CN114807054B - 小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒 - Google Patents

小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒。其中，小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株为2H10，保藏号为CCTCC NO:C202234；或者杂交瘤细胞株为7H10，保藏号为CCTCC NO:C202245。通过筛选两株抗人IgG单抗杂交瘤细胞株，获得了两个新的抗人IgG的抗体，具有较高的特异性，因而适合用于人IgG含量的检测中。且当将这两个抗体制备成双抗体夹心法检测试剂盒时，不仅能够提高检测特异性和准确性，而且相比其他检测方法，也具有高效、快速及通量高的优势。

Description

小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫学检测方法领域，具体而言，涉及一种小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒。
背景技术
IgG是由四条肽链组成的蛋白复合物：两条相同的重链和两条相同的轻链排列而成的一个Y 型抗体单体。每个 IgG 都有 2 个抗原结合位点。IgG 是唯一能够通过人类胎盘的免疫球蛋白，从而给子宫内的胎儿提供保护。IgG是机体免疫细胞识别抗原后合成并分泌的，在血液中含量很高，占血液中免疫球蛋白的75%左右。免疫球蛋白含量的高低与许多疾病有密切的联系（如含量升高常见于各种慢性感染、肺结核、慢性肝病及自身免疫性疾病如类风湿性关节炎等；而在肾病、免疫缺陷综合征、蛋白丢失性肠病、慢性淋巴细胞白血病等情况下，IgG含量会降低）。血液制品、科学实验、临床诊断中，快速、准确的检测人血清中IgG的含量都有很大的参考价值。从献血者的血浆中提取的 IgG 抗体可用作静脉注射免疫球蛋白，来治疗免疫缺陷、自身免疫性疾病和感染性疾病。
目前常用的IgG测定方法是免疫比浊法，免疫比浊法是利用抗原和抗体可以特异性结合的性质，在液相中产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定折射或吸收后的透射光或散射光推算出其中的含量。其缺点有：需要样本量较多，关键试剂使用量较多（抗人IgG血清）；大批量检测困难，操作复杂，且需要特定的分析仪器；实验重复性较差；液体中形成的复合物分子不够稳定，要足够大足够多才能有较为准确的读值，在样本含量低时准确度会很差；所使用的缓冲体系中还需要用到叠氮钠危险品。紫外-分光光度法测定IgG含量也有上述缺点。
其他的检测方法还有免疫扩散实验，其缺点是实验操作影响因素多，检测时间长，灵敏度差，适合于粗略估计样本中的含量；HPLC及毛细管电泳法，其缺点是需要专门的仪器和经验丰富的人员操作，仪器价格昂贵。
因此，仍需要提供一种新的检测人IgG含量的方法，以提高检测的便利性及准确性。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒，以解决现有技术中的检测繁琐或准确性低或检测通量低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株2H10，保藏编号为CCTCC NO:C202234，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；或者杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株7H10，保藏编号为CCTCC NO:C202245，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
根据本发明的第二方面，提供了一种抗人IgG抗体，抗人IgG抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或者为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
进一步地，抗人IgG抗体为上述的抗人IgG单抗杂交瘤细胞株产生的；优选地，抗人IgG抗体为固相载体包被抗体或为检测标记所标记的抗体；优选地，固相载体选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；优选地，检测标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记；优选地，酶标记选自如下任意一种：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶。
根据本发明的第三方面，提供了一种抗人IgG抗体组合，组合包括抗人IgG抗体1和抗人IgG抗体2，抗人IgG抗体1的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQID NO:4，抗人IgG抗体2的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
进一步地，抗人IgG抗体1和抗人IgG抗体2均来源于杂交瘤细胞株，其中，抗人IgG抗体1的杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株7H10，保藏编号为CCTCC NO:C202245，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；抗人IgG抗体2的杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株2H10，保藏编号为CCTCC NO:C202234，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；优选地，抗人IgG抗体1包被于固相载体上，抗人IgG抗体2为带有检测标记的抗体；优选地，固相载体选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；优选地，检测标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记；优选地，酶标记选自如下任意一种：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶。
根据本发明的第四方面，提供了一种人IgG含量检测试剂盒，试剂盒包括上述抗人IgG单抗杂交瘤细胞株，或上述的抗人IgG抗体，或者上述抗人IgG抗体组合。
进一步地，试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
进一步地，试剂盒为双抗体夹心法免疫检测试剂盒。
根据本发明的第五方面，提供了一种人IgG含量检测方法，检测方法包括：利用上述任一种试剂盒进行检测。
