CN113667014B

CN113667014B - 一种抗bsa纳米抗体及应用

Info

Publication number: CN113667014B
Application number: CN202010417248.3A
Authority: CN
Inventors: 王玉芳; 查长春; 刘川; 谭建雄; 颜蚺; 韩权
Original assignee: Shanghai Baiying Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Baiying Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2040-05-15
Also published as: CN113667014A

Abstract

本发明公开了一种抗BSA纳米抗体及应用，所述纳米抗体至少具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3之一，该抗体能够以高亲和力特异性识别BSA，可用于纯化、检测和去除BSA，具有重要的应用价值。

Description

一种抗BSA纳米抗体及应用

技术领域

本发明涉及一种抗BSA纳米抗体及应用，属于生物技术领域。

背景技术

牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，具有清除自由基、抗凝血及维持血浆渗透压和体液平衡等作用，广泛用于生化研究，遗传工程和药物研究。

常规的BSA分离方法如层析法、沉淀法、色谱法和电泳法等，它们的共同缺点在于不能对某种特定蛋白质进行选择性的分离，因此无法对其中的有效成分进行回收分离。所以需要一种吸附效率高，并且能够特异性与BSA结合的纯化方法，例如利用抗BSA抗体对BSA进行分离纯化。

牛血清是细胞培养和扩增过程中培养液的重要组分，是细胞培养中用量最大的天然培养基，也是许多生物制品保存液中的必要组分之一。BSA是牛血清中的主要成分，同时作为异源蛋白也是引起过敏反应的主要因素之一。因此检测并去除用牛血清培养的细胞溶液中的BSA，对于提高细胞生物制品的生物安全性具有重要作用。

纳米抗体，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子，其分子量约为15 KD。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单、能够在大肠杆菌中大量表达等优势。应用纳米抗体纯化、检测、去除BSA具有广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种抗BSA纳米抗体及应用，所述纳米抗体能特异性识别BSA，可应用于纯化、检测、去除BSA。

本发明采取的具体技术方案是：

一种抗BSA纳米抗体，所述抗体至少具有以下技术特征之一：

i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26—35；

ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基51—58；

iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基97—108。

优选地，所述重链包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3；重链CDR1即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26—35；重链CDR2即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基51—58；重链CDR3即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基97—108。

优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供：

编码前文所述抗BSA纳米抗体的核酸。

优选地，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供：

具有前文所述核酸的表达载体。

优选地，所述表达载体为原核表达载体或哺乳系统表达载体。

更优选地，所述原核表达载体优选pET28a，所述哺乳系统表达载体优选pcDNA3.1。

本发明还提供：

具有前文所述表达载体的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞优选大肠杆菌BL21或CHO。

本发明还提供：

固定有前文所述抗BSA纳米抗体的磁珠载体。

本发明还提供：

前文所述磁珠载体具有纯化、检测和去除BAS的作用。可用于纯化牛奶中BSA，检测并去除Vero细胞培养上清中BSA。

本发明还提供：

前文所述抗BSA纳米抗体用于制备诊断试剂或诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。

本发明还提供：

前文所述核酸用于制备抗BSA纳米抗体、药物或药物组合物的用途。

本发明还提供：

前文所述宿主细胞用于制备药物或药物组合物的用途。

进一步地，所述药物或药物组合物具有纯化、检测和去除BAS的作用。

本发明的有益效果是：本发明通过噬菌体展示技术获得了靶向BSA的纳米抗体，该抗体能够以高亲和力特异性识别BSA，可用于纯化、检测和去除BSA，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中ELISA检测每轮淘选富集噬菌体对BSA的结合情况图。

图2为实施例1中ELISA检测单克隆噬菌体对抗原蛋白的结合情况图。

图3为实施例1的单克隆富集率分析图。

图4为实施例2的原核表达载体和哺乳系统表达载体示意图。

图5为实施例2的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的电泳检测图。

图6为实施例3的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的结合ELISA结果图。

图7为实施例4的从牛奶中纯化的BSA的电泳检测图。

图8为实施例5的细胞培养上清去除BSA前后的Western Blot检测BSA结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。

实施例1、筛选抗BSA纳米抗体

以牛血清白蛋白（BSA）为抗原，应用噬菌体展示技术从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库（文库大小为1 .47x10⁹）中筛淘抗BSA的纳米抗体。

采用固相淘选的方法，将100 ug/mL BSA包被到ELISA板条上，每孔100 uL，4℃过夜包被。PBST洗三遍，每孔加入200 uL 3％的酪蛋白，37℃封闭2小时。PBST洗三遍后加入噬菌体展示库（约有1x10¹²CFU），37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，PBST洗10遍。每孔加100 uL的甘氨酸-盐酸（PH＝2.2）溶液，37℃反应7分钟，轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗脱下来，然后加入Tris-HCl（PH＝8.8）溶液中和至中性。洗脱的噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增回收后的噬菌体，用于下一轮淘选。

