CN116396384B - 针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体及其应用和双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体及其应用和双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体及其应用和双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒。所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体2A10和/或兔单克隆抗体7A11，2A10的轻链互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3‑5所示，重链互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8‑10所示；7A11的轻链互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13‑15所示，重链互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18‑20所示。本发明提供的具备前述序列的兔单克隆抗体2A10和7A11具有高特异性和亲和力，用于检测小鼠脂联素时能显著提升检测精度和灵敏度，适用于作为免疫学诊断和检测领域的抗体材料。

Description

针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体及其应用和双抗夹心法酶联 免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体及其应用和双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
脂联素(Adiponectin，APN)，又名apM1、Arcp-30、AdipoQ或GBP-28，是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，由Scherer等于1995年首先从鼠的脂肪细胞分离出来，1999年Arita等人将其正式命名为脂联素。在正常小鼠的血清中，脂联素水平较高，浓度在0.44ng/mL左右，具有多种生物学功能，其可通过不同的途径作用于多个器官，在一些重要的生理过程中发挥关键的调控作用，包括糖脂代谢、造血、炎症、补体激活、血栓形成以及抗肿瘤细胞生长等，其分泌失调与许多疾病的发生、发展密切相关。大量研究表明，脂联素能够促进脂肪细胞分化、脂肪酸分解代谢和胰岛素敏感性，其通过刺激肝脏和骨骼肌中的AMPK磷酸化和活化，增强葡萄糖利用率和脂肪酸燃烧，与肥胖、2型糖尿病和动脉粥样硬化生成呈负相关，脂联素水平在上述疾病中明显降低。此外，脂联素能够通过负调节TNF-α在肝脏和巨噬细胞等各种组织中的表达并通过抵消其作用来拮抗TNF-α，从而影响炎症反应。脂联素还可以结合和螯合具有不同结合亲和力的各种生长因子，在细胞生长、血管生成和组织重塑中发挥作用。特异性检测生物样本如血清/血浆中脂联素水平对于揭示前述相关疾病的发病机制、新药靶点的筛选以及相关疾病的早期预测、疗效监测和预后判断都有重要价值。
目前，定量检测脂联素的方法主要有采用多克隆抗体的竞争性放射免疫分析方法(Radioimmunoassay，RIA)和双抗体夹心分析模式的酶联免疫吸附方法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay，ELISA)。ELISA方法灵敏度高，特异性强，标记试剂稳定，无RIA方法的放射污染和危害，应用更为广泛。但是，目前市面上面主流的脂联素ELISA检测试剂盒，都是使用大鼠单克隆抗体搭配针对脂联素的兔或者羊多克隆抗体实现特异性检测，所使用的兔或者羊多克隆抗体依赖于传统的杂交瘤方法开发和生产，制备工艺较为复杂，存在较大的批间差，而且结合位点不同，使得不同批次间测得的脂联素水平存在差别，限制了脂联素检测的临床推广。而且现有的兔或者羊多克隆抗体存在着特异性差等问题，检测灵敏度有待提高。
发明内容
针对现有技术中定量检测脂联素的抗体特异性差、检测灵敏度低和/或批间差差异大等问题，本发明提供了一种针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，并提供了该兔单克隆抗体的应用及基于该兔单克隆抗体的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，用于特异性、高灵敏度检测小鼠脂联素水平。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体2A10和/或兔单克隆抗体7A11，其中，所述兔单克隆抗体2A10的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3-5所示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8-10所示；所述兔单克隆抗体7A11的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13-15所示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18-20所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体2A10的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7所示；所述兔单克隆抗体7A11的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体2A10的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链为κ链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：6，所述重链为IgG1型；所述兔单克隆抗体7A11的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述轻链为κ链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：16，所述重链为IgG1型。
