CN115894683B

CN115894683B - 检测甲胎蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN115894683B
Application number: CN202211654450.3A
Authority: CN
Inventors: 张祥伟
Original assignee: Shandong Narui Boen Biopharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Narui Boen Biopharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-22
Filing date: 2022-12-22
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2042-12-22
Also published as: CN115894683A

Abstract

本发明公开了一种检测甲胎蛋白的单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。本发明的单克隆抗体组合包括：单克隆抗体2‑3D和单克隆抗体2‑9D；所述单克隆抗体2‑3D，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4‑6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；所述单克隆抗体2‑9D，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7‑9所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:10‑12所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。本发明开发设计了对甲胎蛋白具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体组合，为酶联免疫检测和胶体金免疫检测甲胎蛋白提供了新的抗体来源。

Description

检测甲胎蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测甲胎蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成并出现在胎儿血清中，出生后血清中AFP的含量很低，正常人血清中的AFP浓度在20μg/L以下。当机体发生原发性肝癌时，肝癌细胞可合成和分泌大量AFP，在癌组织提取液、血清及腹水中均可检出高水平的AFP，现已作为肝癌的标志物，广泛应用于肝癌的普查、诊断、疗效判断和复发的预测。因此，AFP的可靠检测对早期临床诊断和长期治疗具有重要价值。

近年来，很多分析方法被开发并用于AFP检测，例如：酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、化学发光免疫分析(CLIA)等。上述分析方法的实施均需以特异性识别AFP的特异性抗体为关键成分。因此，开发高亲和力和高特异性的单克隆抗体具有十分重要的意义。

专利CN107022030 A公开了一种检测甲胎蛋白的单克隆抗体及试剂盒和应用，该单克隆抗体能结合人甲胎蛋白的不同表位，形成双抗体夹心模式，实现人血清中的甲胎蛋白的定量检测。但针对甲胎蛋白的不同抗原表位开发具有更高亲和力和特异性的单克隆抗体仍是当前研发的方向。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测甲胎蛋白的单克隆抗体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供单克隆抗体组合，所述单克隆抗体组合包括：单克隆抗体2-3D和单克隆抗体2-9D；

所述单克隆抗体2-3D，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；

所述单克隆抗体2-9D，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7-9所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:10-12所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

优选的，单克隆抗体2-3D的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，单克隆抗体2-3D的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

单克隆抗体2-9D的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，单克隆抗体2-9D的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

本发明的第二方面，提供单克隆抗体2-3D的编码基因。

优选的，所述编码基因包括：SEQ ID NO:17所示的DNA序列，以用于编码单克隆抗体2-3D的重链；SEQ ID NO:18所示的DNA序列，以用于编码单克隆抗体2-3D的轻链。

本发明的第三方面，提供单克隆抗体2-9D的编码基因。

优选的，所述编码基因包括：SEQ ID NO:19所示的DNA序列，以用于编码单克隆抗体2-9D的重链；SEQ ID NO:20所示的DNA序列，以用于编码单克隆抗体2-9D的轻链。

本发明的第四方面，提供如下任一项所述的物质：

(1)重组表达载体，所述重组表达载体包含单克隆抗体2-3D的编码基因，或者包含单克隆抗体2-9D的编码基因；

(2)宿主细胞，所述宿主细胞包含(1)中所述的重组表达载体；

(3)药物偶联物，所述药物偶联物包含单克隆抗体2-3D和/或单克隆抗体2-9D。

本发明的第五方面，提供上述单克隆抗体组合在如下(1)或(2)中的应用：

(1)制备检测AFP的产品；

(2)制备肝癌诊断试剂盒或试剂。

优选的，所述检测AFP的产品包括但不限于：ELISA检测试剂盒、胶体金检测试剂盒和化学发光免疫分析试剂盒等。

本发明的第六方面，提供一种检测AFP的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒中含有上述单克隆抗体组合。

优选的，所述ELISA试剂盒，以单克隆抗体2-3D为检测抗体，以单克隆抗体2-9D为捕获抗体。

本发明的有益效果：

(1)本发明开发设计了对甲胎蛋白具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体组合，为酶联免疫检测和胶体金免疫检测甲胎蛋白提供了新的抗体来源。

(2)基于本发明的单克隆抗体组合研制的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，将有助于原发性肝癌的早期诊断，也为肝脏干细胞分化的研究提供了有用的制剂。

