CN115960237A - Oxa-48酶单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及OXA‑48酶单克隆抗体及应用。本发明提供的OXA‑48酶结合分子特异性好、生物活性高、稳定性强、批间差小，不受细胞株退化影响，与OXA‑48酶亲和力高，效价达到了1:1280000以上，能够用于OXA‑48酶检测或者纯化产品的制备。

Description

OXA-48酶单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及OXA-48酶单克隆抗体及应用。

背景技术

1993年，PATON等报道的第一个具有碳青霉烯酶活性的β-内酰胺酶，纯化于1985年分离于苏格兰爱丁堡病人的多重耐药鲍曼不动杆菌，命名为ARI21。直到2000年，DONALD等对ARI21酶的氨基酸进行序列分析，将其命名为OXA223。2000～2004年之间，在世界各地又发现了6种新的D类碳青霉烯酶。随后又在许多国家碳青霉烯类耐药菌株中发现了7种D类酶。迄今为止，在121种OXA型酶种，至少有45种具有碳青霉烯酶活性。

通常，D类碳青霉烯酶表现出弱碳青霉烯水解活性，产该类酶的分离菌对碳青霉烯类的耐药，可能是同时伴有其他耐药机制的结果，如外膜孔蛋白丢失、泵出作用增强、青霉素结合蛋白(PBP)改变等。成熟D类碳青霉烯酶含有243～260个氨基酸残基，分子量为23～35.5kDa不等，pI为5.1～>9.0。该类酶对亚胺培南的水解速率是青霉素的1％～3％，对苯唑西林的水解速率是青霉素的2倍，对三代头孢菌素的水解活性很弱；其活性可被他唑巴坦和克拉维酸所抑制。对携带编码D类碳青霉烯酶重组质粒的大肠埃希菌转化结合子或转化株的体外抗生素敏感性研究发现，它们对氨基青霉素和羧基青霉素高水平耐药，对脲酰基青霉素的敏感性不定(仅OXA240和OXA248对哌拉西林耐药)；对头孢菌素类，包括窄谱头孢菌素、氧亚氨基头孢菌素和72α2甲氧基头孢菌素、氧头孢烯类以及单酰胺类均敏感(仅OXA248对头孢噻吩耐药)。除了OXA223显示哌拉西林在他唑巴坦存在下其MIC值降低8倍以外，其他对克拉维酸和他唑巴坦的抑制作用不敏感。

OXA-48在碳青霉烯类耐药中，显示出了日趋重要的碳青霉烯酶的活性，其在世界各地肠杆菌科的报道逐年增多。OXA-48于2001年首次发现于土耳其的肺炎克雷伯菌中，该菌株几乎对所有β-内酰胺类药物耐药，包括青霉素类、头孢菌素类、单环内酰胺类和碳青霉烯类。对该肺炎克雷伯菌的进一步分析得知，其合并表达SHV-2a、TEM-1和OXA-47，并且有细胞外膜蛋白的缺失，导致了它对各种抗生素的高度耐药。随后几年里，OXA-48菌株在土耳其各地区相继出现过暴发或流行。除土耳其外，OXA-48在比利时、黎巴嫩、突尼斯、德国、摩洛哥、法国等国家均有报道。迄今为止，OXA-48仅在肠杆菌中有报道，包括肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、雷氏普罗威登斯菌等。在世界各地呈现出散发或暴发的趋势。D类酶中的OXA-48对青霉素类水解能力很强，对碳青霉烯类药物活性较弱，不能被克拉维酸和他唑巴坦等抑制剂抑制，对超广谱头孢菌素类药物敏感。目前已报道的OXA-48酶包括OXA-48、OXA-162、OXA-181、OXA-204、OXA-232、OXA-244、OXA-245、OXA-247、OXA-436、OXA-484和OXA-519，产OXA-48酶肠杆菌科在不同生态系统中的快速传播给临床带来巨大挑战。

