KR20080012449A - 뉴클레오캡시드 또는 스파이크 단백질을 이용한 사스진단방법 - Google Patents

뉴클레오캡시드 또는 스파이크 단백질을 이용한 사스진단방법 Download PDF

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KR20080012449A KR1020060073275A KR20060073275A KR20080012449A KR 20080012449 A KR20080012449 A KR 20080012449A KR 1020060073275 A KR1020060073275 A KR 1020060073275A KR 20060073275 A KR20060073275 A KR 20060073275A KR 20080012449 A KR20080012449 A KR 20080012449A
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Abstract

본 발명은 뉴클레오캡시드 또는 스파이크 단백질을 이용한 SARS 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 E. coli 시스템을 이용하여 SARS-CoV-N항원을 생산하거나 VSV (Vesicular stomatitis virus) 시스템을 이용하여 스파이크 (Spike) 항원을 생산하는 모조(pseudotype)의 VSV를 제작함으로써 일반실험실 및 임상에서도 중화 항체가의 검사를 가능하게 하여 안전하고 신속한 SARS 진단 방법을 제공한다.
뉴클레오캡시드, 스파이크단백질, SARS, 항원, 항체

Description

뉴클레오캡시드 또는 스파이크 단백질을 이용한 사스 진단방법 {Diagnostic methods for SARS by using Nucleocapside or spike protein}
도 1은 N 단백질을 인코딩 하는 cDNA의 클로닝에 관한 도이다.
도 2는 클로닝한 cDNA를 대장균 발현 벡터인 N-말단 Nus-tag pET43 벡터에 넣고 대장균에서 발현할 수 있도록 형질전환(Transformation)시킨 것을 나타낸 도이다.
도 3은 N1과 N2를 단백질을 발현시킨 후 정제를 하고 투석을 한 후 Nus-tag를 엔테로키나제 (enterokinase)로 떼어낸 것을 나타낸 도이다.
도 4는 N3 단백질을 발현시킨 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 제작한 SARS-CoV-N 단클론 항체 + Gold 및 SARS-CoV가 있는 검체를 혼합하여 SARS-CoV-N 단클론 항체가 흡착되어있는 막 (membrane)에 반응하는 것을 나타낸 도이다.
도 6은 SARS 스파이크 단백질을 PCR한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 S 단백질은 인코딩하는 cDNA의 클로닝에 관한 도이다.
도 8은 형질감염(transfection) 및 감염(infection)의 모식도이다.
도 9는 ELISA 진단을 위한 검체 준비에 관한 도이다.
도 10은 HA 어세이(assay)를 위한 검체 준비에 관한 도이다.
본 발명은 사스코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 또는 스파이크 단백질 항원을 이용한 SARS 진단방법에 관한 것이다.
급성호흡기증후군, 일명 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome)는 기존의 사람 코로나바이러스인 HCoV-229E, HCoV-OC43와는 다른, SARS-CoV 라는 변종코로나바이러스에 의해 유발되는 바이러스성 호흡기질환이다. 사스는 2003 년 2 월 아시아에서 처음으로 보고되었으며, 그 후 불과 몇 개월 사이에 북미, 남미, 유럽 및 아시아의 26개국 이상으로 퍼져나갔다. SARS는 2003. 2. 26 베트남 하노이에서 처음 발생하여 전 세계적으로 퍼져나가고 있는 전염성 질환에 대해 WHO(세계보건기구)가 명명한 것이고, 비전형성 폐렴은 2002년 11월 광동성에서 발생하여 괴질로 명명된 질환을 말한다. 그러나 이 둘은 서로 매우 흡사한 증상을 나타내어 동일 질병으로 규정, SARS라 명명하게 되었다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 2003년 전 세계에 걸쳐 총 8,098 명의 사람들이 사스에 감염되었으며, 이들 중 774 명이 사망한 것으로 보고되었다.
SARS-CoV는 29.7 Kb의 nuceotides를 가지며 4개의 중요한 구조 단백질을 가 지고 있다. Nucleocapsid (N), Spike (S), M 과 E 단백질이 있으며, 그 중 S 단백질은 1255개의 아미노산으로 이루어져있으며 150 KDa의 당단백질 (glycoprotein)이다. 이 단백질은 중화항체의 생산을 유도하며 막 융합 (membrane fusion)을 매개한다. 또한, N 단백질은 422 아미노산을 포함하는 인단백질 (phosphoprotein)로 바이러스의 증식 (replicaiton)에 관여하며 바이러스 RNA와 결합한다. 또한 바이러스 감염이 이루어지는 동안 많은 N 단백질을 발현한다. 따라서 이러한 특징은 N, S 단백이 SARS의 초기 진단에 매우 유용한 단백질임을 나타내주고 있다.
SARS는 주로 발열(체온 측정 시 38℃ 이상)이 첫 증상으로 나타나며 인플루엔자 의사 증상이 발생한다. 주요 증상은 발열, 권태감, 근육통, 두통, 오한 등이며, 특이적인 증상이나 증후는 없고, 발열이 가장 흔한 증상이지만, 초기에 발열이 없을 수도 있다. 감염 2~7일이 지나면, 기침(초기에는 객담없는 마른 기침), 호흡곤란, 설사가 나타난다. 중증 환자는 급속히 호흡부전이 진행되어 환자의 약 20%에서는 집중치료가 필요할 정도로 산소부족을 겪게 된다. 많은 환자에서 혈액 또는 점액이 없는 대량 수양성 설사 증상이 보고되어있으며, 타인으로의 전염도 주로 이러한 증상이 나타날 때 일어난다.
