CN114133447B - 2019-nCoV表面蛋白受体结合区抗体制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了2019‑nCoV表面蛋白受体结合区抗体制备方法及用途。本发明提供了检测新型冠状病毒抗原的试剂盒，其为包括包被抗体和酶标抗体的酶联免疫试剂盒，所述包被抗体和酶标抗体为单克隆抗体或其抗原结合部分，包被抗体重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的第1‑120位所示，轻链可变区的氨基酸序列为序列2的第1‑106位所示；酶标抗体重链可变区的氨基酸序列为序列3的第1‑115位所示，轻链可变区的氨基酸序列为序列4的第1‑107位所示。使用该试剂盒可以特异性检测新型冠状病毒的受体结合区，灵敏度为7.82ng/mL，可应用于检测或诊断新型冠状病毒所致疾病或开发相关治疗性抗体或药物。

Description

2019-nCoV表面蛋白受体结合区抗体制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及2019-nCoV表面蛋白受体结合区抗体制备方法及用途。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV)为2019年底发现的β属冠状病毒新毒株。人体感染后常见症状为发热、咳嗽、气促和呼吸困难等；较严重病例中，可导致急性肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

目前，对于新型冠状病毒所致疾病尚无有效治疗方法。物理隔离暂时是防止病毒传播的有效方法，新冠疫苗成为公众的迫切需求。新冠疫苗抗原检测是研发过程中的重要环节。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测新型冠状病毒受体结合区(RBD)抗原。

为解决疫苗研发中的抗原检测问题，本发明首先提供了检测新型冠状病毒抗原的试剂盒。所述试剂盒包括包被抗体，所述包被抗体可为单克隆抗体或其抗原结合部分。所述单克隆抗体可为单克隆抗体A。所述单克隆抗体A或其抗原结合部分可含有名称为A-V_H的重链可变区和名称为A-V_L的轻链可变区。所述A-V_H和A-V_L均可由决定簇互补区和框架区组成。所述A-V_H和所述A-V_L的决定簇互补区均可由CDR1、CDR2和CDR3组成：

所述A-V_H的CDR1的氨基酸序列可如序列1的第31-35位；

所述A-V_H的CDR2的氨基酸序列可如序列1的第50-66位；

所述A-V_H的CDR3的氨基酸序列可如序列1的第99-109位；

所述A-V_L的CDR1的氨基酸序列可如序列2的第23-33位；

所述A-V_L的CDR2的氨基酸序列可如序列2的第49-55位；

所述A-V_L的CDR3的氨基酸序列可如序列2的第88-96位。

上文所述单克隆抗体A的重链可变区的氨基酸序列可为序列表中序列1的第1-120位所示。所述单克隆抗体A的轻链可变区的氨基酸序列可为序列表中序列2的第1-106位所示。

上文所述试剂盒可为酶联免疫试剂盒。

所述酶联免疫试剂盒还包括酶标抗体。所述酶标抗体是酶与抗体或其抗原结合部分形成的结合物。所述抗体可为单克隆抗体。所述单克隆抗体可为单克隆抗体C。所述单克隆抗体C或其抗原结合部分含有名称为C-V_H的重链可变区和名称为C-V_L的轻链可变区。所述C-V_H和C-V_L均由决定簇互补区和框架区组成。所述C-V_H和所述C-V_L的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成：

所述C-V_H的CDR1的氨基酸序列可如序列3的第31-35位；

所述C-V_H的CDR2的氨基酸序列可如序列3的第50-66位；

所述C-V_H的CDR3的氨基酸序列可如序列3的第99-104位；

所述C-V_L的CDR1的氨基酸序列可如序列4的第24-34位；

所述C-V_L的CDR2的氨基酸序列可如序列4的第50-56位；

所述C-V_L的CDR3的氨基酸序列可如序列4的第89-97位。

上文所述酶可为过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、荧光酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等。具体可为过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。

上文所述单克隆抗体C的重链可变区的氨基酸序列可为序列表中序列3的第1-115位所示，所述单克隆抗体C的轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列4的第1-107位所示。所述单克隆抗体形式可包括Fab片段、Fab’片段、(Fab’)₂片段、Fv片段、scFv和双体等。

上文所述抗原结合部分可选自Fab片段、Fab’片段、(Fab’)₂片段、Fv片段、scFv和/或双体。

所述“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

所述“Fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的部分或片段，所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域，使得在2个Fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成(Fab’)₂分子。

