CN113557431A - 诊断SARS-CoV-2感染的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断SARS‑CoV‑2感染的方法，所述方法包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体优选IgA类抗体的存在或不存在的步骤，用于冠状病毒感染的鉴别诊断的方法，针对SEQ ID NO：1的抗体优选IgA类抗体用于诊断SARS‑CoV‑2感染或用于鉴别诊断冠状病毒感染优选用于区分SARS‑CoV‑2、MERS和NL63、229E、OC43和HKU1感染的用途，以及试剂盒，其包含含有SEQ ID NO：1或其变体的多肽，所述多肽优选包被在诊断上有用的承载体上，以及选自包含以下的组的一种或多种、优选所有试剂：针对SEQ ID NO：1的抗体；洗涤缓冲液；用于检测抗体的存在的工具，所述抗体优选为IgA类抗体；优选与IgA类抗体特异性结合的第二抗体，所述第二抗体优选包含可检测标记；和稀释缓冲液。

Description

诊断SARS-CoV-2感染的方法和试剂
技术领域
本发明涉及用于诊断SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体优选IgA类抗体的存在或不存在的步骤，用于冠状病毒感染的鉴别诊断的方法，针对 SEQ ID NO：1的抗体优选IgA类抗体用于诊断SARS-CoV-2感染或用于鉴别诊断冠状病毒感染优选用于区分SARS-CoV-2、MERS和 NL63、229E、OC43和HKU1感染的用途，以及试剂盒，其包含含有SEQ ID NO：1或其变体的多肽，所述多肽优选包被在诊断上有用的承载体上，以及选自包含以下的组的一种或多种、优选所有试剂：针对SEQ ID NO：1的抗体；洗涤缓冲液；用于检测抗体的存在的工具，所述抗体优选为IgA类抗体；优选与IgA类抗体特异性结合的第二抗体，所述第二抗体优选包含可检测标记；和稀释缓冲液。
背景技术
分离出一种新型冠状病毒，并根据其系统发育、分类学和既定惯例，冠状病毒研究组(CSG)将其识别为严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-1)的姐妹株，并将其标记为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。尽管SARS-CoV-2的病原性通常低于 SARS-CoV-1和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，但它具有相对高的传播性。由于症状可能很轻微并且可能与感冒相混淆，因此存在患者可能不知道自己已被感染并可能帮助病毒进一步传播的危险。
SARS-CoV-2是一种冠状病毒，其具有四种主要结构蛋白，特别是刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。 N蛋白拥有RNA基因组，而其他三种结构蛋白是病毒包膜的组分。S 蛋白负责允许病毒附着并融合至宿主细胞的膜。它包含介导附着的S1 结构域和介导病毒细胞膜与宿主细胞的融合的S2结构域。S1结构域包含受体结合结构域(RBD)，其是人宿主细胞上受体血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合位点。因此，RBD是阻断病毒与其宿主细胞之间的相互作用从而赋予免疫力的中和抗体的结合位点。相对于高死亡率和严重疾病相关的SARS-CoV-1和SARS-CoV-2，存在与轻度和过往疾病相关的其他冠状病毒，例如冠状病毒229E、NL63、OC43 和HKU1。这些冠状病毒经常与普通感冒相关，特别是在儿童中。
由于高传播性和健康影响，用于诊断SARS-CoV-2感染的可靠方法至关重要。过去，血清学和实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 方法的组合被用来检测和确认冠状病毒感染。
RT-PCR方法基于感兴趣的冠状病毒的一种或多种核酸，更特别地病毒核糖核酸(RNA)的检测。基于RT-PCR的方法是快速的，并且基于来自咽喉或鼻咽拭子的样品，可以在疾病的第一周内用于检测 SARS-CoV-2。但是，它们的有用性在很大程度上取决于样品中可检测到核酸的时间，其因病毒而异。特别地，对在疾病早期获得的样品进行的诊断测试得出的阴性结果可能是毫无意义的。此外，通常需要来自患者上呼吸道的样品。这样的样品的不恰当或不足的回收、延长的运输时间以及病毒RNA的相关降解或仪器故障也可能导致假阴性结果。因此，应检查几个样品，其中有来自感染的第1周的样品，和在3-4周后获得的随访样品。
Corman等人发表了用于检测SARS-CoV-2的基于实时RT-PCR 的测定(Corman VM,Landt O,Kaiser M等人,Detection of 2019 novel coronavirus(2019-nCoV)by real-time RT-PCR.Euro Surveill. 2020；25(3):2000045.doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045)，其于2020年1月在WHO的网页上首次发布。
还经常使用血清学测试。这些测试基于针对某些病毒特异性抗原的抗体的检测。但是，血清学测定也存在严重障碍：
经常观察到的一个问题是它们有限的灵敏度。为了使血清学测定产生阳性结果，需要在患者血液中存在病毒抗原特异性抗体。通常，无法预测在新的病毒感染后首次产生和可检测抗体的时间点，因为它取决于多种因素，包括病毒本身、病毒载量即在给定量的患者血液中的病毒数量、与患者相关的因素(例如年龄，性别，健康状况，免疫状况等)、感兴趣的抗体的免疫球蛋白类别以及选择用于建立诊断测试的抗原靶标。尤其是在疾病的非常早期阶段，即在患者的身体能够以可检测的量引发特异性抗体反应之前，尽管存在感染，但血清学测定可能产生阴性结果。考虑到要检测的抗体是否属于某种免疫球蛋白 (Ig)类别，进一步的血清学测试可能有助于监测疾病的进程，并将急性与过去的感染或疫苗接种区别开来。因此，当前大多数可用于检测病毒感染包括SARS-CoV-1感染的血清学测定都集中在IgG或IgG 和IgM类抗体的检测上。然而，除了由于抗体反应的固有延迟而特别地在感染的非常早期的阶段产生假阴性结果的风险外，用于诊断 SARS-CoV-1感染的血清学测定还容易产生假阳性结果，推测是由于针对常见季节性冠状病毒(CoV)的抗体群体中高的血清阳性率和针对免疫原性病毒蛋白的保守部分的交叉反应性抗体的相关存在。针对这样的与抗原密切相关的季节性冠状病毒的这种交叉反应也不允许进行鉴别诊断，例如将威胁生命的变体SARS-CoV-1与其他冠状病毒区分开。在Meyer,Drosten&Müller,Virus Research 194(2014)； 175-186中综述了用于诊断和区分冠状病毒，特别是用于诊断 SARS-CoV-1的血清学测定的挑战和陷阱。与早期冠状病毒的血清学诊断相关的这些多重挑战(例如，感染早期阶段的灵敏度差；和由交叉反应抗体的存在而导致的特异性差)也适用于检测最近出现的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的诊断测定的开发。
鉴于持续的全球SARS-CoV-2大流行所造成的当前严重威胁以及上述用于诊断相应感染的现有测定的问题，在本领域中迫切需要改进的，尤其是更灵敏的，更特异性的，和因此更可靠的用于诊断 SARS-CoV-2感染的工具和方法，尤其是用于SARS-CoV-2感染的早期诊断，以及用于将其与其他冠状病毒(例如常见的季节性冠状病毒) 的感染区分开的工具和方法，以实现更具靶病毒特异性和从而更有效的治疗。
发明详述
本发明通过提供克服这些先前障碍的诊断工具和方法来解决这种需求。
具体而言，本发明解决了(但不旨在限制)以下问题：
本发明解决的一个问题是提供用于SARS-CoV-2的早期血清学检测的测定和试剂。这是特别重要的，因为即使获得阴性PCR结果，患者仍可能患有活动性疾病并具有传染性。注意疾病控制与预防中心 (CDC)建议，从症状发作起患者保持隔离至少10天，并且在严重疾病的情况下隔离多至20天。
本发明解决的另一个问题是提供可用于区分已知的冠状病毒感染 (特别是SARS-CoV-2感染)与其他冠状病毒感染(优选与轻度感冒样症状或其他病原体或这样的症状的起因相关的冠状病毒)的测定。优选地，可以在早期阶段区分感染。
本发明解决的另一个问题是提供具有高度优化的可靠性(特别是关于灵敏度和/或特异性，优选灵敏度)的测定。
本发明解决的另一个问题是为缺乏针对SARS-CoV-2N蛋白的抗体或缺乏IgM类抗体的患者提供具有高灵敏度的测定。
本发明解决的另一个问题是提供具有持久的高灵敏度的测定。
用于诊断冠状病毒感染的先前测定描述于例如以下文件中： WO2014/045254公开了用于诊断中东呼吸综合征相关冠状病毒 (MERS-CoV)感染的测定，包括其中在样品中检测针对病毒蛋白抗原的抗体的血清学测定。但是，没有显示出这样的测定的实际证据。US2005/0112559公开了SARS-CoV-1相关的方法和试剂。核衣壳(N) 蛋白被认为是主要的诊断抗原。WO2005/118813公开了与 SARS-CoV-1相关的S蛋白的变体，以及在样品中其存在或与其结合的抗体的存在的检测。US2006/0188519公开了用于诊断SARS-CoV-1 感染的肽。Hsueh等人报道，IgG最早可在SARS-CoV-1感染发生后四天被检测到，与IgM和IgA同时或比IgM和IgA早一天被检测到 (Hsue,P.R.,Huang,L.M.,Chen,P.J.,Kao,C.L.和Yang P.C.(2004)Chronological evolution of IgM,IgA,IgG and neutralization antibodiesafter infection with SARS-associated coronavirus,Clinical Microbiology andInfection,10(12),1062-1066)。Reusken等人公开了针对SARS-CoV-2刺突蛋白片段的抗体的特异性但不一定灵敏的检测(Specific serology for emerging human coronavirusesby protein microarray.Euro Surveill.2013；18(14))。Yu等人(2020)Measures fordiagnosing and treating infections by a novel coronavirus responsible for apneumonia outbreak originating in Wuhn,China,Microbes and Infection 22(2020),74-79在未指出特定抗原的情况下公开可以使用免疫学方法用于检测SARS-CoV-2感染，但与较差的灵敏度和特异性有关。
如本说明书和权利要求书所述，本发明解决了上文讨论的问题。
在第一方面，本发明提供了用于诊断SARS-CoV-2感染的方法，该方法包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选IgM、IgG和/或IgA类抗体，更优选IgA类抗体的存在或不存在的步骤。在本说明书全文中无论何时提及SEQ ID NO并且SEQ ID NO：表示氨基酸序列时，其意图是表示包含所述相应氨基酸串的多肽，即使在这方面没有特别提及术语“多肽”。关于本发明，术语“包含”具有两个含义，即“包含”和“由...组成”。
在第二方面，本发明提供了用于鉴别诊断冠状病毒感染的方法，优选用于区分SARS-CoV；优选SARS-CoV-2；MERS、NL63、229E、 OC43和HKU1感染，包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO： 1的抗体、优选IgA和/或IgG类抗体、更优选IgA类抗体的存在或不存在的步骤。
在一个优选的实施方案中，除了针对SEQ ID NO：1的IgA类抗体之外，还检测针对SEQ ID NO：1的IgG和/或IgM类抗体的存在。
根据本发明，“受试者”(或在本文中可互换地称为“患者”) 是指哺乳动物，优选人，但也可以替代地还指不同的哺乳动物，例如非人灵长类动物或能够产生针对SEQ IDNO：1或其变体的抗体的其他哺乳动物或甚至非哺乳动物。
根据本发明，来自受试者的术语“样品”可以是所述受试者的可以包含抗体的任何体液或组织的样品。示例性体液包括例如血液、唾液、鼻粘液或淋巴液。在一个优选的实施方案中，样品是血液样品，优选选自包含以下的组：全血、血清、血浆、毛细血管血液、动脉血、静脉血或其任何混合物。毛细血管血液优选地是干燥的斑点的形式，其可以由患者制备、送到实验室、然后提取血液。本领域技术人员知道可用于从受试者获得适合用于本文公开的方法、产品和用途的目的和所需量的样品的各种工具和方法。在某些实施方案中，样品可以由医师从受试者获得，而在其他情况下，样品可以由受试者本身获得，例如，通过使用微创工具，例如手指刺破以取血(“手指针刺血液”)。
还应理解，出于本文公开的发明的目的，样品可以源自单个受试者，即单个个体，但是可替代地还可以包含来自多于一个受试者的样品，其中所述来自多于一个受试者的样品被合并为单个样品。例如，在某些情况下，在资源和实验时间方面可能更有效的是首先分析包括来自一组受试者(例如，普通家庭、学校班级、运动队或同一公司部门的成员)的合并的样品并且只有在检测到存在针对SEQ ID NO：1 或其变体的抗体的情况下，才进行第二次分析，其中单独地对来自个体受试者的样品进行测定。
如本文所述，可以用来自受试者的样品进行根据本发明的各种方法或用途。这些方法或用途也可以表征为“体外”方法或“体外”用途。
根据本发明，广义上的术语“第二抗体”应被理解为是指能够特异性结合IgA、IgG和/或IgM类抗体或其片段(例如选定物种优选人类物种的特定Ig类别的恒定结构域)的任何种类的“结合部分”，优选结合蛋白。结合部分的非限制性实例包括抗体，例如免疫或遗传地衍生自任何物种(例如人、鸡、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鲨鱼、山羊、啮齿动物、牛、狗、兔等)的抗体、抗体片段、结构域或其部分，例如Fab、Fab’、F(ab')2、scFab、Fv、scFv、VH、VHH、VL、VLR 等，双抗体，单克隆抗体(mAb)，多克隆抗体(pAb)，mAbdAb，噬菌体展示衍生的结合物，亲和体(affibody)，异源缀合物抗体，双特异性抗体，evibody，脂质运载蛋白(lipocalin)，anticalin，亲和体， avimer，最大抗体(maxibody)，热休克蛋白(例如GroEL和GroES)，反式抗体(trans-body)，DARPin，适配体，C型凝集素结构域，例如四连接素；人γ-晶状蛋白和人泛素衍生的结合剂，例如affilin，PDZ 结构域衍生的结合剂；蝎毒素和/或Kunitz型结构域结合剂，纤连蛋白衍生的结合剂，例如adnectin，受体，配体，凝集素，链霉亲和素，生物素，包括其衍生物和/或组合，例如由两种或更多种这些结合分子形成的双/多特异性形式。各种抗体衍生的和替代的(即非抗体)结合蛋白支架(包括其产生方法)是本领域已知的(例如，在Chiu ML等人,Antibodies(Basel),(2019)；8(4):55；Simeon R.&Chen Z.,ProteinCell.(2018)；9(1):3-14；和Stefan Dübel编辑的第7章–Non-Antibody Scaffolds fromHandbook of Therapeutic Antibodies(2007)中综述的)。
所有这些类型的分子是本领域众所周知的。一些示例在下文中更详细地描述。
“Evibody”是从T细胞表面受体细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4)的可变(V)组Ig样支架衍生的工程化结合蛋白。对应于抗体的CDR的环可以被异源序列取代以赋予不同的结合特性。制备evibody的方法是本领域已知的，并描述于例如美国专利号 7,166,697。
“脂质运载蛋白”是细胞外蛋白家族，其运输小的疏水分子，例如类固醇、后胆色素、类维生素A和脂质。它们具有刚性的β-折叠二级结构，其中在锥形结构的开放端具有多个环，其可以被工程化为与不同的靶抗原结合。根据本发明，“anticalin”，也称为“affilin”，大小为160-180个氨基酸，并且衍生自脂质运载蛋白(Rothe C&Skerra A.,BioDrugs.(2018)；32(3):233-243；Gebauer M&Skerra A,Curr Opin Biotechnol.(2019)；60:230-241)。
“亲和体”是衍生自葡萄球菌蛋白A的Z-结构域的抗体模拟物家族。亲和体在结构上基于三螺旋束结构域。亲和体的分子量为约6 kDa，并且在高温下以及在酸性或碱性条件下是稳定的。通过使位于参与亲本蛋白结构域的结合活性中的两个α-螺旋中的氨基酸随机化来获得靶标特异性(Feldwisch,J&Tolmachev,V.(2012)Methods Mol. Biol.899:103-126)。制备亲和体的方法是本领域已知的，并在Wikman M等人,Protein Eng Des Sel.(2004)；17(5):455-62中描述。
“Avimer”(亲和力多聚体的缩写)是一类人工多结构域蛋白，其通过多个结合位点特异性结合某些抗原。该蛋白也称为“最大抗体”或低密度脂蛋白受体(LDLR)结构域A。它由两个或更多个基于A 结构域的(多肽)肽序列组成。A结构域是衍生自细胞外富含半胱氨酸的细胞表面受体蛋白并通过二硫键的形成和钙离子的络合作用得以稳定的30-35个氨基酸的支架(～4kDa)。支架结构由12个保守氨基酸维持，剩下的所有其余非保守残基适合随机化和配体结合。 Avimer具有高度的热稳定性。由于其体积小，avimer通常由多个A 结构域组成，每个结构域与靶标上的不同位点结合，从而通过亲合力实现更高的亲和力(Silverman J等人(2005)，Nat Biotechnol 23： 1556-1561)。
“DARPin”是经设计的锚蛋白重复结构域，并基于紧密堆积的锚蛋白重复序列，其各自形成β转角和两个反平行的α螺旋。DARPin 通常携带对应于人工共有序列的三个重复序列，其中单个重复序列通常由33个氨基酸组成，其中六个形成结合表面。在重组文库设计期间，这些位点用于引入随机氨基酸的密码子。DARPin通常由屏蔽疏水区的N端和C端基序之间包含的两个或三个结合基序形成。DARPin是小蛋白(～14-18kDa)，其具有极强的热稳定性并且对蛋白酶和变性剂具有抗性(PlückthunA.，Annu Rev Pharmacol Toxicol.(2015)；55：489-511)。
“Kunitz型结构域结合剂”是～60个氨基酸的多肽(～7kDa)，其衍生自Kunitz型蛋白酶抑制剂例如抑肽酶(牛胰腺胰蛋白酶抑制剂)、阿尔茨海默氏淀粉样蛋白前体蛋白和组织因子途径抑制剂的活性基序。Kunitz结构域的疏水核心由通过三对二硫键稳定的扭曲的双链反平行β-折叠和两个α-螺旋组成。可以取代三个环中的残基而不破坏结构框架的稳定性(Hosse RJ等人(2006).Protein Sci 15:14-27； Simeon R.&Chen Z.Protein Cell.(2018)；9(1):3-14)。
“Adnectin”是一类具有由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第十个结构域的天然氨基酸序列的骨架组成的支架的结合蛋白。该分子采用β夹心折叠，其中七条链由六个环连接，类似于免疫球蛋白结构域，但没有任何二硫键。可以对β夹心一端的三个环进行工程改造以使adnectin能够特异性识别感兴趣的靶标。还发现非环残基扩大了可用的结合足迹。已通过mRNA、噬菌体和酵母展示技术选择了具有纳摩尔至皮摩尔范围的结合亲和力的配体结合型adnectin变体(Hackel BJ等人(2008)J Mol Biol 381:1238-1252)。
用于开发、筛选和鉴定针对期望的靶结构的各种支架(包括但不限于本文所述的那些)的合适结合分子(例如IgA和/或IgG类抗体) 的工具和方法是本领域众所周知的并且是常规使用的。如今，示例性的常规执行的方法包括但不限于基于高通量(HT)组合库的展示和选择方法，例如噬菌体展示，核糖体展示，mRNA展示和细胞表面展示 (例如酵母展示)。
在一个优选的实施方案中，第二抗体是免疫球蛋白(Ig)，优选在非人类物种中产生的IgG，其中所述第二抗体特异性结合另一个选定物种优选人物种的一种或多种特定Ig类别或其片段(例如特定Ig 类别的恒定结构域)的免疫球蛋白。一个例子是在山羊中产生的特异性识别人IgA的多克隆抗体(即，多克隆山羊抗人IgA抗体)。在另一个优选的实施方案中，第二抗体是特异性结合另一种选定物种优选人物种的一种或多种特定Ig类别或其片段(例如特定Ig类别的恒定结构域)的免疫球蛋白的单克隆抗体。用于产生能够特异性结合一种或多种选择的靶抗原的(单克隆或多克隆)抗体的工具和方法是本领域众所周知的。