노약자에서는 발열이 없거나 혹은 세균성 패혈증/폐렴이 동반되는 등 비전형적인 증상이 문제가 되고있다. 노약자는 대부분 만성질환이 있고 보건의료기관을 자주 이용함에 따라 병원감염으로 전염될 가능성이 높다. 또한 임산부는 사스에 감 염되면 임신초기에는 유산이 될 수 있으며, 임신후기에는 모성사망을 증가시킨 것으로 알려져 있다.
대부분 환자들은 발병초기 3-4일에 호흡기 증상이 없음에도 불구하고 흉부방사선 또는 CT소견상 변화가 관찰된다. 전형적인 소견으로는 일측성 말초부위에 반점형 경화(patchy consolidation)소견을 보이다가 다발성 병변 또는 젖빛유리모양(ground-glass appearence) 소견을 보이며, 일부 부위는 편위(shifting) 소견을 보인다. 발병 후기에는 가끔 자연적 기흉, 기중격동(pnemomediastinum), 흉막하 섬유증(sub-pleural fibrosis) 및/또는 낭성변화(cyctic change)가 관찰된다.
사스에 특이적인 혈액학적 또는 생화학적 지표는 없으나, 여러 연구를 통하여 다음 소견이 지속적으로 주목받고 있다.
혈액학적으로 림프구감소증(lymphopenia)이 가장 흔한 소견이며, 발병기간동안 진행되며, 때때로 혈소판감소증(thrombocytopenia)과 APTT 지연 소견이 관찰되기도 한다. 생화학적으로 흔히 LDH, ALT, AST, CPK의 상승이 보고되었으며, 저나트륨혈증, 저칼륨혈증, 저마그네슘혈증, 저칼슘혈증과 같은 비정상적인 혈청전해질이 증상 발현 동안 보고되었다.
80 ∼ 90%의 대부분 환자는 6-7일째 증상이 호전이 되나, 10∼ 20% 정도의 환자는 증상이 악화되어 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome)이 발생하여 기계호흡이 필요할 정도 중증으로 발전한다. 캐나다, 중국, 홍콩, 싱가포르, 베트남, 미국의 자료 분석에 의하면 사스의 치사율은 연령군에 따라서 0%에서 50%이상으로 추정되며, 전반적인 사스 치명률은 약 11%로 추정된다. 남자와 기저질환이 있는 경우치사율이 높아진다.
SARS의 전형적인 잠복기는 2∼7일이다. 그러나 극소수의 환자에서 10일까지 잠복기를 보이기도 하고 13일까지 보고된 환자가 있으므로 14일까지는 38℃ 이상의 발열이 있는지를 관찰해야 한다. 아직 SARS의 전파는 주로 비말(작은 침방울)을 통해 감염되는 것으로 생각되고 있다. 즉 SARS 환자가 기침, 재채기, 말할 때 배출되는 호흡기 비말에 의해 전파될 수 있으며 호흡기 분비물에 오염된 물건을 통해서도 전파될 수 있다.
사스코로나바이러스(SARS-coronavirus: SARS-CoV)에 대한 연구는 중국과 베트남 및 일본을 포함한 선진국에서 이루어져 왔으며 N 단백질을 이용한 진단계는 많은 연구성과가 이루어지고 있다. 하지만, 아직까지 효과적인 S 단백을 이용한 진단계와 백신개발에 대한 연구결과는 미미하다.
현재는 세계보건기구 (WHO)를 중심으로 한 국제 사회의 공동 노력으로 공식적으로 이 질병의 전파가 통제되고 새로운 발병 사례도 보고되지 않고 있지만 이 질병의 재유행이 우려된다.
자연계에 존재하는 SARS-CoV의 보유동물숙주는 아직까지 명확하지 않으며, 사람의 경우도 잠복감염자 및 불현성 감염자의 존재유무에 대해서도 규명되어 있지 않다. 또한, 최근의 보고에 따르면 SARS-CoV가 사람에 감염되었을 때 수개월 간의 지속감염 (persistent infection)의 가능성이 대두되고 있기 때문에 재 유행에 대한 우려를 더욱 높이고 있다.
아직까지 감염경로가 완전히 밝혀지진 않았지만, CDC의 보고 및 문헌보고에 의하면 SARS-CoV는 호흡기를 통해 주로 전파되는 질병으로 예상되고 있으며, 감염환자의 침(saliva)에서도 바이러스가 분리 된다 (Wang et al., 2004; Lapinsky and Granton, 2004). 따라서 매우 빠르고 쉽게 퍼져 나갈 수 있을 뿐만 아니라 바이러스 자체의 높은 감염력과 전파력은 SARS의 재유행시 범세계적인 유행을 초래할 수 있을 것이다. 이러한 바이러스의 전파를 미연에 방지하기 위해서는 감염이 예상되는 환자에 대한 진단을 빠르고 정확히 하여 SARS의 재 유행 전에 효과적인 진단 개발의 연구가 절실히 요구되고 있다.