进一步地，用于制备如上述所述的兔单克隆抗体2A10和兔单克隆抗体7A11的免疫原为小鼠脂联素第19位至247位氨基酸片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸用于编码如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体2A10和/或兔单克隆抗体7A11。
本发明第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
本发明第四方面提供了如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体在检测小鼠脂联素中的应用。
进一步地，检测小鼠脂联素的方法包括酶联免疫法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法、流式细胞术或免疫色谱法。
更进一步地，检测小鼠脂联素的方法包括双抗夹心法酶联免疫法。
进一步地，检测小鼠脂联素的生物样本包括离体的血清或血浆，所述小鼠脂联素包括天然分泌的小鼠脂联素或采用基因工程技术重组表达的小鼠脂联素。
本发明第五方面提供了一种双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，包括如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体2A10和兔单克隆抗体7A11，其中，所述兔单克隆抗体2A10作为捕获抗体，经发光标记物标记的所述兔单克隆抗体7A11作为检测抗体。
进一步地，所述双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒还包括包被缓冲液、封闭液、显色液、抗体稀释液、洗涤液和终止液中的一种或多种。
本发明的优点及积极效果为：
1、本发明提供的具备上述所述的CDR序列的兔单克隆抗体2A10和7A11具有高度的专一性和特异性，与分子结构相似的其他脂联素无明显交叉反应，且其与小鼠脂联素的结合力度强，具有高亲和力，用于检测小鼠脂联素时能显著提升检测精度和灵敏度，适用于作为免疫学诊断和检测领域的抗体材料，尤其是通过蛋白相互作用非标技术证明兔单克隆抗体2A10和7A11分别结合于小鼠脂联素表面不同的抗原决定簇，可以用于建立针对小鼠脂联素的双抗夹心酶联免疫检测方法，能够实现小鼠脂联素的高特异性、高灵敏度检测。
2、本发明的兔单克隆抗体批次差异小，不同批次间可保持与小鼠脂联素的结合位点不变，且稳定性高，提高了检测结果的重复性和检测的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例构建兔单克隆抗体所用的表达载体图谱，其中，图a为构建兔单克隆抗体轻链所用的表达载体图谱，图b为构建兔单克隆抗体重链所用的表达载体图谱；
图2为本发明实施例2的兔单克隆抗体2A10的亲和力拟合曲线；
图3为本发明实施例2的兔单克隆抗体7A11的亲和力拟合曲线；
图4为本发明实施例2的兔单克隆抗体2A10和7A11的抗原决定簇测定结果图；
图5为本发明实施例3基于兔单克隆抗体2A10和7A11建立的ELISA标准曲线；
图6为本发明实施例3基于兔单克隆抗体2A10和7A11建立的ELISA特异性测定结果图；
图7为本发明实施例4的兔单克隆抗体2A10和7A11热稳定性测定结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明利用小鼠(Mouse)的脂联素(Adiponectin)全长胞外区蛋白片段免疫新西兰大白兔，筛选得到能够与Mouse Adiponectin特异性结合的2个兔单克隆抗体，其对小鼠脂联素(Mouse Adiponectin)具有高特异性和高亲和力，与分子结构相似的其他脂联素如人白介素系列蛋白无明显交叉反应，适用于Mouse Adiponectin的免疫学检测，尤其是这2个单克隆抗体结合于Mouse Adiponectin表面不同的抗原决定簇，可以建立针对MouseAdiponectin的双抗夹心酶联免疫检测方法。在此基础上完成了本发明。
在本发明的上下文中，术语“与小鼠脂联素特异性结合的兔单克隆抗体”、“抗小鼠脂联素的兔单克隆抗体”、“针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体”等类似词语可互换使用，均指特异性结合小鼠脂联素的单克隆抗体。“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
术语“抗体”是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。典型的抗体分子由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成，轻链可分为两种：kappa(κ)链和lambda(λ)链，重链可分为五种：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其中lgG又可分为四个亚类，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原结合位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。轻链恒定区(CL)和重链恒定区()不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。“兔单克隆抗体”表明抗体由兔产生。
本发明实施例提供了一种针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体2A10和/或兔单克隆抗体7A11，所述兔单克隆抗体2A10和所述兔单克隆抗体7A11均包括轻链和重链，所述轻链和所述重链均包括互补决定区(CDR)，为描述方便，所述轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，所述重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。其中，所述兔单克隆抗体2A10的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。所述兔单克隆抗体7A11的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15所示，HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20所示。
