CN113735968A - 一种猪传染性胃肠炎病毒n蛋白抗体效价测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，包括如下步骤：S1、实验动物免疫测试；包括N蛋白免疫双峰驼和N蛋白抗体效价的测定；S2、构建VHH噬菌体文库；包括扩增VHH基因及展示载体构建和纳米抗体文库的构建以及库容量测定；S3、淘选N特异性纳米抗体；包括文库救援及重组噬菌体滴度测定、淘选N蛋白特异性重组噬菌体、蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备和N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测。

Description

一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域。特别涉及一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性接触性传染病，临床上主要变现为脱水、严重腹泻、呕吐、肠绒毛萎缩，该病对初生仔猪具有严重危害作用，极易造成哺乳期仔猪死亡，给我国养猪业带来巨大经济损失。完整的TGE病毒包含四种结构蛋白：分别为包裹着基因组RNA的核衣壳蛋白N(简称N蛋白)、脂质囊膜中的膜结合蛋白M，形成病毒凸起的糖蛋白S，小膜蛋白sM。其中N蛋白作为猪传染性肠胃炎病毒的核衣壳蛋白，其本质是一种磷酸化蛋白，包裹着病毒基因组，并在RNA复制加工过程中起重要作用，N蛋白具有很强的保守性，可以做为TGE的诊断抗原。目前，市面上存在TGE的检测试剂盒是基于多克隆抗体和单克隆抗体而制备的，单抗制备过程费时费力，杂交瘤细胞生产单抗所需成本高；多克隆抗体虽制备过程简单，但存在针对表位繁多、特异性低等问题。纳米抗体制备筛选过程简单，分子量小，能够深入抗原结构的缝隙中，识别单克隆抗体识别不到的隐藏表位，还具有高稳定性、高亲和力、易于基因工程改造等优势，可通过不同的表达系统获得，生产成本低，可以作为一种良好的诊断和治疗工具。
骆驼血液中存在的一种特殊形式的抗体，在自然条件下该抗体没有轻链且重链部分缺失第一恒定区(constant region 1，CH1)，被称为重链抗体(heavy chainantibodies,HCAbs)。重链抗体可变区(variable domain of heavy chain antibody，VHH)由四个框架区(framework regoin，FR)和三个互补决定区(complementarity-determiningregion，CDR)构成。VHH结构长4nm，直径为2.5nm，所以又称纳米抗体(nanobody，Nb)是自然条件下存在的可与抗原结合的最小片段，相对分子质量15000，为传统抗体的1/10左右。纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势，并且可通过不同的表达系统获得，是一种良好的诊断和治疗工具。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法。
为了达到该目的，本发明采用以下技术手段：
一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，包括如下步骤：
S1、实验动物免疫测试；包括N蛋白免疫双峰驼和N蛋白抗体效价的测定；
S2、构建VHH噬菌体文库；包括扩增VHH基因及展示载体构建和纳米抗体文库的构建以及库容量测定；
S3、淘选N特异性纳米抗体；包括文库救援及重组噬菌体滴度测定、淘选N蛋白特异性重组噬菌体、蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备和N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测。
作为一种优先的技术方案，步骤S1中，
N蛋白免疫双峰驼；将1mL通过亲和层析法纯化的重组N蛋白(1mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂混匀，乳化完全后形成油包水状态，注射于骆驼颈部，注射方式为皮下注射；第二次至第五次免疫均采用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔期为两周，第五次免疫五次后通过颈静脉采集外周血200mL；
N蛋白抗体效价的测定；将采集的血液分离出血清用于检测针对N蛋白的抗体效价，未免疫前血清作对照，通过间接ELISA检测血清中抗N蛋白的抗体效价。
作为一种优先的技术方案，步骤S1中，
扩增VHH基因及展示载体构建；
将颈静脉采集的200ml的外周血装入抗凝血采血袋，并加入相同体积的细胞培养基稀释好血液，分离外周血淋巴细胞，使用RNA提取试剂盒进行RNA提取；以提取的RNA作为模板，扩增第一轮，胶回收700bp附近的条带，以cDNA为模板，扩增VHH基因；将第二轮PCR产物进行电泳，切取400bp附近条带，用胶回收试剂盒回收PCR产物；选择Pst I和Not I酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切16h后，使用DNA连接酶将VHH连接至pCANTAB5E载体；