附图说明

图1：AFP灵敏度检测结果；图中纵坐标指450nm处的OD值。

图2：单克隆抗体2-3D的特异性检测结果；图中纵坐标指450nm处的OD值。

图3：单克隆抗体2-9D的特异性检测结果；图中纵坐标指450nm处的OD值。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如前所述，AFP的可靠检测对早期临床诊断和长期治疗具有重要价值。现有的酶联免疫分析、放射免疫分析、化学发光免疫分析等AFP检测方法均需以特异性识别AFP的特异性抗体为关键成分。因此，开发高亲和力和高特异性的单克隆抗体具有十分重要的意义。

有鉴于此，本发明首先开发了能够识别甲胎蛋白的单克隆抗体。本发明将大肠杆菌中表达的人AFP蛋白对小鼠进行快速免疫，得到免疫小鼠，利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合；然后筛选得到12株杂交瘤细胞株，再制备腹水抗体并进行纯化，最终制备得到12种单克隆抗体。

由于不同杂交细胞株分泌的单克隆抗体识别AFP的特异性会存在差异，本发明将获得的12个单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，共132个配对组合。将132个组合分别检测AFP样本，筛选出8对配对抗体能够快速检测到AFP。随后将这10对配对抗体对AFP和人血清白蛋白(HSA)进行交叉反应，发现2-9D作为捕获抗体、2-9D作为检测抗体这一组合无交叉反应。因此，将单克隆抗体2-9D和单克隆抗体2-9D的组合用于特异性识别和检测AFB，并对所得到的单克隆抗体2-9D和单克隆抗体2-9D的序列和结构进行了分析。

基于本发明开发的单克隆抗体2-9D和单克隆抗体2-9D，本发明还设计了一种检测AFB的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒是以单克隆抗体2-3D为检测抗体，以单克隆抗体2-9D为捕获抗体。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。。

实施例1：人AFP单克隆抗体制备

(1)大肠杆菌中表达重组人AFP蛋白；

在NCBI中选择适合的人AFP蛋白序列(NP_001125.1alpha-fetoprotein isoform1precursor[Homo sapiens])。委托苏州金唯智公司合成表达载体：质粒：pET-28a(+)、5’酶切位点：Ndel、3’酶切位点：Xhol、表达菌株：BL21(DE3)；

取100ng质粒和20ul感受态细胞混合，冰上放置30min；热激45s，冰上放置2min，37℃，200rpm培养1h，2000rpm离心，留少量上清涂Kana抗性平板。37℃培养箱过夜培养；第二天挑菌扩大培养，1mM IPTG，37℃诱导4h；表达成功后增加摇菌体积，进行蛋白纯化，制备得到重组人AFP蛋白。

(2)用重组人AFP蛋白对小鼠进行快速免疫，得到免疫小鼠，利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆。

小鼠免疫过程如下：

第一次免疫：100μg重组人AFP蛋白和完全弗氏佐剂按照体积比1：1完全混合后，小鼠后足垫皮下注射；

第二次免疫：第一次免疫完成后2周进行第二次免疫，100μg重组人AFP蛋白和不完全弗氏佐剂按照体积比1：1完全混合后，小鼠后足垫皮下注射；

第三次免疫：第二次免疫完成后2周进行第三次免疫，100μg重组人AFP蛋白和PBS缓冲液按照体积比1：1混匀后，腹腔注射；

第三次免疫完成后10天取小鼠眼周血做效价检测；

加强免疫：融合前三天，100μg重组人AFP蛋白和PBS缓冲液按照体积比1:1混匀后，小鼠尾静脉注射。

淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合实验的具体操作如下：

按照数量比1:5混合骨髓瘤细胞和淋巴细胞，得到细胞混合物；将所述细胞混合物放到50ml离心管中，用RPMI-1640基础培养基稀释，然后在1000rpm条件下离心5min，弃上清，摇动离心管使细胞均匀，缓慢加入1ml 50％PEG，反应90秒，然后加入10ml RPMI-1640培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10min，在1000rpm条件下离心5min，弃上清后加入RPMI-1640完全培养基重悬细胞；