根据本发明的第六方面，提供了一种基因，该基因编码前述抗人IgG抗体，当抗人IgG抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4时，编码轻链可变区的基因的序列为SEQ ID NO:1，编码重链可变区的基因的序列为SEQ ID NO:2；当抗人IgG抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8时，编码轻链可变区的基因的序列为SEQ ID NO:5，编码重链可变区的基因的序列为SEQ ID NO:6。
应用本发明的技术方案，通过筛选两株抗人IgG单抗杂交瘤细胞株，获得了两个新的抗人IgG的抗体，具有较高的特异性，因而适合用于人IgG含量的检测。且当将这两个抗体制备成双抗体夹心法检测试剂盒时，不仅能够提高检测特异性和准确性，而且相比其他检测方法，也具有高效、快速及通量高的优势。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例一制备得到抗体的电泳检测结果图。
图2示出了本发明的实施例二中通过双抗夹心ELISA的方法建立的标准曲线。
菌种保藏说明
分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株2H10，保藏编号为CCTCC NO:C202234，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，电话为027-68752319。
分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株7H10，保藏编号为CCTCC NO:C202245，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，电话为027-68752319。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中检测人IgG含量的方法存在要么检测繁琐，要么检测准确性低、需要样本量高等问题，为了改善这一现状，本发明综合分析了现有技术的各种检测方法，并从操作方便程度、对操作人员要求的高低程度、是否需要专门的仪器以及检测灵敏度、特异性及检测通量等多方面考虑，初步选择采用酶联免疫的方法来进行检测。进一步，从高特异性的角度考虑，进一步选择双抗体夹心法进行检测。
对于双抗体夹心法的检测灵敏度和特异性而言，重要的在于提供针对人IgG的两个不同的抗体。在本发明第一种典型的实施方式中，提供了一种小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为2H10，保藏号为CCTCC NO:C202234；或者该杂交瘤细胞株为7H10，保藏号为CCTCC NO:C202245。
在本发明第二种典型的实施方式中，提供了一种抗人IgG抗体，该抗人IgG抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或者为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。这两个抗体都是新的抗人IgG的抗体，具有较高的特异性，因而适合用于人IgG含量的免疫检测中。且当将这两个抗体制备成双抗体夹心法检测试剂盒时，不仅能够提高检测特异性和准确性，而且相比其他检测方法，也具有高效、快速及通量高的优势。
优选地，上述轻链和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的抗人IgG抗体来源于杂交瘤细胞株为7H10，保藏号为CCTCC NO:C202245。轻链和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的抗人IgG抗体来源于杂交瘤细胞株为2H10，保藏号为CCTCC NO:C202234。
相应地，编码上述抗体的基因的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或者为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。利用上述抗体的基因可以进一步经过基因重组，构建出不同的抗体基因，进而经过表达，获得具有上述轻链可变区和重链可变区的具体结构的抗体，比如Fab抗体，ScFv抗体或全长抗体等。具体方法或操作手段，采用现有技术即可。
上述基因序列和氨基酸序列分别如下：
SEQ ID NO:1
gacatccagatgacccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcaatctcacttgccgggcaagtcagcgcattgatggaagcttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactattaaactcctggtctacgccacatccagtcttgaatctggtgtccccaaaaggttcagaggcagtaggtctgggtcagattattctctcaccatcagcagccttgagtctgaagattttgcagactattactgtcaacaatatggtacttctccgctcacgttcggtgctgggaccaagttggaactgaaa。
SEQ ID NO:2
caggttcagttgctgcagtctggacctgaactgatgaaacctgggacctcagtgaggatgtcctgcaagacctctggctactcattcactggctactggatggagtgggtcaaacagaggcctggacatggccttgaatggattggagagattttgcctggaactgataaaactaattacaataagaacttcaaggacaaggccactctcactgcagatacgtcctcctccacagcctatttgcaagtcaccagcctgacatctgaggactctgccgtctatttttgtgtgagaggttatggtgactccgggtcctggtttctttactggggccaggggactctggtcactgtctctaca。
SEQ ID NO:3
DIQMTQSPSSLSASLGERVNLTCRASQRIDGSLNWFQQKPDGTIKLLVYATSSLESGVPKRFRGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCQQYGTSPLTFGAGTKLELK。
SEQ ID NO:4
QVQLLQSGPELMKPGTSVRMSCKTSGYSFTGYWMEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTDKTNYNKNFKDKATLTADTSSSTAYLQVTSLTSEDSAVYFCVRGYGDSGSWFLYWGQGTLVTVST。