所述“(Fab’)₂片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。(Fab’)₂片段因而由两个Fab’片段组成，而两个Fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。

所述“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。

所述“单链Fv”或“scFv”，是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。

所述“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(VH)和与之连接的轻链可变结构域(VL)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点。

上述酶联免疫试剂盒还可包括进行酶联免疫检测所需的包被缓冲液、洗涤液、封闭液、二抗稀释液和/或RBD标准溶液。

上述酶联免疫试剂盒中，所述封闭液可含有体积百分含量为10％的小牛血清。

上述酶联免疫试剂盒中，所述二抗稀释液可含有体积百分含量为5％的小牛血清。

上述酶联免疫试剂盒还可包括用于固定所述包被抗体的固相载体。

上述酶联免疫试剂盒中，可作为所述固相载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该固相载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。

上文所述抗原可为新型冠状病毒表面蛋白受体结合区(RBD)。

上文所述抗原还可为新型冠状病毒S蛋白抗原、新型冠状病毒S1蛋白抗原等。

上述检测试剂盒可为定量检测试剂盒。所述定量检测试剂盒具体可为通过对已知不同稀释浓度的新型冠状病毒RBD抗原标准品进行检测后绘制ELISA检测值-抗原含量标准曲线，然后对所述待测新型冠状病毒RBD抗原进行定量。所述定量检测，准确的讲，即将抗原标准品不同梯度稀释，四参数拟合法绘制ELISA检测值-抗原含量标准曲线，用于待测样品中抗原进行定量检测。具体可为将RBD抗原不同浓度稀释，配制成不同浓度梯度的标准品，使用双抗夹心法测定其OD_450nm值，绘制ELISA检测值-RBD抗原标准曲线。依据标准曲线，计算待测样品中RBD抗原含量。

上文所述酶联免疫试剂盒具体可为双抗夹心ELISA试剂盒。所述双抗可为抗体A和抗体C。所述抗体可为单克隆抗体。所述单克隆抗体A在所述双抗夹心ELISA试剂盒中包被ELISA板后，封闭，洗涤，可进行抗原结合，然后加标记的所述抗体C，显色，酶标仪检测。

上文所述单克隆抗体的表达宿主细胞可为真核或原核宿主细胞。所述真核宿主细胞可为HEK293细胞、CHO细胞、酵母细胞和/或昆虫细胞。所述原核宿主细胞可为大肠杆菌、枯草杆菌等。

上文所述单克隆抗体的表达宿主细胞具体可为真核宿主细胞CHO细胞。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一种蛋白质：

M1、上文所述的单克隆抗体A或其抗原结合部分；

M2、上文所述的单克隆抗体C或其抗原结合部分；

M3、检测新型冠状病毒抗原的组合物，由所述M1和M2组成。

上文所述蛋白质还可为如下蛋白质：

m1)与上述M1或M2所述蛋白质的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性的的单克隆抗体；

m2)m1)所述单克隆抗体的融合抗体；

m3)含有m1)或m2)所述单克隆抗体的Fab、Fab'，(Fab')₂、Fv、ScFv和/或双抗；

m4)含有m1)或m2)所述单克隆抗体的完整抗体；

m5)宿主细胞系为真核宿主细胞CHO细胞的单克隆抗体。

编码上文所述的单克隆抗体A或其抗原结合部分的核酸分子和/或编码上文所述的单克隆抗体C或其抗原结合部分的核酸分子，也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)所述的DNA分子：

c1)序列表中序列5的73-432位所示的DNA分子；

和/或，序列表中序列6的73-390位所示的DNA分子；

和/或，单克隆抗体的编码DNA分子；所述单克隆抗体的重链可变区编码序列为序列如序列5的73-432位所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的序列如序列6的73-390位所示的DNA分子；

c2)序列表中序列7的73-417位所示的DNA分子；

和/或，序列表中序列8的73-393位所示的DNA分子；

和/或，单克隆抗体的编码DNA分子；所述单克隆抗体的重链可变区编码序列为序列如序列7的73-417位所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的序列如序列8的73-393位所示的DNA分子；

c3)与c1)或c2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的DNA。

术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的同一性。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了生物材料。所述生物材料可为上文所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物和/或重组动物细胞系。

