CN117866100B - 针对d-二聚体的单域抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用 - Google Patents

针对d-二聚体的单域抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了肽技术领域中针对D‑二聚体的单域抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用。本发明所要解决的技术问题是提供高特异性高灵敏度的D‑二聚体抗体。为了解决该技术问题，本发明提供了针对D‑Dimer蛋白的重链单域抗体或其抗原结合片段，所述重链单域抗体或其抗原结合片段包含3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述单域抗体为1A6；所述区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别依次为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3。本发明可用检测D‑dimer含量检测。

Description

针对D-二聚体的单域抗体或其抗原结合片段及其相关生物材 料与应用
技术领域
本发明属于肽技术领域，具体涉及针对D-二聚体的单域抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用。
背景技术
D-二聚体是纤维蛋白在凝血酶、凝血因子XIIIa以及纤溶酶的连续作用下形成的产物，体内半衰期约8h，主要经过肾脏和网状内皮系统代谢。血浆中D-二聚体水平的高低是反应机体凝血纤溶系统活跃程度的标志。D-二聚体水平升高说明体内存在高凝状态和继发性的纤维蛋白溶解亢进。如高凝状态、肾脏疾病、器官移植排斥反应、心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、静脉血栓形成、手术、肿瘤、弥漫性血管内凝血、感染及组织坏死等均可导致循环中D-二聚体升高。目前D-二聚体的临床应用主要包括以下几个方面：1、静脉血栓栓塞症（VTE）包括深静脉血栓形成(DVT)和肺血栓栓塞(PE)。D-二聚体水平显著升高提示可能存在静脉血栓形成。检测D-二聚体可用于VTE的诊断，同时可以用于评价抗凝治疗效果；2、在急性冠状动脉综合征、急性缺血性卒中等心脑血管疾病发生时，D-二聚体水平明显升高，提示存在血栓形成。测定D-二聚体可为心脑血管血栓提供早期诊断提供帮助，同时可以结合临床指标判断预后情况；3、肺栓塞患者D-二聚体浓度升高，对肺栓塞诊断有较高的敏感性。联合临床表现及影像学检查，D-二聚体检测对肺栓塞诊断有重要价值；4、恶性肿瘤患者发生血栓的概率较高，且D-二聚体水平常持续增高。监测D-二聚体有助于评估恶性肿瘤患者的血栓风险。5、对于进行溶栓治疗的血栓性疾病，监测D-二聚体水平的降低情况，可以评价溶栓治疗的效果。如果D-二聚体无法降低，提示溶栓治疗效果可能不佳。6、系统性红斑狼疮患者D-二聚体升高与疾病活动性和血栓风险相关。监测D-二聚体水平变化，可评价系统性红斑狼疮的病情和血栓风险。
目前D-二聚体（D-dimer）的检测包括胶乳凝集法(LATEX)、ELISA法、胶体金法、免疫荧光法和免疫比浊法等。这些方法均需要高灵敏度的单克隆抗体，而目前D-二聚体单抗在灵敏度和特异性上还存在一定的缺陷，且传统单克隆抗体价格昂贵。因此，急切需要寻求高特异性高灵敏度的廉价D-二聚体抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供高特异性高灵敏度的D-二聚体抗体。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了针对D-Dimer蛋白的重链单域抗体或其抗原结合片段，所述重链单域抗体或其抗原结合片段包含3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述单域抗体为下述任一种：
H1）由1A6和1E4组成的组合物；
H2）所述1A6；
H3）所述1E4；
所述1A6的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.1；
所述1A6的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.2；
所述1A6的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.3；
所述1E4的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.10；
所述1E4的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.11；
所述1E4的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.12。
上述重链单域抗体或其抗原结合片段，所述重链单域抗体还包含4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4；所述1A6的FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.4，所述1A6的FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.5，所述1A6的FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.6，所述1A6的FR4的氨基酸序列为SEQ ID No.7；所述1E4的FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.13，所述1E4的FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.14，所述1E4的FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.15，所述1E4的FR4的氨基酸序列为SEQ ID No.16。
上述所有FR1、FR2、FR3和FR4的序列可以替换为其保守序列变体。
上述重链单域抗体或其抗原结合片段中所述1A6的氨基酸序列是SEQ ID No.8，所述1E4的氨基酸序列是SEQ ID No.17。
上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同一性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同一性”，更优选为“至少90％同一性”，更优选为“至少95％同一性”，最优选为“至少98％同一性”。