在某些实施方案中，可以选择第二抗体以特异性结合仅一类、仅两类或所有三类Ig抗体，即IgA、IgG和/或IgM。在某些实施方案中，代替仅使用一种类型的第二抗体，可以使用几种不同的第二抗体的混合物，其中不同的第二抗体结合相同的一种或不同的Ig类别(例如，均与IgA结合的不同抗体(例如多克隆抗体)的混合物)或结合例如 IgA和IgG或IgM，或其中不同的第二抗体结合不同的个体靶结构(例如，特异性结合IgA的一种类型的第二抗体，特异性结合IgG的另一种类型的第二抗体)。
在一个优选的实施方案中，使用标记的第二抗体优选结合IgA、 IgG和/或IgM类抗体的标记的第二抗体检测针对SEQ ID NO：1的抗体。
如本文所用，关于第二抗体的术语“标记的”旨在包括这样的实施方案，其中通过偶联优选物理连接可检测物质例如放射性试剂或其他提供可检测的信号的分子(例如但不限于荧光团，例如小的有机化学荧光团或荧光蛋白，或酶活性标记，即酶，例如碱性磷酸酶，其存在可基于其与底物物质的反应性和/或底物物质的转化来评估并任选地定量)来标记第二抗体。各种合适的可检测标记是本领域已知的，并且在下文中也描述了其中的一些。
在一个优选的实施方案中，使用选自包含比色法、免疫荧光、酶促活性的检测、化学发光和放射活性的组的方法来检测抗体，优选 IgA、IgG或IgM类抗体。
在一个优选的实施方案中，在早期阶段检测到感染。在一个优选的实施方案中，如本文在SARS-CoV-2感染的过程的背景下所指的术语“早期阶段”是指在已知感染时间点的情况下，例如在实验室实验中受试者的感染，在感染时间点(即病毒与受试者身体之间初次接触的时间点)后少于14天(优选少于6天)内的任何时间点。在另一个优选的实施方案中，本文在SARS-CoV-2感染的过程的背景下所指的术语“早期阶段”是指在疾病发作后(即在一种或多种典型的SAR-CoV-2 感染相关的临床症状(例如如本文所定义的)的首次出现后)少于14 天，优选少于6天(在病毒学领域也称为“疾病发作后的天数”(dpoi)) 的任何时间点。本领域技术人员知道，在感染后，可以直接检测冠状病毒的成分，例如使用PCR用于检测核酸和免疫测定用于检测样品中的病毒抗原。在最大病毒载量的感染高峰之后，可能是患者首次接触病毒后仅几天，病毒的浓度降低，这使得直接检测越来越困难并最终是不可能的，最终病毒在样品中不存在。同时，一旦患者血液中存在病毒成分，就会触发针对病毒成分的抗体的产生。在另一个优选的实施方案中，术语“早期阶段”是指病毒与患者之间的第一次接触或疾病发作(优选疾病发作)与针对病毒的可检测IgG抗体产生之间的时间窗口，更优选在IgG抗体是主要的免疫球蛋白类别，即以比IgA和IgM 更高的浓度存在之前，最优选在达到IgG浓度峰值之前。因此，IgA 和IgM抗体的检测可促成仍是急性的(具有或不具有可检测的症状) 但在发展出完整的IgG免疫应答之前的感染的诊断。
在第三方面，本发明提供了针对SEQ ID NO：1的抗体优选IgA 类抗体用于诊断SARS-CoV-2感染或用于冠状病毒感染的鉴别诊断，优选用于区分SARS-CoV、优选SARS-CoV-2、MERS、NL63、229E、 OC43和HKU1感染的用途。
在一个优选的实施方案中，该用途用于SARS-CoV-2感染的早期诊断或早期阶段诊断。
在第四方面，本发明提供了试剂盒，其包含含有SEQ ID NO：1 或其变体的多肽，所述多肽优选包被在诊断上有用的承载体上，以及选自包含以下的组的一种或多种、优选所有试剂：针对SEQ ID NO： 1的抗体；洗涤缓冲液；用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在或不存在的工具，所述抗体优选为IgA、IgG和/或IgM类抗体，更优选为IgA类抗体；优选与IgA、IgG和/或IgM特异性结合的第二抗体，更优选为IgA类抗体，所述第二抗体优选包含可检测标记；和稀释缓冲液。
在一个优选的实施方案中，诊断上有用的承载体选自包含以下的组：珠子，优选磁性或顺磁性珠子，测试条，微量滴定板，膜，优选地选自包含硝酸纤维素膜、蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹的组，侧向流动装置，玻璃表面，载玻片，微阵列，色谱柱和生物芯片，并且优选为微量滴定板。
在一个优选的实施方案中，试剂盒包含两个或更多个、优选三个或更多个校准物。
在一个优选的实施方案中，每个校准物是与SEQ ID NO：1结合的重组抗体，其优选被结合IgA类抗体的第二抗体识别。在某些优选的实施方案中，校准物是与SEQ ID NO：1或其变体结合的重组抗体，并且所述重组抗体优选是与第二抗体结合的Ig类别相同的Ig类别的免疫球蛋白(Ig)。
在第五方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽和/或针对SEQ IDNO：1的抗体优选IgA类抗体在制备根据此方面的诊断试剂盒中的用途，本发明特别涉及包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽在制备诊断试剂盒中的用途。此外，本发明还提供了针对SEQ ID NO：1的抗体，优选IgA、IgM和/或IgG，更优选IgA类抗体，在制备诊断试剂盒中的用途。
诊断试剂盒优选用于诊断SARS-CoV-2感染，或用于鉴别诊断冠状病毒感染，优选用于区分SARS-CoV、优选SARS-CoV-2、MERS、 NL63、229E、OC43和HKU1感染。因此，本发明涉及包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽在制备用于诊断SARS-CoV-2感染的诊断试剂盒中的用途。所述SARS-CoV-2感染的诊断可以例如包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1 的IgA、IgM和/或IgG，更优选IgA类抗体的存在或不存在的步骤。所述SARS-CoV-2感染的诊断还可以包括从受试者获得样品的步骤，以及检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对 SEQ ID NO：1的IgA、IgM和/或IgG，更优选IgA类抗体的存在或不存在的步骤。本发明进一步涉及包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽在制备诊断试剂盒中的用途，所述诊断试剂盒用于鉴别诊断冠状病毒感染，优选用于区分SARS-CoV、优选SARS-CoV-2、MERS、NL63、 229E、OC43和HKU1感染。所述鉴别诊断可以例如包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1 的IgA、IgM和/或IgG，更优选IgA和/或IgG类抗体，最优选针对 SEQ ID NO：1的IgA类抗体的存在或不存在的步骤。所述鉴别诊断还可包括从受试者获得样品的步骤，以及检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1的IgA、IgM和/ 或IgG，更优选IgA和/或IgG类抗体，最优选针对SEQ ID NO：1 的IgA类抗体的存在或不存在的步骤。
根据此方面，本发明同样提供了用于诊断例如用于在人或动物体上实践的诊断方法的包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽。特别地，本发明提供了用于诊断SARS-CoV-2感染的包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽。所述SARS-CoV-2感染的诊断可以例如包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1 的IgA、IgM和/或IgG，更优选IgA和/或IgG类抗体，最优选针对 SEQ ID NO：1的IgA类抗体的存在或不存在的步骤。所述 SARS-CoV-2感染的诊断还可以包括从受试者获得样品的步骤，以及检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1的IgA、IgM和/或IgG，更优选IgA和/或IgG类抗体，最优选针对SEQ ID NO：1的IgA类抗体的存在或不存在的步骤。本发明进一步提供了包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽用于鉴别诊断冠状病毒感染，优选用于区分SARS-CoV(优选SARS-CoV-2)、MERS、 NL63、229E、OC43和HKU1感染。所述鉴别诊断可以例如包括检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1的IgA、IgM和/或IgG，更优选IgA和/或IgG类抗体，最优选针对SEQ ID NO：1的IgA类抗体的存在或不存在的步骤。所述鉴别诊断还可以包括从受试者获得样品的步骤，以及检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1的IgA、 IgM和/或IgG，更优选IgA和/或IgG类抗体，最优选针对SEQ ID NO： 1的IgA类抗体的存在或不存在的步骤。
本发明进一步提供了用于诊断例如用于在人或动物体上实践的诊断方法的针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1的IgA、 IgM和/或IgG，更优选IgA和/或IgG类抗体，最优选IgA类抗体。特别地，本发明涉及用于诊断SARS-CoV-2感染的针对SEQ ID NO： 1的抗体，优选IgA、IgM和/或IgG，更优选针对SEQ ID NO：1的 IgA和/或IgG类抗体，最优选IgA类抗体。本发明还涉及针对SEQ ID NO：1的抗体，优选针对SEQ ID NO：1的IgA、IgM和/或IgG，更优选针对SEQ ID NO：1的IgA和/或IgG类抗体，最优选IgA类抗体，其用于冠状病毒感染的鉴别诊断，优选用于区分SARS-CoV、优选SARS-CoV-2、MERS、NL63、229E、OC43和HKU1感染。
在第六方面，本发明提供了与SEQ ID NO：1结合的重组抗体作为校准物用于早期诊断SARS-CoV-2感染的用途，所述重组抗体优选被结合IgA类抗体的第二抗体识别。
根据这个方面，本发明还提供了与SEQ ID NO：1结合的重组抗体例如重组IgA类抗体作为校准物，优选作为用于检测来自受试者的样品中的针对SEQ ID NO：1的抗体优选针对SEQ ID NO：1的IgA 类抗体的校准物的用途。这样的校准物尤其可以用于诊断 SARS-CoV-2感染的方法，用于鉴别诊断冠状病毒感染的方法，优选用于区分SARS-CoV、优选SARS-CoV-2、MERS、NL63、229E、OC43 和HKU1感染。因此，本发明同样提供了与SEQ ID NO：1结合的重组抗体例如重组IgA类抗体作为校准物的用途，优选地用于 SARS-CoV-2感染的诊断，特别是用于早期诊断。
在一个优选的实施方案中，人受试者是接种疫苗的人受试者。
在一个优选的实施方案中，该方法还包括评估结果以用于诊断。在一个优选的实施方案中，该方法还包括将诊断或评估的结果传送到不同的位置。
各种抗原和抗体已被用作冠状病毒免疫学检测的基础，其中包括整个病毒或任何结构蛋白或其片段以及与这些抗原结合的抗体。
本发明基于发明人的令人惊讶的发现，即可以在感染的早期阶段检测到针对SEQID NO：1的抗体。为了确定在感染的早期阶段是否存在感染，可以对它们进行检测。
换句话说，本文所公开的结果证明了用于诊断已经在感染早期阶段的SARS-CoV-2感染的优越的灵敏度，优选地，如通过相对于所检查的样品的总数的正确阳性测定的样品的数量测量的。观察到的灵敏度提高的重要贡献因素是以下令人惊讶的发现：针对SEQ IDNO：1 的IgA类抗体可在许多患者(包括缺乏可检测的IgM抗体的患者亚群) 中比其他Ig类别的抗体(例如IgG抗体)更早地被检测到。
此外，本发明基于以下令人惊讶的发现：与针对SARS-CoV-2N 蛋白的抗体相比，针对SEQ ID NO：1的抗体(优选IgG和/或IgA) 持续时间更长并且可在更长的时间内被检测到。
另外，在来自被其他冠状病毒(优选非SARS-CoV-1和 SARS-CoV-2)感染的患者的样品中存在与一系列抗体的令人惊讶的低的交叉反应性，这促成了针对SEQ ID NO：1的抗体的检测的优越的特异性，优选如通过正确鉴定的阴性样品的高的数量测量的，即相对于检查的样品总数的假阳性鉴定的样品的低的数量。特别地，发明人发现用作抗原的SEQ IDNO：1的特异性与SEQ ID NO：33(S2 结构域)相比是优越的(Okba等人,Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus 2-Specific Antibody Responses in CoronavirusDisease Patients.Emerg Infect Dis.2020Jul；26(7):1478-1488，预先发布在medRxiv2020.03.18.20038059上)。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“诊断”应在其最广泛的意义上理解，并且可以是指旨在获得有助于评估患者在过去、在诊断时或在未来是否曾经患有、患有或可能或比平均水平或比较受试者(后者优选具有类似的症状)更可能患有某种疾病或病症(以发现疾病如何进展或可能会在未来进展，或者评估一名或多名患者通常对治疗(优选疫苗)的反应性，或者发现样品是否来自这样的患者) 的信息的任何种类的程序。这样的信息可以用于临床诊断，但是也可以出于一般研究的目的而由实验和/或研究实验室获得，例如以确定患者队列或群体中患有疾病的受试者的比例。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括预测和/或监测疾病或病症的病程，包括监测一个或多个患者对药物或候选药物施用的反应，例如以确定其功效。同样，可以利用针对SEQ ID NO：1的IgA和/或IgG抗体的早期出现和/或长期持久性。虽然可以将结果分配给特定患者用于临床诊断应用，并且可以将结果例如通过电话、传真、信件或电子格式(例如电子邮件或使用数据库)传达给治疗所述患者的医生或机构，但对于其他应用(例如出于研究目的的诊断中)，并不一定需要这样做，将结果分配给来自匿名患者或患者队列的样品可能就足够了。在一个优选的实施方案中，要诊断的人即“受试者”或“患者”是匿名献血者，其血液可以被捐献或用于获得治疗上有用的抗体。优选地，该疾病是 SARS感染，包括SARS-CoV-1和SARS-CoV-2，更优选SARS-CoV-2 感染。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法、产品和用途可用于相互作用研究，包括确定药物候选物或其他化合物包括候选疫苗或任何身体化合物(bodily compound)例如阻断抗体是否存在并且是否可能干扰抗体与SARS-CoV-2的结合或是否可能影响任何下游过程。在一个优选的实施方案中，它们可用于在包含含有SEQ ID NO：1的多肽或其免疫原性变体的免疫原性组合物的施用(例如施用至哺乳动物，其可以是人以外的哺乳动物，例如实验室动物)后监测免疫应答，更优选监测针对包含SEQ ID NO：1优选由SEQ ID NO：1组成的多肽的抗体的出现和/或滴度。IgA和/或IgG抗体的检测(优选在受试者的免疫的晚期，更优选地出于增加检测灵敏度或优化检测灵敏度的目的)是特别优选的。在一个优选的实施方案中，免疫是SARS-CoV-2 感染的结果或施用包含SEQ ID NO：1或其变体的疫苗的结果。所述增加或优化可以与针对SARS-CoV-2或其组分(例如SEQ ID NO：30 (N蛋白))的其他抗体(优选针对SEQ ID NO：30的IgG类抗体) 相比。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“晚期阶段”是指从疾病发作或疫苗的第一次施用后的第20、30、40、50、60、61、70、 80或90天(优选60天)开始的时期。其优选持续28天、1、2、3、 4、5、6、9、12、15、18、24、36、48、60或更多个月，优选3个月或更多个月。在一个优选的实施方案中，方法或用途可以用于免疫的长期监测。免疫可以是SARS-CoV-2感染或疫苗接种(优选用SEQ ID NO：1或其变体的疫苗接种)的结果。分析了在晚期阶段获得的至少一种(优选两种或更多种)样品。在晚期阶段，可至少每周一次或每月一次获得样品并进行分析。
如果在来自受试者的样品中检测到针对SEQ ID NO：1的IgA和 /或IgG和/或IgM抗体，则该受试者可能或更可能遭受SARS-CoV-2 感染。本领域技术人员熟悉涉及反映抗体的存在或不存在的结果的解释的病毒学的一般原理(例如，Doerr，HW和Gerlich，W.，Medizinische Virologie：Grundlagen，Diagnostik，
Figure GDA0003130300840000171
Therapie，Thieme 2010，例如其中的图9.7)。简而言之，针对病毒特异性抗原的特异性抗体的首次检测可以用于感染的初步诊断。除特定情况(例如肠病毒感染的情况)外，IgA抗体通常与诊断无关 (Gressner/Arndt,Lexikon der Medizinischen Labordiagnostik,2. Auflage,Springer,2013，第1387页)，但如果它们出现，则其滴度通常会低于IgM和IgG类抗体，并且它们可能较晚出现。低浓度的 IgG类抗体，优选在没有IgM和IgA类抗体的情况下，表明过去已经进行了免疫接种。增加的IgG类抗体滴度或高浓度可能指示急性感染或再次感染。在一个优选的实施方案中，由于先前或正在进行的 SARS-CoV-2感染或疫苗接种，针对SEQ IDNO：1的抗体的存在指示免疫接种。在一个优选的实施方案中，使用包含含有SEQ ID NO： 1或其变体的多肽的疫苗(或使用编码含有SEQ ID NO：1或其变体的多肽的核酸，例如基于RNA的疫苗)的成功接种可以通过确认不存在针对SEQ ID NO：1以外的SARS-CoV-2抗原的抗体，优选通过确认不存在针对SEQ ID NO：30(SARS-CoV-2N蛋白)的抗体来与 SARS-CoV-2感染区别开。
样品优选为哺乳动物样品，即来自哺乳动物的样品，更优选为人样品，即来自人的样品。
术语“诊断”优选地并不意味着根据本发明的诊断方法或试剂将确定并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断，而是可以指的是促成所谓的“鉴别诊断”，即一种系统的诊断程序，该诊断程序基于一系列诊断参数来考虑一系列可能条件的可能性。根据本发明，可以区分患者(优选已经怀疑患有冠状病毒感染的患者)是否患有SARS，优选SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2感染，或者另一种冠状病毒感染，优选选自包含MERS、NL63、229E、OC43和HKU1的组。NL63、229E、OC43和HKU1与大量普通感冒病例相关，因此鉴别诊断可能涉及区分SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2与感冒。例如，由于可能暴露于风险环境和/或基于常见症状例如发烧、咳嗽和呼吸急促，可能最初怀疑患者患有冠状病毒感染。随后可进行PCR(例如 Corman VM,Landt O,Kaiser M等人,Detection of 2019novel coronavirus(2019-nCoV)by real-time RT-PCR.Euro Surveill. 2020；25(3):2000045.doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045)和/ 或免疫测定。如果PCR是阴性的，例如因为样品在感染后数天获得，则可以使用本发明的方法检测是否存在针对SEQ ID NO：1的抗体。此外，可以检测针对来自另一种冠状病毒(优选选自包含以下的组： SARS-CoV-1、MERS、NL63、229E、OC43和HKU1，更优选选自 MERS、NL63、229E、OC43和HKU1)的抗原的抗体的存在或不存在。可以检测针对来自SARS-CoV-2的SEQ ID NO：1的同源物和变体的抗体。基于特定的临床症状，例如头痛和身体疼痛(它们更多地是SARS-CoV-1的特征)，或味觉和嗅觉的丧失和喉咙痛(它们更多地是SARS-CoV-2的特征)，可以最终完成诊断。可以考虑患者是否曾暴露于感染的患者。例如，SARS-CoV-1病例是极少见的，因此可以假设在SARS-CoV-2大流行中患有常见SARS-CoV-1和SARS-CoV-2症状的许多患者遭受后一冠状病毒的感染。基于不同的时间分辨的免疫球蛋白(Ig)类别标志，特别是SARS-CoV-1中IgA 类抗体的较晚出现(Hsue,P.R.,Huang,L.M.,Chen,P.J.,Kao,C.L., 和Yang P.C.(2004)Chronological evolution ofIgM,IgA,IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus,Clinical Microbiology and Infection,10(12),1062-1066)，SARS-CoV-1和SARS-CoV-2之间的区分是可能的。可以监测(例如，在数周内)抗体水平，以检测感兴趣的抗体的消失或出现，这可以帮助区分初次和二次感染或免疫接种(例如，接种疫苗的结果)或识别多于一种冠状病毒的感染。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“SARS-CoV-2”是指通过在登录号MN908947下保藏在GenBank或SEQ ID NO：13的基因组(优选如SEQ ID NO：13所示，及其在整个基因组核苷酸序列上具有至少80％、优选85％、优选88％、优选90％、优选91％、优选92％、优选93％、优选94％、优选95％、优选96％、优选97％、优选98％、优选99％、优选99.5％、优选99.8％、优选99.9％或99.99％的序列同一性的衍生物)表征的病毒。本文中使用的所有数据库条目或产品代码均对应于本申请的最早优先权或申请日在线的版本。例如，对于以登录号MN908947保藏的SARS-CoV-2基因组序列，版本 MN908947.3(于2020年1月17日发布)在本申请的最早优先权或申请日是在线的。MN908947.3中公开的核苷酸序列与SEQ ID NO：13 相同。更优选地，包括了诸如来自包含英国变体B.1.1.7、南非变体B.1.351、巴西变体P.1和来自丹麦的水貂变体的组的那些突变体。