纳米抗体文库的构建以及库容量测定
将扩增VHH基因及展示载体构建的连接产物通过电转化至TG1感受态细胞中，转化结束后加入10ML预热的SOC培养基置于37℃摇床中220rpm培养1h；取出50μL菌体涂布于LB/Amp-GLU固体平板上，37℃倒置培养6-8h，用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，加入浓度为50％的甘油，分装保存于-80℃；取出少量菌液涂板培养12h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，随机挑取47个单菌落进行菌液PCR鉴定。
作为一种优先的技术方案，步骤S3中，
文库救援及重组噬菌体滴度测定；2×TY/Amp-GLU培养基中加入1ML文库菌液，置于摇床培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min，离心15min弃上清，使用2×TY/Amp-Kan重悬菌体，37℃，220rpm培养14h，离心40min弃上清，加入PEG/NaCl混匀，4℃静置6h，12000g离心5min后加入1ML PBS重悬；蘸取TG1菌液涂布于M9平板，37℃放置40h，挑取单菌落培养至对数期，用2×TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9、10-10的样品100μL加入到200μL的TG1菌液中，37℃静置30mi涂布于LB/Amp-GLU平板，37℃恒温培养箱中培养8h，计算噬菌体滴度。
作为一种优先的技术方案，步骤S3中，
淘选N蛋白特异性重组噬菌体；每孔包被10μg N蛋白，对照孔包被PBS，加入100μl3％的BSA，室温封闭1h；PBS’T洗板4次，噬菌体稀释至5×1011pfu/ml加入100μl，25℃孵育1h；洗板结束后加入0.1M三乙胺100μl，置于通风橱静止10min，加入100μl的1M Tris-HCl(pH7.4)中和，测定洗脱下来的噬菌体滴度；取2mL对数生长期的TG1菌液，加入100μl噬菌体溶液混匀，37℃培养箱放置30min，立即加入8mL 2×TY/Amp-GLU培养基，置于摇床中培养至对数生长期；取40μlM13K07辅助噬菌体加入到培养基侵染1h，离心后用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床培养12h；重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程。
作为一种优先的技术方案，步骤S3中，
N蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备；包被N蛋白400ng每孔，4℃过夜，使用3％的BSA封闭1h。PBS’T洗涤3次，每孔100μL十倍稀释的噬菌体溶液，孵育1h；洗板三次加入抗M13噬菌体单克隆抗体(1：3000稀释)100μl，25℃孵育1h后使用PBS’T洗板3次，加入TMB显色液静置15min显色，每孔加入3M硫酸50μl终止，使用分光光度计读值；取第三轮噬菌体洗脱液100μl，涂布于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度1mM IPTG诱导表达；将菌液离心10min后收集菌体，置于-80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μl PBS离心收集上清。
作为一种优先的技术方案，步骤S3中，
N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测；N蛋白包被400ng每孔，PRRSV-N蛋白作为对照蛋白，PBS’T洗3次后加入200μL 3％BSA室温封闭1h，洗去封闭液，向孔中加入稀释好的纳米抗体粗提物100μL，25℃孵育1h，PBS’T洗涤结束后，加入100μL Mouse@E-tag(1:2000)抗体并置于室温孵育1h，洗板三次后加入100μL HRP标记的羊抗鼠的IgG(1:5000)，洗板结束后每孔加入100μLTMB显色液避光显色10min；反应后加入50μL 3mol/L的H2SO4终止，读取OD450吸光值；将实验孔比对照孔数值高三倍以上的孔记录，对应的阳性的克隆测序后根据其CDR区域将序列分类，48个阳性克隆含有12株高变区序列不同的纳米抗体，用ELISA鉴定纳米抗体的特异性和效价。
本发明还提供一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白纳米抗体，所述N蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
优选地，所述N蛋白纳米抗体的氨基酸序列与SEQ ID No.1具有90％以上的同源性。