SEQ ID NO:5
cagattgttctcacccagtctccaacaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagttcaattgttagtgatatgttctggtatcaacagaagtcaggatcttcccccagactcctgatttatgacacatccagcctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgtgacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggcgttattacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa。
SEQ ID NO:6
gatgtgcagcttcaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctacttaatctccagtgcttatgcctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggttacatagacttcagtggtgccactaactataacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacgtccaagaaccagttcttcctgcagttgaattctgtgactcctgaagacacagccacatattactgtgcaagagaagatgtggggtcaggggcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca。
SEQ ID NO:7
QIVLTQSPTIMSASPGEKVTMTCSASSIVSDMFWYQQKSGSSPRLLIYDTSSLASGVPVRFSGSGSVTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWRYYPLTFGAGTKLELK。
SEQ ID NO:8
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYTISSAYAWNWIRQFPGNKLEWMGYIDFSGATNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYYCAREDVGSGAYWGQGTLVTVSA。
根据实际检测产品的形式要求，上述抗人IgG抗体还可以被设置为合适的抗体产品形式。比如，上述抗人IgG抗体为固相载体包被抗体或为检测标记标记的抗体。优选地，固相载体选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；优选地，检测标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记；优选地，酶标记选自如下任意一种：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶。在本发明一种优选的实施例中，其中一个抗体被设计为酶标抗体，适用于直接与抗原结合进行检测，也适用于作为双抗体夹心法中的酶标抗体。
根据本发明的第三个方面，提供了一种抗人IgG抗体组合，该组合包括抗人IgG抗体1和抗人IgG抗体2，抗人IgG抗体1的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，抗人IgG抗体2的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8。采用这两个抗体的组合，能够采用双抗体夹心法检测待测样品（如血清、血液制品）中的人IgG的含量。
优选地，上述抗人IgG抗体1来源于杂交瘤细胞株7H10，保藏号为CCTCC NO:C202245，上述抗人IgG抗体2来源于所述杂交瘤细胞株2H10，保藏号为CCTCC NO:C202234。
上述抗人IgG抗体组合中，两种抗体的设置形式也根据检测方法的不同而进行合理选择。优选地，抗人IgG抗体1包被于固相载体上，抗人IgG抗体2为带有检测标记的抗体。具体地，固相载体包括但不限于酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。优选地，检测标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记；优选地，酶标记选自如下任意一种：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶。
根据本发明的第四个方面，提供了一种人IgG含量检测试剂盒，该试剂盒包括上述小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、任一种抗人IgG抗体或任一种抗人IgG抗体组合。
在一种优选的实施例中，该试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
在一种优选的实施例中，该试剂盒为双抗体夹心法免疫检测试剂盒。
根据实际需要，上述试剂盒可以利用单一一种抗体进行检测，也可以同时利用两种抗体进行检测。
利用本发明的两种抗体的组合来进行检测时，采用双抗体夹心法进行检测，能够实现快速、准确且检测通量高的效果。
根据本发明的第五个方面，提供了一种人IgG含量检测方法，该检测方法包括：利用上述任一种试剂盒进行检测，具有快速、准确且检测通量高的效果。
需要说明的是，在本发明优选的实施例中采用双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术检测人IgG含量。其中，双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术检测人IgG含量的原理如下：
（1）将抗人IgG抗体1包被在酶标板上，形成包被抗体；
（2）分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的人IgG会与酶标板上的包被抗体充分结合；
（3）洗板，去除与酶标板上的抗体未进行非特异性结合的物质；
（4）加入标记的抗人IgG抗体2（如HRP标记），该抗体与酶标板上包被抗体捕获的标准品和样本中的人IgG发生特异性结合；
（5）洗板，去除与抗原-抗体复合物未进行非特异性结合的物质；
（6）加入显色剂底物（如与HRP对应的TMB），若反应孔中样品存在不同浓度的人IgG，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；
（7）最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的人IgG浓度与OD成正比，通过标准曲线便可计算出样本中人IgG的浓度。