产OXA-48酶的菌株对亚胺培南和美罗培南的易感性下降，其MIC在敏感范围内，但对厄他培南中度敏感或耐药。因此厄他培南对携带OXA-48肠杆菌科菌株的检测灵敏度更高，可作为OXA-48检测较好的指示物。改良Hodge实验是美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的OXA-48酶表型检测方法。菌株对三代、四代头孢菌素耐药，厄他培南MIC≥2μg/ml，亚胺培南、美罗培南MIC 2～4μg/ml时，应进行改良Hodge实验。当亚胺培南抑菌圈内出现待检菌呈增强性生长者为阳性，但近来这种改良Hodge实验的假阳性报道也日益增多。聚合酶链反应(PCR)技术是检测菌株是否携带blaOXA-48基因的金标准，在传统基础上，多种新型的分子生物学技术如实时荧光定量PCR、基因芯片、环介导等温扩增等被开发出来，应用领域逐渐扩大。与传统PCR相比，这些方法在OXA-48酶检测方面基本具有较高的敏感性和特异性，同时在检测数量、检测时间方面更有优势，但操作难度较高，步骤繁琐，部分试验对操作人员有专业要求，多由专业平台或实验室进行，试验用具、设备等硬件要求高，部分试验要求操作人员进行专业课程的学习，单个检测成本较高。

由于抗生素滥用的现象日趋严重，OXA-48的出现应引起关注，建立一种快速、准确、易于标准化的检测OXA-48细菌的方法值得关注，从而加强对OXA-48细菌的监测，揭示其流行特征，采取正确有效的管理措施，控制感染及感染的传播流行。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤细胞制备，基于细胞融合技术，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，培养成细胞群后，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。特异性抗体检测的目的首先是协助临床诊断，在某些疾病中亦是观察疗效及预后的一个指标，耐药性以及传染病流行病学调查中，特异性抗体的检测也具有特殊的、重要的意义。抗体免疫学检测具有以下优点：特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，可操作性增加，容易推广和便于普查；影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。

现有的OXA-48检测方法特异性差、耗时长，延误患者的诊断和治疗。CN112500489A公开了一种抗OXA-23酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用；CN114317454A公开了一种鼠抗OXA-48酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用；上述单克隆抗体均具有纯度效价高、特异性强的特点，适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断OXA-23、OXA-48酶。但是上述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，并且都是采用动物免疫直接获得的单克隆抗体。尽管鼠源单克隆抗体属于使用最广泛的抗体，但仍然存在亲和力弱、特异性差的问题，

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种OXA-48酶结合分子，该结合分子能够特异性结合OXA-48酶不同亚型，将其用于OXA-48酶检测诊断中，能够进一步提高检测的灵敏度和特异性。

本发明的另一个目的在于，提供一种含有OXA-48酶特异性结合分子的试剂盒，以期用于OXA-48酶检测。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供OXA-48酶结合分子，包括与OXA-48酶特异性结合的模块a或模块b；

所述模块a包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1(DYSMT)所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2(LIKRNAYGGTTEYAASVRG)所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQ ID No.3(GYSGYDWEGLDAFDV)所示氨基酸序列的第一CDR-H3；

所述模块b包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4(GYWMH)所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5(YINSDGSSTNYADSVKG)所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQ ID No.6(GGGYSYGPFD)所示氨基酸序列的第二CDR-H3。

在可选的实施方式中，所述第一VH结构域具有SEQ ID No.13(EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFTFADYSMTWVRQPPGKGLEWVGLIKRNAYGGTTEYAASVRGRFTISRDNSQSIAYLQMNTLRTEDTPAYYCLRGYSGYDWEGLDAFDVWGQGTMVTVSS)所示氨基酸序列；所述第二VH结构域具有SEQ IDNo.14(EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHWVRQAPEKGLVWVAYINSDGSSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLRAEDTAMYYCARGGGYSYGPFDYWGQGTSVTVSS)所示氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述模块a还包括第一VL结构域，所述第一VL结构域包括具有SEQ ID No.7(KSGQSVLFTSNNKNYLA)所示氨基酸序列的第一CDR-L1，具有SEQ ID No.8(WASTRES)所示氨基酸序列的第一CDR-L2和具有SEQ ID No.9(QQYYSPGPFT)所示氨基酸序列的第一CDR-L3；