下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

P1、上文任一所述的试剂盒、上文所述的单克隆抗体A或其抗原结合部分、上文所述的单克隆抗体C或其抗原结合部分在检测新型冠状病毒表面蛋白受体结合区中的应用；

P2、上文所述的蛋白质、上文所述的核酸分子和/或上文所述的生物材料在制备检测新型冠状病毒表面蛋白受体结合区产品(试剂或试剂盒)中的应用；

P3、上文所述的试剂盒、上文所述的单克隆抗体A或其抗原结合部分、上文所述的单克隆抗体C或其抗原结合部分在检测或诊断新型冠状病毒所致疾病中的应用；

P4、上文所述的蛋白质、上文所述的核酸分子和/或上文所述的生物材料在制备检测或诊断新型冠状病毒所致疾病的产品(试剂或试剂盒)中的应用；

P5、上文所述的蛋白质、上文所述的核酸分子和/或上文所述的生物材料在制备或开发新型冠状病毒所致疾病的治疗性抗体(如中和抗体)中的应用；

P6、上文所述的蛋白质、上文所述的核酸分子和/或上文所述的生物材料在制备或开发新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用。

上文中，所述新型冠状病毒所致疾病可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。所述呼吸系统感染为呼吸道感染和/或肺部感染，所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可为肺炎。所述消化系统感染可为腹泻。

上文中，新型冠状病毒所致疾病通常包括病毒性肺炎、严重急性呼吸综合征等。

本研究采用噬菌体展示技术发现新型冠状病毒表面蛋白受体结合区(RBD)五个抗体，进行HRP标记，抗体配对筛选，最终建立了一种基于RBD抗原的两个抗体(单克隆抗体A和单克隆抗体C)夹心ELISA检测试剂盒，用于疫苗研发和生产中的抗原检测。此外，发现的抗体还可作为中和抗体，用于新冠肺炎的抗体治疗。

附图说明

图1为抗体A，B，C，D和E表达质粒构建酶切鉴定图。其中，泳道编号首位字母表示抗体名称，即抗体A，B，C，D和E；泳道编号第二位字母表示酶切鉴定重链(H)和轻链(L)。重链采用BstBI和PacI双酶切鉴定；轻链采用HindIII和XhoI双酶切鉴定。

图2为抗体A，B，C，D和E纯化SDS-PAGE鉴定图。泳道编号首位字母表示抗体名称，即抗体A，B，C，D和E；泳道编号第二位字母N表示非还原SDS-PAGE鉴定，R表示还原SDS-PAGE鉴定。

图3为RBD抗原定量标准曲线。横坐标为新冠病毒RBD浓度(ng/ml)，纵坐标为ELISA检测值，采用四参数拟合线性回归绘制标准曲线。

图4为检测方法特异性验证实验结果。横坐标为SARS-COV-2RBD，SARS病毒S蛋白和MERS病毒S蛋白浓度(ng/ml)，纵坐标为ELISA检测值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

RBD-His融合蛋白抗原按照专利CN202011117036.X中所述方法制备，简要步骤如下：义翘神州SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD Gene作为模板，使用引物1和引物3(表1)进行第一轮扩增；第一轮扩增产物片段作为第二轮模板，使用引物2和引物3(表1)进行第二轮扩增获得H-RBD目标片段，将H-RBD目标片段无缝连接至pCGS3载体，构建pCGS3-H-RBD表达质粒，将pCGS3-H-RBD表达质粒瞬转Expi293F细胞，培养第4天活率下降至65％-75％时离心收样，经镍柱亲和层析，超滤浓缩置换PBS(pH 7.4)，分装入库，储存，备用。

表1pCGSS-H-RBBD表达质粒构建引物

下述实施例中的关键试剂及其厂家信息如下：

ExpiCHO-S^TM Cells：Thermo公司；

ExpiCHO^TM Expression Medium：Thermo公司；

ExpiFectamine^TM CHO Transfection Kit：Thermo公司；

pCGS3表达载体：Merck公司；

SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD Gene：北京义翘神州科技股份有限公司；

Recombinant SARS-CoV S-trimer Protein：上海近岸科技有限公司

Recombinant MERS-CoV S-trimer Protein：上海近岸科技有限公司

Protein A预装色谱柱：生工生物工程(上海)股份有限公司；

HRP偶联试剂盒(过碘酸盐法)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Centrifugal Filters