这种方法借助了酶显色放大体系，其检测灵敏度较高，可以检测含量比较低（浓度低至0.3125ng/ml）的样本。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
实施例一、抗人IgG单抗的制备
1、动物免疫
选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使用天然提取的人IgG抗原与等体积弗氏佐剂乳化后进行免疫，免疫周期为两周，免疫3次后取血测效价，融合前三天再次加强免疫。
2、细胞融合
采用断颈处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作如下：
a.骨髓瘤（SP2/0）细胞活化:
解冻并复苏商品化SP2/0细胞，随后重悬于营养液(RPMI-1640，添加小牛血清)中，置于37℃、5%CO2条件下培养箱培养；3-5d后进行传代；
收集细胞并悬浮于1640基础液中，计数后取0.5~1×106个注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9~10d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5 min后无菌操作取瘤。
剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加1640基础液充分研磨后补加10 mL 1640液，静置2 min，吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mL1640液，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000 r/min离心10 min去上清，随后重悬于30 mL基础1640液中。
于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200 r/min离心 15min，吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用1640液清洗细胞2遍后重悬于10mL 1640液中，计数后备用。
b.免疫脾细胞的制备：
取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。
c.饲养细胞的制备：
取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2~3 mL 1640基础液，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10 min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5%C02培养箱中待用。
d.融合：
将1-2×107个SP2/0与108个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000 r/min，离心8min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50%PEG 0.8 mL (sigma)，搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的1640基础液10ml。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清于37℃放置5-8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250ul/孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
3、杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。具体操作如下：
a.用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：
包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10μg/ml；向微孔中每孔加100μl，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃ 1h；甩掉孔内液体（尽量拍干空里面的液体）；洗涤3次，每次2～3min。
封闭酶标孔中没被抗原包被的位置:向微孔中每孔加200μl封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样:将待测的杂交瘤每孔取50μl上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀37℃ 1h，洗涤，拍干。
加酶标抗抗体:先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μlml，轻轻摇匀，置37℃ 1h；然后洗涤，拍干。加显色液：每孔加新鲜配置的显色液100μl，轻轻摇匀，37℃，10min。终止反应：每孔加终止液50μl。
判定结果：酶标仪OD450下进行读数，大于阴性孔3倍可判定为阳性。
b.杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)
克隆前制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到5、10、30个细胞/毫升；
将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100μl/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和3个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；
特异性抗体的检测:在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水。
4、单抗细胞株7H10与2H10可变区序列测定
收集杂交瘤细胞数量大于106：采用索莱宝科技有限公司总RNA提取试剂盒，并按照说明书操作分别提取两株细胞（7H10细胞株和2H10细胞株）的总RNA；按照索莱宝反转录试剂盒合成cDNA第一条链；送至苏州泓迅进行后续构建及测序。
得到基因测序结果是：
7H10细胞株轻链可变区序列长321bp，编码107个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链可变区序列长360bp，编码120个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:2所示，蛋白序列如SEQ ID NO:4所示。