本发明还提供所述的纳米抗体在制备抗猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用。
为制备猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白的纳米抗体，本发明将N蛋白的基因克隆至pET-21b表达载体，转化至大肠杆菌中表达，并通过亲和层析法纯化得到N蛋白，免疫骆驼后分离其外周血淋巴细胞利用巢氏PCR方法扩增双峰驼的VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术经过淘选，共筛选到12株N蛋白特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与N蛋白特异性反应，其中Nb9(即SEQ ID No.1序列的蛋白)有较强的结合力，被选用于下一步抗病毒试验的研究。本发明分别在ST细胞开展了病毒感染实验，接毒量在0.01个MOI后，Nb9对病毒复制的有明显的抑制作用。
本发明取得了如下积极效果：
N蛋白作为病毒的保守性蛋白，在病毒变异快速的情况下，编码病毒N基因的同源性很高。基于筛选到针对N蛋白纳米抗体，发明了一种简便、快速检测猪血清中抗TGEV抗体的灵敏、特异、简便、快速的竞争ELISA方法，开发成为试剂盒，可用于检测猪血清中TGEV病毒抗体水平和评价疫苗免疫效果。
附图说明
图1为重组质粒pET-28a-N在BL21(DE3)感受态细胞的表达情况。其中：M:蛋白质marker 1:pET-28a-N未诱导2:0.1mMIPTG诱导
图2为五次免疫后，采集骆驼血后检测血清中抗体效价。其中：横坐标：骆驼血清稀释比例，纵坐标：OD450吸光度
图3为展示文库的构建与鉴定。其中：A：第一轮PCR B：第二轮PCR C：载体的双酶切D：菌液PCR鉴定阳性率
图4为N蛋白特异性噬菌体的富集情况。
图5为间接ELISA检测针对N蛋白的VHH。
图6为Nb9的特异性及效价检测。
图7为棋盘滴定法确定最佳抗原及Nb9使用量
图8为确定最佳血清稀疏度
图9为真核表达载体菌液PCR鉴定。其中：A：pEGFP-N1载体图谱信息B：pCAGEN载体图谱信息C：载体和N基因的双酶切及回收D：菌液PCR鉴定真核表达载体的构建
图10为Nb9的表达及鉴定。其中：A：Nb9-EGFP在HEK 293T细胞的表达B：westernblot鉴定Nb9在pEGFP-N1和pCAGEN载体上的表达情况M：maker 1：pEGFP-N1-Nb9-EGFP 2：pCAGEN-Nb9
图11为Nb9在ST细胞中对病毒复制的影响。其中：(A)用q-PCR检测细胞感染病毒后N基因mRNA的变化水平；(B)检测细胞培养基中子代病毒的滴度；(C)IFA检测Nb9抑制病毒表达情况。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详述本发明，但需说明的是，本发明的保护范围不受这些具体实施方式和原理性解释的限制，而是由权利要求书来确定。
本发明中，除了明确说明的内容之外，未提到的任何事宜或事项均直接适用本领域已知的那些而无需进行任何改变。而且，本文描述的任何实施方式均可以与本文描述的一种或多种其他实施方式自由结合，由此形成的技术方案或技术思想均视为本发明原始公开或原始记载的一部分，而不应被视为是本文未曾披露或预期过的新内容，除非本领域技术人员认为该结合明显不合理。
本发明所公开的所有特征可以任意组合，这些组合应被理解为本发明所公开或记载的内容，除非本领域技术人员认为该组合明显不合理。
本说明书所公开的数值点，不仅包括实施例中具体公开的数值点，还包括说明书中各数值范围的端点，这些数值点所任意组合的范围都应被视为本发明已公开或记载的范围。
本发明中的技术和科学术语，给出定义的以其定义为准，未给出定义的则按本领域的通常含义理解。
实施例1表达并纯化猪传染性胃肠炎病毒N蛋白
重组载体转化至BL21(DE3)内，取1.5μL质粒加入到100μL的感受态细胞中，将EP管静置于冰上30min，随后42℃水浴锅热激90s，EP管内加入无抗LB 1mL后37℃摇床震荡培养1h，用涂布器涂抹在平板上150μL菌液倒置于恒温培养箱过夜。挑取平板上形状规则的单菌落，加入30mL Amp+LB液体培养基培养，210r/min 37℃，当菌液OD600nm值处于0.6～0.8，加入终浓度为1mM/L IPTG诱导剂，37℃诱导6h后通过SDS-PAGE分析重组N蛋白成功表达(图1)。
实施例2噬菌体展示文库的构建及纳米抗体的淘选
2.1实验动物免疫
2.1.1N蛋白免疫双峰驼
将1mL通过亲和层析法纯化的重组N蛋白(1mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂混匀，乳化完全后形成油包水状态，注射于骆驼颈部，注射方式为皮下注射。第二次至第五次免疫均采用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔期为两周，第五次免疫五次后通过颈静脉采集外周血200mL。
2.1.2N蛋白抗体效价测定