经过三轮淘选后，用Phage-ELISA进行验证是否特异性富集。将2 ug/mL BSA包被到ELISA板条上，4℃过夜包被。PBST洗三遍后用3％的酪蛋白37℃封闭2小时。PBST洗5遍后加入三轮淘选的噬菌体展示库，首孔约1x10¹²CFU，4倍梯度稀释，末孔空白，37℃结合1小时。PBST洗5遍后加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加TMB显色液，室温避光显色5-10分钟，最后用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值并做Phage-ELISA结合曲线。

ELISA检测结果如图1所示，以辅助噬菌体为阴性对照，在三轮富集后，噬菌体群对BSA的亲和力逐轮升高。

对第三轮富集的噬菌体单克隆进行抗原结合分析，具体过程为：

用第三轮富集的噬菌体库感染TG1细胞，并从中随机挑取440个单克隆，扩增并回收噬菌体。将2 ug/mL BSA包被到ELISA板条上，4℃过夜包被。PBST洗三遍后用3％酪蛋白37℃封闭2小时。将440个扩增后的单克隆噬菌体以及阴性对照辅助噬菌体分别以1:1比例与含3％酪蛋白的PBST溶液室温孵育1小时，将孵育好的噬菌体加到封闭好的酶标板中，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加TMB室温避光显色5-10分钟，最后用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值，吸光值在阴性对照两倍以上的为阳性克隆。分析单克隆噬菌体对BSA的结合能力。检测结果如图2所示，发现440单克隆噬菌体中有个295个识别BSA的阳性克隆。

对这295个阳性克隆进行测序分析，得到8个Unique sequence，其中Unique 3为优势富集克隆（如图3所示）。

Unique 3的抗体DNA序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：1：cagttgcagctggtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccttcagtagctatgccatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgtgagttagtagcagctattagccggagaggtggtagcacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtctattactgtaatgccaaatcgtacggtagtaccgtgcgcaactattggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

SEQ ID NO：2：QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERELVAAISRRGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAKSYGSTVRNYWGQGTQVTVSS

在氨基酸序列中，氨基酸残基26-35（即GRTFSSYAMG）为重链CDR1，氨基酸残基51-58（即ISRRGGST）为重链CDR2，氨基酸残基97-108（即NAKSYGSTVRNY）为重链CDR3。

实施例2：抗BSA的纳米抗体的原核表达纯化和哺乳系统表达纯化

原核表达纯化

构建实施例1中Unique3纳米抗体的原核表达载体pET28a（GST标签），如图4所示，然后以此制备质粒。提取质粒并热激转化至菌株BL21（DE3）感受态细胞，以0.5 mM IPTG诱导纳米抗体蛋白表达。第二天将菌液离心收集用80 mL PBS重悬菌体后进行超声破碎，条件为200 w，破碎3 s，间歇3 s。然后4 ℃，8000 g离心收集上清，过GST 4FF介质（百英内部提供），纳米抗体吸附到层析介质上，用1×PBS洗去杂蛋白，加入20 mM还原型谷胱甘肽洗脱，在得到的纳米抗体溶液中加入PBS进行超滤（3600 rpm/min，12 min，重复3次），得到的纳米抗体是溶在PBS中，纯化的纳米抗体进行SDS-PAGE，实验结果如图5所示。

哺乳系统表达纯化

构建实施例1中Unique3纳米抗体的哺乳系统表达载体pcDNA3.1，如图4所示，然后以此制备质粒。运用脂质体转染法将构建成功的重组载体转染293F细胞。取对数生长期293F细胞接种至6孔板中，细胞密度为1.5×10⁶ cell/mL，37℃、5% CO2培养箱中微孔板振荡器600 rpm培养，2 h后进行转染。将脂质体一载体混合液加入细胞孔，培养2、4、6天补料补液，第7天收样纯化。用20 mL 1xPBS，1 mL/min的流速平衡层析柱，1 mL/min的流速上样，20 mL 1xPBS，1 mL/min的流速洗杂，用柠檬酸缓冲液（PH3.4）洗脱，流速1 mL/min，分管收集，每管约500 uL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280 nm吸光度值。将高浓度蛋白吸至透析袋放1XPBS的烧杯中透析。收集纯化好的抗体其还原条件下的SDS-PAGE结果如图5。

实施例3 原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的结合ELSIA

用ELISA对纳米抗体进行验证。将2 ug/mL BSA包被到ELISA板条，4℃过夜，3％的酪蛋白37℃封闭1小时，将实施例2中抗BSA纳米抗体稀释至2.5 ug/mL作为首孔浓度，4倍梯度稀释，末孔为空白，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干，用HRP标记的anti-human IgG做二抗，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干。每孔加100uL TMB室温避光反应5-10分钟，用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值。