또한, WHO에서는 이 바이러스에 대한 연구를 Biosafety level (BSL) 3로 규정하고 있어 일반 실험실에서 연구를 수행하기에 많은 제약과 어려움이 있다. 또한 SARS-CoV는 변이가 심하여 새로운 변이주들이 보고되고 있으며, Whole virus를 이 용한 진단방법은 안전성과 정확성의 측면에서 개선되어야 할 부분이 많다. 따라서 안전하고 정확한 SARS의 진단방법을 개발하여, 일반 실험실과 임상에서 SARS의 신속한 진단을 이루려는 노력이 있다.
현재까지는 SARS에 대한 충분한 정보가 없으며 정해진 치료방법이나 백신이 없다. 기존의 사람 코로나바이러스인 HCoV-229E, HCoV-OC43와 다르기 때문에 백신의 교차효과를 기대할 수 없으며, SARS-CoV의 특성을 분석하여 적절한 백신을 개발하고 치료방법을 모색하는 것이 시급하다. 또한 이에 앞서 정확하고 신속한 초기진단이 필히 수행되어져야 하는데, 이는 앞서 기술하였듯이 SARS가 쉽게 전파되며 2주가량의 잠복기를 갖고 있기 때문에 전염의 통제가 어렵기 때문이다. 따라서 비말전파가 본격적으로 일어나는 감염 2주차 전에 SARS감염 환자를 진단하여 격리하거나 치료한다면 질병의 통제가 용이할 수 있다.
이미 미국 CDC에서는 SARS에 대한 실험실진단에 대해서 이미 가이드라인을 제작하여 권고하고 있다 (Public Health Guidance for Community-Level Preparedness and Response to Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Version 2, Supplement F: Laboratory Guidance Appendix F8, Guidelines for Laboratory Diagnosis of SARS-CoV Infection). 이를 살펴보면, 임상적으로 사스가 의심되는 환자에 대해 다음과 같은 검사를 수행하여 1개 이상의 검사에서 양성을 나타내면 SARS로 진단하기를 권고하고 있다.
(1) PCR
적어도 두종류의 다른 임상검체(예, 비인두도말과 대변)에서 양성이거나 동일한 임상검체에 대해 질병의 이환기간 동안 2회 이상 양성인 경우. 또는, 원래의 임상검체에서 추출한 새로운 RNA추출물을 이용하여 PCR을 반복검사하거나 두 가지 다른 분석법을 사용한 경우
(2) 혈청검사(Seroconversion by ELISA or IFA)
급성기 혈청검사에서 음성이었으나 회복기 혈청검사에서 양성으로 양전되었거나 급성기와 회복기 혈청검사에서 항체가가 4배 이상 증가한 경우
(3) 바이러스 분리(Virus isolation)
임상검체의 세포배양검사에서 사스코로나바이러스가 분리되었으며, PCR 확인검사에서 양성인 경우
그러나 WHO에서는 이 바이러스에 대한 연구를 Biosafety level (BSL) 3로 규정하고 있어 일반 실험실에서 연구를 수행하기에 많은 제약과 어려움이 있다. 또한 SARS-CoV는 변이가 심하여 새로운 변이주들이 보고되고 있으며, 전체 바이러스를 이용한 진단방법은 안전성과 정확성의 측면에서 개선되어야 할 부분이 많다.
이에 본 발명은 SARS-CoV의 N 항원 또는 S 항원을 이용하여 안전하고 정확한 SARS의 진단방법을 개발하고, 이를 이용하면 일반 실험실과 임상병원 등에서 SARS의 신속한 진단 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 사스코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(SARS-CoV-N) 또는 스파이크 단백질 (SARS-Cov-S) 항원을 이용하여 안전하고 신속한 SARS의 진단방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 사스코르나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 (SARS-CoV-N) 또는 스파이크 단백질 (SARS-Cov-S)을 이용한 SARS 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 일견지에 의하면,
SARS-CoV-N (SARS Coronavirus-Nucleocapsid protein) 항원을 코딩하는 유전자를 증폭시킨 후 E. coli에 적용하여 SARS-CoV-N 항원을 생산하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 수득한 항원에 대한 항체를 생산하는 제 2단계; 상기 SARS-CoV-N의 항체에 발색물질을 결합시킨 항체와 SARS-CoV 항원을 포함하는 검체를 SARS-CoV-N 항체가 흡착되어있는 막에 반응시키는 제 3단계;를 포함하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단방법이 제공된다.
상기 발색물질은 효소 또는 금(gold)을 포함하며, 상기 항체는 단클론 항체임을 특징으로 한다. 또한, 상기 SARS-CoV-N 항원은 베트남 주로부터 수득된 것을 포함한다.
본 발명의 제 2견지에 의하면,
SARS-Co-N (SARS Coronavirus-Nucleocapsid protein)에 대한 항체가 흡착되어 있는 막; 발색물질이 결합된 SARS-CoV-N 단클론항체를 포함하는 용액;을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단용 키트가 제공된다.
상기 항체는 단클론 항체를 포함고, 상기 발색물질은 효소 또는 금(gold)을 포함한다.