将采集的血液分离出血清用于检测针对N蛋白的抗体效价，未免疫前血清作对照，通过间接ELISA检测，血清中抗N蛋白的抗体效价可达1:512000(图2)。
2.2构建VHH噬菌体文库
2.2.1扩增VHH基因及展示载体构建
将颈静脉采集的200ml的外周血装入抗凝血采血袋，并加入相同体积的细胞培养基稀释好血液，分离外周血淋巴细胞按照说明书指示进行，使用RNA提取试剂盒进行RNA提取。以提取的RNA作为模板，扩增第一轮(图3-A)，胶回收700bp附近的条带，以cDNA为模板，扩增VHH基因(图3-B)。将第二轮PCR产物进行电泳，切取400bp附近条带，用胶回收试剂盒回收PCR产物。选择Pst I和Not I酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理(图3-C)，酶切16h后，使用DNA连接酶将VHH连接至pCANTAB 5E载体。
2.2.2纳米抗体文库的构建以及库容量测定
将2.2.1的连接产物通过电转化至TG1感受态细胞中，转化结束后加入10ML预热的SOC培养基置于37℃摇床中220rpm培养1h。取出50μL菌体涂布于LB/Amp-GLU固体平板上，37℃倒置培养6-8h，用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，加入浓度为50％的甘油，分装保存于-80℃。取出少量菌液涂板培养12h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，随机挑取47个单菌落进行菌液PCR鉴定(图3-D)。
2.3淘选N特异性纳米抗体
2.3.1文库救援及重组噬菌体滴度测定
2×TY/Amp-GLU培养基中加入1ML文库菌液，置于摇床培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min，离心15min弃上清，使用2×TY/Amp-Kan重悬菌体，37℃，220rpm培养14h，离心40min弃上清，加入PEG/NaCl混匀，4℃静置6h，12000g离心5min后加入1ML PBS重悬。蘸取TG1菌液涂布于M9平板，37℃放置40h，挑取单菌落培养至对数期，用2×TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9、10-10的样品100μL加入到200μL的TG1菌液中，37℃静置30mi涂布于LB/Amp-GLU平板，37℃恒温培养箱中培养8h，计算噬菌体滴度。
2.3.2淘选N蛋白特异性重组噬菌体
每孔包被10μg N蛋白，对照孔包被PBS，加入100μl 3％的BSA，室温封闭1h。PBS’T洗板4次，噬菌体稀释至5×1011pfu/ml加入100μl，25℃孵育1h。洗板结束后加入0.1M三乙胺100μl，置于通风橱静止10min，加入100μl的1M Tris-HCl(pH7.4)中和，测定洗脱下来的噬菌体滴度。取2mL对数生长期的TG1菌液，加入100μl噬菌体溶液混匀，37℃培养箱放置30min，立即加入8mL 2×TY/Amp-GLU培养基，置于摇床中培养至对数生长期。取40μlM13K07辅助噬菌体加入到培养基侵染1h，离心后用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床培养12h。重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程，噬菌体回收情况如表1所示。
表1淘选过程噬菌体回收情况
Figure BDA0002822019760000091
2.3.3N蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备
包被N蛋白400ng每孔，4℃过夜，使用3％的BSA封闭1h。PBS’T洗涤3次，每孔100μL十倍稀释的噬菌体溶液，孵育1h。洗板三次加入抗M13噬菌体单克隆抗体(1：3000稀释)100μl，25℃孵育1h后使用PBS’T洗板3次，加入TMB显色液静置15min显色，每孔加入3M硫酸50μl终止，使用分光光度计读值(图4)。取第三轮噬菌体洗脱液100μl，涂布于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度1mM IPTG诱导表达。将菌液离心10min后收集菌体，置于-80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μl PBS离心收集上清。
2.3.4N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测