同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。所述85%以上的同一性可为至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。所述90%以上的同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。所述95%以上的同一性可为至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
上述重链单域抗体或其抗原结合片段中所述重链抗体含有前述重链单域抗体。
所述的单域抗体为VHH，其仅包含抗体重链，不包含抗体轻链。
上述重链单域抗体或其抗原结合片段中所述重链抗体包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为下述任一种：
M1）SEQ ID No.8；
M2）SEQ ID No.17；
M3）与SEQ ID No.8或SEQ ID No.17具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上或者75%以上的同一性。
上述重链单域抗体或其抗原结合片段，所述重链抗体为单域抗体1A6的Fc融合蛋白或1E4的Fc融合蛋白。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料为如下任一种：
D1）含有前述的单域抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体的单克隆抗体；
D2）含有前述的单域抗体或其抗原结合片段的小分子抗体。
本发明还提供了遗传材料，所述遗传材料为下述任一种：
g1)核酸分子，所述核酸分子编码前述的单域抗体或其抗原结合片段、或前述的重链抗体；
g2)含有g1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
本发明还提供了针对D-Dimer蛋白的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含前述单域抗体或其抗原结合片段或前述的重链抗体。
所述检测试剂盒可为酶联免疫试剂盒。所述酶联免疫试剂盒还可包括用于固定所述重链抗体的固相载体。上述酶联免疫试剂盒中，可作为所述固相载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该固相载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。
本发明还提供了应用，所述应用为如下任一种：
M1)前述遗传材料在制备前述单域抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体中的应用；
M2)前述单域抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体在制备前述检测试剂盒中的应用；
M3)前述单域抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体或前述遗传材料在制备用于预防和/或治疗D-Dimer蛋白升高的疾病的产品中的应用；
M4)前述单域抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体或前述遗传材料在制备用于检测D-Dimer蛋白的产品中的应用。
所述D-Dimer蛋白升高的疾病包括如下：
1、静脉血栓栓塞症（VTE）：包括深静脉血栓形成(DVT)和肺血栓栓塞(PE)。
2、急性冠状动脉综合征、急性缺血性卒中等心脑3、血管疾病。
3、肺栓塞。
4、恶性肿瘤。
5、系统性红斑狼疮。
本发明还公开特异性针对D-dimer蛋白的单域抗体在D-dimer-ELISA检测试剂盒中的应用，由前述针对D-dimer蛋白的单域抗体在检测D-dimer含量的定量检测方法。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
首先，在获得高特异性的单域抗体后通过原核表达或者酵母表达便可以获得，产量和纯化效率高并且批间质量稳定；其次，与传统单克隆抗体相比，其亲和力更高，可以提升抗原捕获能力和检测效果，提高检测的灵敏度。此外，单域抗体属于单克隆抗体，其成分更加单一，批间稳定性更好，更好的控制检测试剂盒的检测标准，从而使实际的D-dimer含量检测结果可信度更高。因此，本发明获得的针对D-dimer的抗体，既能够在普通的ELISA实验中作为检测工具对各类生物制品中的D-dimer进行定性分析，也可以被开发成ELISA检测试剂盒，对待测样品中的D-dimer进行定量分析。
附图说明
图1是单域抗体1A6的Fc融合蛋白和1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白纯化的SDS-PAGE分析结果。其中从左往右第1泳道（第1列）为蛋白Markerr，该列从上到下的依次为蛋白Marker中的140 kDa、115 kDa、80 kDa、65 kDa、50 kDa、40 kDa、30 kDa、15 kDa和10 kDa的条带，从左往右第9泳道（第9列）为1A6，从左往右第10泳道（第10列）为1E4。
图2是重组抗体进行D-Dimer含量检测的线性区间。其中，纵坐标为OD450值，横坐标为D-Dimer浓度（ng/ul）。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
术语“纳米抗体”即重链单域抗体VHH(variable domain of heavy chain ofheavy-chain antibody)。VHH包含CDR1、CDR2和CDR3这三个互补决定区（CDRs）以及FR1、FR2、FR3和FR4这4个框架区（FRs）。VHH可按照如下方法制备：将VHH基因通过基因工程方法表达。
VHH可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种提供的抗体。像完整的轻重链抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。值得一提的是，本发明中，与本发明公开的CDR1-3的序列同一性高的序列，也可以得到针对D-Dimer的单域抗体。在一些实施例中，与(1)-(34)中的序列具有“至少80％同一性”的序列，或者“至少85％同一性”、“至少90％同一性”、“至少95％同一性”、“至少98％同一性”的序列都可以实现发明目的(即衍生蛋白)。
