CN112794910B - 一种抗pd-1的纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗pd-1的纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗PD‑1的纳米抗体及其应用。该抗体至少具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3之一，该抗体可用于检测人体外周血中的可溶性PD‑1。本发明通过噬菌体展示技术获得了靶向PD‑1的纳米抗体，该抗体能够以高亲和力特异性识别PD‑1。

Description

一种抗PD-1的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗PD-1纳米抗体及应用，属于生物技术领域。
技术背景
程序性死亡受体-1(programmed cell death-1，PD-1)及其配体(programmeddeath-1 ligand，PD-L1)分子是肿瘤免疫逃逸及免疫耐受过程中的关键性因素。靶向于PD-1/PD-L1通路的免疫治疗虽然获得了巨大成功，但目前尚未找到确切的疗效预测指标，筛选出最获益的治疗群体。PD-1存在膜性和可溶性(sPD-1)两种形式，由于可溶形式存在的分子，使PD-1/PD-L1通路无论是在组成还是功能方面都更加的复杂多变，因此动态监测血液中sPD-1的变化过程可能会帮助我们更准确的判断患者的免疫状态及预测疗效，筛选最佳治疗人群。
纳米抗体是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到的，其分子量约为15KD，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。因此，应用纳米抗体技术监测血液中sPD-1的变化过程具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的主要目的是：提供一种抗PD-1的纳米抗体，能特异性识别PD-1。同时，还提供该抗体的应用。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基；
ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第51—60位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第51—58位氨基酸残基；
iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第99—117位氨基酸残基，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第97—116位氨基酸残基。
优选地，所述抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3；重链CDR1即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基；重链CDR2即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第51—60位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第51—58位氨基酸残基；重链CDR3即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第99—117位氨基酸残基，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第97—116位氨基酸残基。
优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供：
编码前文所述抗PD-1的纳米抗体的核酸。
优选地，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供：
具有前文所述的核酸的原核表达载体和哺乳系统表达载体。
优选地，原核表达载体为pET28a，哺乳系统表达载体为pcDNA3.1。
本发明还提供：
具有前文所述两种表达载体的宿主细胞。
优选地，原核表达宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，哺乳系统表达宿主细胞为CHO。
本发明还提供：
前文所述抗PD-1纳米抗体在检测人体外周血中可溶性PD-1的应用。
本发明通过噬菌体展示技术获得了靶向PD-1的纳米抗体，该抗体能够以高亲和力特异性识别PD-1。该抗体能够检测人体外周血中可溶性的PD-1，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中ELISA检测每轮淘选富集噬菌体对PD-1的结合情况图。
图2为实施例1中ELISA检测单克隆噬菌体对抗原蛋白的结合情况图。
图3为实施例1的单克隆富集率分析图。
图4为实施例2的原核表达载体和哺乳系统表达载体示意图。
图5为实施例2的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的电泳检测图。
1：Unique6哺乳系统表达抗体
2：Unique11哺乳系统表达抗体
3：Unique6原核表达抗体
4：Unique11原核表达抗体
图6为实施例3的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的结合ELISA结果图。
图7为实施例4的双抗夹心法绘制的Human PD-1的标准曲线。
图8为实施例4的20例正常人外周血中可溶性PD-1的含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
实施例1、筛选抗PD-1纳米抗体
以Human PD-1/His为抗原，应用噬菌体展示技术从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库(文库大小为1.47x109)中筛淘抗PD-1的纳米抗体。