在抗体的结构中，互补决定区(CDR)决定了抗体的特异性和亲和性，本发明具备上述所述的CDR序列的兔单克隆抗体2A10和兔单克隆抗体7A11仅特异性识别和结合小鼠脂联素(Mouse Adiponectin)，包括重组表达的Mouse Adiponectin和天然分泌(如小鼠血清或特定细胞分泌)的Mouse Adiponectin，而与分子结构相似的其他脂联素如人白介素系列蛋白无明显交叉反应，具有高度的专一性和特异性，因此适用于特异性检测小鼠脂联素，且其与小鼠脂联素的结合力度强，兔单克隆抗体2A10和7A11与重组表达的Mouse Adiponectin结合的亲和常数(Kd)，具有高亲和力，用于检测Mouse Adiponectin时能显著提升检测精度和灵敏度，适用于作为免疫学诊断和检测领域的抗体材料，尤其是通过蛋白相互作用非标技术证明兔单克隆抗体2A10和7A11分别结合于Mouse Adiponectin表面不同的抗原决定簇，可以用于建立针对Mouse Adiponectin蛋白的双抗夹心酶联免疫检测方法，能够实现Mouse Adiponectin蛋白的高特异性、高灵敏度检测。此外，本发明提供的兔单克隆抗体，利用基因工程技术生产，不存在批次之间的差异，可保持与Mouse Adiponectin的结合位点不变，稳定性高，解决了多抗批间差异大，重复性差，且成本较高的问题。
可选地，所述轻链和所述重链均包括框架区(FR)，FR和CDR构成可变区(V)。所述兔单克隆抗体2A10的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。所述兔单克隆抗体7A11的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
可选地，所述兔单克隆抗体2A10的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链为κ链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：6，重链为IgG1型。所述兔单克隆抗体7A11的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，轻链为κ链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：16，重链为IgG1型。
用于制备上述所述的兔单克隆抗体2A10和兔单克隆抗体7A11的免疫原(或抗原)为小鼠脂联素第19位至247位氨基酸片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。为描述方便，以下将小鼠脂联素第19位(含)至第247位(含)氨基酸片段简称小鼠脂联素(19-247aa)，该区域为小鼠脂联素的全长胞外区蛋白片段，具有小鼠脂联素的功能，以其作为抗原或免疫原，可在免疫动物体内产生种类和抗体表位更为丰富的抗体。
为了获得更接近于真实结构的小鼠脂联素，上述所述的免疫原通过哺乳细胞表达系统产生，表达得到的重组蛋白包括小鼠脂联素(19-247aa)。为便于纯化，所述重组蛋白还可以带有不影响其免疫原性的纯化标签，如组氨酸标签(6×His)。采用哺乳细胞表达系统获得大量纯化的免疫原，哺乳细胞表达系统有合适的翻译后修饰过程，得到的重组蛋白更接近真实结构的蛋白状态，由其免疫获得的抗体能更好识别小鼠脂联素且实现特异性识别与结合。
本发明另一实施例提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸用于编码如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体2A10和/或兔单克隆抗体7A11。
需要注意的是，所述多核苷酸的序列依据氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。
本发明再一实施例提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
通过将含有编码本发明兔单克隆抗体的多核苷酸序列的表达载体导入宿主细胞内，即可获得相应的特异性抗体。需要说明的是，在一些实施方式中，编码如本发明所述的兔单克隆抗体2A10或兔单克隆抗体7A11的重链与轻链的多核苷酸可以克隆至一个表达载体中，每段核苷酸序连接到合适的启动子下游。如，编码重链与轻链的每段核苷酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些实施方式中，编码如本发明所述的兔单克隆抗体2A10或兔单克隆抗体7A11的重链与轻链的多核苷酸也可以分别构建到两个载体上，这两个载体组成表达载体，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型，此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
基于本发明提供的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体特异性强、亲和力高等特性，本发明实施例还提供了如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体或如上所述的多核苷酸或如上所述的表达载体在检测小鼠脂联素中的应用。
如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体或如上所述的多核苷酸或如上所述的表达载体在检测小鼠脂联素中的应用的优势与如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