Millipore公司；

Centrifugal Filters 0.5ml 10K

Millipore公司；

PBS pH7.4(1×)：Thermo公司；

Sure PAGE^TM，Bis-Tris，10x8，4-12％，12wells：南京金斯瑞生物科技有限公司。

下述实施例中的主要仪器及其厂家信息如下：

电穿孔仪：Bio-Rad公司；

凝胶成像系统：Protein Simple公司；

酶标仪：Molecular Devices公司；

eStain^TML1蛋白染色仪：南京金斯瑞生物科技有限公司。

实施例1、全抗组装、表达、纯化和标记

本研究通过噬菌体展示技术获得单链抗体A、单链抗体B、单链抗体C、单链抗体D和单链抗体E共计五个单链抗体序列，添加IgG1-Fc组装全抗分子，名称分别为单克隆抗体A、单克隆抗体B、单克隆抗体C、单克隆抗体D和单克隆抗体E的5个单克隆抗体。其中，单克隆抗体A由重链和轻链组成，重链的氨基酸序列是序列1，序列1的第1-120位为重链可变区的氨基酸序列，序列1的第31-35位为单克隆抗体A的重链的CDR1的氨基酸序列，第50-66位为单克隆抗体A的重链的CDR2的氨基酸序列，第99-109位为单克隆抗体A的重链的CDR3的氨基酸序列，序列1的第121-224位为重链恒定区的氨基酸序列。轻链的氨基酸序列是序列2，序列2的第1-106位为轻链可变区的氨基酸序列，序列2的第23-33位为单克隆抗体A的轻链的CDR1的氨基酸序列，第49-55位为单克隆抗体A的轻链的CDR2的氨基酸序列，第88-96位为单克隆抗体A的轻链的CDR3的氨基酸序列，序列2的第107-213位为轻链恒定区的氨基酸序列。

单克隆抗体C由重链和轻链组成，重链的氨基酸序列是序列3，序列3的第1-115位为重链可变区的氨基酸序列，序列3的第31-35位为单克隆抗体C的重链的CDR1的氨基酸序列，第50-66位为单克隆抗体C的重链的CDR2的氨基酸序列，第99-104位为单克隆抗体C的重链的CDR3的氨基酸序列，序列3的第116-219位为重链恒定区的氨基酸序列。轻链的氨基酸序列是序列4，序列4的第1-107位为轻链可变区的氨基酸序列，序列4的第24-34位为单克隆抗体C的轻链的CDR1的氨基酸序列，第50-56位为单克隆抗体C的轻链的CDR2的氨基酸序列，第89-97位为单克隆抗体C的轻链的CDR3的氨基酸序列，序列4的第108-214位为轻链恒定区的氨基酸序列。

进行CHO密码子优化抗体重链和轻链，合成基因。其中，单克隆抗体A的重链基因的核苷酸序列是序列5，其中1-6位BstBI酶切位点，7-72为信号肽，73-1425重链序列，1426-1433为PacI酶切位点，其中第73-432位核苷酸序列为重链可变区的编码序列；单克隆抗体A的轻链基因的核苷酸序列是序列6，其中1-6位HindIII酶切位点，7-72为信号肽，73-714轻链序列，715-720为XhoI酶切位点，其中第73-390位核苷酸为轻链可变区的编码序列。单克隆抗体C的重链基因的核苷酸序列是序列7，其中1-6位BstBI酶切位点，7-72为信号肽，73-1410重链序列，1411-1418为PacI酶切位点，其中73-417位核苷酸序列为重链可变区的编码序列；单克隆抗体C的轻链基因的核苷酸序列是序列8，其中1-6位HindIII酶切位点，7-72为信号肽，73-717轻链序列，718-723为XhoI酶切位点，其中73-393位核苷酸序列为轻链可变区的编码序列。

五个单克隆抗体的重链基因采用BstBI和PacI双酶切，轻链基因采用HindIII和XhoI双酶切，依次连接至pCGS3表达质粒得到五个单克隆抗体重组质粒，酶切鉴定图符合预期(图1)，五个单克隆抗体重组质粒大提后进行瞬转表达。