结果如图6所示，两种表达系统的抗BSA纳米抗体与均可与BSA结合。

实施例4：应用原核表达的抗BSA纳米抗体纯化牛奶中的BSA

将原核表达的抗BSA纳米抗体共价固定到磁珠载体（Biointron,BY0111-10mL）上。具体为取适量抗BSA纳米抗体用Coupling Buffer溶解并配成浓度为≥3.0 mg/mL的溶液。取400μL 25%磁珠于EP管中，磁分离去除上清液富集磁珠。加1 mL Washing Buffer A于EP中，混匀后磁分离去除上清液富集磁珠。加200μL抗体溶液于EP管中，室温混合2~4 h。磁分离去除上清液富集磁珠。加1 mL Blocking Buffer于EP管中，混匀后磁分离去除上清液。再加1 mL Blocking Buffer于EP管中，室温反应2 h，磁分离去除上清液富集磁珠。加1 mL超纯水于EP管中，混匀后磁分离去除上清液富集磁珠。加1 mL Storage Buffer于EP管中，混匀后磁分离去除上清液富集磁珠，重复该操作2次。最后加入400μL Storage Buffer，充分混合后4℃保存备用。

取浓缩后的牛奶100 µL至EP管中，加入900 µL Binding/Washing buffer，充分混匀。取200 µL磁珠于EP管中，磁分离弃上清后用1 mL Binding/Washing buffer洗涤2次，磁分离弃上清收集磁珠。加入处理好的牛奶样品，混匀后室温混合15 min，磁分离弃上清收集磁珠。加入1 mL Binding/Washing buffer，混匀后磁分离弃上清收集磁珠，该操作重复3次。加入0.5~1.0 mL Elution buffer，迅速重悬，室温下混合10 min，磁分离收集上清液至新的EP管。向洗脱液中加入一定量的Neutrilization buffer，使洗脱的BSA保持中性环境。用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，结果如图7。

实施例5：应用原核表达的抗BSA纳米抗体检测并去除Vero细胞培养上清中的BSA

取一支工作库的Vero细胞种子，37℃水浴快速化冻后接种至MEM溶液（含10% FBS胎牛血清）配制的完全培养液中，次日换液，长满单层后进行传代培养。收集每次传代的细胞培养上清。

通过冷冻干燥的方法对细胞培养上清进行浓缩，测定蛋白的总浓度，样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟以充分变性蛋白，BSA做阳性对照。冷却到室温后，把样品加到SDS-PAGE胶加样孔内，恒压100 V，90－120分钟至溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。使用PVDF膜和Bio-Rad的标准湿式转膜装置，300-400mA电转30-60分钟。转模结束后将蛋白膜用Western洗涤液漂洗1-2分钟以去除转膜液，使用2.5-5%（w/v）的酪蛋白做封闭液，室温缓慢摇动封闭60分钟。BSA纳米抗体作为一抗（1 mg/mL，1:1000稀释使用），室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。侧摆摇床上用Western洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤5-10分钟（如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数）。封闭液稀释的Anti-VHH，HRP做二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。侧摆摇床上用Western洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤5-10分钟（如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数）。最后用超敏ECL发光液来检测蛋白。

按照实施例4的方法用BSA纳米抗体磁珠去除Vero细胞培养上清中的BSA，收集去除了BSA的上清，并用上述Western Blot法检测BSA是否去除干净。

如图8所示结果，用BSA纳米作一抗，通过Western Blot可以检测出细胞培养上清中含有的微量BSA，通过BSA纳米抗体磁珠可以去除细胞培养上清中含有的微量BSA。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 泰州市百英生物科技有限公司

<120> 一种抗BSA纳米抗体及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工合成(Unknown)

<400> 1

cagttgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt agctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt agtagcagct attagccgga gaggtggtag cacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtct attactgtaa tgccaaatcg 300

tacggtagta ccgtgcgcaa ctattggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工合成(Unknown)

<400> 2

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Lys Ser Tyr Gly Ser Thr Val Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.一种抗BSA纳米抗体，其特征在于，所述抗体包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3；重链CDR1即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26—35；重链CDR2即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基51—58；重链CDR3即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基97—108。

2.根据权利要求1所述的抗BSA纳米抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

3.编码权利要求1或2所述抗BSA纳米抗体的核酸。

4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。

5.具有权利要求4所述的核酸的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体或哺乳系统表达载体。

7.具有权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21或CHO。

9.固定有权利要求1或2所述抗BSA纳米抗体的磁珠载体。

10.权利要求9所述磁珠载体用于纯化牛奶中BSA或检测并去除Vero细胞培养上清中BSA的用途。