본 발명의 제 3견지에 의하면,
SARS-CoV-S (SARS Coronavirus-spike protein) 항원을 코딩하는 유전자를 증폭하고 벡터에 삽입하여 클로닝하는 1단계; 클로닝한 SARS-CoV-S항원 유전자를 발현벡터에 삽입하고 293 T 세포를 상기 발현 벡터로 형질감염(transfection) 시키는 제 2단계; 형질감염된 293 T 세포를 VSV (vesicular stomatitis vesicle)로 감염시킨 후 배양하여 VSV (vesicular stomatitis vesicle)로부터 SARS-CoV-S 항원을 제조하는 제 3단계;를 포함하는 모조 (pseudotype)의 VSV (vesicular stomatitis vesicle)를 이용한 SARS-CoV-S 항원의 제조방법이 제공된다.
상기 SARS-CoV-S 항원은 베트남 주로부터 수득된 것임을 포함 한다.
본 발명의 제 4견지에 의하면,
상기의 SARS-CoV-S 항원 제조방법에 의해 제조된 SARS-CoV-S (SARS Coronavirus-spike protein) 항원이 제공된다.
본 발명의 제 5견지에 의하면,
상기 SARS-CoV-S 항원 제조방법에 의해 제조된 SARS-CoV-S (SARS Coronavirus-spike protein) 항원이 흡착되어 있는 막 및 발색물질이 결합되어 있으며 상기 항원에 결합하는 검체 내의 항체에 대한 2차 항체를 포함하는 용액을 포함하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단용 키트가 제공된다.
상기 2차 항체는 HRP-결합 항 인간 IgG 항체 (HRP-conjugated anti human IgG antibody)을 포함하고, 상기 발색 물질은 OPD (O-phenyldiamine) 또는 금 (gold)를 포함한다.
본 발명의 제 6견지에 의하면,
모조(pseudotype) VSV(vesicular stomatitis vesicle)를 이용하여 SARS-CoV-S 항원을 생산하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 수득한 항원에 대한 항체를 생산하는 제 2단계; 상기 SARS-CoV-S의 항체에 발색물질을 결합시킨 항체와 SARS-CoV 항원이 있는 검체를 SARS-CoV-S 항체가 흡착되어있는 막에 반응시키는 제 3단계;를 포함하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단방법이 제공된다.
상기 발색물질은 효소 또는 금(gold)을 포함하고, 상기 효소는 OPD (O-phenyldiamine)을 포함하며, 상기 항체는 단클론 항체임을 특징으로 한다.
또한, 상기 SARS-CoV-S 항원은 베트남 주로부터 수득된 것을 포함한다.
본 발명에서 정의되는 “SARS-CoV-S”는 사스코로나바이러스의 스파이크 단백질을 의미한다.
본 발명에서 정의되는 “SARS-CoV-N”은 사스코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1. 재조합 SARS - CoV -N 항원을 이용한 진단계의 확립
1-1. SARS - CoV -N 유전자의 클로닝
SARS-CoV 베트남 주(Vietnam strain)의 RNA로부터 SARS-CoV-N 항원 전체(422 amino acid)를 인코딩할 수 있도록, 즉 N 1-422, N 1-109, N 110-422, N 355-422 아미노산을 클로닝을 하였다.
N 1-422 아미노산을 위한 프라이머는 하기와 같다.
센스 프라이머: BamHI-ATG-N: 5′-CGGGGATTCATGTCTGATAATGGACCCCAA-3′(서열번호 1)
안티센스 프라이머: PstI-stop-N: 5′-CTGCAGTTCTTATGCCTGAGTTGAATCAGC-3′(서열번호 2)
N 1-109 아미노산을 위한 프라이머는 하기와 같다.
센스 프라이머: BamHI-ATG-N: 5′-CGGGGATTCATGTCTGATAATGGACCCCAA-3′(서열번호 3)
안티센스 프라이머: PstI-Stop-N109: 5′-CTGCAGTCACCATCTGGGGCTGAGCTCTTT-3′(서열번호 4)
N110-422 아미노산을 위한 프라이머는 하기와 같다.
센스 프라이머: BamHI-ATG-N110: 5′-CGGGGATTCATGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGC-3′(서열번호 5)
안티센스 프라이머: PstI-Stop-N: 5′-CTGCAGTTCTTATGCCTGAGTTGAATCAGC-3′(서열번호 6)
N355-422 아미노산을 위한 프라이머는 하기와 같다.