在一些实施例中，与(1)-(2)中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；(b)极性带正电残基：His、Arg、Lys；(c)芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在CDR1-3区，而框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明采用D-Dimer来免疫阿拉善双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并建立D-Dimer的单域抗体文库。在抗体筛选过程中，将D-Dimer的偶联生物素(D-Dimer-Biotin)，将中性亲和素蛋白偶联在酶标板上，利用生物素和中性亲和素结合的特性，使D-Dimer间接展示在酶标板表面，使其抗原表位得以暴露，然后利用噬菌体展示技术筛选D-Dimer免疫后的单域抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，获得了能在大肠杆菌中高效表达的单域抗体株。
将筛选获得的单域抗体在大肠杆菌中表达后通过镍离子偶联的琼脂糖进行纯化，将纯化后的单域抗体进行分析。
下述实施例采用EXCEL软件对数据进行处理，使用的二次项拟合绘制图2。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1、针对D-Dimer蛋白的单域抗体文库的构建
1、骆驼免疫
将D-Dimer抗原（欧凯生物，C1564）与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只无免疫背景羊驼，每2周免疫一次，共连续免疫4次，首次免疫剂量为500μg，其余六次免疫剂量为250μg，该免疫过程中刺激B细胞表达特异性的单域抗体。
2、骆驼血液外周血淋巴细胞的分离
免疫结束后，采集羊驼外周血，并从中提取羊驼外周血淋巴细胞100mL。
3、套式PCR扩增VHH基因片段
提取步骤2中骆驼外周血淋巴细胞中的总RNA；合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH。以合成的cDNA为模板，F1和R1进行第一轮PCR，扩增dsDNA；以回收的第一轮PCR产物为模板，以F2和R2进行第二轮PCR扩增，扩增VHH片段。
4、电转连接产物
利用限制性内切酶Pst I及Not I酶切20μg pMECS噬菌体展示载体及10μg步骤3中扩增的VHH，并连接两种片段；将连接产物转化至电转感受态细胞TG1（Agilent（安捷伦）200123）中，构建D-Dimer蛋白噬菌体展示文库并测定库容，文库库容的大小约为2×109；同时，通过菌落PCR检测所建文库中目的片段的正确插入率，随机的选取34个克隆做菌落PCR，结果显示插入率达到90%。
实施例2、针对D-Dimer蛋白单域抗体的筛选
(1)取200 μL重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40 μL辅助噬菌体VCSM13（Agilent（安捷伦）200251）侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl（称取200g PEG6000，146g NaCl，使用超纯水定容至1L，磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌20min，4℃放置备用）沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；(2)将稀释在100mM pH 8.3的NaHCO3中的中性亲和素蛋白500 μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；(3)第二天加入100μL生物素标记的D-Dimer蛋白(D-Dimer-Biotin)，室温孵育2小时，阴性对照孔加入100μL PBS；(4)2小时后，加入100μL的3％的脱脂乳，室温封闭2h；(5)封闭结束后，加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒)，室温作用1h；(6)作用1小时后，用PBS+0.05％Tween-20洗5遍，以洗掉未结合的噬菌体；(7)用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与D-Dimer蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并用前述解离后的噬菌体感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步得到富集。
实施例3、用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
(1)根据上述单域抗体筛选方法对D-Dimer蛋白进行几轮筛选，筛选结束后，针对D-Dimer蛋白的噬菌体富集因子达到10以上(约为10000)，从筛选获得的阳性克隆中挑选400个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜；(2)利用渗透涨破法获得粗提抗体；将中性亲和素蛋白稀释至100mM pH 8.3的NaHCO3中并将100μg中性亲和素蛋白在酶标板中4℃包被过夜，次日向酶标板内加入100ug D-Dimer-Biotin蛋白；(3)将上述步骤中获得的抗体粗提液取100uL转移至加入抗原的ELISA板上，室温孵育1h；(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，ThermoFisher)，在室温孵育1h；(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:20000稀释后的Anti-Rabbit HRP conjugate(山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，购自于ThermoFisher)，在室温孵育1h；(6)用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入中止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值；(7)当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；(8)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/μl氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对D-Dimer蛋白的单域抗体。其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在真核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。共计获得1A6和1E4这两种单域抗体（其中1A6和1E4为实验过程中的实际克隆编号），具体如下：
