CN118344485A - 抗叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体或其抗原结合片段、其制备方法及应用 - Google Patents
抗叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体或其抗原结合片段、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体或其抗原结合片段、其制备方法及应用。所述单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：(1)重链可变区，具有氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示的HCDR1‑3；和轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、QMS和SEQ ID NO.5所示的LCDR1‑3；或(2)重链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10‑12所示的HCDR1‑3；和轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、AAS和SEQ ID NO.14所示的LCDR1‑3。本发明单克隆抗体或其抗原结合片段能以高特异性、高亲和力结合叶酸及其结合蛋白复合物，提高了叶酸的检测准确性和灵敏度，实现了叶酸的夹心法免疫检测。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备及免疫学检测技术领域，具体涉及一种特异性结合叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体及其应用。
背景技术
叶酸（Folate）是一种水溶性维生素，被人体摄入后，在二氢叶酸还原酶的两次还原作用下，先后还原为二氢叶酸（dihydrofolate，DHF）和四氢叶酸（tetrahydrofolate，THF）。5-甲基四氢叶酸（5-methyltetrahydrofolate，5MeTHF）为THF主要代谢物，在人体内含量占比约是82%~93%。叶酸（Folate）参与体内一碳单位代谢，缺乏叶酸（Folate）容易引起神经管缺陷、巨幼细胞性贫血、心血管疾病和肿瘤疾病等。
目前，叶酸的检测方法主要有微生物检测法（microbiological assay，MA）、叶酸结合蛋白（folate-binding protein，FBP）检测法、高效液相色谱（highperformanceliquid chromatography，HPLC）法和ID-LC-MS/MS法。这些方法均可对血清/血浆和红细胞中叶酸进行检测。临床上主要通过FBP法检测叶酸（Folate），该方法检测成本低，但特异性较差，不同检测系统间存在较大差异，很容易造成结果的误判。
鉴于现有技术中存在上述问题，目前急需开发针对叶酸及其结合蛋白复合物的高特异性、高亲和力的单克隆抗体以满足免疫学检测的需求，以此突破传统竞争法的局限，实现夹心法检测叶酸（Folate）。
发明内容
本发明的目的在于提供针对叶酸及其结合蛋白复合物的高特异性、高亲和力的单克隆抗体或其抗原结合片段，并开发适用于与结合蛋白采用夹心法免疫学检测的高性能的抗体，对于叶酸（Folate）的检测具有更高的灵敏度，此外所述抗体还可检测体内各种叶酸代谢物，即可检测总叶酸含量。
为了实现上述目的，本发明经过大量的筛选获得了高特异性、高亲和力针对叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体或其抗原结合片段，其相关核酸及细胞产品，其制备方法和应用，以及基于其的免疫检测试剂，从而为叶酸（Folate）的高特异性、高灵敏度免疫检测提供了基础。
具体地，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了针对叶酸（Folate）及其结合蛋白复合物的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
（1）重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、QMS和SEQ ID NO. 5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
（2）重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQID NO. 12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ IDNO. 13、AAS和SEQ ID NO. 14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
（1）重链可变区，其具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或，
（2）重链可变区，其具有如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。进一步优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
（1）重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，或，
（2）重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；轻链，其氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示。