所述模块b还包括第二VL结构域，所述第二VL结构域包括具有SEQ ID No.10(TGTSSDIGNNDYVS)所示氨基酸序列的第二CDR-L1，具有SEQ ID No.11(DVSRRPS)所示氨基酸序列的第二CDR-L2和具有SEQ ID No.12(SSYAGSSNLV)所示氨基酸序列的第二CDR-L3。

在可选的实施方式中，所述第一VL结构域具有SEQ ID No.15(DIVMSQSPSSLAVSLGEKVTINCKSGQSVLFTSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLAISSVQAEDVAVYYCQQYYSPGPFTFGQGTKVEIK)所示氨基酸序列；所述第二VL结构域具有SEQ ID No.16(QSVLTQPSSASTSPGSSVKLSCTGTSSDIGNNDYVSWYQQYMGRPPTNIIYDVSRRPSGVSDRFSGSIDRSSNTAFLTVNNVQADDEADYYCSSYAGSSNLVFGGGTKLTV)所示氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述OXA-48酶结合分子选自与OXA-48酶特异性结合的scFv分子、Fv分子、Fab分子或完整抗体分子。

所述完整抗体分子包括单克隆抗体或克隆抗体。

在可选的实施方式中，所述单克隆抗体包括以下(A)或(B)：

(A)具有前述实施方式所述的第一VH结构域和前述实施方式所述的第一VL结构域；

(B)具有前述实施方式所述的第二VH结构域和前述实施方式所述的第二VL结构域。

第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的OXA-48酶结合分子在制备OXA-48酶抗原检测产品中的应用，或者在非以疾病诊断或治疗为目的的OXA-48酶抗原体外检测中的应用；

所述检测的方法包括双抗夹心间接ELISA法或免疫层析法。

在可选的实施方式中，所述免疫层析法中的标记物选自胶体金、胶体银、胶体碳、磁微球、荧光微球、彩色微球或量子点；优选为胶体金。

第三方面，本发明提供了用于检测OXA-48酶的试剂盒，所述试剂盒中含有前述实施方式所述的OXA-48酶结合分子。

在可选的实施方式中，所述试剂盒中包括免疫层析检测卡，所述免疫层析检测卡中包含前述实施方式任一项所述的OXA-48酶结合分子和标记物。

优选的，所述标记物选自胶体金、胶体银、胶体碳、磁微球、荧光微球、彩色微球或量子点；进一步优选为胶体金。

本发明利用蛋白质组学，通过抗原特异性，提供了OXA-48酶结合分子，尤其是含有所述OXA-48酶结合分子的单克隆抗体具有抗原识别位点多、特异性好、亲和力高等特点，在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断OXA-48酶，其效价达到了1:1280000以上。进一步地，使用所述单克隆抗体制备得到的体外检测试剂盒能够用于耐药菌株的早期分型，并指导临床用药，辅助临床感染控制和治疗。

本发明应用抗OXA-48酶的单克隆抗体建立胶体金免疫层析检测体系，采用该方法可以在15分钟内从培养的菌株中获得结果，灵敏度和特异性均较高，操作简单快捷，无需任何仪器设备，无需专业人员操作，便于临床推广，可以快速、便捷、准确的对OXA-48酶进行检测。原料来自稳定表达的细胞株，不存在原料供应的风险且性能稳定、成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例6得到两组单克隆抗体电泳结果；

图2为本发明实施例7得到的两组单克隆抗体效价测定结果；

图3为本发明实施例9中第一单克隆抗体交叉反应实验结果；

图4为本发明实施例9中第二单克隆抗体交叉反应实验结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在某次具体实施方式中，第一方面，本发明提供了特异性结合OXA-48酶的模块(a1)，所述模块(a1)包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第一CDR-H3。

在另一次具体实施方式中，本发明提供了特异性结合OXA-48酶的模块(a2)，所述模块(a2)包括第一VH结构域和的第一VL结构域。所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQID No.3所示氨基酸序列的第一CDR-H3。所述第一VL结构域包括具有SEQ ID No.7所示氨基酸序列的第一CDR-L1，具有SEQ ID No.8所示氨基酸序列的第一CDR-L2和具有SEQ ID No.9所示氨基酸序列的第一CDR-L3。