2H10细胞株轻链可变区序列长318bp，编码106个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；重链可变区序列长360bp，编码120个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:6所示，蛋白序列如SEQ ID NO:8所示。
5、抗体制备
建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，7天左右收集腹水，采用Protein G亲和层析纯化抗体（见图1）。
实施例二、检测人IgG含量的双抗夹心ELISA试剂盒建立
1、源于细胞株2H10的单抗（抗人IgG抗体2）的HRP标记
将抗人IgG抗体2加入到透析袋中，4℃浸入0.01M 的CB缓冲液中过夜透析。取10mgHRP，溶于2ml水中。配制新鲜的NaIO4溶液，0.1mol/L，加0.4ml 0.1 mol/L NaIO4于2ml POD溶液中，混匀，室温避光45min，浸入10mM 的NaAc缓冲液中4℃过夜透析。取出过夜透析的抗体和POD溶液加pH为9.5的0.2 mol/L碳酸盐缓冲液0.1ml。
然后立即在POD溶液中加入已经取出的抗体，室温避光轻轻搅拌2h。称取0.04gNaBH4溶于10ml水中，取0.4ml加入反应液中，混匀，置于4℃，2h。取出放于透析袋中，于0.01mol/L PBS中透析，两小时后换一次液，4℃过夜透析。取出过夜透析的标记液，加入等体积甘油，放于-20℃保存。
2、源于细胞株7H10的单抗（抗人IgG抗体1）酶标板的制备
用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗人IgG抗体1稀释至2μg/ml。在96孔聚苯乙烯试剂板反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。经过上述步骤后，用2%BSA溶液封闭反应板的每个孔，每孔0.3ml，2h。弃去孔内溶液，放干房干燥后抽真空，4℃保存。
3、双抗夹心ELISA方法的建立
实验前30 min，拿出抗人IgG抗体1包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释浓度的人IgG标准品，人IgG稀释浓度为25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.78125ng/ml、0.390625ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl酶标记抗体HRP-2H10工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液2M 硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5min内）。以不同浓度的人IgG标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，其检测范围为0.4-25ng/ml，R2为0.9998（参见图2）。
4、双抗夹心ELISA特异性检测
实验前30 min，拿出抗人IgG抗体1包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释倍数的人IgG标准品（来源：Solarbio，货号为SP001）或高浓度的人IgG结构类似蛋白，其中人IgA、人IgM、兔IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、牛IgG、猪IgG，所有样品做高浓度稀释，分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体HRP-2H10工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液2M 硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5 min内）。结果显示，该抗体对不与其他类似蛋白反应。（表1）
表1：
Figure 360897DEST_PATH_IMAGE001
5、双抗夹心ELISA试剂盒稳定性检测
将抗人IgG抗体1包被好的酶标板、HRP标记的单抗2H10、及标准品人IgG放于37℃进行加速稳定性实验，放置10天（约4℃放置15个月）。随后取出检测，检测方法为，取出酶标板洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释浓度的人IgG标准品，人IgG稀释浓度为20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体HRP-2H10工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液2M 硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5 min内）。以不同浓度的人IgG标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，试剂盒稳定性良好（见表2）。
表2：
Figure 464988DEST_PATH_IMAGE002
实施例三、与国内外其他品牌同种类型试剂盒测试结果比较
选择国内伊莱瑞特（Elascience） （名称：QuicKey Human IgG(ImmunoglobulinG) ELISA Kit 货号：E-TSEL-H0011）及国外Bio-tech（Novus 名称：Human IgG ELISA Kit(Colorimetric) 货号：NBP2-60474）品牌进行类比测试，按照各品牌最适的方式进行实验（完全按照其说明书进行操作）。通过以下两个方面对3种试剂盒的性能进行比较。
a. 标准曲线比对：结果表明本试剂盒拟合曲线优于其他两个品牌试剂盒（R2=0.999）且本试剂盒本底表现优良（零孔值，即空白值为0.018），低于其他两个品牌试剂盒（表3）。
表3：
Figure 775884DEST_PATH_IMAGE003
。
b.样本测定结果比对：随机选择16份人血清样本同时进行测定（单位mg/ml），根据文献报道正常人血清中IgG含量范围为3-16mg/ml（根据年龄、个体不同含量不同）。测定结果显示本试剂盒测定含量与X品牌相一致，范围在3-12mg/ml之间，Y品牌测出的含量偏高，在13-40mg/ml之间，是本试剂盒测定值的3-5倍，与参考范围差别也较大（表4）。
表4：
Figure 577618DEST_PATH_IMAGE004
实施例四、人血清IgG含量测定