N蛋白包被400ng每孔，PRRSV-N蛋白作为对照蛋白，PBS’T洗3次后加入200μL 3％BSA室温封闭1h，洗去封闭液，向孔中加入稀释好的纳米抗体粗提物100μL，25℃孵育1h，PBS’T洗涤结束后，加入100μL Mouse@E-tag(1:2000)抗体并置于室温孵育1h，洗板三次后加入100μL HRP标记的羊抗鼠的IgG(1:5000)，洗板结束后每孔加入100μLTMB显色液避光显色10min。反应后加入50μL 3mol/L的H2SO4终止，读取OD450吸光值(图5)。将实验孔比对照孔数值高三倍以上的孔记录，对应的阳性的克隆测序后根据其CDR区域将序列分类，48个阳性克隆含有12株高变区序列不同的纳米抗体，用ELISA鉴定纳米抗体的特异性和效价，其中Nb9的抗体特异性及效价如(图6)所示，Nb9能特异性的和N蛋白结合，在稀释度为1:200000时，Nb9的OD450值仍大于阴性对照OD450值的三倍，效价可达200000以上，亲和力非常高。
实施例3竞争ELISA方法的建立
3.1采用棋盘滴定法确定生物素标记纳米抗体和最适包被抗原的浓度和稀释度
将浓度为1mg/ml生物素标记的Nb9作为一抗，HRP标记的链霉亲和素作为二抗，找到OD值在1.0附近的抗体使用浓度。Nb9浓度为10μg/mL～1ng/mL，用不同稀释度(0.5，1，2，4μg/mL)的N蛋白包被于的96孔板，每孔用200μL封闭液封闭，室温孵育1h。洗涤3次后，将不同浓度的生物素化Nb9以100μL每孔加入酶标版，孵育1h洗涤3次后，加入100μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育30min。洗涤3次后，加入100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，避光反应10min。最后，加入50μL浓度为3mol/L的H2SO4停止反应，读取OD450。最终确立最佳N蛋白包被浓度为1μg/mL，生物素标记Nb9浓度为100ng/mL(1:100000)(图7)。
3.2确定最佳血清稀释比例。将阳性血清按照1:5,1:10,1:20,1:40等比例稀释，将稀释好的血清与生物素标记Nb9混匀后加入每孔，孵育1h洗涤3次后，加入100μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育30min。洗涤3次后，加入100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，避光反应10min。最后，加入50μL浓度为3mol/L的H2SO4停止反应，读取OD450值。当阳性血清与阴性血清的OD450值之比(P/N)最大时，确定最佳血清稀释度。最终确立血清稀释比例为1:10(图8)。
3.3Cut-off值的确定
竞争抑制率(PI)计算公式为：PI(％)＝[1-(待测血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值)]×100％。以200份阴性血清样品的平均(PI)加3个标准差(SD)为Cut-off值，对200份阴性猪血清样本进行了cut-off值的确定，200份血清的平均抑制率PI(X)为21.4％，SD为1.9％，竞争ELISA方法的Cut-off值为27.1％(X+3SD)。
3.4特异性、交叉反应性测定
使用猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)阳性猪血清检测该方法的特异性，用TGEV阳性猪血清作为对照，结果如表2所示，竞争抑制率均小于竞争ELISA的Cut-off值27.1％，表明该ELISA方法无交叉反应，具有较强的特异性。
表2特异性实验结果
Figure BDA0002822019760000121
3.5灵敏度测定
用不同稀释度的TGEV阳性血清检测ELISA的灵敏度，并与商品化的ELISA试剂盒进行比较。ELISA的能检出阳性的稀释度为1：160，大于商品化ELISA试剂盒的检出限(1：40)。表明竞争ELISA方法的敏感性强。
表3敏感性实验结果
Figure BDA0002822019760000122
3.6可重复性测试
用6份阳性血清样本的变异系数(CV)评价该方法的板内和板间变异，如表4所示，6份猪TGEV阳性血清样品进行了3次平板内检测，批内变异系数在1.53-4.12％之间，中位数为2.9％。6份血清样品在3个平板上重复3天的ELISA试验，批间变异系数在5.14-9.18％之间，中位数为8.3％。这些结果表明，ELISA具有良好的重复性。
表4重复性评价
Figure BDA0002822019760000123
实施例4Nb9真核表达载体的构建及表达
将Nb9的基因与克隆至pEGFP-N1以及pCAGEN真核表达载体(图9-A，图9-B)，通过双酶切和胶回收(图9-C，图9-D)、连接、转化，以及菌液PCR鉴定(图9-E)重组质粒的构建情况，将HEK 293T细胞铺于细胞六孔板，待细胞密度在80％左右时，将构建好的pEGFP-N1-Nb9质粒转染至HEK 293T细胞中，置于5％CO2培养箱中继续培养36h，通过荧光显微镜下可以观察到HEK 293T细胞中出现特异性的绿色荧光(图10-A)，说明Nb9-EGFP在293T细胞中成功表达。将构建好的pCAGEN-Nb9以及pEGFP-N1-Nb9载体转入HEK 293T细胞，转染后48h收集细胞，加入100μL的NP40裂解液裂解细胞，将细胞裂解物收集进行western blot，抗His的标签抗体稀释比例为1:5000，二抗羊抗鼠的IgG(1mg/ml)稀释比例为1:3000，将PVDF膜置于加入抗体的封闭液中室温孵育一小时后洗膜，加入ECL发光液显色，结果表明两种真核表达载体均在胞内成功表达(图10-B)。