采用固相淘选的方法，将100ug/mL PD-1/His包被到ELISA板条上，每孔100uL，4℃过夜包被。PBST洗三遍，每孔加入200uL 3％的酪蛋白，37℃封闭2小时。PBST洗三遍后加入噬菌体展示库(约有1x1012CFU)，37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，PBST洗10遍。每孔加100uL的甘氨酸-盐酸(PH＝2.2)溶液，37℃反应7分钟，轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗脱下来，然后加入Tris-HCl(PH＝8.8)溶液中和至中性。洗脱的噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增回收后的噬菌体，用于下一轮淘选。
经过三轮淘选后，用Phage-ELISA进行验证是否特异性富集。将2ug/mL PD-1/His包被到ELISA板条上，4℃过夜包被。PBST洗三遍后用3％的酪蛋白37℃封闭2小时。PBST洗5遍后加入三轮淘选的噬菌体展示库，首孔约1x1013CFU，4倍梯度稀释，末孔空白，37℃结合1小时。PBST洗5遍后加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加TMB显色液，室温避光显色5-10分钟，最后用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值并做Phage-ELISA结合曲线。
ELISA检测结果如图1所示，以辅助噬菌体为阴性对照，在三轮富集后，噬菌体群对PD-1/His的亲和力逐轮升高。
对第三轮富集的噬菌体单克隆进行抗原结合分析，具体过程为：
用第三轮富集的噬菌体库感染TG1细胞，并从中随机挑取440个单克隆，扩增并回收噬菌体。将2ug/mL PD-1/His包被到ELISA板条上，4℃过夜包被。PBST洗三遍后用3％酪蛋白37℃封闭2小时。将440个扩增后的单克隆噬菌体以及阴性对照辅助噬菌体分别以1:1比例与含3％酪蛋白的PBST溶液室温孵育1小时，将孵育好的噬菌体加到封闭好的酶标板中，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加TMB室温避光显色5-10分钟，最后用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值，吸光值在阴性对照两倍以上的为阳性克隆。分析单克隆噬菌体对PD-1的结合能力。检测结果如图2所示，发现440单克隆噬菌体中有个192个识别PD-1的阳性克隆。
对这192个阳性克隆进行测序分析，得到11个Unique sequence，其中Unique 6和Unique 11为优势富集克隆(如图3所示)。
Unique 6的抗体DNA序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
在氨基酸序列中，氨基酸残基26-35(即GFTSDDYAIG)为重链CDR1，氨基酸残基51-60(即FRTRGGYIGT)为重链CDR2，氨基酸残基99-117(即AALQSVQAMCFMRPEDYKN)为重链CDR3。
Unique 11的抗体DNA序列为SEQ ID NO.2，氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
在氨基酸序列中，氨基酸残基26-35(即GFTLDYAAIG)为重链CDR1，氨基酸残基51-58(即VSRDGDRV)为重链CDR2，氨基酸残基97-116(即AARSSNSRDWCPQNSAAYPY)为重链CDR3。
实施例2：抗PD-1的纳米抗体的原核表达纯化和哺乳系统表达纯化
原核表达纯化
构建实施例1中Unique6和Unique11纳米抗体的原核表达载体pET28a(GST标签)，如图4所示，然后以此制备质粒。具体为以Unique6和Unique11单克隆菌株为模板，引物为Seq Pet28a-F:SEQ ID NO.5/Seq Pet28aR:SEQ ID NO.6，插入为点位为NdeI/XhoI，用试剂盒提取质粒并热激转化至菌株BL21(DE3)感受态细胞，以0.5mM IPTG诱导纳米抗体蛋白表达。第二天将菌液离心收集用80mL PBS重悬菌体后进行超声破碎，条件为200w，破碎3s，间歇3s。然后4℃，8000g离心收集上清，过GST 4FF介质，抗体吸附到层析介质上，用1×PBS洗去杂蛋白，加入20mM还原型谷胱甘肽洗脱，在得到的抗体溶液中加入PBS进行超滤(3600rpm，12min，重复3次)，纯化后进行SDS-PAGE，实验结果如图5所示。
哺乳系统表达纯化
构建实施例1中Unique6和Unique11纳米抗体的哺乳系统表达载体pcDNA3.1，如图4所示，然后以此制备质粒。具体为以Unique6和Unique11单克隆菌株为模板，引物为SeqPcDNA3.1-F:SEQ ID NO.7/Seq PcDNA3.1-R:SEQ ID NO.8，插入为点位为NotI/XbaI，用试剂盒提取质粒并运用脂质体转染法将构建成功的重组载体转染293F细胞。取对数生长期293F细胞接种至6孔板中，细胞密度为1.5×106cell/mL，37℃、5％CO2培养箱中微孔板振荡器600rpm培养，2h后进行转染。将脂质体一载体混合液加入细胞孔，培养2、4、6天补料补液，第7天收样纯化。用20mL 1xPBS，1mL/min的流速平衡层析柱，1mL/min的流速上样，20mL1xPBS，1mL/min的流速洗杂，用柠檬酸缓冲液(PH3.4)洗脱，流速1mL/min，分管收集，每管约500uL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。将高浓度抗体吸至透析袋放1XPBS的烧杯中透析。收集纯化好的抗体其还原条件下的SDS-PAGE结果如图5。
实施例3原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的结合ELSIA
用ELISA对纳米抗体进行验证。将2ug/mL PD-1/His包被到ELISA板条，4℃过夜，3％的酪蛋白37℃封闭1小时，将实施例2中抗PD-1纳米抗体稀释至2.5ug/mL作为首孔浓度，4倍梯度稀释，末孔为空白，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干，用HRP标记的anti-VHH做二抗，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干。每孔加100uL TMB室温避光反应5-10分钟，用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值。
结果如图6所示，两种表达系统的抗PD-1纳米抗体均可与PD-1结合。
实施例4：应用双抗夹心法检测人体外周血中可溶性的PD-1。