在一个优选的实施方案中，待诊断的SARS-CoV-2感染是或可能与英国变体B.1.1.7(其特征在于相对于SEQ ID NO：1具有来自包含His 54和/或Val55中的一个或多个缺失、Gln486Tyr、Ala555Asp、 Asp599Gly和Pro666His的组的一个或多个突变优选全部突变的刺突蛋白)相关。优选地，具有来自包含His 54和/或Val55中的一个或多个缺失、Gln486Tyr、Ala555Asp、Asp599Gly和Pro666His的组的一个或多个突变优选全部突变的SEQID NO：1的变体用于根据本发明的试剂、方法和用途。包含所有这些突变的SEQ ID NO：1的变体由 SEQ ID NO：51表示。
在一个优选的实施方案中，待诊断的SARS-CoV-2感染是或可能与南非变体B.1.351(其特征在于相对于SEQ ID NO：1具有来自包含 Lys402Gln、Glu469Lys、Gln486Tyr和Asp599Gly的组的一个或多个突变优选全部突变的刺突蛋白)相关。优选地，具有来自包含 Lys402Gln、Glu469Lys、Gln486Tyr和Asp599Gly的组的一个或多个突变优选全部突变的SEQ ID NO：1的变体用于根据本发明的试剂、方法和用途。包含所有这些突变的SEQ ID NO：1的变体由SEQ ID NO：52表示。
在一个优选的实施方案中，待诊断的SARS-CoV-2感染是或可能与巴西变体P.1(其特征在于相对于SEQ ID NO：1具有来自包含 Glu469Lys和Gln486Tyr的组的一个或多个突变优选全部突变的刺突蛋白)相关。优选地，具有来自包含Glu469Lys和Gln486Tyr的组的一个或多个突变优选全部突变的SEQ ID NO：1的变体用于根据本发明的试剂、方法和用途。包含所有这些突变的SEQ ID NO：1的变体由SEQ ID NO：53表示。
在一个优选的实施方案中，待诊断的SARS-CoV-2感染是或可能与来自丹麦的水貂变体(其特征在于相对于SEQ ID NO：1具有来自包含His 54和/或Val55中的一个或多个缺失、Asp599Gly和 Tyr438Phe的组的一个或多个突变优选全部突变的刺突蛋白)相关。优选地，具有来自包含His 54和/或Val55中的一个或多个缺失、 Asp599Gly和Tyr438Phe的组的一个或多个突变优选全部突变的SEQ ID NO：1的变体用于根据本发明的试剂、方法和用途。包含所有这些突变的SEQ ID NO：1的变体由SEQ ID NO：54表示。
在一个优选的实施方案中，术语“诊断”是指该方法或产品或用途可用于帮助疾病的诊断或鉴定具有患有疾病的风险的受试者。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或药剂。换句话说，该方法或药剂可以涉及为受试者选择治疗方案。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法包括提供诊断上有用的承载体和来自怀疑被感染的患者优选哺乳动物更优选人患者的样品的步骤。承载体被包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽包被。然后可以在允许任何抗体与包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽结合的条件下使承载体与样品接触。然后可以去除样品，并且可以洗涤承载体以去除任何剩余的样品。然后可以在允许任何结合的抗体和第二抗体之间形成复合物的条件下，使与要检测的抗体结合并带有可检测标记的第二抗体或类似试剂或工具与承载体接触。然后可以洗涤承载体以除去未结合的第二抗体。最后，通过检查是否可以检测到第二抗体来检测抗体的存在。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“SARS-CoV-2感染”或类似术语是指受试者优选人受试者被SARS-CoV-2感染，即病毒至少暂时地在所述受试者的体内的存在，更优选连同可检测水平的病毒本身和/或来自包含SARS-CoV-2多肽(来自包含结构蛋白，特别是S和N，更优选地S1结构域的组)和与其结合的抗体和/或来自 SARS-CoV-2的核酸(后者可通过PCR检测)的组的一种或多种生物标志物。所述受试者可以具有临床症状，优选选自包含发烧、疲倦、干咳、鼻充血、流鼻涕和喉咙痛的组的一种或多种更优选全部症状。更严重的症状包括呼吸困难、胸痛或压力以及突然的意识混乱。该疾病可能导致并发症，例如肺炎、急性呼吸窘迫综合征、败血症、败血性休克和肾衰竭。然而，许多受感染的受试者仅具有轻度的症状，并且甚至可能不知道其感染。
在一个优选的实施方案中，方法被多于一次使用以检查来自同一患者的样品，优选在不同的日期进行。例如，可以在一到两周内每天检测抗体的存在或不存在。在一个优选的实施方案中，在不同的日期检查至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个样品。在一个优选的实施方案中，至少在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15或16周的时间内取样。
根据本发明的方法、试剂和用途还可以用于筛选抗病毒药物或疫苗或候选疫苗的效力和有用性。在这方面，值得注意的是，本发明的方法已经在接种疫苗的人中得到验证，即，在用包含含有SEQ ID NO： 1的多肽的组合物接种的人中可检测到针对包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的抗体。它们可以用作疫苗接种试验和研究的一部分，目的是在人和其他受试者(包括实验动物)中确认疫苗的质量或确认受试者的免疫系统对疫苗的施用有反应。优选地，疫苗基于SEQ ID NO：1或其片段。所述方法、试剂和用途可用于在初次施用疫苗之前初步诊断患者，以检查所述患者是否已经被免疫，例如由于先前 SARS-CoV-2感染或先前疫苗接种。例如，可以选择患者以包括在研究或试验中或从研究或试验中排除，并随时间进行监测。特别地，已经被感染的受试者可以被排除在测试候选疫苗之外。可以确认先前的疫苗接种是否仍然有效，优选基于针对SEQ ID NO：1的IgA和/或 IgG类抗体的检测。
根据本发明的方法和试剂还可用于筛选捐献的血液是否被冠状病毒污染或献血者是否产生针对SARS-CoV-2(优选SEQ ID NO：1) 的抗体，其可从捐赠的血液中提取，例如用于治疗用途。在检测针对 SEQ ID NO：1的IgG、IgM和/或IgA类抗体优选IgG和IgA更优选IgA的存在或不存在后，可以例如通过亲和层析或通过在与形成包含针对SEQ ID NO：1的抗体与承载体的复合物、去除任何剩余的捐献血液和从承载体分离抗体相容的条件下使根据本发明的承载体与捐献的血液接触，来从献血者的血液中纯化针对SARS-CoV-2优选针对SEQ ID NO：1的抗体。在一个优选的实施方案中，捐献的血液选自包含以下的组：全血、血浆和血清，并且可以包含抗凝血剂。还可以存在选自包含以下的组(优选全部)的化合物：柠檬酸盐、磷酸盐、右旋糖和腺嘌呤。
待检测的抗体优选与SEQ ID NO：1特异性结合。特异性结合优选是指结合反应强于特征在于1x10-5M，更优选1x10-7M，更优选 1×10-8M，更优选1×10-9M，更优选1×10-10M，更优选1×10-11M，更优选1×10-12M的解离常数(如在25℃下在pH为7的PBS缓冲液中使用Biacore设备进行表面等离振子体共振测量的)的结合反应。
本发明的教导不仅可以使用具有在本申请中明确提及(例如通过功能、名称、序列或登录号)的确切序列(例如SEQ ID NO：1或6) 的多肽来进行。
根据本发明，如本文所用，术语“变体”也指所提及的全长序列的至少一个片段，或包含所述片段的多肽，更具体地指相对于全长序列在一个或两个末端上有一个或多个氨基酸的截短的一个或多个氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少10、15、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500或600 个连续氨基酸的(多)肽。例如，SEQ ID NO：1的片段包括SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：31。可以融合片段的两个或更多个拷贝以提高灵敏度。
还应理解，如本文所用，术语“变体”也涵盖包含与所提及的参考氨基酸序列或其片段具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、 85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的这样的多肽或其片段，优选包含至少25，更优选50，更优选200个连续氨基酸的片段，其中除对于生物学活性(例如与感兴趣的抗体特异性结合或维持多肽的折叠或结构的能力)是必需的那些氨基酸外的氨基酸可以被缺失或取代，和/或可以以保守的方式替换一个或多个这样的必需氨基酸和/或添加或缺失氨基酸使得至少部分保留多肽的生物学活性。例如，SEQ ID NO：1的片段包括SEQ ID NO： 5、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14-29、SEQ ID NO：35-37和SEQ ID NO：40-43。现有技术包括可用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008), Introduction to bioinformatics,Oxford University Press,2008，第3 版。在一个优选的实施方案中，以默认设置使用ClustalW软件(Larkin, M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A., McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R., Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W andClustal X version 2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)。
有关特定氨基酸序列的SARS-CoV-2相关出版物(例如Beal等人) 可以帮助技术人员设计变体(Beal,J.,Mitechell,T.,Wyschogrod,W., Manthey,J和Clore,A.(2020)Highly Distinguished Amino Acid Sequences of 2019-nCoV doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.31.929497)，以及与SARS-CoV有关的出版物，例如Hua等人(Hua,R.,Zhou,Y.,Wang,Y.,Hua,Y和 Tong,T.(2004)Identification of two antigenic epitopeson SARS-CoV spike protein,BBR 319,929-935)，其中可以发现同源表位并根据它们的同源性鉴定SARS-CoV-2表位。例如，可能的表位可以衍生自SEQ ID NO：5。Dahlke等人提出了基于微阵列的表位作图，该微阵列包含源自S1多肽的重叠15mer肽(Dahlke,C.,Heidepriem,J.,Kobbe,R., Santer R.,Koch,T.,Fathi,A.,Ly,M.L,Schmiedel,S.,Seeberger,P. H.,ID-UKE COVID-19study group,Addo,M.M.和Loeffler,F.F. (2020)https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20059733doi)。更具体地，包含S1蛋白的氨基酸序列SSVLHSTQDLFLPFF(SEQ ID NO：14，其为SEQ ID NO：1的30-44)、TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPV(SEQ ID NO：15，其为48-68)、 NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEG(SEQ ID NO：16，其为110-166)、 DLPQGFSALEPLVDL(SEQ ID NO：17，其为200-214)、 LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY(SEQ ID NO：18，其为 226-250)、QPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDP(SEQ ID NO：19，其为256-277)、NATRFASVYAWNRKR(SEQ IDNO：20，其为 328-342)、TGKIADYNYKLPDDF(SEQ ID NO：21，其为399-414)、YNYLYRLFRKSNLKP(SEQ ID NO：22，其为434-448)、 FGRDIADTTDAVRDPQTLEILDI(SEQ ID NO：23，其为550-572)、 SNQVAVLYQDVNCTE(SEQ ID NO：24，其为590-604)、AGCLIGAEHVNNSYECDIP(SEQ ID NO：25，其为632-650)的肽被鉴定为IgA反应性表位。包含S1蛋白的氨基酸序列 YNSASFSTFKCYGVS(SEQ ID NO：26，其为354-368)、 STGSNVFQTRAGCLI(SEQ ID NO：27，其为622-636)的肽被鉴定为IgG反应性表位。包含S1蛋白的氨基酸序列SSVLHSTQDLFLPFF(SEQ ID NO：28，其为30-44)和 LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY(SEQ IDNO：29，其为 226-250)的肽被鉴定为IgM反应性表位。此外，发明人已经显示具有序列RTQLPPAYTNS(SEQ ID NO：41)、LTPGDSSSGWTAG (SEQ ID NO：35)、YQAGSTPCNGV(SEQ ID NO：36)和 YGFQPTNGVGYQ(SEQ ID NO：37)的肽与来自SARS-CoV-2患者的抗体具有反应性。许多其他出版物可以在设计变体时被本领域技术人员使用作为指导(Zhang等人,(2020)Miningof epitopes on spike protein of SARS-CoV-2from COVID-19patients,Cell Res 30,702-704 (2020).https://doi.org/10.1038/s41422-020-0366-x；Poh,C.M., Carissimo,G.,Wang,B.等人,Two linear epitopes on the SARS-CoV-2 spike protein thatelicit neutralising antibodies in COVID-19patients. Nat Commun 11,2806(2020).https://doi.org/10.1038/s41467-020-16638-2；Wang等人,(2020) SARS-CoV-2ProteomeMicroarray for Mapping COVID-19Antibody Interactions at Amino AcidResolution,ACS Cent.Sci.2020,6,12, 2238-2249)。在一个优选的实施方案中，使用的多肽包含SEQ ID NO： 1或其变体并且被折叠，并且更优选地包含SEQ ID NO：1的至少150、200、250、300、400、500或600个连续氨基酸。
在一个优选的实施方案中，变体可以另外包括化学修饰，例如标记(例如同位素标记或可检测标记)或共价修饰(例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧化、瓜氨酸化、羟基化等)。本领域技术人员熟悉用于修饰多肽的方法。此外，变体也可以通过与其他已知的多肽或其变体(例如人工接头，亲和标签，其他抗原等)融合而产生。例如，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO： 38是根据本发明的融合蛋白。
根据本发明，可以通过在细胞例如真核细胞(例如CHO或 HEK293细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌细胞)中表达包含亲和标签(任选地与可以包括蛋白酶切割位点的人工接头一起)的SEQ ID NO：1的重组变体，使表达的变体与特异性结合亲和标签的配体(该配体固定在固相上)接触，洗涤固相使得除去来自细胞的非特异性结合的物质并从固相洗脱表达的变体(优选通过添加过量的未固定的配体)，来制备医学或诊断设备，例如诊断上有用的承载体。然后可以将变体固定在设备上。任选地，可以通过使变体与蛋白酶(优选识别蛋白酶切割位点的蛋白酶)接触去除亲和标签，优选在固定之前进行。亲和标签可以选自包含以下标签的组：His、18A、ACP、醛、Avi、 BCCP、钙调蛋白结合肽(CBP)、几丁质结合结构域(CBD)、E-Tag、 ELK16、FLAG、flash、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、GST、绿色荧光蛋白、HA、麦芽糖结合蛋白、myc、nus、NE、ProtA、ProtC、Tho1d4、 S-Tag、SnoopTag、SpyTag、SofTag、链霉亲和素、Strep-标签II、 T7表位标签、TAP、TC、硫氧还蛋白、Ty、V5、VSV和Xpress标签。有用的蛋白酶包括但不限于TEV、凝血酶、Faktor Xa或肠肽酶。包含蛋白酶切割位点的合适的接头(例如，在SEQ ID NO：1或其变体和亲和标签之间)可以包含在该变体中，并且可以是可用于表达所述变体的可商购获得的表达载体(例如pET载体系列(Novagen)) 的编码序列的一部分。
多肽的变体具有生物学活性。在一个优选的实施方案中，这样的生物学活性是结合相应抗体的能力。在一个优选的实施方案中，其包含具有与针对SEQ ID NO：1的抗体结合的能力的表位或自身具有与针对SEQ ID NO：1的抗体结合的能力，所述抗体优选为针对SEQID NO：1的IgA类抗体，所述抗体优选来自患有SARS-CoV-2的患者的样品，其中更优选表位包含含有至少5、6、7或8个氨基酸残基的序列。更优选地，它不特异性结合来自其他冠状病毒(优选选自包含MERS(SEQ ID NO：6)、NL63(SEQ ID NO：10)、229E(SEQ ID NO：7)、OC43(SEQ ID NO：8)和HKU1(SEQ ID NO：9)的组，更优选地选自包含SARS-CoV-1(SEQ ID NO：11)、MERS、 NL63、229E、OC43和HKU1的组)的SEQ ID NO：1的同源物，其中优选使用Biacore设备如上所述定义和确定特异性结合。