在另一次具体实施方式中，本发明提供了特异性结合OXA-48酶的模块(b1)，所述模块(b1)包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQ ID No.6所示氨基酸序列的第二CDR-H3。

在另一次具体实施方式中，本发明提供了特异性结合OXA-48酶的模块(b2)，所述模块(b2)包括第二VH结构域和的第二VL结构域。所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQID No.6所示氨基酸序列的第二CDR-H3。所述第二VL结构域包括具有SEQ ID No.10所示氨基酸序列的第二CDR-L1，具有SEQ ID No.11所示氨基酸序列的第二CDR-L2和具有SEQ IDNo.12所示氨基酸序列的第二CDR-L3。

结合第一方面所述的各个模块中含有CDR的氨基酸序列，第二方面，在一次具体的实施方式中，本发明提供了如下各模块：

模块(a11)包括第一VH结构域，所述第一VH结构域具有SEQ ID No.13所示氨基酸序列。

模块(a12)包括第一VH结构域和第一VL结构域，所述第一VH结构域具有SEQ IDNo.13所示氨基酸序列，所述第一VL结构域具有SEQ ID No.15所示氨基酸序列。

模块(b11)包括第二VH结构域，所述第二VH结构域具有SEQ ID No.14所示氨基酸序列。

模块(b21)包括第二VH结构域和第二VL结构域，所述第二VH结构域具有SEQ IDNo.14所示氨基酸序列，所述第二VL结构域具有SEQ ID No.16所示氨基酸序列。

结合第二方面提供的各模块，第三方面，本发明提供了第一scFV分子和第二scFV分子，所述第一scFV分子包括由弹性连接肽(Linker)连接的第一VH结构域和第一VL结构域；所述第二scFV分子包括由弹性连接肽(Linker)连接的第二VH结构域和第二VL结构域。对于所述Linker的氨基酸残基组成和长度本领域技术人员能够根据实际需求，通过常规手段调整获得，包括但不限于由长度为15～25个氨基酸残基的甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)构成。

第四方面，本发明提供了第一Fv分子和第二Fv分子，所述第一Fv分子包括由短肽连接的第一VH结构域和第一VL结构域；所述第二Fv分子包括由短肽连接的第二VH结构域和第二VL结构域。所述短肽本领域技术人员能够根据实际需求，通过常规手段调整获得，包括但不限于由3～9个氨基酸残基组成的短肽链。

第五方面，本发明提供了第一Fab分子和第二Fab分子，所述第一Fab分子包括第一VH结构域、第一VL结构域、轻链恒定区(CL)和一个重链恒定区(CH1)；所述第二Fab分子包括第二VH结构域、第二VL结构域、轻链恒定区(CL)和一个重链恒定区(CH1)。对于CH1和CL，本领域技术人员能够根据实际需求进行选择，例如所述CH1选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种或几种，所述CL选自κ链或λ链，此外，本领域技术人员还可以实际需求，通过常规手段对上述选用的CH1和CL的序列及修饰进行调整。

第六方面，本发明还提供了基于前述实施方式的完整抗体分子，所述完整抗体分子包括2条相同的重链和2条相同的轻链，所述重链包括第一VH结构域或第二VH结构域，和重链恒定区，所述轻链包括与重链对应的第一VL结构域或第二VL结构域，和轻链恒定区；对于重链恒定区和轻链恒定区的具体序列组成，本领域技术人员能够根据实际需求进行选择，例如所述重链恒定区可以选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种或几种，所述轻链恒定区可以选自κ链或λ链，此外，本领域技术人员还可以实际需求，通过常规手段对上述选用的重链恒定区和轻链恒定区的序列或者修饰进行调整。

需要说明的是，上述提供的各模块、scFV分子、Fv分子、Fab分子和完整抗体分子可以通过人工合成获得，完整抗体分子还可以通过构建杂交瘤细胞，表达分泌获得。

第七方面，本发明提供第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体具有前述实施方式所述的第一VH结构域和前述实施方式所述的第一VL结构域。

第八方面，本发明提供第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体具有前述实施方式所述的第二VH结构域和前述实施方式所述的第二VL结构域。