在一些可行的实施方案中，所述单克隆抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体；所述单克隆抗体可为人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
第二方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。该多核苷酸不受限于其产生的方法，并且可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
第三方面，本发明提供了核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，以及，任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第四方面，本发明提供了一种重组载体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，或者如上述第三方面所述的核酸构建体。
本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，例如，可以是质粒，粘粒，噬菌体等。
在一些优选的实施方案中，所述重组载体为重组表达载体，优选为真核表达载体。
第五方面，本发明提供了一种转化的宿主细胞，其中转化有如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的重组载体；
所述宿主细胞包括但不限于：原核细胞，例如大肠杆菌细胞；真核细胞，例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。所述宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞系。
优选地，所述宿主细胞为真核细胞，进一步优选为哺乳动物细胞。
第六方面，本发明提供了如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的重组载体和/或如上述第五方面所述的转化的宿主细胞在制备用于检测叶酸（Folate）的检测试剂或试剂盒中的应用。
在可行的实施方案中，所述样品为受试者的生物学样品，优选为受试者的血清或血浆样品。
第七方面，本发明提供了选自如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测叶酸（Folate）的检测试剂或试剂盒中的应用。
优选地，所述一种单克隆抗体或其抗原结合片段选自：
（I）抗体1或其抗原结合片段；
（II）抗体2或其抗原结合片段；
其中，抗体1或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第（1）项所定义，抗体2或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第（2）项所定义。
第八方面，本发明提供了一种检测叶酸（Folate）的检测试剂或试剂盒，其包括如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的重组载体和/或如上述第五方面所述的转化的宿主细胞。
作为优选，所述检测试剂或试剂盒包含如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，优选包含选自如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段，更优选包含选自以下的一单克隆抗体或其抗原结合片段：
（I）抗体1或其抗原结合片段；
（II）抗体2或其抗原结合片段；
其中，抗体1或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第（1）项所定义，抗体2或其抗原结合片段由上述第一方面中的任意第（2）项所定义。
在可行的实施方案中，所述试剂盒包括时间分辨荧光免疫层析试剂，所述时间分辨荧光免疫层析试剂基于夹心法原理、以选自如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段和叶酸结合蛋白分别作为捕获物和检测物；
优选地，所述时间分辨荧光免疫层析试剂以（1）抗体1或其抗原结合片段和叶酸结合蛋白的任意一种作为捕获物，并以另外一种作为检测物；进一步优选地，所述时间分辨荧光免疫层析试剂以抗体1或其抗原结合片段作为捕获物，以叶酸结合蛋白作为检测物；
优选地，所述时间分辨荧光免疫层析试剂以（2）抗体2或其抗原结合片段和叶酸结合蛋白的任意一种作为捕获物，并以另外一种作为检测物；进一步优选地，所述时间分辨荧光免疫层析试剂以抗体2或其抗原结合片段作为捕获物，以叶酸结合蛋白作为检测物；
优选地，作为检测物的叶酸结合蛋白标记有可被检测的标记物；此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，胶体金、时间分辨荧光微球、FITC等。
第九方面，本发明提供了一种制备如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合于所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，使如上述第五方面所述的转化的宿主细胞表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
第十方面，本发明提供了一种检测叶酸（Folate）在样品中的存在或其水平的方法，所述方法包括使用如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体、如上述第五方面所述的转化的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的检测试剂或试剂盒。
在可行的实施方案中，所述样品包括但不限于来自受试者的血清，血浆等。