本领域技术人员熟悉如何基于合适的氨基酸序列制备诊断上有用的试剂，并且能够提供线性肽(例如通过化学合成)和多肽(例如通过重组表达)。特别地，本领域技术人员知道构象表位和顺序表位都存在，并且必须选择合适的表达和纯化策略以获得可用于检测抗体例如针对SEQ ID NO：1的抗体的诊断上有用的多肽(例如Reischl,U., MolecularDiagnosis of Infectious diseases,Humana Press,1998，例如第12、15、16、18和19章)。本领域技术人员还熟悉评估重组蛋白对测试系统的有用性的方法(例如Reischl,U.,Molecular Diagnosis of Infectious diseases,Humana Press,1998，例如第21-26章)。
根据本发明的用于预后、诊断的抗体或复合物的检测、方法或试剂盒包括使用选自包含以下的组的方法：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记的免疫测定，例如选自放射性标记的免疫测定、酶免疫测定例如比色测定、化学发光免疫测定和免疫荧光技术。在一个优选的实施方案中，使用选自包含以下的组的方法检测复合物：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记的免疫测定，包括放射性标记的免疫测定，化学发光免疫测定，免疫荧光技术和免疫沉淀技术。本领域技术人员熟悉这些方法，这些方法也在现有技术中有所描述，例如在Zane,H.D.(2001): Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company中，尤其是在第14章中。优选地，测试形式为ELISA，并将包含孔的微量滴定板用作诊断上有用的承载体。
优选地，包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽被固定在诊断上有用的承载体的固相上。当与样品接触时，它可以直接固定在固相上，但是也可以使用竞争性测定、捕获桥测定、免疫计量测定、固相上的类别特异性第二抗体、直接或间接的类别捕获测定。这些形式各自的原理在The Immunoassay Handbook,第3版,David Wild编辑, Elsevier,2005中有详细说明。更优选地，固相是测试条或用于ELISA 的微量滴定板的孔，最优选的是用于ELISA的微量滴定板的孔。
在一个优选的实施方案中，使用竞争性测定形式，其中待检测的抗体与另一种针对SEQ ID NO：1的抗体或另一种与SEQ ID NO：1 特异性结合的配体竞争。与SEQ ID NO：1特异性结合的配体可以选自包含以下的组：与SEQ ID NO：1结合的适配体或抗体和人ACE2 受体(SEQ ID NO：39)或其变体，SARS-CoV-2刺突蛋白的天然结合伴侣。这样的方法可以包括提供包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽和与SEQ ID NO：1特异性结合的配体，所述配体优选地选自包含以下的组：抗体、适配体和ACE受体或其变体。如果存在待检测的抗体，它将干扰复合物的形成或部分或完全置换特异性结合SEQ ID NO：1的配体，从而减少复合物的数量。然后可以通过使复合物沉淀 (例如使用与包含SEQ ID NO：1的多肽或与待检测的抗体结合的分子例如第二抗体附接的亲和配体)来检测包含待检测的抗体的任何复合物。亲和配体的实例包括谷胱甘肽和生物素。亲和配体的结合伴侣可以包被在分别与亲和配体例如GST或链霉亲和素结合的固相上。然后可以检测沉淀的任何复合物，优选通过检测分别附接至特异性结合包含SEQ ID NO：1的多肽的配体或附接至包含SEQ ID NO：1的多肽的可检测标记。Tan等人,(2020)A SARS-CoV-2surrogate virus neutralization test based onantibody-mediated blockage of ACE2-spike protein protein interation,NatureBiotechnology 38 (1073-1078)已公开了一项特定的竞争性测试。
可替代地，如果特异性结合SEQ ID NO：1或包含SEQ ID NO： 1的多肽或变体的配体被包被在所述表面上，则复合物可在承载体的表面上形成。通常，将使用这种形式来检测干扰复合物形成的IgA、 IgM和IgG类抗体的存在或不存在。可以通过例如使用蛋白A或蛋白G或第二抗体在之前分离感兴趣的Ig类别的抗体(优选选自包括IgA、 IgM和IgG类抗体的组，优选IgA)来检测特定IgA类抗体。本领域技术人员熟悉适配体(Thiviyanathan V,Gorenstein DG.Aptamers and the next generation of diagnosticreagents.Proteomics Clin Appl. 2012；6(11-12):563-573.doi:10.1002/prca.201200042)和抗体(Hust M, Frenzel A,Schirrmann T,Dübel S.Selection ofrecombinant antibodies from antibody gene libraries.Methods Mol Biol. 2014；1101:305-20；Hanack K,Messerschmidt K,Listek M.Antibodies and Selection ofMonoclonal Antibodies.Adv Exp Med Biol. 2016；917:11-22；Harold F.Stills,in TheLaboratory Rabbit,Guinea Pig,Hamster,and Other Rodents,2012)的合成、选择和使用以及产生并选择与特定靶标结合的抗体(Lottspeich/Engels,Bioanalytic,第6 章及其中的参考文献,Springer 2012)。
在另一个优选的实施方案中，如果样品中存在抗体，则可以在液相中形成包含含有SEQ ID NO：1或其变体的第一和第二多肽(例如 RBD)和待检测的抗体的复合物，因为抗体具有两个或多个结合位点，其各自与包含SEQ ID NO：1的多肽结合。然后可以通过沉淀复合物 (例如使用附接至第一多肽的亲和配体例如谷胱甘肽或生物素以及包被在固相上的分别结合亲和配体的结合伴侣例如GST或链霉亲和素，该固相可以例如是珠子)来检测包含待检测的抗体的任何复合物。然后可以检测沉淀的任何复合物，优选通过检测附接至第二多肽的可检测标记物来检测。可替代地，如果将包含SEQ ID NO：1或其变体的第一多肽包被在承载体的表面上，则可以在所述表面上形成复合物。可替代地，第一和第二多肽可以各自用两个不同的标记物标记，只有当它们非常接近时，例如当通过待检测的抗体桥接时，才可以检测到。同样，将检测是IgA、IgM和IgG类抗体的存在或不存在，除非之前已经例如使用蛋白A或蛋白G或第二抗体分离特定的Ig类抗体(优选选自包括IgA、IgM和IgG类抗体的组，优选IgA)。优选地，在感染的早期阶段，当尚未产生IgG抗体时，IgA抗体将主要或仅被检测到。
任何多肽，例如包含SEQ ID NO：1的多肽或第二抗体，都可以以任何形式和以任何纯化程度从以内源性形式包含所述多肽的组织、流体或细胞(更优选过表达该多肽的细胞，这样的细胞的粗制或富集的裂解物以纯化和/或分离基本上是纯的多肽)提供。在一个优选的实施方案中，该多肽是天然多肽，其中如本文所用，术语“天然多肽”是指折叠的多肽，更优选从细胞，更优选从原核或真核细胞，优选哺乳动物细胞中纯化的折叠的多肽。可以使用糖基化形式的多肽。第二抗体优选是纯的，例如在基于蛋白A或G作为亲和配体的纯化之后。在一个优选的实施方案中，根据本发明使用或提供的任何多肽以折叠状态使用或提供，其中没有显著浓度的变性剂例如含硫醇的化合物例如 DTT。
在一个优选的实施方案中，检测针对SEQ ID NO：1的IgA、IgM 和/或IgG类抗体的存在或不存在。在另一个优选的实施方案中，仅检测IgA的存在或不存在。在另一个优选的实施方案中，仅检测IgM的存在或不存在。在另一个优选的实施方案中，仅检测IgG的存在或不存在。
在一个优选的实施方案中，检测IgA的存在或不存在以及IgG的存在或不存在。更优选地，针对该检测使用或提供针对IgA类抗体的第二抗体和针对IgG类抗体的第二抗体。在另一个优选的实施方案中，检测IgM的存在或不存在以及IgG的存在或不存在。更优选地，针对该检测使用或提供针对IgM类抗体的第二抗体和针对IgG类抗体的第二抗体。在另一个优选的实施方案中，检测IgM的存在或不存在和IgA 的存在或不存在。更优选地，针对该检测使用或提供针对IgM类抗体的第二抗体和针对IgA类抗体的第二抗体。
在一个优选的实施方案中，可以使用包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽(该多肽可以包含附加序列，优选人工序列，例如接头或结合表位)来检测针对SEQ ID NO：1的抗体例如IgA、IgM和/或IgG 的存在或不存在。然而，选择这样的附加序列使得SEQ ID NO：1或其变体与待检测抗体特异性结合的能力或诊断可靠性特别是灵敏度和 /或特异性不会显著改变，更不用说废除。例如，与SEQ ID NO：1或其片段结合从而掩盖表位的结构域不应与多肽融合或不应存在。根据本发明，针对诊断，优选SARS-CoV-2感染的早期诊断，可以检测或使用检测针对SARS-CoV-2抗原的IgA、IgM和/或IgG类免疫球蛋白的第二抗体，其优选选自包含以下的组：包含SEQ ID NO：1或其变体的抗原，包含SEQ ID NO：30或其变体的抗原，包含SEQ ID NO： 31或其变体的抗原和包含SEQ ID NO：33或其变体的抗原，优选选自其全部。选自包括包含SEQ ID NO：30或其变体的抗原、包含SEQ ID NO：31或其变体的抗原和包含SEQID NO：33或其变体的抗原的组优选选自其全部的抗原可以被包被在诊断上有用的承载体上(优选在空间上分开或以混合物的形式)，并与样品接触以检测特异性结合各自抗原的抗体。在一个优选的实施方案中，在检测针对SEQ ID NO：1以外的这样的SARS-CoV-2抗原的抗体之外还检测针对SEQ ID NO：1的抗体可以提高测定的总体灵敏度，特别是在早期阶段诊断 SARS-CoV-2感染或用于在早期阶段的鉴别诊断时。
在一个优选的实施方案中，本发明的产品、方法和用途被配置为使得可以将针对SEQ ID NO：1的抗体的存在或不存在与针对另一种 SARS-CoV-2抗原或一种或更多种其他抗原(优选来自SARS-CoV-2N 蛋白，更优选来自包含SARS-CoV-2N蛋白、SARS-CoV-2M蛋白和SARS-CoV-2E蛋白的组，最优选来自包含非存在于SEQ ID NO：1 上的那些的SARS-CoV-2N蛋白、SARS-CoV-2M蛋白、SARS-CoV-2 E蛋白和SARS-CoV-2S蛋白表位的组)的抗体的存在区分开。在一个更优选的实施方案中，当用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在或不存在时，将包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽与这样的其他 SARS-CoV-2抗原或其他冠状病毒抗原在空间上分开。例如，包含SEQ ID NO：1或变体的多肽可以是纯的和/或在承载体上分离。例如，它可以在印迹或微量滴定孔或珠子上，与其他抗原在空间上分离。
在一个优选的实施方案中，本发明的产品、方法和用途被配置为使得可以检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在或不存在，而无需确定检测到的抗体是否属于某种免疫球蛋白类别。这通常被称为检测针对一种或多种抗原(例如SEQ ID NO：1)的“总抗体”。检测总抗体 (包括IgA和IgG)提高测定的灵敏度，因为存在于早期阶段的IgA 类抗体和在晚期阶段的针对SEQ ID NO：1的IgA和IgG类抗体被检测作为针对SEQ ID NO：1的总抗体的一部分。优选地，可以将针对 SEQ ID NO：1的抗体与针对另一种SARS-CoV-2抗原(例如N蛋白 (SEQ IDNO：30)或S2结构域(SEQ ID NO：32))的抗体区分开，更优选因为其他SARS-CoV-2抗原是不存在的或在空间上分离的，或者针对这样的另一种SARS-CoV-2的抗体产生可与针对SEQ IDNO：1的抗体产生的信号区分开的信号。
在一个优选的实施方案中，本发明的产品、方法和用途被配置为使得可以检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在或不存在，而无需确定检测到的抗体是否结合SEQ ID NO：1或另一种SARS-CoV-2抗原，例如N蛋白或S2蛋白。这可以通过使用包含SEQ ID NO：1或其变体的抗原与N蛋白(SEQ ID NO：30)或其变体或S2结构域(SEQ ID NO：32)或其变体组合的混合物来实现。在一个更优选的实施方案中，可以使用包含S1和S2结构域的整个刺突蛋白(SEQID NO：32)，任选地与N蛋白(SEQ ID NO：30)组合使用。同样，这样的测定的灵敏度增加，因为针对SEQ ID NO：1的抗体(包括IgA和IgG)增加了测定的灵敏度，因为存在于早期阶段的IgA类抗体和存在于晚期阶段的针对SEQ ID NO：1的IgA和IgG类抗体被检测作为针对SEQID NO：1的总抗体的一部分。
在一个优选的实施方案中，本发明的产品、方法和用途被配置为使得可以检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在或不存在，而无需确定检测到的抗体是否属于某种免疫球蛋白类别。此过程通常被称为检测针对一种或多种抗原(例如SEQ ID NO：1)的“总抗体”。检测总抗体(包括IgA和IgG)提高测定的灵敏度，因为存在于早期阶段的 IgA类抗体被检测作为针对SEQ ID NO：1的总抗体的一部分。
在一个优选的实施方案中，可以使用包含SEQ ID NO：1或其变体的分离的、纯的和/或重组的多肽来检测针对SEQ ID NO：1的抗体的不存在。
在一个优选的实施方案中，另外确定针对由SEQ ID NO：30定义的SARS-CoV-2N蛋白的抗体(优选IgA、IgG和/或IgM抗体，更优选IgG或IgM，最优选IgG)的存在或不存在。为此目的，根据本发明的承载体可以用包含由SEQ ID NO：30定义的SARS-CoV-2N 蛋白或其变体的多肽包被。
在一个优选的实施方案中，检测针对由SEQ ID NO：31定义的 SARS-CoV-2S1结构域的受体结合结构域(RBD)的抗体的存在或不存在。为此目的，根据本发明的承载体可以用包含SEQ ID NO：31 或其变体的多肽包被。
在一个优选的实施方案中，检测针对SARS-CoV-2刺突蛋白的由 SEQ ID NO：32定义的SARS-CoV-2S2结构域的抗体的存在或不存在。为此目的，根据本发明的承载体可以包括包含SEQ ID NO：32 或其变体的多肽。
在一个优选的实施方案中，第二抗体是与来自抗体或免疫球蛋白类别(优选人抗体类别，优选IgA和/或IgG和/或IgM抗体，优选IgA) 的所有抗体结合的抗体。第二抗体通常识别所述类别的恒定结构域或为多价的，具有针对跨所述Ig类别的抗体共有的序列或3D结构上的各个表位的结合位点。第二抗体通常来自人以外的哺乳动物或来自鸟类，优选来自鸡、兔子、小鼠、大鼠、马、猪、驴、山羊、牛、骆驼，美洲驼或非人灵长类动物。它们中许多可商购获得。
根据本发明，SARS-CoV-2感染可以在早期阶段，优选在疾病症状发作后5天或更短的时间内以增加的灵敏度被检测到。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法还包括评估结果以用于诊断。进行根据本发明的评估以决定是否需要针对测试的个体的治疗。诊断结果的评估可以包括让医生参与，以便在诊断为阳性时选择合适的治疗方法。重要的是，本发明的排除评估的方法可以在一个地点例如一个国家进行，并且诊断结果的评估可以在不同的地点进行。
在不同的优选的实施方案中，本发明的方法还包括将诊断或评估的结果传送到不同的地点。该优选的实施方案涉及这样的情况，其中本发明的方法(任选地包括评估步骤)在一个地点例如一个国家中进行，并且诊断和评估的结果分别被转移到不同的地点例如不同的国家。转移可以通过技术人员可用的任何方式进行。这包括数据的电子传输以及阅读资料的实际传输。根据该优选的实施方案，特别是在阳性结果的情况下，治疗患者的医师或诊所可以采取适当的步骤来成功治疗。
诊断上有用的承载体优选选自包含以下的组：载玻片，优选用于显微镜检查，生物芯片，微阵列，微量滴定板，侧向流动装置，测试条，膜，例如硝酸纤维素膜，优选线印迹，色谱柱和珠子，优选微量滴定板。
在一个优选的实施方案中，诊断上有用的承载体是线印迹(Raoult, D.和Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal and otherantibodies.Its application to the serotyping of gram-negativebacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65； WO2013041540)。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“线印迹”是指已经用一种或多种用于特异性捕获抗体的工具(优选地，这些工具各自是多肽)包被的测试条，更优选基于膜的测试条。如果使用两个或更多个工具，则它们优选在承载体上在空间上分开。优选地，带的宽度为测试条的宽度的至少30％，更优选40％、50％、60％、70％或80％。线印迹可包含一个或多个对照带以用于确认其已与样品接触足够长的时间并在适当的条件下(特别是在人血清存在下)接触，或分别与第二抗体接触。线印迹优选由硝酸纤维素膜制成。
在另一个优选的实施方案中，诊断上有用的承载体是珠子。用于多种应用的各种珠子是可商购获得的，主要基于碳水化合物，例如琼脂糖凝胶或琼脂糖，或塑料。它们可以包含活性或可活化的化学基团，例如羧基或甲苯磺酰基或酯基，其可用于固定特异性捕获抗体的工具。优选地，珠子是平均直径为0.1μm至10μm、0.5μm至8μm、0.75μm 至7μm或1μm至6μm的珠子。可以用特异性捕获抗体的工具直接或经由亲和配体(例如分别地生物素或谷胱甘肽和链霉亲和素或 GST)包被珠子。例如，珠子可以用生物素或谷胱甘肽包被，并且抗原可以分别与链霉亲和素或谷胱甘肽-S-转移酶或其变体融合。优选地，以水性悬浮液的形式提供珠子，其中珠子含量为10至90％，优选20至80％，优选30至70％，更优选40至60％(w/w)。本领域技术人员熟悉这样的珠子(Diamindis,E.P.,Chriopoulus,T.K.,Immunoassays,1996,Academic Press)，它们是可商购获得的，例如来自Bio-Rad的Bio-Plex COOH珠子MC10026-01或171-506011。
在特别优选的实施方案中，珠子是顺磁性珠子，其可以借助磁体容易地集中在表面上。为此目的，商业化顺磁性珠子通常包含顺磁性矿物，例如氧化铁。多种合适的顺磁性珠子是可商购获得的。珠子可以用可检测的标记物标记。
在一个优选的实施方案中，通过施加磁场以集中和固定磁珠来在缓冲液中使用和洗涤或孵育顺磁性珠子，随后除去存在的缓冲液并添加新的缓冲液。然后可以中断磁场以使珠子在新缓冲液中的悬浮更有效。缓冲液可以是根据本发明使用的任何缓冲溶液，包括稀释的患者样品、孵育缓冲液或包含第二抗体的缓冲液。
在一个优选的实施方案中，使用化学发光标记物检测抗体。在一个优选的实施方案中，这是化学发光酶，其优选选自包含以下的组：荧光素酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶或其变体，其可以周转化学发光底物而不自身消耗(Kricka,L.J.(2003).Clinical applications of chemiluminescence.Analytica chimica acta,500(1):279-286)。在另一个优选的实施方案中，化学发光标记物是不具有催化化学发光反应的酶活性的小的有机化合物，其在与包含无机和/或非酶有机化合物(其是发射信号所需的)的化学发光底物溶液接触时被降解后发出化学发光信号。优选地，不具有酶活性的小的有机化合物选自包含以下的组：吖啶酯(Weeks,I.,Beheshti,I.,McCapra,F., Campbell,A.K.,Woodhead,J.S.(1983)Acridinium esters as high specific activity labels inimmunoassay.Clin Chem 29:1474-1479)和鲁米诺或其化学发光衍生物，例如异鲁米诺。这样的小的有机化合物可以与第二抗体偶联。在鲁米诺的情况下，底物溶液包含高pH值的H2O2。在吖啶酯的情况下，经常使用H2O2和氢氧化钠的混合物。小的有机化合物在化学发光信号的发射后被消耗。在一个优选的实施方案中，化学发光标记物的化学发光在化学发光检测反应开始后检测1 至60秒，优选检测2至20秒，更优选检测3至15秒。在另一个优选的实施方案中，化学发光标记物的化学发光检测至少0.5、1、1.5、2、 2.5或3秒。在另一个优选的实施方案中，承载体是包含至少8个孔的微量滴定板，其可用于ELISA。用特异性捕获抗体的工具(优选包含 SEQ ID NO：1或其变体的多肽)直接或间接地包被至少一个孔。可以使用限定浓度的至少3个、优选4个、更优选5个校准物来建立用于半定量分析的校准曲线。当进行本发明的方法时，可以平行于样品处理和显影通常覆盖了覆盖校准曲线的浓度范围的校准物。可以提供包含可检测标记例如酶活性标记(例如具有辣根过氧化物酶活性或碱性磷酸酶活性的标记或能够化学发光的酶)的第二抗体。