第九方面，本发明提供了用于检测OXA-48酶的试剂盒，所述试剂盒中含有前述实施方式所述的OXA-48酶结合分子或前述实施方式所述的单克隆抗体。

在一些可选的实施方式中，上述试剂盒包括免疫层析检测卡，在样品结合垫上包埋标记物标记的抗OXA-48酶的第一或第二单克隆抗体，在检测线(T)包被抗OXA-48酶的第二或第一单克隆抗体。若检测样本为阳性，其中的OXA-48酶与标记物标记的第一或第二单克隆抗体结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线(T)时被预包被的OXA-48酶第二或第一单克隆抗体捕获，形成免疫复合物，出现可检测的信号值；若检测样本为阴性，不会形成免疫复合物，在检测线处不会出现可检测的信号值。标记物例如可以为但不限于为胶体金、胶体银、胶体碳、磁微球、荧光微球、彩色微球或量子点。优选第一单克隆抗体包埋于样品结合垫，第二单克隆抗体包被于检测线。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1：抗原的制备

本发明通过NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)序列比对，获得OXA-48酶(OXA-48-162～163、OXA-48-181、OXA-48-204、OXA-48-232、OXA-48-247、OXA-48-244～245)的保守序列。采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pET-28a(+)-PM，采用CaCl₂热激法将重组载体转化到大肠杆菌DH5a感受态中。利用含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行PCR鉴定，确定目标基因存在。将提取的表达质粒pET-28a(+)-PMAA转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，在选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/mL氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1mL过夜培养物接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，震荡培养至对数期(OD600在0.5～0.6)，加入IPTG(1mmol/L),16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，通过原核基因表达得到高纯度蛋白。

实施例2：动物免疫

挑选适龄、重量在1.5公斤左右的新西兰大耳白兔，在标准动物房饲养3天，如无异常情况则开始进行免疫：将100μg OXA-48酶抗原加入到0.5mL高压灭菌的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀，加入0.5mL弗氏完全佐剂，用注射器相互推拉进行充分混合乳化，对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫；两周后进行加强免疫，此后每隔一周加强免疫一次，共免疫六次，并且从第三次免疫开始，免疫一周后取大耳白兔耳缘静脉血200～500μL，测定效价和亲和性；在最后一次免疫后，取脾脏进行细胞融合，用于制备杂交瘤细胞。

实施例3：杂交瘤细胞的制备和筛选

对制备的兔抗血清进行效价检测，合格的情况下使用兔脾脏进行细胞融合，制备单克隆杂交瘤细胞株，方法如下：将免疫完成的新西兰大耳兔处死，无菌条件下取出脾脏，用细胞培养液清洗1次后研碎，过不锈钢筛网，将得到的细胞离心并用细胞培养液清洗2次；取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合，用不含胎牛血清的细胞培养液清洗一次后离心、弃上清，加入聚乙二醇溶液，37℃恒温处理90s左右；用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20％胎牛血清的HAT选择培养液重悬细胞，将细胞加入到96孔板中，37℃、5.0％CO₂中培养；将96孔板内生长状态良好的细胞用细胞培养液稀释至1～3个细胞/mL，加入到96孔板内，放入细胞培养箱中在37℃、5.0％CO₂条件下培养，每个细胞株进行编号，选取培养液上清呈阳性的细胞株进行扩大培养，最终得到杂交瘤细胞株。对获得的杂交瘤细胞采用ELISA法进行筛选，融合后第5天观察细胞的生长情况，第10～14天采用间接ELISA法检测细胞培养上清的效价，将效价最强的阳性杂交瘤细胞扩大培养至细胞阳性率达100％，定株得到杂交瘤细胞株，冻存于液氮中备用。