该方法可用于诊断目的(例如，所述样品是来自患者的样品)，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
使用单克隆抗体或其抗原结合片段来检测目标抗原在样品中的存在或其水平的一般方法是本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中，所述检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、免疫层析检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
有益效果：
本发明的针对叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体可以高亲和力、高特异性与叶酸及其结合蛋白复合物结合（其结合活性EC50均达到ng/ml级别，KD均达到10-10M -10- 11M），实现了蛋白复合物的高准确性、高灵敏度检测；并且，本发明突破了传统竞争法检测试剂灵敏度低、临床相关性差的局限，实现了叶酸（Folate）的夹心法免疫检测，该检测方法具有更高的特异性和灵敏度，其临床符合率在0.97以上。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为本发明实施例4所表达和纯化的2株抗叶酸-结合蛋白复合物单克隆抗体的SDS-PAGE检测的凝胶图；其中A图为FA mAb1，B图为FA mAb2，图中M表示分子量Marker的电泳条带，泳道1显示还原条件下各单克隆抗体的电泳条带，泳道2显示非还原条件下各单克隆抗体的电泳条带。
图2为本发明实施例4所表达和纯化的2株抗叶酸-结合蛋白复合物单克隆抗体与叶酸-结合蛋白复合物结合活性的检测结果图，其中A图为FA mAb1，B图为FA mAb2，如实施例5所检测的。
图3为基于本发明抗体制备的检测试剂与罗氏检测试剂的临床样本相关性的结果图，其中A图为FA mAb1，B图为FA mAb2，如实施例7所检测的。
具体实施方式
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，包括但不限于±5%、±2%、±1%和±0.1%，因为这些变化适于进行所公开的方法。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
如本文所用，术语“或”应被理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包容性的，即，包括数量或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，额外的未列出的项目。只有明确指出相反的术语下，例如“只有一个”或“的确一个”或者在权利要求中使用“由...组成”时，将指的是仅列出的一个数字或列表的一个元素。
术语“百分比(%)氨基酸序列同一性”或简称“同一性”定义为在将氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选氨基酸序列中的氨基酸残基与参比氨基酸序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。
术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDR的肽等。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和一条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。一般而言，scFv多肽在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域和另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数(KD)代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10-9M或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明本发明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1：针对叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体的制备
（1）叶酸结合蛋白的表达与纯化
在UniProt网站上查询UniProt号：P02702，找到Folate receptor alpha（即，叶酸结合蛋白）的氨基酸序列，利用软件推导出对应的基因序列，并进行合成。将获得的DNA序列克隆至PCDNA3.4载体（泰斯托生物 TSPLA10357）中，然后进行转化涂板，挑取克隆、提取质粒。
将重组质粒转染N293细胞，转染条件为：PEI/质粒的质量比为3:1，按照2μg质粒/1ml N293细胞的比例转染；转染后5-7天，收集细胞上清；用镍柱进行纯化，获得高纯度的结合蛋白，并通过透析将洗脱缓冲液置换成PBS，利用Bradford法测定抗体浓度。
（2）动物免疫
将叶酸小分子与结合蛋白按摩尔比20:1混合，静置30min，使两者完全结合，再以得到的叶酸及其结合蛋白复合物（浓度0.5mg/ml）作为免疫原，取30μg抗原（即60μl）与等量（60μl）的弗氏完全佐剂充分乳化后，经腹腔注射以免疫小鼠（品种：Balb/c，雌性，6-8周龄），以两周时间间隔进行加强免疫，共免疫3次，末次加强免疫后5-8天，采微量尾血，用ELISA法检测血清效价，具体实验信息如表1所示。
表1.实验信息
ELISA法检测血清效价数据如表2所示。
表2.ELIAS法检测血清效价数据
选取血清效价为512K的小鼠，进行脾脏单细胞悬液的制备。
（3）脾脏单细胞悬液制备