센스 프라이머: BamHI-ATG-N355 : 5′-CGGGGATTCATGAACAAGCACATTGACGCATAC-3′(서 열번호 7)
안티센스 프라이머: PstI-Stop-N : 5′-CTGCAGTTCTTATGCCTGAGTTGAATCAGC-3′(서열번호 8)
상기의 프라이머들을 각각 제작하여 유전자를 증폭시켰다. (도 1)
증폭되어 Gel에서 확인한 cDNA를 TA 벡터 (vector)에 넣고 클로닝한 후 대장균 발현 벡터인 N-말단(terminal) Nus-tag pET43 벡터에 넣어 클로닝한 유전자가 BL21 대장균에서 발현할 수 있도록 형질전환(transformation)을 하였다. (도 2 및 도 3)
1-2. 재조합 SARS - CoV -N 항원의 발현
pET43에 클로닝한 구성체 (construct)를 대장균 BL21(DE3)세포에 형질전환 (transformation) 하였다. 재조합 단백질의 발현은 0.1 mM IPTG (isopropyl-1thio-D-galactopyranoside)를 사용하여 37℃에서 5시간 동안 유도시켰다. 세포는 원심으로 모아 펠렛 (pellet)을 결합 완충액 (binding buffer; 20 mM Tris_HCl, pH .9, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 1 mM NaF, 1 mM PMSF) 또는 BugBuster 용액으로 부유시켜 초음파 처리 (sonication) 하였다. 발현된 재조합 단백질은 10-15% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 분석하였으며 (도 4), Ni-NTA 컬럼 (Ni-nitrilotriacetic acid column)을 사용하여 분리 하였다. 분리된 단백질은 BCA 키트 (Pierce)로 농도를 분석하여 사용 할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
1-3. 단클론 항체제작
(가) 쥐의 면역화 (Immunization of mice)
항원이 들어있는 PBS 와 같은 부피의 CFA (Complete Freund's adjuvant)가 섞인 에멀전 (emulsion)을 만들어서 6주령 암컷 BALB/c 쥐 (mouse)의 복강 내에 주입하였다. 1마리당 1~100 ug의 항원을 주사하되 총 부피는 200~400ul로 하였다. 2주, 4주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 이 후 2주 후에 항원 (1차 투여량의 반 용량)을 멸균 PBS에 섞어 미정맥으로 투여한 후 혈청을 채취하였다.
(나) 세포융합
면역시킨 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 얻어진 비장세포와 형질종세포(myeloma cell)인 SP-2세포를 폴리에틸렌 글리콜 (polyethlene glycol) 1500 (PEG1500, Boehringer Mannheim)을 이용하여 세포융합을 실시하였다. 최종면역 4일 후 마우스의 비장을 무균적으로 적출하고, 단일 세포 (single cell)로 만들어 DMEM 배지에 부유시킨 후, 쥐(mouse) Histopack을 이용하여 림프구를 분리하고, 0.87% Tris NH4Cl 용액을 이용하여 적혈구를 용해 (lysis) 시키고 DMEM으로 3회 세 척하였다. 분리된 림프구를 SP-2세포와 10:1 정도의 비율로 혼합하고, 50% PEG 1500을 첨가하였다. 2분간 혼합세포가 들어있는 튜브 (tube)를 흔들어주면서 세포융합을 유도하였다. DMEM배지를 첨가한 후 37 ℃에서 10분간 정치시킨 후 700g에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. HAT (0.1mM hypoxanthine, 0.4M aminopten, 16 uM thymidine, Sigma)와 20% FBS가 첨가된 DMEM 에 1× 106 cell/ml 의 농도로 부유시킨 다음, 이 부유액 100ul를 96 웰 플레이트 (well plate)에 분주하고, 세포배양기에서 2주간 배양하여 융합된 세포를 선별하였다.
(다) 융합된 세포의 항체형성 확인
융합된 세포의 항체 생성 여부는 정제된 N 항원과 융합된 세포 배양액을 이용하여 간접 (Indirect) ELISA를 실시하여 관찰하였다. 정제된 SARS-N을 CBB용액에 10 ug/ml의 농도로 희석하여 냉장에서 16시간 정치시켜 항원을 코팅한 후 각 웰 (well)을 t-PBS (0.05% tween 20) 로 3회 세척하였다. 1% BSA를 상온에서 2시간 반응하여 블로킹 (blocking) 하였다. 융합된 세포의 배양액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 반응한 후 t-PBS로 3회 세척한 후 1:10000의 비율로 HRP-결합 항 쥐 IgG 항체 (HRP-conjugated anti mouse IgG antibody; Zymed)를 각 웰에 100 ㎕ 분주하여 37 ℃에서 1시간 반응한 후 t-PBS로 3회 세척하였다. OPD (Sigma)를 100 ㎕ 첨가한 후 차관상태에서 10~30분간 반응한 후 ELISA 판독기 (reader)를 이용하여 OD(optical density)를 측정하였다.
(라) 항체의 정제
항체를 생성하는 융합세포를 25T 플라스크로 옮겨서 대량 배양한 후, 얻어진 세포 상층액으로부터 항체를 정제하였고, 상용화된 키트 (ImmunoPure IgG Purification Kit)를 사용하였다.
(마) 단클론항체의 분석
① isotyping에 의한 단클론 항체의 선별
상용화된 키트 (ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit, PIERCE 등)를 이용하여 제조사의 수행방법을 준수하여 분석하였다.
② 단클론항체의 친화도 (affinity) 분석
정제된 재조합 N 항원과 단계 희석된 단클론 항체를 이용하여 간접 (indirect) ELISA를 수행하여 친화도를 조사하고, 웨스턴 블랏 (Western blot)과 샌드위치 (Sandwich) ELISA를 실시하여 변성-형태 (denatured-form) 항원과 고유-형태 (Native-form) 항원에서의 반응성을 각각 조사하였다. 이를 통해 응용 가능한 진단계를 선정할 수 있다.
간접 (indirect) ELISA는 정제된 N 항원을 흡착시킨 후 각 단클론 항체를 200 nM부터 2배 계단 희석하여 0.2 nM 농도까지 희석하여 각 웰에 첨가하고 상기 기술한 방법과 동일하게 간접 (indirect) ELISA를 수행하였다.