1A6的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示：包括框架区（FR:FR1、FR2、FR3、FR4）和互补决定区（CDR: CDR1、CDR2、CDR3）。所述框架区的四个部分依次记为SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7；所述互补决定区的三个部分依次记为SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3。
SEQ ID No.1：ANGLTINT
SEQ ID No.2：IARGGAAT
SEQ ID No.3：NAKRGWVGSGY
SEQ ID No.4：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAN
SEQ ID No.5：MGWYRQAPGKERELVAT
SEQ ID No.6：NYADSAKGRFTISRDNAKNTIYLQMNNLKPEDTAVYLC
SEQ ID No.7：WGQGTQVTVSS
SEQ ID No.8:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTANANGLTINTMGWYRQAPGKERELVATIARGGAATNYADSAKGRFTISRDNAKNTIYLQMNNLKPEDTAVYLCNAKRGWVGSGYWGQGTQVTVSS
SEQ ID No.9(5'-3'):
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCACCGCCAACGCCAACGGCCTGACCATCAACACCATGGGCTGGTACAGGCAGGCCCCCGGCAAGGAGAGGGAGCTGGTGGCCACCATCGCCAGGGGCGGCGCCGCCACCAACTACGCCGACAGCGCCAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACCATCTACCTGCAGATGAACAACCTGAAGCCCGAGGACACCGCCGTGTACCTGTGCAACGCCAAGAGGGGCTGGGTGGGCAGCGGCTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGC
1E4的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示：包括框架区（FR:FR1、FR2、FR3、FR4）和互补决定区（CDR: CDR1、CDR2、CDR3）。所述框架区的四个部分依次记为SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16；所述互补决定区的三个部分依次记为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12。
SEQ ID No.10：GRSFSILH
SEQ ID No.11：ITWDSNT
SEQ ID No.12：AAARIGSSWAAPDY
SEQ ID No.13：QVQLVESGGGLVQAGDSLTLSCAAS
SEQ ID No.14：MGWFRQAPGKEREFVGT
SEQ ID No.15：YYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID No.16：WGQGTQVTVSS
SEQ ID No.17：
QVQLVESGGGLVQAGDSLTLSCAASGRSFSILHMGWFRQAPGKEREFVGTITWDSNTYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAARIGSSWAAPDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID No.18(5'-3'):
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGGCCGGCGACAGCCTGACCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCAGGAGCTTCAGCATCCTGCACATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGAGAGGGAGTTCGTGGGCACCATCACCTGGGACAGCAACACCTACTACGTGGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGCCAGGATCGGCAGCAGCTGGGCCGCCCCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGC
其中，互补决定区的序列根据IMGT编号系统定义。
实施例4、构建单域抗体1A6的Fc融合蛋白和单域抗体1E4的Fc融合蛋白真核表达质粒
RJK-V4-hFC质粒（南京融捷康生物科技有限公司）：该质粒是以所述Fc序列对应的碱基替代pcDNA3.4（invitrogen，Catalog Number A14697）的第729至756位碱基，且保持其他核苷酸不变。Fc氨基酸序列来源于human Immunoglobulin heavy constant gamma 1（Uniprot数据库编号P01857-1序列的第99位至第330位，Fc碱基序列是由氨基酸序列通过密码子表反转录而来。
使用RJK-V4-hFC质粒为载体，通过基因工程的方法将核苷酸序列是SEQ ID NO. 9的DNA分子（单域抗体1A6的Fc融合蛋白的编码基因）与上述Fc碱基序列通过重组的方式融合表达，保持RJK-V4-hFC质粒的其它核苷酸不变，得到含有单域抗体1A6的Fc融合蛋白的编码基因的重组表达质粒。
使用RJK-V4-hFC质粒为载体，通过基因工程的方法将核苷酸序列是SEQ ID NO.18的DNA分子（单域抗体1A6的Fc融合蛋白的编码基因）与上述Fc碱基序列通过重组的方式融合表达，保持RJK-V4-hFC质粒的其它核苷酸不变，得到含有单域抗体1A6的Fc融合蛋白的编码基因的重组表达质粒。
实施例5、单域抗体1A6的Fc融合蛋白和1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500ml摇瓶为例)：
1、转染前3天以2.5×105个细胞/ml的传代密度进行细胞传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml(终体积)的OPM-293CD05Medium培养基（购于OPM，货号81075-001）的500ml摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106个活细胞/mL。