融合的细胞辅到96孔板中，每孔100μl；然后将细胞培养板放到CO₂培养箱中培养，融合10天后，融合筛选阳性孔细胞。

所述亚克隆的具体操作如下：

吹打阳性孔中细胞，取10μl计数为N，根据有限稀释法在离心管中加入PBS缓冲液，取100μl细胞悬液到离心管中，吹匀后取30μl，加入500μl RPMI-1640完全培养基，吹匀后接种到半固体培养基上，6-8天后挑选肉眼可见的单克隆细胞株接种到96孔板上，然后筛选出阳性单克隆细胞株。

(3)筛选经步骤(2)亚克隆后得到的强阳性细胞株进行腹水制备，对腹水进行纯化处理，对腹水进行纯化处理的操作具体如下：

将蛋白质A琼脂糖凝胶介质装入镍离子亲和层析柱，将腹水与PBS按照体积比1:1等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，最终纯化得到12个单克隆抗体。

实施例2：特异性识别AFP的单克隆抗体组合的筛选

将实施例1获得的12个单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，进行ELISA夹心抗体配对，其中检测抗体用HRP标记。ELISA检测流程为：包被捕获抗体，洗板三次，封闭，洗板三次，加入AFP抗原孵育，洗板，加入检测抗体，孵育，洗板，加入TMB显色液，室温避光孵育10-15min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。检测结果见表1。

表1：双抗体夹心ELISA法筛选配对抗体

注：表中的“-”代表OD₄₅₀值＜0.5，“+”数量代表OD₄₅₀值的高低，“4+”代表OD₄₅₀值＞4.0，“3+”代表OD₄₅₀值＞3.0，“2+”代表OD₄₅₀值＞2.0，“1+”代表OD₄₅₀值＞1.0。OD₄₅₀值越高，则表示配对效果越好。

由此筛选出8对配对单克隆抗体能够检测AFP。人血清白蛋白(HSA)是AFP的主要交叉反应蛋白，仿照人血液中HAS浓度，以30mg/ml的HAS作为交叉反应原，通过ELISA法检测上述筛选出的8对配对单克隆抗体是否对人血清白蛋白存在交叉反应，检测结果见表2。

表2：交叉反应考察结果

注：表中的“-”代表和相应的检测对象无反应，“+”代表和相应的检测对象有反应，“+”前的数字代表反应信号强度，数字越大，表示反应信号强度越高。

结果发现，以单克隆抗体2-3D为检测抗体，以单克隆抗体2-9D为捕获抗体进行组合，其对人血清白蛋白无交叉反应，其它配对抗体组合存在一定程度的交叉反应。

因此，选取2-3D作为检测抗体，2-9D作为捕获抗体这个配对组合作为特异性识别AFP的单克隆抗体组合。

实施例3：单克隆抗体2-3D和单克隆抗体2-9D的序列和结构分析

对单克隆抗体2-3D和单克隆抗体2-9D作进一步的序列和结构分析，其中：

单克隆抗体2-3D包括：重链(Heavy Chain)和轻链(Light Chain)；单克隆抗体2-3D重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，具体如下：

氨基酸序列：

注：阴影区域为重链可变区；斜体加粗区域为CDR(互补决定簇)区。

核苷酸序列：

注：阴影区域为重链可变区的编码序列。

单克隆抗体2-3D的重链可变区包含3个CDR区，分别为：氨基酸序列如SEQ IDNO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，具体如下：

VHCDR1：NYLIE；(SEQ ID NO:1)

VHCDR2：MINPGSGNTNYNEKFKG；(SEQ ID NO:2)

VHCDR3：RDFFAMDY；(SEQ ID NO:3)

单克隆抗体2-3D轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，具体如下：

氨基酸序列：

注：阴影区域为轻链可变区；斜体加粗区域为CDR(互补决定簇)区。

核苷酸序列：

注：阴影区域为轻链可变区的编码序列。

单克隆抗体2-3D的轻链可变区包含3个CDR区，分别为：氨基酸序列如SEQ IDNO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，具体如下：

VLCDR1：SASQGISNYLN；(SEQ ID NO:4)

VLCDR2：YTSSLHS；(SEQ ID NO:5)

VLCDR3：QQYTKLPRT；(SEQ ID NO:6)

单克隆抗体2-9D包括：重链(Heavy Chain)和轻链(Light Chain)；单克隆抗体2-9D重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，具体如下：

氨基酸序列：

核苷酸序列：

注：阴影区域为重链可变区的编码序列。

单克隆抗体2-9D的重链可变区包含3个CDR区，分别为：氨基酸序列如SEQ IDNO:7-9所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，具体如下：