实施例5Nb9胞内抗病毒作用研究
将ST细胞接种于24孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养；待细胞长至70％左右时将，将3.1构建好的pCAGEN-Nb9转染至ST细胞，转染36h后取出细胞，用PBS洗两次，接种0.01MOI的TGEV，37℃孵育1h后，换成含3％FBS的DMEM培养基，继续培养至24h；收集细胞，用qPCR检测N基因的mRNA的水平，孔内的ST细胞用PBS洗涤3次，用TRIzol提取总RNA，根据PrimeScript RT试剂盒说明书进行逆转录，反应体系为20μL，以纤维素甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA为内参，结果表明Nb9显著抑制TGEV N基因的表达，经统计学分析差异极显著(图11-A)。
收集接毒后的每孔的细胞培养液，检测细胞上清中的子代病毒的滴度。将ST细胞接种于96孔板上，病毒上清液按10倍稀释，每孔加入100L，共8个三联孔，感染6天后，用Reed-Muench法计算组织培养的50％感染量(TCID50)，结果表明Nb9可以抑制子代病毒的产生，使病毒滴度下降2个。(图11-B)。
通过间接免疫荧光实验(IFA)检测Nb9对病毒的抑制作用，在固定前，用DAPI在室温下染色5分钟，细胞在室温下用4％多聚甲醛固定10min，用PBS清洗3次，然后用0.2％Triton X-100渗透10min，在室温下用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭30min后，用TGEV的阳性猪血清(1：500)室温孵育1h，用PBS洗涤3次。与Alexa Fluor555偶联的羊抗鼠IgG(1:500)在室温下孵育1h，3次洗涤后将玻片贴在显微镜玻片上，在共聚焦显微镜下观察染色的细胞，转染了NC-Nb33(阳性对照)的感染的细胞作为对照，评估背景染色的阳性率，结果发现接毒量为0.01个MOI时，加入Nb9后感染病毒的细胞数量比阳性孔减少80％以上，感染病毒的荧光细胞明显减少，IFA显示出对病毒复制有明显的抑制作用(图11-C)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、实验动物免疫测试；包括N蛋白免疫双峰驼和N蛋白抗体效价的测定；
S2、构建VHH噬菌体文库；包括扩增VHH基因及展示载体构建和纳米抗体文库的构建以及库容量测定；
S3、淘选N特异性纳米抗体；包括文库救援及重组噬菌体滴度测定、淘选N蛋白特异性重组噬菌体、蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备和N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测。
2.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S1中，
N蛋白免疫双峰驼；将1mL通过亲和层析法纯化的重组N蛋白(1mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂混匀，乳化完全后形成油包水状态，注射于骆驼颈部，注射方式为皮下注射；第二次至第五次免疫均采用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔期为两周，第五次免疫五次后通过颈静脉采集外周血200mL；
N蛋白抗体效价的测定；将采集的血液分离出血清用于检测针对N蛋白的抗体效价，未免疫前血清作对照，通过间接ELISA检测血清中抗N蛋白的抗体效价。
3.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S1中，
扩增VHH基因及展示载体构建；
将颈静脉采集的200ml的外周血装入抗凝血采血袋，并加入相同体积的细胞培养基稀释好血液，分离外周血淋巴细胞，使用RNA提取试剂盒进行RNA提取；以提取的RNA作为模板，扩增第一轮，胶回收700bp附近的条带，以cDNA为模板，扩增VHH基因；将第二轮PCR产物进行电泳，切取400bp附近条带，用胶回收试剂盒回收PCR产物；选择PstI和NotI酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切16h后，使用DNA连接酶将VHH连接至pCANTAB5E载体；
纳米抗体文库的构建以及库容量测定
将扩增VHH基因及展示载体构建的连接产物通过电转化至TG1感受态细胞中，转化结束后加入10ML预热的SOC培养基置于37℃摇床中220rpm培养1h；取出50μL菌体涂布于LB/Amp-GLU固体平板上，37℃倒置培养6-8h，用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，加入浓度为50％的甘油，分装保存于-80℃；取出少量菌液涂板培养12h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，随机挑取47个单菌落进行菌液PCR鉴定。
