核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列编码权利要求1-6任意一项所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：110-125中的任意一条所示。
8.表达载体，其特征在于，其包含权利要求7所述的核苷酸序列。
9.宿主细胞、细胞系或非人生物体，其特征在于，其可以表达出权利要求1-6任意一项所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，或其包含权利要求8所述的表达载体。
10.权利要求1-6任意一项所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体在与目标抗原在原核水平识别、HDAC6-cat1区域抗原表位的分析鉴定或抗HDAC6-cat1纳米抗体的特异性分析中的应用。
11.表达抗HDAC6-cat1纳米抗体细胞系在抗HDAC6-cat1纳米抗体的功能分析中的应用，其特征在于，表达抗HDAC6-cat1纳米抗体细胞系可以表达出权利要求1-6任意一项所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体，或其包含权利要求8所述的表达载体。
12.权利要求1-6任意一项所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体作为HDAC6的选择性抑制剂的用途。
13.权利要求1-6任意一项所述的针对HDAC6-cat1区域的纳米抗体、权利要求7的核苷酸序列、权利要求8所述的宿主细胞、细胞系或非人生物体在制备组蛋白脱乙酰基酶6(HDAC6)选择性抑制剂药物中的应用。
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