在另一个优选的实施方案中，承载体是微阵列。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“微阵列”是指用多种在空间上分离的抗原(优选至少20种，优选30、40、50、80或100种)点样的芯片。优选地，每种抗原是包含跨越SEQ ID NO：1的片段更优选跨越RBD (SEQID NO：31)的5至25个，优选7至15个连续氨基酸或由其组成的肽。包含标记优选荧光标记的第二抗体可以用于检测。优选地，点样其他抗原，更优选地来自包括SEQ ID NO：30(SARS-CoV-2N 蛋白)和SEQ ID NO：33(SARS-CoV-2S2蛋白)的多肽的组。
在另一个优选的实施方案中，使用载玻片，其在用于显微免疫荧光分析的承载体上或是其一部分。细胞优选真核细胞例如HEK293细胞在载玻片上。它可以覆盖有封固缓冲剂(mounting buffer)。现有技术中描述了各种组合物和方法，例如在由Wright CellImaging Facility,Toronto Western Research Institute University Health Network出版的“Mountants and Antifades” (https://de.scribd.com/document/47879592/ Mountants-Antifades)、Krenek等人,(1989)Comparison of antifading agents used inimmunofluorescence,J.Immunol.Meth 117,91-97和Nairn等人, (1969)Microphotometryin Immunofluorescence,Clin.Exp.Immunol. 4,697-705中。细胞表达优选过表达包含SEQID NO：1或其变体的多肽。承载体可以包含模拟转染的细胞，该细胞已用与过表达包含 SEQID NO：1或其变体的多肽的细胞相同但没有编码该多肽的核酸的承载体转染。这样的模拟转染的细胞可以用作阴性对照。另一种细胞可包含另外的冠状病毒，优选SARS，更优选SARS-CoV-2抗原，例如N蛋白、S2蛋白或RBD，以检测抗体。
根据本发明，免疫荧光可以用于检测抗体。本领域技术人员熟悉该方法(Storch,W.B.,Immunofluorescence in Clinical Immunology: A Primer and Atlas,
Figure GDA0003130300840000371
2000；Wesseling JG,Godeke GJ, Schijns VE,Prevec L,Graham FL,Horzinek MC,Rottier PJ.Mouse hepatitis virus spike and nucleocapsid proteinsexpressed by adenovirus vectors protect mice against a lethal infection.J GenVirol. 1993Oct；74(Pt 10):2061-9.doi:10.1099/0022-1317-74-10-2061.PMID:8409930)。简而言之，将抗原优选包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽固定在承载体(其可以是表达所述抗体的细胞)上并与样品接触，然后通过荧光检测待检测的抗体，优选使用用于检测用荧光标记物标记的抗体的工具。在一个优选的实施方案中，细胞是过表达多肽的真核细胞，例如选自包含以下的组的细胞：HEK，Hela，CHO和Jurkat 细胞及其衍生物。在一个优选的实施方案中，细胞是过表达多肽(其优选在异源强启动子的控制下)的重组细胞。
根据本发明，可以使用侧向流动装置来检测抗体。本领域技术人员熟悉用于此目的的侧向流动装置(Lateral Flow Immunoassay, Raphael Wong,Harley Tse编辑,2009,Springer；Paper-based diagnostics:Current Status and Future applications,KevinJ.Land, Springer 2019)。简而言之，侧向流动测定可以基于膜，例如硝化纤维素膜，其包含含有SEQ ID NO：1或其变体的多肽(包含可检测标记)。如果膜与样品接触，则要检测的抗体将与抗原结合。所得的复合物将在膜上在毛细作用力的驱动下移动，并将固定在膜上的测试线上，该测试线包括用于检测抗体的工具，该工具通常是与待检测的抗体的免疫球蛋白类别(例如IgG和/或IgA和/或IgM)结合的第二抗体。优选使用纳米颗粒或珠子作为标记，例如金纳米颗粒或乳胶珠子。
根据本发明，多肽优选包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽可以是重组蛋白，其中如本文所用，术语“重组”是指使用基因工程方法(例如通过将编码多肽的核酸融合至强启动子用于在细胞或组织中过表达，或通过工程改造多肽本身的序列)在生产过程的任何阶段产生的多肽。本领域技术人员熟悉用于工程改造核酸和编码的多肽的方法(例如，在GreenM.R.和Sambrook,J.(2012),Molecular Cloning–A Laboratory Manual,Fourth Edition,CSH或在Brown T.A.(1986), Gene Cloning–an introduction,Chapman&Hall中描述的)，和用于生产和纯化天然或重组多肽的方法(例如，Handbooks“Strategies for ProteinPurification”,“Antibody Purification”,由GE Healthcare Life Sciences出版,以及Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009): Guide to Protein Purification)。在另一个优选的实施方案中，多肽是分离的多肽，其中术语“分离的”是指该多肽与其在使用生物技术或合成方法生产时的状态相比已经过富集，并且优选是纯的，即相应液体中的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳然后考马斯亮蓝染色和目视检查所判断的。优选地，用作捕获抗体的工具的在承载体上的任何多肽是纯的。
在一个优选的实施方案中，可检测标记用于检测根据本发明的抗体，该标记是可以用于使用生物物理检测方法将分子群体与其他分子区分开的标记。它优选选自包含以下的组：荧光、放射性、化学发光标记，重金属例如金标记物，纳米颗粒，珠子或酶活性标记，优选催化比色反应的酶活性标记。在一个优选的实施方案中，荧光标记选自包含以下的组：Alexa染料、FITC、TRITC和绿色荧光蛋白(GFP)。碘-125可用作放射性标记。在一个优选的实施方案中，酶活性标记选自包含以下的组：辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和荧光素酶。本领域技术人员能够选择合适的标记并将其附接至蛋白质、核酸和其他分子(Hassanzadeh L,Chen S,Veedu RN. Radiolabeling of Nucleic AcidAptamers for Highly Sensitive Disease-Specific MolecularImaging.Pharmaceuticals(Basel). 2018；11(4):106。发布于2018年10月15日。doi:10.3390/ph11040106 Hassanzadeh L,Chen S,Veedu RN.Radiolabeling of NucleicAcid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging.Pharmaceuticals(Basel).2018；11(4):106。发布于2018年10月15日。 doi:10.3390/ph11040106,Bioconjugate Techniques,第3版(2013)， Greg T.Hermanson,Obermaier C,Griebel A,Westermeier R. Principles of protein labeling techniques.MethodsMol Biol. 2015；1295:153-65)，并且各种各样的标记的分子可商购获得。
根据本发明，提供了用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在的工具。在一个优选的实施方案中，包含可检测标记的第二抗体可以用于检测针对SEQ ID NO：1(更优选SEQ IDNO：1和另一种冠状病毒抗原)的IgA和/或IgG和/或IgM，优选IgA类抗体。具有过氧化物酶活性的蛋白质可以用作酶活性标记。优选地，第二抗体识别哺乳动物更优选人抗体。如果要检测来自一种Ig类别的抗体，则可以使用两种第二抗体，优选一种与IgA类抗体结合，另一种与IgG类抗体结合。两种第二抗体可以混合使用或可以分开使用，优选分开使用以允许单独检测来自不同Ig类别的抗体(例如IgA、IgM和IgG抗体，优选IgG和IgA)例如以获得有关疾病进程的信息(基于许多患者中 IgA类抗体比IgG类抗体更早出现的事实)。可替代地，可以使用与来自多于一种Ig类别的抗体(例如来自包含IgG、IgA和IgM的组) 结合的一种第二抗体，优选与IgG和IgA类抗体结合的第二抗体。第二抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，第二抗体来自人以外的哺乳动物，但与某种Ig类别优选IgA、IgG和/或IgM的人抗体结合。本领域技术人员熟悉第二抗体的产生和使用 (Kalyuzhny,A.,Immunohistochemistry,Essential Elements and Beyound,Springer,2017,特别是第4章；Howard,G.C.和Bethell,D. R.,Basic Methods in Antibody Production andCharacterization,2000, CRC press)。多种第二抗体(任选地带有标记，例如荧光标记)是可商购获得的，例如FITC标记的第二抗体Cat#H15101、Cat# 62-8411、Cat#A24459，辣根过氧化物酶标记的第二抗体Cat#31420、 Cat#SA1-35467、Cat#SA1-35467、Cat#SA1-35467和来自Thermo Fisher的其他产品。也可以使用第二抗体或适配体的标记的片段。本领域技术人员熟悉适配体的合成、选择和使用，其还可以用作用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在的工具，例如当与待检测的抗体(优选IgG和/或IgA和/或IgM抗体)特异性结合时(Thiviyanathan V,Gorenstein DG.Aptamers and the next generation of diagnosticreagents.Proteomics Clin Appl.2012；6(11-12):563-573. doi:10.1002/prca.201200042)，以及熟悉特异性抗体的生成(Hust M, Frenzel A,Schirrmann T,DübelS.Selection of recombinant antibodies from antibody gene libraries.MethodsMol Biol.2014； 1101:305-20；Hanack K,Messerschmidt K,Listek M.Antibodies andSelection of Monoclonal Antibodies.Adv Exp Med Biol. 2016；917:11-22；HaroldF.Stills,in The Laboratory Rabbit,Guinea Pig,Hamster和Other Rodents,2012)。这样的适配体可以特异性结合恒定区或待检测抗体的其他部分中的表位。
在另一个优选的实施方案中，包含SEQ ID NO：1或其变体(优选受体结合结构域(SEQ ID NO：31))的多肽可以用作用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在的工具。更具体地说，所述多肽可以包被在诊断上有用的承载体上并且可以用于捕获任何待检测的抗体。由于人抗体具有多于一个结合位点，因此仅可占据捕获的抗体的一个抗原结合位点。随后添加未被包被在承载体上的包含SEQ ID NO：1 或其变体的另一种多肽可导致该新添加的多肽占据另一结合位点。然后可以检测包含包被的多肽、要检测的抗体和该另一种多肽的复合物。更优选地，该另一种多肽带有可检测标记，并将其用于检测复合物。在该实施方案中，可以检测所有抗体，更特别地IgA、IgM和IgG类抗体。
在另一个优选的实施方案中，与SEQ ID NO：1中的受体结合结构域结合的包含SEQID NO：39(ACE2)或其变体的多肽(任选地与结合ACE2受体的包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽组合)可以用作用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在的工具。然后使用竞争性测定形式检测其存在。
在另一个优选的实施方案中，与不同的免疫球蛋白类别结合的特异性蛋白质可以用可检测的标记物标记，并且用作用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在的工具。例如，蛋白质G、A和L是细菌蛋白质，其与IgG类抗体结合(L.Bjorck,G.Kronvall:Purificationand some properties of streptococcal protein G,a novel IgG-binding reagent.In:Journal of Immunology.133(2)/1984)，而木菠萝素(jacalin) (Abcam，ThermoFisher)可用于结合IgA类抗体(参见，例如Choe 等人,Materials(Basel).2016Dec；9(12):994；Wilkinson&Neville Vet Immunol Immunopathol.1988Mar；18(2):195-8)。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的试剂盒包含含有SEQ ID NO：1或其变体的多肽，其优选包被在诊断上有用的承载体(更优选在微量滴定板)上，以及选自包含以下的组的一种或多种、优选所有试剂：校准物，阳性对照，阴性对照，洗涤缓冲液，用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体(优选IgA、IgM和/或IgG类抗体，优选特异性结合抗体更优选IgA、IgM和/或IgG类抗体的第二抗体，其中所述第二抗体可包含可检测标记)的存在的工具，样品缓冲液，检测溶液，优选色原/底物溶液，终止液和保护性箔。
在一个优选的实施方案中，校准物是与包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽结合并且优选被识别IgA、IgM和/或IgG类抗体的第二抗体识别的试剂。校准物可以是针对SEQ IDNO：1的IgA抗体。可替代地，校准物可以是嵌合抗体，优选包含不同免疫球蛋白类别(优选IgA和/或IgG和/或IgM)共有的恒定区或其他区域或表位，以及可变区，特别是衍生自人工抗体的结合位点。本领域技术人员熟悉这样的校准物的设计、生产和使用(LütkecosmannS,Faupel T,Porstmann S,Porstmann T,Micheel B,Hanack K.A cross-reactivemonoclonal antibody as universal detection antibody in autoantibodydiagnostic assays.Clin Chim Acta.2019Dec；499:87-92.doi: 10.1016/j.cca.2019.09.003.Epub 2019Sep 4.PMID:31493374,Hackett J Jr,Hoff-Velk J,Golden A,Brashear J,Robinson J,Rapp M,Klass M,Ostrow DH,MandeckiW.Recombinant mouse-human chimeric antibodies as calibrators in immunoassaysthat measure antibodies to Toxoplasma gondii.J Clin Microbiol.1998May；36(5):1277-84.doi:, WO2009081165A1)。在一个优选的实施方案中，阳性对照是以使用根据本发明的方法获得阳性结果的量包含来自患有SARS-CoV-2的患者的样品的化合物(例如针对SEQ ID NO：1的抗体，优选来自包含 IgA、IgG和IgM类抗体的组，更优选IgA)的溶液。阴性对照是缺少这样的化合物并且可能包含来自健康人的血清的试剂。洗涤缓冲液可以在孵育后用于洗涤承载体例如微量滴定板以去除非特异性抗体，并且可以是PBS。用于检测抗体的存在的工具可以是与要检测的抗体类别(优选人IgA、IgM和/或IgG类抗体)结合的第二抗体，并且用可检测标记物标记，优选用酶标记，更优选用具有过氧化物酶活性的酶标记。样品缓冲液可用于稀释患者样品，并且可以是PBS。检测溶液可以在标记的第二抗体的存在下产生信号，并且优选是显色溶液，以及更优选是3,3’,5,5’四甲基联苯胺/H2O2。可以将终止溶液添加到反应中以终止检测溶液的反应，并且终止溶液可以包含强酸，优选0.5M 硫酸。可以将保护箔放置在诸如微量滴定板的承载体的顶部，以避免蒸发。
根据本发明使用的任何试剂可以包含防腐剂，例如叠氮化物。
根据本发明，提供了包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽或针对SEQ ID NO：1的抗体优选IgA类抗体在制备诊断试剂盒中的用途。在一个优选的实施方案中，多肽或抗体被包装为这样的试剂盒的组分之一。多肽或抗体可用于在试剂盒生产时确认质量。例如，抗体可以用作阳性对照，以证实包含SEQ ID NO：1的多肽的反应性，该多肽是试剂盒的组分，其是单独的或包被在诊断上有用的承载体上。该多肽可用于确认作为试剂盒一部分的特异性结合SEQ ID NO：1的抗体的反应性。该多肽可用于包被诊断上有用的承载体作为制造的一部分。多肽和抗体两者可用于分别测定在用于制备承载体和试剂盒的缓冲溶液中抗体或多肽的浓度，或用于检查细胞是否表达包含SEQ ID NO： 1的多肽。
根据本发明，针对SEQ ID NO：1的抗体、优选IgA类抗体用于诊断SARS-CoV-2感染或用于根据本发明的鉴别诊断。该用途可以涉及检测抗体本身或与针对SEQ ID NO：1的其他抗体或针对其他 SARS-CoV-2抗原的抗体组合，从而提高诊断测定的总体灵敏度。在一个更优选的实施方案中，IgA类抗体用于增加诊断测定的灵敏度，特别是在感染的早期阶段。这可以通过检测不仅仅IgG而且还检测 IgA类抗体(任选以及针对SEQ ID NO：1的IgM类抗体或仅IgA) 来实现。在一个更优选的实施方案中，IgG类抗体用于增加诊断测定的灵敏度，特别是在看到针对其他抗原的抗体(例如针对SARS-CoV-2 的N蛋白的IgG类抗体)的浓度下降的时间段内，例如在SARS-CoV-2 感染的晚期阶段。这可以通过检测不仅仅IgG而且还检测IgA类抗体 (任选以及针对SEQ ID NO：1的IgM类抗体或仅IgG)来实现。在另一个优选的实施方案中，抗体可以用于通过使用包含所述抗体(优选IgA、IgM和/或IgG类抗体，优选为所有抗体)的校准物的校准装置或测定来用于诊断。在一个优选的实施方案中，针对SEQ IDNO： 1的IgA和/或IgG抗体用于增加在免疫的后期阶段的灵敏度。该抗体可以用于测定的验证，用于校准，用于确认试剂或测定材料例如诊断上有用的承载体的质量或作为阳性对照。