实施例4：利用RT-PCR从杂交瘤细胞中分离抗体可变区基因

将杂交瘤细胞匀浆化后，加入细胞裂解液进行RNA提取，用异丙醇从水相层中沉淀出RNA，离心后洗涤沉淀RNA，去除杂质，重悬后进行反转录，得到cDNA；利用新西兰大耳兔的特异性引物进行PCR，以杂交瘤细胞cDNA为模板，扩增抗体的重、轻链可变区基因，50μL体系中含有5μL cDNA、HotStarTaq Plus酶、dNTPs和0.5μM特异性引物，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段，送样测序，测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对，得到两组抗体可变区基因片段，第一单克隆抗体具有第一VH结构域(氨基酸序列如SEQ ID No.13所示)和第一VL结构域(氨基酸序列如SEQ ID No.14所示)，第二单克隆抗体具有第二VH结构域(氨基酸序列如SEQ ID No.15所示)和第二VL结构域(氨基酸序列如SEQ ID No.16所示)。

实施例5：单克隆抗体的构建、表达和纯化

利用同源重组引物分别在两组抗体重链可变区基因的两端和轻链可变区基因的两端加入同源重组臂和信号肽核酸片段，其中重链可变区对应的信号肽的氨基酸序列SEQID No.17所示(MDWTWRFLFVVAAATGVQS)，轻链可变区对应的信号肽的氨基酸序列SEQ IDNo.18所示(MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC)。最终得到的编码第一单克隆抗体重链可变区(含信号肽)的核苷酸片段如SEQ ID No.19所示，编码第一单克隆抗体轻链可变区(含信号肽)的核苷酸片段如SEQ ID No.20所示，编码第二单克隆抗体重链可变区(含信号肽)的核苷酸片段如SEQ ID No.21所示，编码第二单克隆抗体轻链可变区(含信号肽)的核苷酸片段如SEQID No.22所示。

而后使用双酶将含有兔抗体重、轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化，产生同源重组臂；将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的表达载体，将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增质粒。

分别将得到的两组单克隆抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入DNA 4倍质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中；孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyleTM293表达培养基，使用AKTA蛋白纯化系统，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化表达的抗体上清，得到抗IMP酶的单克隆抗体，具体步骤为：(1)将表达的抗体上清以2500×g室温离心10min，去除沉淀物；(2)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；(3)将表达上清以5mL/min的流速通过纯化柱；(4)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(BindingBuffer)充分洗涤纯化柱；(5)用0.1M pH＝3.0-3.5的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1M pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；(6)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆抗体，用PBS作为抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。

实施例6：分子量测定

用SDS-PAGE电泳鉴定单克隆抗体的分子量，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量标准系列作为参照，首先在90V电压下电泳20min，再在140V电压下电泳直到指示剂全部跑出，取下凝胶，用考马斯亮蓝染色，染色后凝胶分析生物原料的分子量，SDS-PAGE电泳图如图1所示，由左至右泳道依次为Marker、第一单克隆抗体和第二单克隆抗体。

实施例7：效价测定

采用ELISA方法检测单克隆抗体对OXA-48酶的亲和活性(效价)，主要步骤如下：(1)将OXA-48酶抗原用PBS稀释成1ng/μL，以每孔100μL加入到96孔酶标板中，37℃包被2h；(2)弃上清，用0.01M的PBST洗板3次，用PBST配制含3％BSA的封闭液，每孔加入100μL，37℃封闭2h；(3)弃上清，用PBST清洗5次，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从1:1000倍比稀释至1:2560000，加入各孔，每孔加入100μL，37℃温育1h；(4)弃抗体稀释液，用PBST清洗6遍，用1:5000封闭液稀释羊抗兔IgG-HRP，每孔加入100μL，37℃温育1h；(5)弃二抗稀释液，用PBST清洗6遍，加入TMB，100μL/孔，避光37℃放置15min；(6)每孔加入50μL 1M稀硫酸终止反应，在450nm处测定吸光度。结果如图2所示，筛选的两组单克隆抗体(其中1#和2#分别对应第一单克隆抗体和第二单克隆抗体)对OXA-48酶具有较强的结合能力，对OXA-48酶抗原的效价达到1:1280000(OD值＞0.5)。

实施例8：与现有单克隆抗体的对比

采用ELISA方法分别用本发明实施例5制备的单克隆抗体、天然抗体(兔血清)和已公布的鼠源抗OXA-48酶单克隆抗体(采购于珠海博美生物科技有限公司)检测对OXA-48酶的亲和活性(效价)，具体步骤如实施例7。结果如表1所示，表明本发明提供的单克隆抗体较现有技术亲和力增加，生物活性增强。