2、转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106个活细胞/mL。
3、用预热的OPM-293CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml(终体积)的培养基的500ml摇瓶中，得到细胞悬液。
4、用4ml Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/ml)试剂（购于polysciences，货号23966-1），回荡或吹打混匀，得到稀释的PEI试剂；用4ml Opt-MEM培养基分别稀释重组表达质粒RJK-V4-hFC-1A6和RJK-V4-hFC-1E4，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤，得到稀释的质粒DNA。室温孵育5min。
5、将稀释的PEI试剂加入稀释的质粒DNA中，颠倒混匀，室温孵育15-20分钟，得到PEI/质粒DNA复合物，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
6、将细胞在37℃、5％CO2、120rpm震荡培养。
7、转染后第24h、72h添加5ml OPM-CHO PFF05补料（购于OPM，货号F81279-001）。
8、在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集上清，得到蛋白表达上清。
实施例6、单域抗体1A6的Fc融合蛋白和1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白的纯化
1、将实施例5中获得蛋白表达上清分别用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；
2、将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；
3、将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；
4、通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；
5、用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行洗脱；
6、将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；
7、将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用。
结果如图1中第9泳道（第9列）和第10泳道（第10列）所示。即得到单域抗体1A6的Fc融合蛋白和1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白。
实施例7、真核表达的单域抗体与D-Dimer结合能力的初步检测
检测实施例6中纯化的单域抗体1A6的Fc融合蛋白或1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白分别对D-Dimer的亲和力，步骤如下；
（1）包被：使用包被液（0.1M NaHCO3）将单域抗体1A6的Fc融合蛋白或1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白分别稀释到终浓度为1ng/μl，每孔抗体的包被量为50 ng；空白对照，加入50μl 不含蛋白的0.1M NaHCO3，4℃、静置过夜。
（2）封闭：将过夜包被的ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入封闭液（现配现用，0.5‰PBST +2%牛血清蛋白（BSA），涡旋混匀5 min使其充分溶解，200 μl /孔），37℃、静置2h；
（3）孵生物素标记抗原：将上述ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入生物素标记抗原（生物素标记的D-Dimer）（使用购买的D-Dimer蛋白，通过生物素标记试剂盒进行标记获得；Dimer蛋白购于欧凯生物，货号为C1564，生物素标记试剂盒购于Thermo，货号51435），浓度为1ng/μl 50μl /孔，37℃、静置1h；
（4）孵二抗：将上述ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入SA-HRP（用0.5‰ PBST按稀释比例1：14000稀释，SA-HRP购于Thermo，货号为A18805），50μl/孔，37℃、静置30min；
（5）显色：将上述ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入50μl /孔TMB底物，室温、静置15min（此步骤在避光环境下完成，颜色愈蓝，说明反应越好）；
（6）终止：加入50μl终止液立即读数；
（7）测量OD450值，可见单域抗体1A6的Fc融合蛋白和1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白均与D-Dimer具有较强的亲和力。
结果如表2所示，本发明中发明的单域抗体和D-Dimer的结合能力较好。
注：1A6表示包被抗体是单域抗体1A6的Fc融合蛋白，1E4表示包被抗体是单域抗体1E4的Fc融合蛋白。
实施例8、D-Dimer蛋白的特异性单域抗体在D-Dimer-ELISA试剂盒中的应用(双抗夹心法)
本实施例中的相关溶液如下：
包被缓冲液：0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH9.6），溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na2CO31.59g/L和NaHCO32.93g/L。
洗涤液:下述实施例中涉及三种洗涤液，分别命名为0.1%吐温洗涤液、0.5%吐温洗涤液和1.0%吐温洗涤液。这三种洗涤液的区别仅在于吐温的含量。每1升三种洗涤液均按照如下方法配制：
0.5‰ PBST：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温20和叠氮化钠，得到0.5‰ PBST。0.5‰ PBST中，叠氮化钠的含量均为5g/L，吐温20的含量分别为0.5mL/L。
封闭液：在0.5‰ PBST中加入牛血清蛋白（BSA），得到牛血清蛋白（BSA）含量为2%的液体。
将实施例7中获得单域抗体通过双抗夹心法检测梯度稀释的D-Dimer的含量；