将单克隆抗体A的重组表达质粒命名为pCGS3-RBD-A，pCGS3-RBD-A是将pCGS3的BstBI和PacI识别位点间的片段(BstBI和PacI识别位点间的小片段)替换为核苷酸序列是序列5的单克隆抗体A的重链基因，将pCGS3的HindIII和XhoI识别位点间的片段(HindIII和XhoI识别位点间的小片段)替换为核苷酸序列是序列6的单克隆抗体A的轻链基因，保持pCGS3的其它序列不变得到的重组表达载体。

将单克隆抗体C的重组表达质粒命名为pCGS3-RBD-C，pCGS3-RBD-C是将pCGS3的BstBI和PacI识别位点间的片段(BstBI和PacI识别位点间的小片段)替换为核苷酸序列是序列7的单克隆抗体C的重链基因，将pCGS3的HindIII和XhoI识别位点间的片段(HindIII和XhoI识别位点间的小片段)替换为核苷酸序列是序列8的单克隆抗体C的轻链基因，保持pCGS3的其它序列不变得到的重组表达载体。

瞬转表达：按照每mL细胞培养物转染0.8μg质粒的量及质粒原始浓度，计算转染100mL细胞所需原始质粒的体积。将五个单克隆抗体重组质粒与转染试剂(ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit)复合物缓慢滴入ExpiCHO-S细胞培养物(ExpiCHOTM Expression Medium)中培养以表达五种单克隆抗体，边加边摇晃细胞培养物，使DNA与转染试剂复合物分散均匀。按照最大滴度在转染后18～22h添加补料和增强剂，同时将培养条件37℃降至32℃、CO₂浓度由8％降至5％；转染后第5天再次添加补料。当活率降至65％～75％时终止培养得到培养物(表达单克隆抗体A的培养物、单克隆抗体B的培养物、单克隆抗体C的培养物、单克隆抗体D的培养物和单克隆抗体E的培养物)。其中，将表达单克隆抗体A的培养物命名为CHO-S/pCGS3-RBD-A培养物，将表达单克隆抗体C的培养物命名为CHO-S/pCGS3-RBD-C培养物。

纯化：将培养物于6000g离心30min，收集上清并超滤浓缩(Centrifugal Filters

)，上清和结合/洗涤缓冲液(Protein A预装色谱柱的试剂盒成分)按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育，得到超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液。五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液平衡柱子(Protein A预装色谱柱的试剂盒成分)，将超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱。用10-15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复该步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线；用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱上的重组蛋白(单克隆抗体A、单克隆抗体B、单克隆抗体C、单克隆抗体D和单克隆抗体E)，超滤浓缩(Centrifugal Filters 0.5ml10K

)置换到PBS(pH7.4)缓冲液。使用非还原和还原SDS-PAGE鉴定纯化单克隆抗体A、单克隆抗体B、单克隆抗体C、单克隆抗体D和单克隆抗体E，检测结果显示五种单克隆抗体条带符合预期，五个单克隆抗体非还原电泳有最上一条主带即全抗分子，还原条带出现两条带，自上而下依次为重链和轻链(图2)。其中，单克隆抗体A是从CHO-S/pCGS3-RBD-A培养物中纯化出来的单克隆抗体，单克隆抗体C是从CHO-S/pCGS3-RBD-C培养物中纯化出来的单克隆抗体。

HRP标记：取500μl HRP溶液于5ml离心管中，加200μl HRP活化缓冲液，室温缓慢反应30分钟。加200μl HRP偶联缓冲液，静置30分钟，溶液缓慢变回棕黄色。分别加入1mg需偶联的五种单克隆抗体目的蛋白，混匀后将液体转移到透析袋，最后将透析袋置于2L偶联透析液中，4℃透析过夜。透析液体转移到5ml离心管中，加入100μl还原剂，室温静置2小时，间隔半小时用轻轻混匀2-3次，偶联实验已完成，五种单克隆抗体目的蛋白完成HRP标记。

实施例2、双抗夹心法检测新型冠状病毒RBD抗原

筛选二抗：包被新型冠状病毒RBD抗原偶联至酶标板上，4℃过夜孵育。次日100μl0.1％BSA室温封闭，加入HRP标记的五个单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗涤3-5遍去除多余二抗，显色，终止，筛选获得单克隆抗体B和单克隆抗体C为最佳二抗。

配对实验：分别包被五个抗体偶联至酶标板上，4℃过夜孵育。次日100μl 0.1％BSA室温封闭，加入不同浓度梯度RBD抗原，37℃孵育1小时，PBST洗涤3-5遍，加入HRP标记的单克隆抗体B或单克隆抗体C，37℃孵育1小时，PBST洗涤3-5遍。显色，终止，筛选获得单克隆抗体A和抗体C为最佳配对抗体。