小鼠颈椎脱臼处死，在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。将脾脏置于细胞滤网上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液。另取15ml无菌试管，先加入细胞分离液Ficoll，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，分离液和细胞悬液的体积比为1：2。置于离心机中2000转/分钟，室温离心20分钟，离心后取出试管，可以看到不同的分层，吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外15ml无菌试管中，于离心机中1500转/分钟，室温离心10分钟，小心去除上清液后重悬细胞。
（4）获取单个B细胞
利用制备好的脾脏单细胞悬液，通过对抗原标记，使用单细胞筛选平台进行细胞筛选，以获得具有抗原特异性的B细胞。
通过上述步骤，共获得40株针对叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体，经鉴定，其均为IgG抗体。以下实施例中，检测了单克隆抗体的轻、重链基因序列，并进行了表达、纯化，纯化后的40株克隆按表3的布局放置于96孔板中进行结合活性检测。
表3. 96孔板中40株抗体克隆号
注：表3中1-5，A-H分别是96孔板上的横、竖编号。
实施例2：针对叶酸-结合蛋白复合物的单克隆抗体的特异性检测
对实施例1中细胞克隆的上清用ELISA的方法进行抗原特异性检测。
①抗原包被：
将叶酸及其结合蛋白复合物稀释至2µg/ml，然后按100μl/孔的量加入空的酶标板中，将酶标板放置4℃冰箱，过夜孵育；
②封闭：
用洗板机洗板5次，扣干，将封闭液加入酶标板，每孔150μl，置于37℃恒温箱中，封闭1h；用洗板机洗板5次，扣干；
③孵育一抗：
将96孔板培养上清加入酶标板的孔中，每孔100μl，37℃孵育1h；用洗板机洗板5次，扣干；
④孵育二抗：
将HRP标记的羊抗鼠二抗按1：10000稀释，然后加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育30min；用洗板机洗板5次，扣干；
⑤显色：
将显色液加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37℃/15min；
⑥终止、读数：
添加终止液，体积100μl/孔；检测波长设置：检测波长450nm，参比波长620nm，检测结果如表4。
表4.特异性检测结果
⑦数据分析：
对比信号强弱，最终选取反应信号较强、而且特异性结合叶酸-结合蛋白复合物的2株克隆（即FA mAb1和FA mAb2克隆号分别为：1M2B2和2M2E5）进行后续的放大表达及纯化。
实施例3：针对叶酸-结合蛋白复合物的单克隆抗体的轻、重链氨基酸序列的获得
（1）cDNA制备
将实施例2中确定的两株克隆对应的细胞分别进行RNA提取，以RNA为模板进行反转录获得cDNA；
（2）轻、重链基因的获取
利用特异性的引物进行扩增，分别将扩增到的DNA序列克隆至PCDNA3.4载体中，然后进行转化涂板，挑取克隆、提取质粒。将质粒送样测序，获得2株单克隆抗体的基因序列，并推导这2株单克隆抗体的重、轻链氨基酸序列，FA mAb1和FA mAb2的重链氨基酸序列分别如SEQID NO.8、17所示，其轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9、18所示；
FA mAb1：
重链全长（SEQ ID NO.8）
EVLLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTSSWMDWVKQSQGKSLEWIGDIHPKSGNTVYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMELRRLTSEDTAVYYCARDGDFGYWYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
轻链全长（SEQ ID NO.9）
DIQMTQTTSSPSASLGDRVTISCRASKSLLHSNGITFLNWFQQKPDGTVKLLIYQMSKLHSGVPSRFSGSGSGADYSLTISNLEQEDIATYFCAQNLELPWSFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
FA mAb2：
重链全长（SEQ ID NO.17）
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFAFNQYDIYWVRQPPGKGLEWLGMISSGGGNTDRNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARQRSSYGWYFYAMDYWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
轻链全长（SEQ ID NO.18）
DIQMTQSPSSLSTSLGGKVTITCKASRSLLNSENQKNYIAWYQHKPGKGPRLLIHAASTLQPDIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCQNDHSYPITFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
再根据测序结果对这2株单克隆抗体的重链可变区（FV）和轻链可变区（FV）进行分析，最终获得它们的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，分别如下所示，其中下划线为其CDR区。
FA mAb1：
重链FV（SEQ ID NO.6）
EVLLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTSSWMDWVKQSQGKSLEWIGDIHPKSGNTVYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMELRRLTSEDTAVYYCARDGDFGYWYAMDYWGQGTSVTVSS
轻链FV（SEQ ID NO.7）
DIQMTQTTSSPSASLGDRVTISCRASKSLLHSNGITFLNWFQQKPDGTVKLLIYQMSKLHSGVPSRFSGSGSGADYSLTISNLEQEDIATYFCAQNLELPWSFGGGTKLEIK
即：重链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQID NO. 4、QMS和SEQ ID NO. 5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO.1：GYAFTSSW
SEQ ID NO.2：IHPKSGNT
SEQ ID NO.3：ARDGDFGYWYAMDY
SEQ ID NO.4: KSLLHSNGITF
SEQ ID NO.5: AQNLELPWS
FA mAb2：
重链FV（SEQ ID NO.15）
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFAFNQYDIYWVRQPPGKGLEWLGMISSGGGNTDRNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARQRSSYGWYFYAMDYWGAGTTVTVSS
轻链FV（SEQ ID NO.16）
DIQMTQSPSSLSTSLGGKVTITCKASRSLLNSENQKNYIAWYQHKPGKGPRLLIHAASTLQPDIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCQNDHSYPITFGGGTKLEIK
即：重链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQ IDNO. 12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQID NO. 13、AAS和SEQ ID NO. 14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO.10：GFAFNQYD
SEQ ID NO.11：ISSGGGNT
SEQ ID NO.12：ARQRSSYGWYFYAMDY
SEQ ID NO.13：RSLLNSENQKNY
SEQ ID NO.14：QNDHSYPIT。
实施例4：针对叶酸（Folate）及其结合蛋白复合物的单克隆抗体的表达和纯化
（1）培养N293悬浮细胞，当密度达到（1-3）×106个细胞/ml且成活率＞80-90％时，进行细胞转染；
（2）按照实施例3中获得的2株单克隆抗体FA mAb1、FA mAb2的轻、重链基因分别构建入pcDNA3.4质粒；然后，将含抗体轻、重链基因的重组质粒转染N293细胞，转染条件为：PEI/质粒的质量比为3:1，按照2μg质粒/1ml N293细胞的比例转染；
（3）转染后5-7天，收集细胞上清，用Protein A树脂进行亲和纯化，获得高纯度的单克隆抗体，并通过透析将洗脱缓冲液置换成PBS，利用Nanodrop测定抗体浓度；
接下来，通过SDS-PAGE检测抗体的纯度，具体方法如下：
SDS-PAGE检测：
取2μg待测抗体，加入适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，使总体积为20μl；同时制备还原性SDS-PAGE样品及非还原性SDS-PAGE样品，然后进行上样；首先，在80V下电泳30min，然后在120V下电泳直至条带分隔清晰；将电泳后的PAGE胶取下，进行考马斯亮蓝染色，15min之后将染色液去掉，用清水冲洗干净，然后加入脱色液进行脱色，直至看到清晰的条带为止。结果如图1所示，图1中的A图、B图显示：在还原条件下，这2株单克隆抗体FA mAb1和FA mAb2均具有两条电泳条带，并且这两条电泳条带的对应分子量与其各自的轻、重链大小一致；在非还原条件下，2株单克隆抗体FA mAb1和FA mAb2都具有单一条带，并且该电泳条带的对应分子量与其各自的完整抗体的大小一致；这些结果说明，这2株单克隆抗体的表达准确。
此外，所有电泳条带均边缘清晰、无杂带，说明将上述表达和纯化步骤所得的单克隆抗体的纯度较高。
实施例5：针对叶酸的单克隆抗体的抗原结合活性和亲和力检测
本实施例中，分别对实施例4中表达和纯化的2株单克隆抗体FA mAb1和FA mAb2进行抗原活性和亲和力检测。
①抗原包被：
将抗原（即，前述叶酸-结合蛋白复合物）稀释至合适的浓度，然后加入空的酶标板中，体积100μl/孔；将酶标板放置4℃冰箱，过夜孵育；
②封闭：
用洗板机洗板5次，扣干，将封闭液加入酶标板，每孔150μl，置于37℃恒温箱中，封闭1h；用洗板机洗板5次，扣干；
③孵育一抗：
用1×PBS将待测抗体稀释至合适的浓度梯度；将稀释后的待测抗体加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37℃/1h；用洗板机洗板5次，扣干；
④孵育二抗：
将酶标二抗按合适比例稀释，然后加入酶标板中，每孔100μl，反应时间：37℃/30min；用洗板机洗板5次，扣干；
⑤显色：
将显色液加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37℃/15min；
⑥终止、读数：
添加终止液，体积100μl/孔；检测波长设置：检测波长450nm，参比波长620nm，将检测结果导出成Excel表格。