VHCDR1：KYLIE；(SEQ ID NO:7)

VHCDR2：VINPGSGKADYNERFKG；(SEQ ID NO:8)

VHCDR3：WEDYYGNPWFDY；(SEQ ID NO:9)。

单克隆抗体2-9D轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，具体如下：

氨基酸序列：

核苷酸序列：

注：阴影区域为轻链可变区的编码序列。

单克隆抗体2-9D的轻链可变区包含3个CDR区，分别为：氨基酸序列如SEQ IDNO:10-12所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，具体如下：

VLCDR1：QATQDIVKNLN；(SEQ ID NO:10)

VLCDR2：YATELAE；(SEQ ID NO:11)

VLCDR3：LQFYGYPYT；(SEQ ID NO:12)。

本发明获得的单克隆抗体2-3D和单克隆抗体2-9D具有特异的CDR区，与现有报道的单克隆抗体存在显著差异；并且单克隆抗体2-3D和单克隆抗体2-9D对人AFP具有优异的亲和力和特异的识别性能。

实施例4：检测AFP的ELISA试剂盒的构建及方法学考察

1、ELISA试剂盒的构建及检测：

以单克隆抗体2-3D为检测抗体，以单克隆抗体2-9D为捕获抗体，构建ELISA检测试剂盒，具体检测步骤如下：

(1)包被：将捕获抗体2-9D稀释至工作浓度为4ug/ml，按100μL每孔加入到包被板中，4℃包被过夜；

(2)封闭：PBST(含0.05％吐温)洗涤3次，用5％脱脂奶粉进行封闭，每孔200μL，37℃孵育1h；

(3)加抗原：PBST洗涤3次，拍干后加入AFP抗原，加入量80μL；37℃孵育1h；

(4)加二抗：PBST洗涤3～5次，用5％脱脂奶粉8000倍稀释二抗(HRP标记的检测抗体2-3D)，每孔50μl，37℃孵育1h；

(5)用PBST洗涤5次，3min/次，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。

2、方法学考察：

(1)灵敏度：

分别以浓度为20μg/ml、2μg/ml、200ng/ml、20ng/ml、2ng/ml、200pg/ml、20pg/ml和2pg/ml的AFP蛋白作为抗原，采用上述构建的ELISA试剂盒进行检测，绘制得到检测曲线(图1)。

本发明的ELISA试剂盒对AFP的线性检测范围为0.5-300ng/ml，检测灵敏度为0.2ng/ml。

(2)特异性：

试剂盒的特异性主要看所用抗体的特异性，检测的样本为人血清，主要看人血清中有没有和抗体非特异结合的干扰物，然后OD值和抗原浓度成正相关，即可认为特异性良好。

采用Elisa检测两个抗体的特异性，抗原为重组人全长AFP蛋白，铺板浓度梯度设置为2ug/ml(不加人血清的阳性对照)，2ug/ml，1ug/ml，0.2ug/ml，0.04ug/ml，0.008ug/ml，0。

将2-3D和2-9D单克隆细胞培养上清和人血清按体积比1:1混合均匀后孵育0.5h，加入酶标板37℃继续孵育1h，每孔上样量为100ul。

二抗为标记HRP的羊抗鼠，孵育0.5h后加TMB显色。

结果如图2和图3所示，结果表明：加入人血清后抗体效价没有明显降低，且与抗原浓度成正相关，说明人血清中没有抗体非特异识别的物质来影响检测，2-3D和2-9D单克隆抗体特异性较好。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.用于特异性识别甲胎蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，所述轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

2.权利要求1所述的单克隆抗体的编码基因。

3.包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体或宿主细胞。

4.用于特异性识别甲胎蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列如如SEQ ID NO:7-9所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，所述轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10-12所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

5.权利要求4所述的单克隆抗体的编码基因。

6.包含权利要求4所述编码基因的重组表达载体或宿主细胞。

7.单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体组合包括：权利要求1所述的单克隆抗体和权利要求4所述的单克隆抗体。

8.权利要求7所述的单克隆抗体组合在制备检测AFP的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测AFP的产品包括：ELISA检测试剂盒、胶体金检测试剂盒和化学发光免疫分析试剂盒。

10.一种检测AFP的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒中含有权利要求7所述的单克隆抗体组合。

11.根据权利要求10所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒，以权利要求1所述的单克隆抗体为检测抗体，以权利要求4所述的单克隆抗体为捕获抗体。