根据本发明，包含SEQ ID NO：1或其变体或针对SEQ ID NO： 1的抗体优选IgA类抗体用于制备诊断试剂盒，优选用于诊断 SARS-CoV-2，其中检测特异性结合SEQ ID NO：1的IgA类抗体。
针对SEQ ID NO：1的抗体，优选IgA、IgM和/或IgG，更优选 IgA类抗体，用于提高SARS-CoV-2感染的检测灵敏度(优选在感染的早期阶段，更优选在疾病症状发作后5天或更少天数)的用途。在另一个优选的实施方案中，该用途可以是在感染的后期阶段。在一个优选的实施方案中，检测针对SEQ ID NO：1的IgA、IgM和IgG的存在或不存在。
本发明包括一系列新的核酸和多肽序列，特别是包括在以下和/ 或构成本说明书一部分的序列表中描述的序列。将理解的是，在本文下面显示的任何序列与序列表中描述的相应序列之间发生冲突的情况下，本发明具体地和独立地涉及各个序列中的每一个，即，涉及本文下面描述的序列以及序列表中描述的序列。
SEQ ID NO：1(来自S蛋白的SARS-CoV-2S1结构域)
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFS NVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGW IFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKN NKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLRE FVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITR FQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYN ENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTES IVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYN SASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQT GKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRK SNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGV GYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGL TGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS FGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWR VYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTN SPRRAR
SEQ ID NO：2(来自S蛋白的SARS-CoV-2S1结构域，C-末端 his标记的,如例如在细胞中表达的)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFR SSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFND GVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEF QFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFL MDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGF SALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY YVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWN RKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADS FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDS KVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFN CYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKS TNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTT DAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCT EVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARLEHHHHHHHH
SEQ ID NO：3(来自S蛋白的SARS-CoV-2S1结构域，C-末端 his标记的,如在切割信号肽后，在实施例中使用的)
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFS NVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGW IFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKN NKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLRE FVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITR FQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYN ENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTES IVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYN SASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQT GKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRK SNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGV GYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGL TGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS FGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWR VYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTN SPRRARLEHHHHHHHH
SEQ ID NO：4(来自S蛋白的SARS-CoV-2S1结构域，编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列)–仅在序列表中
SEQ ID NO：5(可能的SARS-CoV-2S1表位)–仅在序列表中
SEQ ID NO：6(S1[MERS_CoV])–仅在序列表中
SEQ ID NO：7(S1[HCoV-229E])–仅在序列表中
SEQ ID NO：8(S1[HCoV-OC43])–仅在序列表中
SEQ ID NO：9(S1[HCoV-HKU1])–仅在序列表中
SEQ ID NO：10(S1[HCoV-NL63])–仅在序列表中
SEQ ID NO：11(S1[SARS_CoV])–仅在序列表中
SEQ ID NO：12(SEQ ID NO：1的片段)–仅在序列表中
SEQ ID NO：13(SARS-CoV-2分离株Wuhan-Hu-1基因组的基因组，与GenbankMN908947相同)：[仅在序列表中]
ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTT TCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCT GTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAG TATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTA ACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGT TGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGA CCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGA GAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTACAGGTTCG CGACGTGCTCGTACGTGGCTTTGGAGACTCCGTGGAGGAGG TCTTATCAGAGGCACGTCAACATCTTAAAGATGGCACTTGTG GCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGAAC AGCCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCAC CTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAG GCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTC TTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGGCCATAGTT ACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTG GCACTGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTA AACATAGCAGTGGTGTTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTA ACGGAGGGGCATACACTCGCTATGTCGATAACAACTTCTGTG GCCCTGATGGCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAG CACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCCGAACAACTGG ACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAAC 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CATAATCAGGATGTAAACTTACATAGCTCTAGACTTAGTTTT AAGGAATTACTTGTGTATGCTGCTGACCCTGCTATGCACGCT GCTTCTGGTAATCTATTACTAGATAAACGCACTACGTGCTTTTCAGTAGCTGCACTTACTAACAATGTTGCTTTTCAAACTGTC AAACCCGGTAATTTTAACAAAGACTTCTATGACTTTGCTGTG TCTAAGGGTTTCTTTAAGGAAGGAAGTTCTGTTGAATTAAAA CACTTCTTCTTTGCTCAGGATGGTAATGCTGCTATCAGCGAT TATGACTACTATCGTTATAATCTACCAACAATGTGTGATATCA GACAACTACTATTTGTAGTTGAAGTTGTTGATAAGTACTTTG ATTGTTACGATGGTGGCTGTATTAATGCTAACCAAGTCATCG TCAACAACCTAGACAAATCAGCTGGTTTTCCATTTAATAAAT GGGGTAAGGCTAGACTTTATTATGATTCAATGAGTTATGAGG ATCAAGATGCACTTTTCGCATATACAAAACGTAATGTCATCC CTACTATAACTCAAATGAATCTTAAGTATGCCATTAGTGCAA AGAATAGAGCTCGCACCGTAGCTGGTGTCTCTATCTGTAGTA CTATGACCAATAGACAGTTTCATCAAAAATTATTGAAATCAA TAGCCGCCACTAGAGGAGCTACTGTAGTAATTGGAACAAGCA AATTCTATGGTGGTTGGCACAACATGTTAAAAACTGTTTATA GTGATGTAGAAAACCCTCACCTTATGGGTTGGGATTATCCTA AATGTGATAGAGCCATGCCTAACATGCTTAGAATTATGGCCT CACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGT CACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTAT TGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAAC 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TGAGCTATTATTGTAAATCACATAAACCACCCATTAGTTTTCC ATTGTGTGCTAATGGACAAGTTTTTGGTTTATATAAAAATAC ATGTGTTGGTAGCGATAATGTTACTGACTTTAATGCAATTGC AACATGTGACTGGACAAATGCTGGTGATTACATTTTAGCTAA CACCTGTACTGAAAGACTCAAGCTTTTTGCAGCAGAAACGCT CAAAGCTACTGAGGAGACATTTAAACTGTCTTATGGTATTGC TACTGTACGTGAAGTGCTGTCTGACAGAGAATTACATCTTTC ATGGGAAGTTGGTAAACCTAGACCACCACTTAACCGAAATTA TGTCTTTACTGGTTATCGTGTAACTAAAAACAGTAAAGTACA AATAGGAGAGTACACCTTTGAAAAAGGTGACTATGGTGATGCTGTTGTTTACCGAGGTACAACAACTTACAAATTAAATGTTGG TGATTATTTTGTGCTGACATCACATACAGTAATGCCATTAAG TGCACCTACACTAGTGCCACAAGAGCACTATGTTAGAATTAC TGGCTTATACCCAACACTCAATATCTCAGATGAGTTTTCTAG CAATGTTGCAAATTATCAAAAGGTTGGTATGCAAAAGTATTC TACACTCCAGGGACCACCTGGTACTGGTAAGAGTCATTTTGC TATTGGCCTAGCTCTCTACTACCCTTCTGCTCGCATAGTGTA TACAGCTTGCTCTCATGCCGCTGTTGATGCACTATGTGAGAA GGCATTAAAATATTTGCCTATAGATAAATGTAGTAGAATTAT ACCTGCACGTGCTCGTGTAGAGTGTTTTGATAAATTCAAAGT GAATTCAACATTAGAACAGTATGTCTTTTGTACTGTAAATGC ATTGCCTGAGACGACAGCAGATATAGTTGTCTTTGATGAAAT TTCAATGGCCACAAATTATGATTTGAGTGTTGTCAATGCCAG ATTACGTGCTAAGCACTATGTGTACATTGGCGACCCTGCTCA ATTACCTGCACCACGCACATTGCTAACTAAGGGCACACTAGA ACCAGAATATTTCAATTCAGTGTGTAGACTTATGAAAACTAT AGGTCCAGACATGTTCCTCGGAACTTGTCGGCGTTGTCCTGC TGAAATTGTTGACACTGTGAGTGCTTTGGTTTATGATAATAA GCTTAAAGCACATAAAGACAAATCAGCTCAATGCTTTAAAAT GTTTTATAAGGGTGTTATCACGCATGATGTTTCATCTGCAAT TAACAGGCCACAAATAGGCGTGGTAAGAGAATTCCTTACACG TAACCCTGCTTGGAGAAAAGCTGTCTTTATTTCACCTTATAAT TCACAGAATGCTGTAGCCTCAAAGATTTTGGGACTACCAACTCAAACTGTTGATTCATCACAGGGCTCAGAATATGACTATGTC ATATTCACTCAAACCACTGAAACAGCTCACTCTTGTAATGTA AACAGATTTAATGTTGCTATTACCAGAGCAAAAGTAGGCATA CTTTGCATAATGTCTGATAGAGACCTTTATGACAAGTTGCAA TTTACAAGTCTTGAAATTCCACGTAGGAATGTGGCAACTTTA CAAGCTGAAAATGTAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAG GTAATCACTGGGTTACATCCTACACAGGCACCTACACACCTC AGTGTTGACACTAAATTCAAAACTGAAGGTTTATGTGTTGAC ATACCTGGCATACCTAAGGACATGACCTATAGAAGACTCATC TCTATGATGGGTTTTAAAATGAATTATCAAGTTAATGGTTAC CCTAACATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATAAGACATGTA CGTGCATGGATTGGCTTCGATGTCGAGGGGTGTCATGCTACT AGAGAAGCTGTTGGTACCAATTTACCTTTACAGCTAGGTTTT TCTACAGGTGTTAACCTAGTTGCTGTACCTACAGGTTATGTT GATACACCTAATAATACAGATTTTTCCAGAGTTAGTGCTAAA CCACCGCCTGGAGATCAATTTAAACACCTCATACCACTTATG TACAAAGGACTTCCTTGGAATGTAGTGCGTATAAAGATTGTA CAAATGTTAAGTGACACACTTAAAAATCTCTCTGACAGAGTC GTATTTGTCTTATGGGCACATGGCTTTGAGTTGACATCTATG AAGTATTTTGTGAAAATAGGACCTGAGCGCACCTGTTGTCTA TGTGATAGACGTGCCACATGCTTTTCCACTGCTTCAGACACT TATGCCTGTTGGCATCATTCTATTGGATTTGATTACGTCTATA ATCCGTTTATGATTGATGTTCAACAATGGGGTTTTACAGGTAACCTACAAAGCAACCATGATCTGTATTGTCAAGTCCATGGTA ATGCACATGTAGCTAGTTGTGATGCAATCATGACTAGGTGTC TAGCTGTCCACGAGTGCTTTGTTAAGCGTGTTGACTGGACTA TTGAATATCCTATAATTGGTGATGAACTGAAGATTAATGCGG CTTGTAGAAAGGTTCAACACATGGTTGTTAAAGCTGCATTAT TAGCAGACAAATTCCCAGTTCTTCACGACATTGGTAACCCTA AAGCTATTAAGTGTGTACCTCAAGCTGATGTAGAATGGAAGT TCTATGATGCACAGCCTTGTAGTGACAAAGCTTATAAAATAG AAGAATTATTCTATTCTTATGCCACACATTCTGACAAATTCAC AGATGGTGTATGCCTATTTTGGAATTGCAATGTCGATAGATA TCCTGCTAATTCCATTGTTTGTAGATTTGACACTAGAGTGCT ATCTAACCTTAACTTGCCTGGTTGTGATGGTGGCAGTTTGTA TGTAAATAAACATGCATTCCACACACCAGCTTTTGATAAAAG TGCTTTTGTTAATTTAAAACAATTACCATTTTTCTATTACTCT GACAGTCCATGTGAGTCTCATGGAAAACAAGTAGTGTCAGAT