双抗夹心法检测：包被100μL 10μg/mL单克隆抗体A溶液(100mM Na₂CO₃、pH8.2)偶联至酶标板上，4℃过夜孵育。次日100μL 0.1％BSA室温封闭，加入100000，33333.33，11111.11，3703.7，1234.57，411.52，137.17，45.72，15.24，5.08和1.69ng/mL RBD抗原溶液(溶剂是PBS，pH7.4)100μL，37℃孵育1小时，PBST洗涤3-5遍，加入100μL 10ng/mL HRP标记的单克隆抗体C，37℃孵育1小时，PBST洗涤3-5遍。加入TMB显色，终止，用酶标仪读取各孔OD_450nm数值。标准曲线为y＝(0.052-1.883)/[1+(x/740.8)^1.191]+1.883，R²为0.999，标曲符合样品检测标准曲线要求(图3中坐标轴x为RBD的浓度，单位为ng/mL，坐标轴y为OD_450nm数值)。采用60个空白对照平均值+3SD作为检测值，代入上述公式，得RBD检测灵敏度为7.82ng/mL。

实施例3双抗夹心法检测新型冠状病毒RBD抗原的特异性

包被100μL 10μg/mL单克隆抗体A溶液(100mM Na₂CO₃、pH8.2)偶联至酶标板上，4℃过夜孵育。次日100μl 0.1％BSA室温封闭，分别加入100000，33333.33，11111.11，3703.7，1234.57，411.52，137.17，45.72，15.24，5.08和1.69ng/mLSARS-COV-2RBD抗原溶液、SARS病毒S蛋白(Recombinant SARS-CoV S-trimer Protein)和MERS病毒S蛋白(RecombinantSARS-CoV S-trimer Protein)(PBS pH7.4)100μL，37℃孵育1小时，PBST洗涤3-5遍，加入100μl 10ng/mL HRP标记的单克隆抗体C，37℃孵育1小时，PBST洗涤3-5遍。加入TMB显色，终止，用酶标仪读取各孔OD_450nm数值。实验结果显示，SARS-COV-2RBD特异性结合，SARS病毒S蛋白和MERS病毒S蛋白未出现特异结合，本研究检测方法的特异性符合预期(图4)。

综合以上各实施例的结果可见，本发明发现单克隆抗体A和单克隆抗体C一对抗体可用于新型冠状病毒表面蛋白受体结合区(RBD)的快速检测，即采用RBD抗原的双抗体夹心法检测已知不同稀释浓度RBD抗原，绘制ELISA检测值-RBD抗原标准曲线，对待检测的疫苗中间产物抗原进行定量，为新冠疫苗抗原检测研发提供方法学支持。此外，该方法也可用于检测新冠S1及S抗原、发现的单克隆抗体A和单克隆抗体C也可作为新冠肺炎治疗的中和抗体。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 河南晟明生物技术研究院有限公司

<120> 2019-nCoV表面蛋白受体结合区抗体制备方法及用途

<130> GNCSQ211051

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Thr

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Leu Asp Asn Arg Arg Pro Pro Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Val

65 70 75 80

Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Lys Asn Thr Gly Val

85 90 95

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Asn Phe Ala Met Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Pro Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Val Gly Ala Thr Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Ala Asp Trp Asn Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 5