샌드위치 (Sandwich) ELISA는 정제된 단클론 항체를 CBB에 10ug/ml 농도로 희석한 후 각 well당 100ul를 첨가하고 4‘C에서 16시간 정치시켜 흡착하였다. 각 단클론 항체 (20ug/ml) 과 정제된 N 항원 (10 ug/ml)을 동량 혼합하고 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후, 항체가 흡착된 웰에 100ul 첨가한 후 37 ℃에서 1시간동안 반응시켰다.
1-4. 다클론 항체의 제작
(가) Immunization of mice
정제된 재조합 SARS-CoV-N 항원을 SPF 토끼 (Rabbit)에 근육주사 하였다. 1마리당 1~100 ug의 항원을 주사하되 총 부피는 200~400 ul로 하였다. 2주, 4주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 이 후 2주 후에 항원 (1차 투여량의 반 용량)을 멸균 PBS에 섞어 이정맥으로 투여한 후 혈청을 채취하였다.
(나) 다클론 항체형성 확인
정제된 N 항원과 면역된 (immunized) 토끼혈청을 이용하여 간접 (Indirect) ELISA를 실시하여 관찰하였다. 정제된 SARS-N을 CBB용액에 10 ug/ml의 농도로 희석하여 냉장에서 16시간 정치시켜 항원을 코팅한 후 각 웰 (well)을 t-PBS (0.05% tween 20) 로 3회 세척하였다. 1% BSA를 상온에서 2시간 반응하여 블로킹(blocking)하였다. 면역화 (immunized)된 토끼혈청을 20배부터 2배수로 계단 희석하여 각 웰에 100ul씩 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 반응한 후 t-PBS로 3회 세척하 였다. 세척 후 1:10000의 비율로 HRP-결합 항 마우스 IgG 항체 (HRP-conjugated anti mouse IgG antibody; Zymed)를 각 웰에 100 ul 분주하여 37 ℃에서 1시간 반응한 후 t-PBS로 3회 세척하였다. OPD (Sigma)를 100ul 첨가한 후 차관상태에서 10~30분간 반응한 후 ELISA 판독기 (reader)를 이용하여 OD (optical density)를 측정하였다.
항원과 항체의 농도별반응을 통하여 최적화된 항원항체 반응 농도를 결정하여 다클론항체를 이용한 간접 (Indirect) ELISA 검사법을 확립하였다.
1-5. 재조합 SARS - CoV -N 단백질을 이용한 신속 진단 키트의 제작
면역 크로마토그래피 (Immunochromatography) 방법을 이용하여 1 단계(step)로 SARS-CoV를 진단하는 방법을 확립하였다.
제작한 SARS-CoV-N 단일클론항체 (monoclonal antibody)를 금 (Gold)과 결합 (conjugation)한 후 SARS-CoV가 있는 검체를 혼합하여 SARS-CoV-N 단일클론항체 (monoclonal antibody)가 흡착되어있는 막 (membrane)에 반응하여 육안으로 확인하였다. (도 5)
상기에서 SARS-CoV 검체로서 정제된 재조합 SARS-CoV-N 단백질을 사용하였다.
실시예 2. SARS - CoV -S 항원을 생산하는 VLP ( virus - like - particle )를 이용한 진단 계 확립
2-1. SARS - CoV -S 항원의 클로닝
SARS-CoV 베트남 균주 (Vietnam strain)의 RNA로부터 항원성이 강한 S 단백을 코딩할 수 있는 여러 가지 조합의 프라이머를 이용하여 cDNA산물을 수득하였다. C 말단에서 각각 19, 60개의 아미노산을 삭제시키도록 프라이머를 작제하였다.
S1 아미노산을 위한 프라이머는 하기와 같다.
센스 프라이머: 5′-GGATCCAAGTGATATTCTTGTTAACAAC-3′(서열번호 9)
안티센스 프라이머: 5′-GGATCCAAGAGTAAAAAATCTCATAAAC-3′(서열번호 10)
S2 아미노산을 위한 프라이머는 하기와 같다.
센스 프라이머: 5′-GGATCCAAGTGATATTCTTGTTAACAAC-3′(서열번호 11)
안티센스 프라이머: 5′GGGATCCTTAGCAGCAAGAACCACAAGAGCATG-3′(서열번호 12)
S3 아미노산을 위한 프라이머는 하기와 같다.