ATAGATTATGTACCACTAAAGTCTGCTACGTGTATAACACGT TGCAATTTAGGTGGTGCTGTCTGTAGACATCATGCTAATGAG TACAGATTGTATCTCGATGCTTATAACATGATGATCTCAGCT GGCTTTAGCTTGTGGGTTTACAAACAATTTGATACTTATAAC CTCTGGAACACTTTTACAAGACTTCAGAGTTTAGAAAATGTG GCTTTTAATGTTGTAAATAAGGGACACTTTGATGGACAACAG GGTGAAGTACCAGTTTCTATCATTAATAACACTGTTTACACA AAAGTTGATGGTGTTGATGTAGAATTGTTTGAAAATAAAACA ACATTACCTGTTAATGTAGCATTTGAGCTTTGGGCTAAGCGC AACATTAAACCAGTACCAGAGGTGAAAATACTCAATAATTTG GGTGTGGACATTGCTGCTAATACTGTGATCTGGGACTACAAA AGAGATGCTCCAGCACATATATCTACTATTGGTGTTTGTTCT ATGACTGACATAGCCAAGAAACCAACTGAAACGATTTGTGCA CCACTCACTGTCTTTTTTGATGGTAGAGTTGATGGTCAAGTA GACTTATTTAGAAATGCCCGTAATGGTGTTCTTATTACAGAAGGTAGTGTTAAAGGTTTACAACCATCTGTAGGTCCCAAACAA GCTAGTCTTAATGGAGTCACATTAATTGGAGAAGCCGTAAAA ACACAGTTCAATTATTATAAGAAAGTTGATGGTGTTGTCCAA CAATTACCTGAAACTTACTTTACTCAGAGTAGAAATTTACAA GAATTTAAACCCAGGAGTCAAATGGAAATTGATTTCTTAGAA TTAGCTATGGATGAATTCATTGAACGGTATAAATTAGAAGGC TATGCCTTCGAACATATCGTTTATGGAGATTTTAGTCATAGT CAGTTAGGTGGTTTACATCTACTGATTGGACTAGCTAAACGT TTTAAGGAATCACCTTTTGAATTAGAAGATTTTATTCCTATGG ACAGTACAGTTAAAAACTATTTCATAACAGATGCGCAAACAG GTTCATCTAAGTGTGTGTGTTCTGTTATTGATTTATTACTTGA TGATTTTGTTGAAATAATAAAATCCCAAGATTTATCTGTAGTT TCTAAGGTTGTCAAAGTGACTATTGACTATACAGAAATTTCA TTTATGCTTTGGTGTAAAGATGGCCATGTAGAAACATTTTAC CCAAAATTACAATCTAGTCAAGCGTGGCAACCGGGTGTTGCT ATGCCTAATCTTTACAAAATGCAAAGAATGCTATTAGAAAAG TGTGACCTTCAAAATTATGGTGATAGTGCAACATTACCTAAA GGCATAATGATGAATGTCGCAAAATATACTCAACTGTGTCAA TATTTAAACACATTAACATTAGCTGTACCCTATAATATGAGA GTTATACATTTTGGTGCTGGTTCTGATAAAGGAGTTGCACCA GGTACAGCTGTTTTAAGACAGTGGTTGCCTACGGGTACGCTG CTTGTCGATTCAGATCTTAATGACTTTGTCTCTGATGCAGATT CAACTTTGATTGGTGATTGTGCAACTGTACATACAGCTAATA AATGGGATCTCATTATTAGTGATATGTACGACCCTAAGACTA AAAATGTTACAAAAGAAAATGACTCTAAAGAGGGTTTTTTCA CTTACATTTGTGGGTTTATACAACAAAAGCTAGCTCTTGGAG GTTCCGTGGCTATAAAGATAACAGAACATTCTTGGAATGCTG ATCTTTATAAGCTCATGGGACACTTCGCATGGTGGACAGCCT TTGTTACTAATGTGAATGCGTCATCATCTGAAGCATTTTTAAT TGGATGTAATTATCTTGGCAAACCACGCGAACAAATAGATGG TTATGTCATGCATGCAAATTACATATTTTGGAGGAATACAAA TCCAATTCAGTTGTCTTCCTATTCTTTATTTGACATGAGTAAA TTTCCCCTTAAATTAAGGGGTACTGCTGTTATGTCTTTAAAA GAAGGTCAAATCAATGATATGATTTTATCTCTTCTTAGTAAA GGTAGACTTATAATTAGAGAAAACAACAGAGTTGTTATTTCT AGTGATGTTCTTGTTAACAACTAAACGAACAATGTTTGTTTTT CTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTA CAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCA CACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAG TTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAA TGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGG TACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGG TGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGG CTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGT GAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACC ACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTT ATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGC CTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAA ATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAA AATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCC AATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTA CATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGG ACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCT AGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACA GATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAG TGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAA ACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGA TTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTA ACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGA GAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTC CGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACT AAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCAT TTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGC AAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATG ATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTG ATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTT TAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAAC TGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGA AGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAA CCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTA CTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGA CCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAAT TTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAG TCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGAC ATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTT GAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGT GTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTT CTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATT CATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACA GGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGG GCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATT GGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCT CCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCC TACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCT AATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTA CCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAG ATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCA ATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCG TGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCA AGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACC AATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCA GATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTA CTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTC ATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCT TTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTG TTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGT GCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGG TTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAAC CAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAA ATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAA CTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACG CTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGT GTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCT GAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGT TTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAA ATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAG TGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAG GGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGT GTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAG AACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCA CACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACAC TGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATT ACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTA ATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCT GAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGC ATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGC CTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGAT CTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCA TGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATA GTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGT AGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAA TTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAA TTACATTACACATAAACGAACTTATGGATTTGTTTATGAGAAT CTTCACAATTGGAACTGTAACTTTGAAGCAAGGTGAAATCAA GGATGCTACTCCTTCAGATTTTGTTCGCGCTACTGCAACGAT ACCGATACAAGCCTCACTCCCTTTCGGATGGCTTATTGTTGG CGTTGCACTTCTTGCTGTTTTTCAGAGCGCTTCCAAAATCAT AACCCTCAAAAAGAGATGGCAACTAGCACTCTCCAAGGGTGT TCACTTTGTTTGCAACTTGCTGTTGTTGTTTGTAACAGTTTAC TCACACCTTTTGCTCGTTGCTGCTGGCCTTGAAGCCCCTTTT CTCTATCTTTATGCTTTAGTCTACTTCTTGCAGAGTATAAACT TTGTAAGAATAATAATGAGGCTTTGGCTTTGCTGGAAATGCC GTTCCAAAAACCCATTACTTTATGATGCCAACTATTTTCTTTG CTGGCATACTAATTGTTACGACTATTGTATACCTTACAATAGT GTAACTTCTTCAATTGTCATTACTTCAGGTGATGGCACAACA AGTCCTATTTCTGAACATGACTACCAGATTGGTGGTTATACT GAAAAATGGGAATCTGGAGTAAAAGACTGTGTTGTATTACAC AGTTACTTCACTTCAGACTATTACCAGCTGTACTCAACTCAAT TGAGTACAGACACTGGTGTTGAACATGTTACCTTCTTCATCT ACAATAAAATTGTTGATGAGCCTGAAGAACATGTCCAAATTC ACACAATCGACGGTTCATCCGGAGTTGTTAATCCAGTAATGG AACCAATTTATGATGAACCGACGACGACTACTAGCGTGCCTT TGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTCG TTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTC TTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCAT CCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGT TAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGT GTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCT AAACGAACTAAATATTATATTAGTTTTTCTGTTTGGAACTTTA ATTTTAGCCATGGCAGATTCCAACGGTACTATTACCGTTGAA GAGCTTAAAAAGCTCCTTGAACAATGGAACCTAGTAATAGGT TTCCTATTCCTTACATGGATTTGTCTTCTACAATTTGCCTATG CCAACAGGAATAGGTTTTTGTATATAATTAAGTTAATTTTCCT CTGGCTGTTATGGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGC TGCTGTTTACAGAATAAATTGGATCACCGGTGGAATTGCTAT CGCAATGGCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTT CATTGCTTCTTTCAGACTGTTTGCGCGTACGCGTTCCATGTG GTCATTCAATCCAGAAACTAACATTCTTCTCAACGTGCCACT CCATGGCACTATTCTGACCAGACCGCTTCTAGAAAGTGAACT CGTAATCGGAGCTGTGATCCTTCGTGGACATCTTCGTATTGC TGGACACCATCTAGGACGCTGTGACATCAAGGACCTGCCTAA AGAAATCACTGTTGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAA ATTGGGAGCTTCGCAGCGTGTAGCAGGTGACTCAGGTTTTGC