4.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S3中，
文库救援及重组噬菌体滴度测定；2×TY/Amp-GLU培养基中加入1ML文库菌液，置于摇床培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min，离心15min弃上清，使用2×TY/Amp-Kan重悬菌体，37℃，220rpm培养14h，离心40min弃上清，加入PEG/NaCl混匀，4℃静置6h，12000g离心5min后加入1ML PBS重悬；蘸取TG1菌液涂布于M9平板，37℃放置40h，挑取单菌落培养至对数期，用2×TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9、10-10的样品100μL加入到200μL的TG1菌液中，37℃静置30mi涂布于LB/Amp-GLU平板，37℃恒温培养箱中培养8h，计算噬菌体滴度。
5.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S3中，
淘选N蛋白特异性重组噬菌体；每孔包被10μg N蛋白，对照孔包被PBS，加入100μl 3％的BSA，室温封闭1h；PBS’T洗板4次，噬菌体稀释至5×1011pfu/ml加入100μl，25℃孵育1h；洗板结束后加入0.1M三乙胺100μl，置于通风橱静止10min，加入100μl的1M Tris-HCl(pH7.4)中和，测定洗脱下来的噬菌体滴度；取2mL对数生长期的TG1菌液，加入100μl噬菌体溶液混匀，37℃培养箱放置30min，立即加入8mL 2×TY/Amp-GLU培养基，置于摇床中培养至对数生长期；取40μlM13K07辅助噬菌体加入到培养基侵染1h，离心后用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床培养12h；重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程。
6.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S3中，
N蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备；包被N蛋白400ng每孔，4℃过夜，使用3％的BSA封闭1h。PBS’T洗涤3次，每孔100μL十倍稀释的噬菌体溶液，孵育1h；洗板三次加入抗M13噬菌体单克隆抗体(1：3000稀释)100μl，25℃孵育1h后使用PBS’T洗板3次，加入TMB显色液静置15min显色，每孔加入3M硫酸50μl终止，使用分光光度计读值；取第三轮噬菌体洗脱液100μl，涂布于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度1mM IPTG诱导表达；将菌液离心10min后收集菌体，置于-80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μl PBS离心收集上清。
7.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S3中，
N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测；N蛋白包被400ng每孔，PRRSV-N蛋白作为对照蛋白，PBS’T洗3次后加入200μL 3％BSA室温封闭1h，洗去封闭液，向孔中加入稀释好的纳米抗体粗提物100μL，25℃孵育1h，PBS’T洗涤结束后，加入100μL Mouse@E-tag(1:2000)抗体并置于室温孵育1h，洗板三次后加入100μL HRP标记的羊抗鼠的IgG(1:5000)，洗板结束后每孔加入100μLTMB显色液避光显色10min；反应后加入50μL 3mol/L的H2SO4终止，读取OD450吸光值；将实验孔比对照孔数值高三倍以上的孔记录，对应的阳性的克隆测序后根据其CDR区域将序列分类，48个阳性克隆含有12株高变区序列不同的纳米抗体，用ELISA鉴定纳米抗体的特异性和效价。
8.一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白纳米抗体，其特征在于，所述N蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
优选地，所述N蛋白纳米抗体的氨基酸序列与SEQ ID No.1具有90％以上的同源性。
9.权利要求8所述的纳米抗体在制备抗猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用。
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