⑦数据分析：
利用软件进行数据分析及作图，拟合EC50，并推导得出其KD。
检测数据如表5所示。
表5.各浓度的待测抗体的OD450值
根据表5，制作抗体与抗原的结合活性曲线，结果如图2所示，利用“ELISAcalc”软件，对表5数据进行四参数曲线拟合，从而得出2株抗体的EC50值，并由其推导的KD值，数据如表6所示。
表6. 2株抗体的EC50值和KD值
图2中的A图、B图显示：这2株单克隆抗体FA mAb1和FA mAb2与抗原结合的EC50均达到ng/ml级别，KD均达到10-11M。如前文所提到的，对于IgG抗体而言，本领域通常认为，当与抗原结合的KD值达到10-9M时即被认为具有高亲和性，而本发明的2株单克隆抗体与抗原结合的KD值均达到了10-11M之多，为上述定义值的100倍，由此可以得出：本发明的单克隆抗体具有极强的抗原结合活性和亲和力。
实施例6：基于抗叶酸及其结合蛋白复合物抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂的制备
（1）荧光微球- 叶酸及其结合蛋白复合物的制备
①时间分辨荧光微球的预处理 ：
取时间分辨荧光微球25μl，加入400μl 且pH6.0的PB缓冲液，混匀后，14000rpm，10℃，离心15min ，去除上清液，沉淀物400μl pH6 .0的PB缓冲液重悬；分别配备2.5mg/ml的碳二亚胺和琥珀酰亚胺，各加入2.5μl，室温反应30min后，14000rpm，10℃，离心15min，沉淀物用200μl且pH6.0的PB溶液重悬，获得活化的微球溶液；
②微球耦连叶酸结合蛋白：
上述时间分辨荧光微球溶液中加入10-50μg 叶酸结合蛋白，混匀，室温反应 3h，用1-5％的BSA室温封闭0.5h后，14000rpm，10℃，离心15min，去上清，沉淀用50μl保存液重悬，获得荧光微球-叶酸及其结合蛋白复合物；所述保存液含有pH7.5-8.5的10-100mM Tris缓冲液、1-5% 蔗糖、1-5%海藻糖、1-5% BSA。
（2）喷金
将荧光微球-叶酸及其结合蛋白复合物终浓度稀释至为0.5-2mg/ml，喷金量设置为1-4μl/cm，然后将喷好的标记垫置于37℃烘箱内干燥1-4h，然后在不高于36%的湿度下将标记垫放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
（3）包被质控线C、检测线T
①质控线C、检测线T线包被液的制备：
取羊抗鸡抗体（厂家：江苏华控生物科技有限公司，货号：2-D5021P），用pH7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成0.5-1.0mg/ml的抗体溶液；取本发明的抗叶酸及其结合蛋白复合物抗体，用pH 7.4的10-100mM PBS缓冲液稀释成0.5-1.0mg/ml的抗体溶液；
②包被：
将质控线C、检测线T线包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5-8mm，包被量均为0.8-1.5μl/cm；将包被后的PVC底板置于37℃烘箱中，烘12-24h，然后在不高于36%的湿度下将PVC底板放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
（4）样品垫的预处理
清洗烘网，将样品垫用样品垫预处理液浸泡润湿后，旋转沥干至没有水滴滴下即可，然后置于37℃烘箱内干燥4-6h，然后在不高于36%的湿度下将其放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
所述样品垫预处理液含有pH7.5-8.5的10-100mM Tris缓冲液、0.1-0.5% PVP 10、0.1-0.5% PEG20000、0.1-0.5%Tween20和0.1-0.5%酪蛋白钠；
（5）膜材的组装与切割
在不高于36%的湿度下，取出吸水垫、已处理的样品垫和标记垫，按照（15-20mm）*300mm尺寸进行切割，取出包被的PVC底板，按以下流程进行组装：先在PVC底板上贴上标记垫，使标记垫压着硝酸纤维素膜1-2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压着标记垫3-5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压着硝酸纤维素膜1-2mm；组装好的PVC底板切割成3-5mm的用于检测HBP的时间分辨荧光免疫层析试纸条。
（6）试纸条检测
用样本稀释液将临床样本稀释10倍，加样75μl，反应15min，用荧光免疫分析仪进行检测，并处理数据。
试纸条的抗体配对方式为：
①时间分辨荧光免疫层析试剂1：
叶酸结合蛋白（用于制备微球-叶酸及其结合蛋白复合物）+ FA mAb1全长抗体（用于T线包被）；
②时间分辨荧光免疫层析试剂2：
叶酸结合蛋白（用于制备微球-叶酸及其结合蛋白复合物）+ FA mAb2全长抗体（用于T线包被）。
实施例7：基于抗叶酸-结合蛋白复合物抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂的检测性能
本实施例中，对实施例6所制备的2种时间分辨荧光免疫层析试剂进行了临床血清样本中的叶酸检测，对标罗氏检测试剂。
（1）测试临床血清样本
具体地，对于实施例6所制备的时间分辨荧光免疫层析试剂，用样本稀释液（其组成为：10mM PBS+0.05%DTT +0.5% Tween-20 +0.1％proclin300，pH7.0）稀释临床血清样本，样本稀释比例为1：15（血清：稀释液，v/v），室温反应10min，然后加样80µl，15 min后用干式荧光免疫分析仪进行检测，读取检测信号值，并处理数据；对于罗氏检测试剂盒，则按照其说明书流程进行操作，对血清样本进行稀释，然后检测，获得叶酸浓度数据。然后，将试纸条所检测的叶酸信号值与罗氏试剂所检测的叶酸浓度值相比较，制作临床相关性曲线。