采集正常人的血液并以肝素抗凝，1800rpm离心后收集血清，-20℃备用。生物素标记纳米抗体，具体为向200ug的Abpro-PD1Uni6(原核表达的Unique6抗体)中加入碳酸缓冲液(pH 9-9.5)至1mL，加入为1mg/mL的BNHS-DMSO 40uL，室温避光震荡4小时。去离子水冲洗透析袋，然后用Coating Buffer冲洗透析袋，在0.01M的碳酸缓冲液中4℃透析，每天换液两次。
用2ug/mL，100uL/well的Abpro-PD1Uni11(原核表达的Unique11抗体)包被酶标板，4℃过夜，第二天用PBST洗3次，拍干后用3％的酪蛋白37℃封闭1小时，PBST洗5次拍干，分别加入Human PD-1标准品和待测血清的梯度稀释液，37℃孵育1小时，PBST洗5次拍干，每孔加100uL 2ug/mL的生物素标记的Abpro-PD1Uni6，37℃孵育1小时，PBST洗5次拍干，每孔加入100uL Avdin-HRP，37℃避光孵育20min，PBST洗板5次后拍干。每孔加100uL TMB室温避光反应5-10分钟，用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值，绘制标准曲线并计算血清中sPD-1的含量。
Human PD-1的标准曲线如图7所示，其在65-5000pg/mL区间具有良好的曲线关系，检测灵敏度为25pg/mL，20例正常人外周血中sPD-1含量的测定结果如图8所示，其中sPD-1含量在0.692-1.926mg/mL之间，平均值为1.095mg/mL，中位数为0.997mg/mL。
序列表
<110> 泰州市百英生物科技有限公司
<120> 一种抗PD-1 的纳米抗体及其应用
<160> 8
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Thr Cys Ala Ala Leu Gln Ser Val Gln Ala Met Cys Phe Met Arg Pro
100 105 110
Glu Asp Tyr Lys Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Ala
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Leu Cys Val Ser Arg Asp Gly Asp Arg Val Asn Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp His Val Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Ser Ser Asn Ser Arg Asp Trp Cys Pro Gln Asn Ser Ala
100 105 110
Ala Tyr Pro Tyr Trp Gly His Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctggtgcc gcgcggcagc catatgatga gccccatcct gggctactgg 50
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccggatctc agtggtggtg gtggtggtgc tcgagtgagg agacrgtgac ctgggtccc 59
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaccgatcc agcctccgga cgcggccgca aactacaaga cagacttgca 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatccagagg ttgattgtcg actctagaat catttacccg gagacaggga 50

Claims (9)

1.一种抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体，其特征是，所述抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体包括所述的重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3；所述抗体具有以下技术特征：
i、所述抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体包括SEQ ID NO:3中的第26—35位氨基酸残基所示的重链CDR1、SEQ ID NO:3中第51—60位氨基酸残基所示的重链CDR2以及SEQ ID NO:3中第99—117位氨基酸残基所示的重链CDR3；
或ii、所述抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体包括SEQ ID NO:4中的第26—35位氨基酸残基所示的重链CDR1、SEQ ID NO:4中第51—58位氨基酸残基所示的重链CDR2以及SEQ IDNO:4中的第97—116位氨基酸残基所示的重链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体，其特征是，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
3.编码权利要求1~2中任一项所述抗PD-1的纳米抗体的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征是，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。
5.一种含有权利要求4所述的核酸的表达载体；其特征在于所述的表达载体为原核表达载体或哺乳系统表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述的原核表达载体为pET28a，所述的哺乳系统表达载体为pcDNA3.1。
7.含有权利要求6所述表达载体的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于含有所述的原核表达载体的宿主细胞为大肠杆菌BL21，含有所述的哺乳系统表达载体的宿主细胞为CHO。
9.一种权利要求1或2所述的抗PD-1的羊驼单重链纳米抗体在制备检测人体外周血中的可溶性PD-1的试剂中的应用。
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