센스 프라이머: 5′-GGATCCAAGTGATATTCTTGTTAACAAC-3′(서열번호 13)
안티센스 프라이머: 5′-CGGAATTCCTATTGCTCATATTTTCCC-3′(서열번호 14)
상기의 프라이머로 PCR을 실행한 후(도 6), PCR 산물 (product)은 TA 벡터 (vector)에 넣어 클로닝을 한 후 목적 구성체 (construct)를 발현 벡터인 pCAGGS 벡터에 넣어 발현시킨다. (도 7)
2-2. SARS - CoV -S 항원을 발현하는 VLP ( VSVG * SARS -S)의 제작
293T 세포에 pCAG-SARS-S를 형질감염 (transfection)한 후 36시간에 VSVG*G를 37℃에서 1시간 동안 1 MOI로 감염시켰다. 293T 세포는 1%의 FCS가 포함된 PBS로 세 번 세척하였고 새로운 배지로 24시간 동안 감염된 세포를 배양하였으며, 배양액은 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 만들어진 모조(pseudotype)의 바이러스의 수를 세기위하여 Vero E6 세포를 96 웰 플레이트 (well plate)에 넣어 단층 (monolayer)으로 이루어지게 한 후, 바이러스 군체 (stock)를 단계적으로 희석하여 각 웰에 50 ul씩 분주하여 1시간 동안 감염을 시키고, 바이러스를 제거하였다. 곧이어 새로운 배양액을 넣고 배양을 하였다. 감염 후 16시간이 지나면 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)/PBS에서 10분간 고정을 한 후 물로 세척하였다. 마른 플레이트를 형광 현미경 (fluorescence microscope)로 GFP가 발현된 세포의 수를 세어 감염단위(infectious unit)를 만들었다. (도 8)
2-3. 제작된 VSVG * SARS -S에서 IFA ( indirect fluorescence assay )를 통한 SARS -CoV-S 항원의 발현 확인 및 IFA 진단방법의 구축
pCAGGS에 클로닝된 S 단백을 코딩하는 cDNA는 293T 세포에 유전자 삽입 (transfection) 된 후 발현되었다. 이때 발현의 확인은 사스증후군 환자의 혈청으로 IFA (indirect fluorescence assay)를 실시하여 확인하였다. 항원 슬라이드의 작제는 랩 텍 챔버 (Lab Tek chamber)에 Vero E6 4x104 세포/ 웰당 분주하여 24시간 배양하였다. 세포의 수가 60% 정도에 이르렀을때 0.2 ug의 DNA와 LT1 그리고 optiMEM을 볼텍스 (vortex)를 사용하여 혼합한 후 실온에서 30분 동안 배양 하였다. 그 후 유전자 삽입 (transfection) 하고 48-72시간 후에 10% 포르말린으로 고정하였다. 고정된 랩 텍 챔버 (Lab Tek chamber)는 S 단백을 확인하기 위해 IFA를 실시하였다.
2-4. 생산된 VSVG * SARS -S를 이용한 ELISA 진단방법의 확립
생산된 VSVG*SARS-S를 20-60 % 글루코스 (glucose)가 함유된 TNE 버퍼 (buffer)에 모조(pseudotype)의 VSVG*SARS-S를 넣은 후 초원심 분리하여 항원으로 이용하여, 간접 (Indirect) ELISA를 실시하여 관찰하였다. 초원심으로 분리한 모조(pseudotype)의 바이러스를 TNE 버퍼(buffer)포 희석하여 냉장에서 16시간 정치시켜 항원을 코팅한 후 각 웰 (well)을 TPBS (0.05% tween 20)로 3회 세척하였다. 1% BSA/PBS를 상온에서 2시간 반응하여 블로킹 (blocking)하였다. 사스증후군 환자에게서 얻은 혈청(serum)을 계단 희석하여 각 웰 (well)에 50 ul씩 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 반응한 후 t-PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 1:10000의 비율로 HRP-결합 항 인간 IgG 항체 (HRP-conjugated anti human IgG antibody; Zymed)를 각 웰에 50 ul 분주하여 37 ℃에서 1시간 반응한 후 t-PBS로 3회 세척하였다. OPD (Sigma)를 50 ul 첨가한 후 차관상태에서 10-30분간 반응시키고 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 OD(optical density)를 측정하였다. (도 9)
2-5. 생산된 VSVG * SARS -S의 검증
생산된 VSVG*SARS-S의 감염 (infectivity)의 확인은 HA 분석 (assay)을 통하여 확인하였다. ALSERVER 용액을 이용 거위에서 혈액을 채혈한 후 모세혈관 튜브(tube)에 혈액을 넣고 12000 RPM으로 5분간 원심분리 하였다. 적혈구는 0.2 %로 이용하였다. 바이러스 군체 (Stock)를 pH 7.0의 TNE 버퍼 (buffer)로 보관되었던 바이러스 군체 (Stock)를 바이러스 희석 버퍼 (virus dilution buffer)인 pH 5.8의 PB로 희석하여 RBC 용액 버퍼 (solution buffer)에 희석된 RBC와 반응시켰다. 또한, HA 테스트에서 양성이 관찰되면 사람혈청을 이용하여 HI 테스트를 시도하였다. (도 10)
2-6. 인간 코로나 바이러스 ( Human coronavirus )에 대한 항혈청과의 교차반응 조사
정제된 재조합 N항원과 VSVG*SARS-S가 인간 코로나 바이러스 (human coronavirus) 항체와 교차반응 (cross reactivity)하는지 확인하였다. 인간 코로나 바이러스 (Human coronavirus) 229E, OC43 항혈청을 이용하여 재조합 SARS-CoV-N 및 S 항원들과의 교차반응을 ELISA방법을 통해 비교한 결과, 교차반응이 일어남을 관찰할 수 있었다.
본 발명은 SARS-CoV-N항원 및 SARS-CoV-S 항원을 이용하여 제조한 SARS 진단 키트 및 모조(pseudotype) VSV (vesicular stomatitis cesicle)를 제공함으로써 일반 실험실 및 병원 등에서 초기에 진단이 가능하며 전염의 위험을 줄일 수 있으므로, SARS-CoV의 진단을 용이하게 한다.