<211> 1433

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

ttcgaagccg ccaccatggg ctggtcttgt atcatcctgt ttctggtggc cactgctacc 60

ggcgtgcact ctgaggtgca gctggtgcag agcggcgccg aggtgaagaa gcctggcgcc 120

tctgtgaagg tgagctgtaa ggtgtccgga tacacactga cagagctgag catgcattgg 180

gtgagacagg cccctggaaa gggcctggaa tggatgggag gatttgatcc agaagatggt 240

gagaccatct acgctcagaa gttccaggga agggtgacta tgaccgaaga tacatccaca 300

gatacagctt acatggagct gtctagcctg agatctgagg atacagctgt gtattactgc 360

gcaacaggag gatggtttgg cgagctgttc ctggactatt ggggacaggg aaccctggtg 420

acagtgtcaa gcgctagcac aaagggccct tctgtgttcc ctctggcccc atcttctaag 480

tctacttctg gtggcacagc cgccctgggc tgtctggtga aggattactt tcctgagcct 540

gtgacagttt cttggaattc tggcgccctg acctctggcg tgcacacttt ccctgctgtg 600

ctgcagtcct ctggcctgta tagcctgagc tctgtggtga ccgtgccttc ttcctctctt 660

ggaacacaga cttatatttg taacgtgaat cacaagccaa gtaatactaa ggtggataag 720

agggtggagc caaagtcttg tgataagaca catacctgtc ccccttgtcc tgcccctgag 780

ctgctgggag gcccatccgt gttcctgttt cctccaaagc ctaaagatac actgatgatt 840

agcagaactc cagaagtgac atgcgtggtg gtggatgtga gccacgagga tcctgaggtg 900

aagtttaatt ggtacgtgga cggagtggag gtgcataatg ccaagacaaa gcctagggag 960

gaacagtacg ccagcacata tagagtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 1020

ctgaacggca aggagtataa gtgtaaggtt agtaataagg cccttcctgc ccccattgaa 1080

aaaactatct ctaaggctaa gggccagcca agagagcctc aggtgtatac tctgccacct 1140

agtagggatg aactgactaa gaatcaggtg tctctgacct gcttggtgaa aggcttctac 1200

ccttctgata tcgctgtgga atgggaatct aacggacagc ctgagaacaa ctacaagacc 1260

acacctccag tgctggattc tgatggctct ttctttctgt atagtaagct gacagtggat 1320

aagtctaggt ggcagcaggg caacgtgttt agctgtagtg tgatgcacga ggctctgcat 1380

aaccattata cacagaagtc tctgtctctg agccctggca aatgattaat taa 1433

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

aagcttgccg ccaccatggg ttggtcttgt atcatcctgt ttctggtggc cacagccacc 60

ggcgtgcact ctaactttat gctgacccag cctccttctc tgtctgtgtc tcctggccag 120

acagcctcta tcccttgttc tggcgataag ctgggcgata agtacacaaa ctggtatcag 180

cagaagcctg gccagtctcc tgtgctggtg gtgtacctgg ataacaggag acctcctggc 240

atccctgaga gattttctgg atctaattct ggcaacacag ctacactgac tatcagcgga 300

acccagaccg tggatgaagc tgagtattac tgtcaggtgt gggataagaa caccggagtg 360

tttggaaccg gcacaaagct gaccgtgctg aggacagtgg ccgccccttc tgtgtttatc 420

tttcccccat ctgatgagca gctgaagtct ggcacagcct ctgtggtgtg tctgctgaat 480

aacttttacc ctagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg ataacgctct gcagtctgga 540

aactctcagg agtctgtgac cgagcaggat tctaaggata gcacctatag cctgagctct 600

acactgacac tgtctaaagc tgattacgag aagcacaagg tgtacgcctg tgaggtgaca 660

caccagggac tgagctctcc tgtgaccaag tcttttaata gaggagagtg ttgactcgag 720

<210> 7

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

ttcgaagccg ccaccatggg ctggtcttgt atcatcctgt ttctggtggc caccgccact 60

ggagtgcact ctcaggtgca gctggtgcag tctggccctg aggtgaagaa gcctggaaca 120

tccgtgaagg tgtcctgtaa gacctctggc tttaacttcg ctatgagcgg catgcactgg 180

gtgagacagg ctagaggcca gagacctgaa tggattggct ggatcgtggg tgctacaggc 240

agcgctaatt acgctcagaa gttccagggc agagtgacac tgaccagaga tatgagcacc 300

tctacagcct acatggagct gtctagtctg agatctgatg acacagctgt gtactattgt 360

ggtgccgatt ggaacatgga tgtgtggggc cagggcaccc tggtgacagt gtctagcgcc 420

agcacaaagg gacccagcgt gttccctctc gctcctagct ctaagtctac ctctggaggc 480

accgccgctc tgggatgcct ggtgaaggat tacttccctg agcctgtgac agtgagctgg 540

aactctggag ctctgaccag cggcgtgcat acctttcctg ccgtgctgca gagcagcgga 600

ctgtactctc tgagctctgt ggtgaccgtg ccttctagca gtctgggcac ccagacttac 660

atttgtaacg tgaaccacaa gccttctaac accaaggtgg ataagagagt ggagcctaag 720

tcttgtgaca agacacatac ttgccctccc tgtcctgctc ctgaactgct gggaggccct 780

tctgtgtttc tgtttcctcc taaacctaaa gacacactga tgatcagcag aacacctgag 840

gtgacatgtg tggtggtgga tgtgtcccat gaggacccag aggtgaagtt taactggtat 900

gtggatggag tggaagtgca taatgccaag actaagccaa gagaagaaca gtacgcctct 960

acttatagag ttgtgagcgt gctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa tggaaaggag 1020