表1本发明得到的单克隆抗体与现有单克隆抗体的效价对比

实施例9：交叉反应

分别用KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48酶包被酶标板，每孔包被量为50ng；分别将实施例5制备得到的两组单克隆抗体稀释至10ng/mL，加入到各酶标板中，每孔加入100μL，37℃孵育1h；洗涤后加入HRP标记羊抗兔二抗，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h；洗涤后加入TMB，37℃孵育15min，终止读数。结果如图3和4所示，图3为第一单克隆抗体的交叉反应结果，图4为第二单克隆抗体的交叉反应结果，由如3和4可以看出本发明提供的两组单克隆抗体不与其他型碳青霉烯酶产生交叉反应，特异性强。

实施例10：抗体配对验证

将实施例5制备的第一单克隆抗体作为捕获抗体，第二单克隆抗体作为标记抗体(HRP酶标记)，同时捕获抗体也进行HRP酶标记，作为对照组，将捕获抗体包被在抗原板上，先加入倍比稀释的抗原，孵育后洗去未结合的抗原，再加入标记抗体孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。如果可以显色，说明标记抗体与抗原特异性结合，该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色，说明标记抗体不能与抗原结合，从而被洗脱，该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体，结果如下所示，表明这两种抗体的配对结合抗原的能力最好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.OXA-48酶结合分子，其特征在于，包括与OXA-48酶特异性结合的模块a或模块b；

所述模块a包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第一CDR-H3；

所述模块b包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQ ID No.6所示氨基酸序列的第二CDR-H3。

2.根据权利要求1所述的OXA-48酶结合分子，其特征在于，所述第一VH结构域具有SEQID No.13所示氨基酸序列；

所述第二VH结构域具有SEQ ID No.14所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的OXA-48酶结合分子，其特征在于，所述模块a还包括第一VL结构域，所述第一VL结构域包括具有SEQ ID No.7所示氨基酸序列的第一CDR-L1，具有SEQ IDNo.8所示氨基酸序列的第一CDR-L2和具有SEQ ID No.9所示氨基酸序列的第一CDR-L3；

所述模块b还包括第二VL结构域，所述第二VL结构域包括具有SEQ ID No.10所示氨基酸序列的第二CDR-L1，具有SEQ ID No.11所示氨基酸序列的第二CDR-L2和具有SEQ IDNo.12所示氨基酸序列的第二CDR-L3。

4.根据权利要求3所述的OXA-48酶结合分子，其特征在于，所述第一VL结构域具有SEQID No.15所示氨基酸序列；

所述第二VL结构域具有SEQ ID No.16所示氨基酸序列。

5.根据权利要求1～4任一项所述的OXA-48酶结合分子，其特征在于，所述OXA-48酶结合分子选自与OXA-48酶特异性结合的scFv分子、Fv分子、Fab分子或完整抗体分子；

所述完整抗体分子包括单克隆抗体或克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的OXA-48酶结合分子，其特征在于，所述单克隆抗体包括以下(A)或(B)：

(A)具有权利要求2所述的第一VH结构域和权利要求4所述的第一VL结构域；

(B)具有权利要求2所述的第二VH结构域和权利要求4所述的第二VL结构域。

7.权利要求1～6任一项所述的OXA-48酶结合分子在制备OXA-48酶抗原检测产品中的应用，或者在非以疾病诊断或治疗为目的的OXA-48酶抗原体外检测中的应用；

所述检测的方法包括双抗夹心间接ELISA法或免疫层析法。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫层析法中的标记物选自胶体金、胶体银、胶体碳、磁微球、荧光微球、彩色微球或量子点；优选为胶体金。

9.用于检测OXA-48酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～6任一项所述的OXA-48酶结合分子。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括免疫层析检测卡，所述免疫层析检测卡中包含权利要求1～6任一项所述的OXA-48酶结合分子和标记物；

优选的，所述标记物选自胶体金、胶体银、胶体碳、磁微球、荧光微球、彩色微球或量子点；进一步优选为胶体金。

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