특히 SARS-CoV-S 항원을 생산하는 안전한 pseudo-VSV의 제작은 이 후 백신으로 개발하는데 있어서 안전성 및 효력면에서 개발이 용이하므로 SARS의 재유행에 대한 대비를 하는데 활용될 수 있다.
<110> Seoul national university industry foundation <120> Diagnostic methods for SARS by using nucleocapside or spike protein <130> DP2006-0181 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for N 1-422 amino acid <400> 1 cggggattca tgtctgataa tggaccccaa 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for N 1-422 amino acid <400> 2 ctgcagttct tatgcctgag ttgaatcagc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for N 1-109 amino acid <400> 3 cggggattca tgtctgataa tggaccccaa 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for N 1-109 amino acid <400> 4 ctgcagtcac catctggggc tgagctcttt 30 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for N 110-422 amino acid <400> 5 cggggattca tgtacttcta ttacctagga actggc 36 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for N110-422 amino acid <400> 6 ctgcagttct tatgcctgag ttgaatcagc 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for N 355-422 amino acid <400> 7 cggggattca tgaacaagca cattgacgca tac 33 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for N 355-422 amino acid <400> 8 ctgcagttct tatgcctgag ttgaatcagc 30 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for S1 amino acid <400> 9 ggatccaagt gatattcttg ttaacaac 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for S1 amino acid <400> 10 ggatccaaga gtaaaaaatc tcataaac 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for S2 amino acid <400> 11 ggatccaagt gatattcttg ttaacaac 28 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for S2 amino acid <400> 12 gggatcctta gcagcaagaa ccacaagagc atg 33 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for S3 amino acid <400> 13 ggatccaagt gatattcttg ttaacaac 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for S3 amino acid <400> 14 cggaattcct attgctcata ttttccc 27

Claims (18)

  1. SARS-CoV-N (SARS Coronavirus-Nucleocapsid protein)을 코딩하는 유전자를 증폭시킨 후 E. coli에 적용하여 SARS-CoV-N 항원을 생산하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 수득한 항원에 대한 항체를 생산하는 제 2단계; 상기 SARS-CoV-N의 항체에 발색물질을 결합시킨 항체와 SARS-CoV 항원을 포함하는 검체를 상기 SARS-CoV-N 항체가 흡착되어있는 막에 반응시키는 제 3단계;를 포함하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단방법.
  2. 제 1항 있어서, 상기 발색물질은 효소 또는 금(gold)인 것을 특징으로 하는 진단방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체임을 특징으로 하는 진단방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 SARS-CoV-N 항원은 베트남 주로부터 수득된 것을 포함하는 SARS 진단방법.
  5. SARS-Co-N (SARS Coronavirus-Nucleocapsid protein)에 대한 항체가 흡착되어 있는 막; 발색물질이 결합된 SARS-CoV-N 항체를 포함하는 용액;을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단용 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 항체는 단클론항체임을 특징으로 하는 진단용 키트.
  7. 제 5항 있어서, 상기 발색물질은 효소 또는 금(gold)인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
  8. SARS-CoV-S (SARS Coronavirus-spike protein) 항원을 코딩하는 유전자를 증폭하고 벡터에 삽입하여 클로닝하는 1단계; 클로닝한 SARS-CoV-S항원 유전자를 발현벡터에 삽입하고, 293 T 세포를 상기 발현 벡터로 형질감염(transfection) 시키는 제 2단계; 형질감염된 293 T 세포를 VSV (vesicular stomatitis vesicle)로 감염시킨 후 배양하여 VSV (vesicular stomatitis vesicle)로부터 SARS-CoV-S 항원을 제조하는 제 4단계;를 포함하는 모조 (pseudotype)의 VSV (vesicular stomatitis vesicle)를 이용한 SARS-CoV-S 항원의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 SARS-CoV-S 항원은 베트남 주로부터 수득된 것을 포함하는 SARS-CoV-S 항원의 제조방법.
  10. 제 8항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 SARS-CoV-S (SARS Coronavirus-spike protein) 항원.
  11. 제 10항의 SARS-CoV-S (SARS Coronavirus-spike protein) 항원이 흡착되어 있는 막 및 발색물질이 결합되어 있고 상기 항원에 결합하는 검체 내의 항체에 대한 2차 항체를 포함하는 용액을 포함하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 2차 항체는 HRP-결합 항 인간 IgG 항체 (HRP-conjugated anti human IgG antibody)임을 특징으로 하는 SARS 진단용 키트.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 발색 물질은 OPD (O-phenyldiamine) 또는 금 (gold)를 포함하는 SARS 진단용 키트.
  14. 모조(pseudotype) VSV(vesicular stomatitis vesicle)를 이용하여 SARS-CoV-S 항원을 생산하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 수득한 항원에 대한 항체를 생산하는 제 2단계; 상기 SARS-CoV-S의 항체에 발색물질을 결합시킨 항체와 SARS-CoV 항원이 있는 검체를 SARS-CoV-S 항체가 흡착되어있는 막에 반응시키는 제 3단계;를 포함하는 SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 진단방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 발색물질은 효소 또는 금(gold)을 포함하는 SARS 진단방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 효소는 OPD(O-phenyldiamine)을 포함하는 SARS 진단방법.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체임을 특징으로 하는 SARS 진단방법.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 SARS-CoV-S 항원은 베트남 주로부터 수득된 것을 포함하는 SARS 진단방법.
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