作为本发明的检测小鼠脂联素的方法，可以采用公知的免疫学诊断和检测方法。示例性地，如酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法、免疫印迹法(Western blot，WB)、流式细胞术(Flow Cytometry，CM)或免疫色谱法等。采用前述方法时，本发明提供的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体(兔单克隆抗体2A10和7A11中的一种或二种)通常作为抗原结合抗体，并可以与发光标记物连接，发光标记物可以为胶体金、化学染料、荧光染料等中的一种，抗原结合抗体用于与待检测样本中的小鼠脂联素结合，发光标记物用于产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测小鼠脂联素。
作为本发明的检测对象，可以为血液(包括血清或血浆)中的小鼠脂联素，或细胞分泌的小鼠脂联素，或者采用基因工程技术重组表达的小鼠脂联素。检测对象为离体的生物样本。
本发明的兔单克隆抗体2A10和7A11能结合小鼠脂联素的不同抗原表位，由此可以形成双抗体夹心模式，因此，在较佳的实施方式中，检测小鼠脂联素的方法优选采用酶联免疫法，尤其是双抗夹心法酶联免疫检测法。在所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为兔单克隆抗体2A10，用于与识别和结合抗原以固定抗原，形成捕获抗体-抗原复合物，检测抗体为经发光标记物标记的兔单克隆抗体7A11，用于与捕获抗体-抗原复合物特异性结合并产生可测量的信号。两单克隆抗体配对检测生物样本中的小鼠脂联素具有很高的灵敏性和特异性，检测限低至3.8pg/mL。
本发明又一实施例提供了一种双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，包括如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体2A10和兔单克隆抗体7A11，其中，所述兔单克隆抗体2A10作为捕获抗体，经发光标记物标记的所述兔单克隆抗体7A11作为检测抗体。
所述双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒的优势与如上所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
可选地，所述发光标记物为生物素。
可选地，所述双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒还包括包被缓冲液、封闭液、显色液、抗体稀释液、洗涤液和终止液中的一种或多种。前述试剂均为本领域常规使用的试剂，在此不做特殊限定。如磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常作为抗体稀释液，含牛血清白蛋白或脱脂奶粉的溶液常规作为封闭液。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗小鼠脂联素的兔单克隆抗体制备
本实施例以哺乳细胞表达系统表达得到的重组Mouse Adiponectin全长胞外区19-247aa作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗小鼠脂联素的兔单克隆抗体2A10和7A11。其中：免疫原的氨基酸序列(见SEQ ID NO：21)为：
DDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMAGIPGHPGHNGTPGRDGRDGTPGEKGEKGDAGLLGPKGETGDVGMTGAEGPRGFPGTPGRKGEPGEAAYVYRSAFSVGLETRVTVPNVPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFYCNIPGLYYFSYHITVYMKDVKVSLFKKDKAVLFTYDQYQEKNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGDGDHNGLYADNVNDSTFTGFLLYHDTN。
1、动物免疫：用来制备兔单克隆抗体的免疫原来自293F细胞表达的重组MouseAdiponectin，包括Mouse Adiponectin(19-247aa)。用免疫原分别免疫2只新西兰大白兔；每只免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定其针对Mouse Adiponectin的滴度，取血清滴度高的兔子用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
2、分离和培养脾脏中B淋巴细胞：分离和培养脾脏中B淋巴细胞的方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。
3、编码兔单克隆抗体基因的克隆：将培养后的B淋巴细胞上清用重组MouseAdiponectin包被的ELISA板来鉴定可识别重组Mouse Adiponectin的B淋巴细胞，即阳性克隆，之后将阳性克隆用基因重组方法进行构建重组单抗。具体方法：收集可识别重组MouseAdiponectin的B淋巴细胞细胞，裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司，货号：R1051)提取RNA，反转录成cDNA；反转录体系如下：Oligo(dT)12-18primer(Life)1μL、10mM dNTPs 1μL、模板RNA1μL；在PCR仪中65℃反应5min后，向以上产物中加入5×FSBuffer(购自ABconal)4μL、100mM DTT 1μL、40U/μL RNase OUT(life)1μL、200U/μLABScriptⅡRT(购自ABconal)1μL，混匀后在42℃反应1h，之后85℃反应5min反应，得到cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，PCR反应体系包括：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL2×GloriaHiFi(购自ABclonal)和6.5μL H2O。PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。其中，VL和VH正向引物和反向引物的核苷酸序列如下所示：