tataagtgca aagtgtctaa taaggccctg cctgcaccta tcgagaaaac aatttctaag 1080

gcaaagggcc agcctagaga gcctcaggtg tacacactgc ctcctagtag agatgagctg 1140

acaaagaatc aggtgagtct gacctgtctg gtgaagggct tctatccttc tgatattgct 1200

gtggagtggg agtctaacgg ccagcctgaa aataattaca agaccacacc acctgtgctg 1260

gattctgatg gctctttctt tctgtatagt aagctgactg tggataagtc tagatggcag 1320

cagggaaatg tgttttcttg tagcgtgatg catgaggctc tgcataatca ctacacccag 1380

aagtctctgt ctctgtctcc tggcaagtga ttaattaa 1418

<210> 8

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

aagcttgccg ccaccatggg atggtcttgt atcatcctgt tcctggtggc caccgctacc 60

ggcgtgcact ctgatatcgt gatgacccag tctccttctt ctgtgtctgc tagcatcggc 120

gatagagtga caatcgcctg tagagcctct caggatatca gatactacct gggctggtac 180

cagcagaagc ctggcaaggc ccctaagctg ctgatctacg gcacctctaa cctggagagc 240

ggcgtgcctt ctaggttcag aggctctggc tctggaaccg agttcaccct gaccatcagc 300

tctctgcagc ctgaggattt cgccacctac tactgtcagc aggccgatag cttccctctg 360

acattcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagagaaccg tggccgcccc ttctgtgttc 420

atcttccctc cttctgatga gcagctgaag tctggaacag cctctgtggt gtgtctgctg 480

aacaacttct accctagaga ggccaaggtg cagtggaagg tggataacgc cctgcagtct 540

ggaaactctc aggagtctgt gaccgagcag gattctaagg atagcaccta ctctctgtct 600

agcaccctga ccctgtctaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 660

acccaccagg gcctgagcag ccctgtgacc aagtctttca acagaggcga gtgttgactc 720

gag 723

Claims (11)

1.检测新型冠状病毒抗原的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被抗体，所述包被抗体为单克隆抗体A，所述单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述单克隆抗体A的轻链的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述酶联免疫试剂盒还包括酶标抗体，所述酶标抗体是酶与单克隆抗体C形成的结合物，所述单克隆抗体C的重链的氨基酸序列如序列表中序列3所示，所述单克隆抗体C的轻链的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

4.权利要求1中所述的单克隆抗体A。

5.权利要求3中所述的单克隆抗体C。

6.一种检测新型冠状病毒抗原的组合物，其特征在于：所述组合物由权利要求4所述的单克隆抗体A和权利要求5所述的单克隆抗体C组成。

7.编码权利要求1中所述的单克隆抗体A的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码单克隆抗体A的DNA分子，所述单克隆抗体A的重链基因为序列5所示的DNA分子，所述单克隆抗体A的轻链基因为序列6所示的DNA分子。

8.编码权利要求3中所述的单克隆抗体C的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码单克隆抗体C的DNA分子，所述单克隆抗体C的重链基因为序列7所示的DNA分子，所述单克隆抗体C的轻链基因为序列8所示的DNA分子。

9.生物材料，其特征在于：所述生物材料为含有权利要求7或8所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物和/或重组动物细胞系。

10.权利要求4所述的单克隆抗体A、权利要求5所述的单克隆抗体C、权利要求6所述的组合物、权利要求7或8所述的核酸分子和/或权利要求9所述的生物材料在制备检测新型冠状病毒表面蛋白受体结合区产品中的应用。

11.权利要求4所述的单克隆抗体A、权利要求5所述的单克隆抗体C、权利要求6所述的组合物、权利要求7或8所述的核酸分子和/或权利要求9所述的生物材料在制备检测或诊断新型冠状病毒所致疾病的产品中的应用。

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