实验前30 min，拿出抗人IgG抗体1包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。选择实验室自愿献血者血清4份（编号为1、2、3、4号），加入100μl不同稀释倍数的人血清样本/标准品，样品稀释倍数为100万倍和200万倍，人IgG标准品稀释浓度为20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/m并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体HRP-2H10工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液2M 硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5min内）。检测结果表明该方法能准确测定人血清IgG的含量，且在一定范围内有良好的线性关系（表5）。
表5：
Figure 923149DEST_PATH_IMAGE005
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过开发两种新的抗人IgG的抗体，并在此基础上开发了一种能准确、快速、大批量检测样品中人IgG含量的试剂盒，尤其是基于双抗体夹心法的免疫检测试剂盒。
与免疫比浊法（mg级别）、紫外-分光光度法（mg级别）、HPLC法（mg级别）等其他方法相比，其所应用的试剂盒检测灵敏度高（ng级别），范围为0.3125-25ng/ml（从实施例2的曲线可看出）。
与免疫比浊法（约4h）、紫外-分光光度法（约4h）、HPLC法（约4h）等其他方法相比，其所应用的试剂盒检测时间短（2.5h），可高通量进行检测（以70份样检测时间相比较）
对其所应用的试剂盒做37℃做加速稳定性实验，10天内试剂盒没有显著变化，稳定性高。对其所应用的试剂盒做类似蛋白交叉实验，试剂盒表现出高特异性，不识别人IgA、人IgM、兔IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、牛IgG、猪IgG。
其所应用的试剂盒与国外同品种试剂盒相比，无差别。可以代替国外该进口试剂盒。与国内同品种试剂盒相比，表现更优异。
需要说明的是，IgG从结构上可以分为Fab（40%）和Fc片段(60%)。Fab片段的可变区是随着针对不同的抗原而变化的(可变区约占Fab的20%)。Fc片段在同一物种间是非常保守的。本发明中的抗体是针对保守区的，因而无论健康人还是患病个体，其体内产生的IgG绝大数的片段都是一样的。也正是由于本发明的抗体针对的是Fc片段，因而检测的含量为所有IgG的含量（通常为3-16mg/ml），而非某种特定病原体的含量范围（μg或ng级）。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京索莱宝科技有限公司
<120> 小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒
<130> PN173530SLAB
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcaat 60
ctcacttgcc gggcaagtca gcgcattgat ggaagcttaa actggtttca gcagaaacca 120
gatggaacta ttaaactcct ggtctacgcc acatccagtc ttgaatctgg tgtccccaaa 180
aggttcagag gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
gaagattttg cagactatta ctgtcaacaa tatggtactt ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagt tggaactgaa a 321
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
caggttcagt tgctgcagtc tggacctgaa ctgatgaaac ctgggacctc agtgaggatg 60
tcctgcaaga cctctggcta ctcattcact ggctactgga tggagtgggt caaacagagg 120
cctggacatg gccttgaatg gattggagag attttgcctg gaactgataa aactaattac 180
aataagaact tcaaggacaa ggccactctc actgcagata cgtcctcctc cacagcctat 240
ttgcaagtca ccagcctgac atctgaggac tctgccgtct atttttgtgt gagaggttat 300
ggtgactccg ggtcctggtt tctttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctctaca 360
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Asn Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Asp Gly Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Asp Lys Thr Asn Tyr Asn Lys Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Tyr Gly Asp Ser Gly Ser Trp Phe Leu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
115 120
<210> 5
<211> 318
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 5
cagattgttc tcacccagtc tccaacaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagttc aattgttagt gatatgttct ggtatcaaca gaagtcagga 120
tcttccccca gactcctgat ttatgacaca tccagcctgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgt gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg cgttattacc cgctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 6
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 6
gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggcta cttaatctcc agtgcttatg cctggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga gtggatgggt tacatagact tcagtggtgc cactaactat 180
aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca cgtccaagaa ccagttcttc 240
ctgcagttga attctgtgac tcctgaagac acagccacat attactgtgc aagagaagat 300
gtggggtcag gggcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ile Val Ser Asp Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Val Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Tyr Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asp Phe Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Val Gly Ser Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115

Claims (18)

1.一种小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株2H10，保藏编号为CCTCC NO:C202234，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；或者
所述杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株7H10，保藏编号为CCTCC NO:C202245，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.一种抗人IgG抗体，其特征在于，所述抗人IgG抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或者为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
3.根据权利要求2所述的抗人IgG抗体，其特征在于，所述抗人IgG抗体为权利要求1所述的小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株产生的。
4.根据权利要求3所述的抗人IgG抗体，其特征在于，所述抗人IgG抗体为固相载体包被抗体或为检测标记所标记的抗体。
5.根据权利要求4所述的抗人IgG抗体，其特征在于，所述固相载体选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。
6.根据权利要求4所述的抗人IgG抗体，其特征在于，所述检测标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记。
7.根据权利要求6所述的抗人IgG抗体，其特征在于，所述酶标记选自如下任意一种：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
8.一种抗人IgG抗体组合物，其特征在于，所述组合物包括抗人IgG抗体1和抗人IgG抗体2，所述抗人IgG抗体1的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，所述抗人IgG抗体2的轻链和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
9.根据权利要求8所述的抗人IgG抗体组合物，其特征在于，所述抗人IgG抗体1和所述抗人IgG抗体2均来源于杂交瘤细胞株，
其中，所述抗人IgG抗体1的所述杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株7H10，保藏编号为CCTCC NO:C202245，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；
所述抗人IgG抗体2的所述杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株2H10，保藏编号为CCTCC NO:C202234，保藏日期为2022年3月1日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
10.根据权利要求9所述的抗人IgG抗体组合物，其特征在于，所述抗人IgG抗体1包被于固相载体上，所述抗人IgG抗体2为带有检测标记的抗体。
11.根据权利要求10所述的抗人IgG抗体组合物，其特征在于，所述固相载体选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。
12.根据权利要求10所述的抗人IgG抗体组合物，其特征在于，所述检测标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记。
13.根据权利要求12所述的抗人IgG抗体组合物，其特征在于，所述酶标记选自如下任意一种：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶。
14.一种人IgG含量检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株，或权利要求2至7中任一项所述的抗人IgG抗体，或者权利要求8至13中任一项所述的抗人IgG抗体组合物。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为双抗体夹心法免疫检测试剂盒。
17.一种体外非诊断目的的人IgG含量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：利用权利要求14至16中任一项所述的试剂盒进行检测。
18.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求2所述的抗人IgG抗体，
当所述抗人IgG抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4时，编码所述轻链可变区的基因的序列为SEQ ID NO：1，编码所述重链可变区的基因的序列为SEQ ID NO：2；
当所述抗人IgG抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8时，编码所述轻链可变区的基因的序列为SEQ ID NO：5，编码所述重链可变区的基因的序列为SEQ ID NO：6。
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