VL-Primer-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'(SEQ ID NO：22)；
VL-Primer-R：5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'(SEQ IDNO：23)；
VH-Primer-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'(SEQ ID NO：24)；
VH-Primer-R：5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'(SEQ ID NO：25)。
将获得的兔单克隆抗体的VL和VH基因纯化后，分别装载在含有轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)的表达载体pBR322上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322的图谱见图1；其中，pBR322Ori和f1Ori是E.coli中的复制起始位点，Ampcillin是质粒抗性基因，CMVPromoter为转录启动子，SV 40PAterminator是加尾信号，Heavy chain constant(图a)和Light chain constant(图b)分别为轻链可变区和重链可变区。将含有CL和CH的哺乳动物表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，采用同源重组的方式分别将VL和VH基因连接到pBR322上，将构建成功的载体送由金开瑞生物科技有限公司测序，得到兔单克隆抗体2A10和7A11的氨基酸序列(见表1)。
表1兔单克隆抗体2A10和7A11涉及的氨基酸序列
4、兔单克隆抗体的生产和纯化：为了获得多株识别人Trop2蛋白的兔单克隆抗体，将上述装载有兔单克隆抗体2A10(或7A11)的轻链和重链基因的表达载体pBR332共转染293F细胞，转染后培养72-96h，获得的培养上清中含有识别Mouse Adiponectin蛋白的兔单克隆抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从培养上清中纯化出重组的识别人Trop2蛋白的兔单克隆抗体2A10或7A11，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
实施例2兔单克隆抗体的特性鉴定
1、抗体亲和力测定：对兔单克隆抗体2A10和兔单克隆抗体7A11的亲和力进行测定，抗体浓度为75nm和150nm，亲和力曲线测定结果见图2-3，其中，横坐标为时间，纵坐标为Shift(抗体Load到相应Probe上的值)。通过曲线拟合和计算，获得兔单克隆抗体的亲和力相关参数(见表2)。
表2兔单克隆抗体2A10和7A11的亲和力相关参数测定结果
抗体 Koff(1/s) Kon(1/Ms) Kd(M)
2A10 1.53×10-4 1.28×105 1.19×10-9
7A11 1.92×10-4 2.26×105 8.46×10-10
由图2-3和表2可知，兔单克隆抗体2A10与重组Mouse Adiponectin的解离系数(Koff，用于表征抗体与抗原解离速度的常数)、结合系数(Kon，用于表征抗体与其靶标结合速度的常数)以及亲和力常数(Kd，为Koff/Kon的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数)分别为1.53×10-4、1.28×105、1.19×10-9，兔单克隆抗体7A11与重组Mouse Adiponectin的解离系数、结合系数和亲和力常数分别为1.92×10-4、2.26×105、8.46×10-10，表明兔单克隆抗体2A10、7A11分别与重组Mouse Adiponectin具有高亲和力和灵敏度。
2、抗原表位分析：对两种抗体的氨基酸序列进行比对分析，兔单克隆抗体2A10以及兔单克隆抗体7A11的轻链可变区VL以及重链可变区VH序列一致性分别为75％以及82％，序列一致性低，为2种完全不同的抗体，揭示了这2种抗体有可能作用不同的抗原表位。
进一步使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体2A10和7A11进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇，其中，使用到的材料为重组Mouse Adiponectin蛋白，使用浓度为3μg/mL，第一兔单克隆抗体的浓度为3μg/mL，第二兔单克隆抗体的浓度为1μg/mL，两种抗体的抗原决定簇识别结果见图4，其中，横坐标为时间，纵坐标为Shift(抗体Load到相应Probe上的值)。
从图4中可以看出，兔单克隆抗体2A10和兔单克隆抗体7A11分别识别不同的MouseAdiponectin的抗原表位，因此二者可用于双抗夹心法酶联免疫检测的配对抗体。
实施例3基于兔单克隆抗体2A10和7A11建立双抗夹心法酶联免疫检测方法
双抗夹心法酶联免疫检测方法包括以下步骤：
1)捕获抗体包被：将兔单克隆抗体2A10用1×PBS稀释成1μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h；
2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；
3)封闭：将E013封闭液以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用；
4)加蛋白：将Mouse Adiponectin用稀释液进行稀释(稀释浓度梯度：1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、16.25pg/mL、0pg/mL)，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；
5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；
6)加检测抗体：将生物素标记的兔单克隆抗体7A11(7A11-biotin)稀释成0.016μg/mL后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；