具体结果如下：
表7和表8分别是时间分辨荧光免疫层析试剂1和2的检测结果，表中第一栏代表临床样本用罗氏试剂检测的浓度（单位ng/ml），第二栏代表本发明的时间分辨荧光免疫层析试剂检测对应临床样本的信号值。
表7. 时间分辨荧光免疫层析试剂1的检测结果
表8. 时间分辨荧光免疫层析试剂2的检测结果
根据表7、表8结果，分别制作时间分辨荧光免疫层析试剂1、2检测血清样本中叶酸的临床相关性（即，时间分辨荧光免疫层析试剂1、2检测结果与罗氏检测结果的符合率）曲线，结果如图3中的A图和B图所示；这些结果显示：本发明的时间分辨荧光免疫层析试剂对于检测血清样本中叶酸的临床相关性R2均＞0.97。
上述结果显示，基于本发明抗体与叶酸结合蛋白所制备的叶酸时间分辨荧光免疫层析试剂与罗氏检测结果具有很高的符合率（R2在0.97以上），因此具有很好的临床相关性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (15)
1.抗叶酸及其结合蛋白复合物的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
（1）重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 4、QMS和SEQ ID NO. 5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
（2）重链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQ IDNO. 12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和轻链可变区，其具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、AAS和SEQ ID NO. 14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
（1）重链可变区，其具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；或，
（2）重链可变区，其具有如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
（1）重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示；轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；或，
（2）重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 18所示。
4.根据权利要求1－3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体。
5.根据权利要求1－3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体为人抗体或嵌合抗体。
6.根据权利要求1－3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体为双特异或多特异抗体。
7.多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1－6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
8.核酸构建体，其特征在于，其包含如权利要求7所述的多核苷酸，以及，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
9.一种重组载体，其特征在于，其包含如权利要求7所述的多核苷酸，或者如权利要求8所述的核酸构建体。
10.一种转化的宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求7所述的多核苷酸、如权利要求8所述的核酸构建体或如权利要求9所述的重组载体。
11.如权利要求7所述的多核苷酸、如权利要求8所述的核酸构建体、如权利要求9所述的重组载体和/或如权利要求10所述的转化的宿主细胞在制备用于检测叶酸的检测试剂或试剂盒中的应用。
12.如权利要求1－6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测叶酸的检测试剂或试剂盒中的应用。
13.一种用于检测叶酸的检测试剂，其包含如权利要求1－6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的多核苷酸、如权利要求8所述的核酸构建体、如权利要求9所述的重组载体和/或如权利要求10所述的转化的宿主细胞。
14.根据权利要求13所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂为时间分辨荧光免疫层析试剂，以权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段和叶酸结合蛋白分别作为捕获物和检测物。
15.一种制备如权利要求1－6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合于所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，使权利要求10所述的转化的宿主细胞表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118344485A true CN118344485A (zh) | 2024-07-16 |
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