（1）包被：使用包被液（0.1M NaHCO3溶液）将1E4-Fc单域抗体Fc融合蛋白稀释到浓度为1ng/μl，每孔抗体的包被量为50 ng；空白对照，加入50μL不含蛋白的0.1M NaHCO3，4℃、静置过夜。
（2）封闭：将过夜包被的ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入封闭液（现配现用，0.5‰PBST +2%牛血清蛋白（BSA），涡旋混匀5 min使其充分溶解，200μl/孔），37℃、静置2h；
（3）孵抗原：将上述ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入抗原D-Dimer蛋白（分别是200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml，购于欧凯生物，货号为C1564）50μl/孔，37℃、静置1h；
（4）孵一抗：将上述ELISA板用0.5‰ PBST洗板1次，加入一抗（单域抗体1A6的Fc融合蛋白浓度为1ng/μl的液体，该液体是用0.5‰ PBST稀释单域抗体1A6的Fc融合蛋白得到的）50μl/孔，37℃、静置1h；
（5）孵二抗：将上述ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入二抗SA-HRP（辣根过氧化物酶标记链霉亲和素）（用0.5‰ PBST按稀释比例1：14000稀释），50μl/孔，37℃、静置30min；
（6）显色：将上述ELISA板用0.5‰ PBST洗板，加入50μl/孔TMB底物，室温、静置15min（此步骤在避光环境下完成，颜色愈蓝，说明反应越好）；
（7）终止：加入50μl终止液立即读数；
（8）读数：设置酶标仪于450nm 波长处读数，并保存数据，后期处理。然后基于上述结果绘制线性区间图（图2，y=8.3807x+0.0589，R2=0.9957）。
结果如下：
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (9)

1.针对D-Dimer蛋白的重链单域抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链单域抗体或其抗原结合片段包含3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述单域抗体为下述任一种：
H1）由1A6和1E4组成的组合物；
H2）所述1A6；
H3）所述1E4；
所述1A6的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.1；
所述1A6的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.2；
所述1A6的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.3；
所述1E4的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.10；
所述1E4的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.11；
所述1E4的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.12。
2.根据权利要求1所述的重链单域抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链单域抗体还包含4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4；所述1A6的FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.4，所述1A6的FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.5，所述1A6的FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.6，所述1A6的FR4的氨基酸序列为SEQ ID No.7；所述1E4的FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.13，所述1E4的FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.14，所述1E4的FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.15，所述1E4的FR4的氨基酸序列为SEQ ID No.16。
3.根据权利要求1或2所述的重链单域抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述1A6的氨基酸序列是SEQ ID No.8，所述1E4的氨基酸序列是SEQ ID No.17。
4.针对D-Dimer蛋白的重链抗体，其特征在于，所述重链抗体含有权利要求1-3中任意一项所述的重链单域抗体。
5.根据权利要求4所述的重链抗体，其特征在于，所述重链抗体包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为下述任一种：
M1）SEQ ID No.8；
M2）SEQ ID No.17。
6.生物材料，其特征在于，所述生物材料为含有权利要求1-3中任一所述的单域抗体或其抗原结合片段的小分子抗体。
7.遗传材料，其特征在于，所述遗传材料为下述任一种：
g1)核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一所述的单域抗体或其抗原结合片段、或权利要求4或5所述的重链抗体；
g2)含有g1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
8.针对D-Dimer蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1-3中任一所述的单域抗体或其抗原结合片段或权利要求4或5所述的重链抗体。
9.应用，其特征在于，所述应用为如下任一种：
M1)权利要求7所述的遗传材料在制备权利要求1-3任一所述的单域抗体或其抗原结合片段或权利要求4或5所述的重链抗体中的应用；
M2)权利要求1-3任一所述的单域抗体或其抗原结合片段或权利要求4或5所述的重链抗体在制备权利要求8所述的检测试剂盒中的应用；
M3)权利要求1-3任一所述的单域抗体或其抗原结合片段或权利要求4或5所述的重链抗体或权利要求7所述的遗传材料在制备用于检测D-Dimer蛋白的产品中的应用。
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