7)洗板：按照步骤5)的操作进行洗板；
8)加SA-HRP：将辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素(SA-HRP)溶液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；
9)洗板：按照步骤5)的操作进行洗板；
10)显色：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min，孵育完成后取出酶标板，每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm下读数。
双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度：以Mouse Adiponectin浓度数值为横坐标，吸光值OD450为纵坐标作图，建立标准曲线，结果见图5。以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的最低Mouse Adiponectin蛋白浓度为双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度，根据标准曲线计算得到基于兔单克隆抗体2A10和7A11建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的检测灵敏度达到3.8pg/mL，即鼠脂联素最低检测浓度可低至3.8pg/mL。
双抗夹心法酶联免疫检测方法的特异性：Mouse TNF-alpha(小鼠α-TNF)、HumanAdiponectin(人脂联素)与Mouse Adiponectin分别作为抗原被用于对抗MouseAdiponectin蛋白兔单克隆抗体2A10和7A11的交叉反应检测，所有标准品蛋白的浓度均为1μg/mL，采用的方法为上述的双抗夹心法酶联免疫检测方法，结果见图6。当兔单克隆抗体与抗原结合之后，将产生光信号，而仅有Mouse Adiponectin能够引起吸光度值的变化，这说明基于抗Mouse Adiponectin的兔单克隆抗体2A10和7A11的双抗夹心法酶联免疫检测方法对于Mouse TNF-alpha及其他相似蛋白如人脂联素均无明显交叉反应，证明兔单克隆抗体2A10和7A11对于识别和结合Mouse Adiponectin具有高度的特异性。
实施例4兔单克隆抗体2A10和7A11热稳定性测试
将兔单克隆抗体2A10和7A11放置于37℃保温箱中，于第7天取样，然后通过实施例3的双抗夹心法酶联免疫检测方法检测抗体对Mouse Adiponectin标准品的反应活性，根据比较经37℃处理不同时间的抗体样品和未经37℃处理的抗体样品所建立的标准曲线，来比较抗Mouse Adiponectin的兔单克隆抗体2A10和7A11的热稳定性，结果见图7。
从图7可以看出本发明提供的兔单克隆抗体在37℃下处理7天后，对检测灵敏度和线性范围的影响小于5％，说明兔单克隆抗体2A10和7A11热稳定性强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3-5所示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8-10所示。
2.根据权利要求1所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7所示。
3.根据权利要求2所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链为κ链，重链氨基酸序列如SEQ IDNO：6，所述重链为IgG1型。
4.一种针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13-15所示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18-20所示。
5.根据权利要求4所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示。
6.根据权利要求5所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述轻链为κ链，重链氨基酸序列如SEQ IDNO：16，所述重链为IgG1型。
7.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1-6任一项所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体。
8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达如权利要求7所述的多核苷酸。
9.如权利要求1-6任一项所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体在制备检测小鼠脂联素试剂盒中的应用，其特征在于，检测小鼠脂联素的方法包括酶联免疫法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法、流式细胞术或免疫色谱法。
10.根据权利要求9所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体在制备检测小鼠脂联素试剂盒中的应用，其特征在于，检测小鼠脂联素的方法包括双抗夹心法酶联免疫法；
检测对象包括离体的血清或血浆。
11.一种双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体为如权利要求1-3任一项所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体，所述检测抗体为如权利要求4-6任一项所述的针对小鼠脂联素的兔单克隆抗体且经发光标记物标记。
12.根据权利要求11所述的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括包被缓冲液、封闭液、显色液、抗体稀释液、洗涤液和终止液中的一种或多种。
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