TGCATACAGTCGCTACAGGATTGGCAACTATAAATTAAACAC AGACCATTCCAGTAGCAGTGACAATATTGCTTTGCTTGTACAGTAAGTGACAACAGATGTTTCATCTCGTTGACTTTCAGGTTA CTATAGCAGAGATATTACTAATTATTATGAGGACTTTTAAAG TTTCCATTTGGAATCTTGATTACATCATAAACCTCATAATTAA AAATTTATCTAAGTCACTAACTGAGAATAAATATTCTCAATTA GATGAAGAGCAACCAATGGAGATTGATTAAACGAACATGAAA ATTATTCTTTTCTTGGCACTGATAACACTCGCTACTTGTGAGC TTTATCACTACCAAGAGTGTGTTAGAGGTACAACAGTACTTTTAAAAGAACCTTGCTCTTCTGGAACATACGAGGGCAATTCAC CATTTCATCCTCTAGCTGATAACAAATTTGCACTGACTTGCTT TAGCACTCAATTTGCTTTTGCTTGTCCTGACGGCGTAAAACA CGTCTATCAGTTACGTGCCAGATCAGTTTCACCTAAACTGTT CATCAGACAAGAGGAAGTTCAAGAACTTTACTCTCCAATTTT TCTTATTGTTGCGGCAATAGTGTTTATAACACTTTGCTTCACA CTCAAAAGAAAGACAGAATGATTGAACTTTCATTAATTGACT TCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTCTGCTATTCCTTGTTTTAAT TATGCTTATTATCTTTTGGTTCTCACTTGAACTGCAAGATCAT AATGAAACTTGTCACGCCTAAACGAACATGAAATTTCTTGTT TTCTTAGGAATCATCACAACTGTAGCTGCATTTCACCAAGAA TGTAGTTTACAGTCATGTACTCAACATCAACCATATGTAGTT GATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTATTCTAAATGGTATATTA GAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAATTGTGCG TGGATGAGGCTGGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATA TCGGTAATTATACAGTTTCCTGTTTACCTTTTACAATTAATTG CCAGGAACCTAAATTGGGTAGTCTTGTAGTGCGTTGTTCGTT CTATGAAGACTTTTTAGAGTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTA GATTTCATCTAAACGAACAAACTAAAATGTCTGATAATGGAC CCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC CCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGT GGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAA TAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAA GGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAA CACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAG AGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAG ATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGC CAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCA TATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATC ACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACG CAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCC TCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGC AGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGG CGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAA CCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACA AGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAA GAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGT AACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAG GAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATT ACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTT CAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACAC CTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGG ATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGA ATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGC CTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTT CCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAA TCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAACTCATGCA GACCACACAAGGCAGATGGGCTATATAAACGTTTTCGCTTTT CCGTTTACGATATATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGAATTCT CGTAACTACATAGCACAAGTAGATGTAGTTAACTTTAATCTC ACATAGCAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTT GAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACG ATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATAT GGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATC CCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：14，其是SEQ ID NO：1的30-44–仅在序列表中
SEQ ID NO：15，其是SEQ ID NO：1的48-68–仅在序列表中
SEQ ID NO：16，其是SEQ ID NO：1的110-166–仅在序列表中
SEQ ID NO：17，其是SEQ ID NO：1的200-214–仅在序列表中
SEQ ID NO：18，其是SEQ ID NO：1的226-250–仅在序列表中
SEQ ID NO：19，其是SEQ ID NO：1的256-277–仅在序列表中
SEQ ID NO：20，其是SEQ ID NO：1的328-342–仅在序列表中
SEQ ID NO：21，其是SEQ ID NO：1的399-414–仅在序列表中
SEQ ID NO：22，其是SEQ ID NO：1的434-448–仅在序列表中
SEQ ID NO：23，其是SEQ ID NO：1的550-572–仅在序列表中
SEQ ID NO：24，其是SEQ ID NO：1的590-604–仅在序列表中
SEQ ID NO：25，其是SEQ ID NO：1的632-650–仅在序列表中
SEQ ID NO：26，其是SEQ ID NO：1的354-368–仅在序列表中
SEQ ID NO：27，其是SEQ ID NO：1的622-636–仅在序列表中
SEQ ID NO：28，其是SEQ ID NO：1的30-44–仅在序列表中
SEQ ID NO：29，其是SEQ ID NO：1的226-250–仅在序列表中
SEQ ID NO：30：SARS-CoV-2N蛋白
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQ GLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYY RRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDG IIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYA EGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPR QKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHW PQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPN FKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKK QQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
SEQ ID NO：31：RBD，来自SARS-CoV-2S蛋白的S1结构域的片段
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVA DYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVR QIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNY LYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYG FQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCV NF
SEQ ID NO：32：RBD，来自SARS-CoV-2S蛋白的S1结构域的片段，具有C-末端His标签
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVA DYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVR QIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNY LYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYG FQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCV NFLEHHHHHHHH
SEQ ID NO：33：来自SARS-CoV-2S蛋白的S2结构域
SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMT KTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDK NTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLL FNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLT DEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGI GVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVN QNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLIT GRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVD FCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHD GKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDV VIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGIN ASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIW LGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDS EPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO：34：实施例中使用的RBD
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSGPMRVQPTESIVRFPNITNLCP FGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYG VSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKL PDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDIS TEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFLEHHHHHHHH
SEQ ID NO：35(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO： 1衍生的肽)
LTPGDSSSGWTAG
SEQ ID NO：36(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO： 1衍生的肽)
YQAGSTPCNGV
SEQ ID NO：37(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO： 1衍生的肽)
YGFQPTNGVGYQ
SEQ ID NO：38：His-标记的RBD
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSGPMRVQPTESIVRFPNITNLCPFG EVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVS PTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPD DFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTE IYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF ELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFLEHHHHHHHH
SEQ ID NO：39：人血管紧张素转化酶2(ACE2)
MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSS LASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQ EIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTG KVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVG KQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDG YDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPI GCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQA WDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAV CHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMA YAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDF QEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKD QWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFN MLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQ NKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMY LFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFV TAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTL GPPNQPPVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARS GENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF
SEQ ID NO：40(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO： 1衍生的肽)
RTWLPPAYTNS
SEQ ID NO：41(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO： 1衍生的肽)
RTQLPPAYTNS
SEQ ID NO：42(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO： 1衍生的肽)
SGTNGTKRFDN
SEQ ID NO：43(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO： 1衍生的肽)
MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPV TVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSE KGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMRTQLPPAYTNSRTQLPPAYTNS
SEQ ID NO：44(具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽)
MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPV TVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSE KGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMMSHHHHHH HHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPG KKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMSGTNGTKRFDNSGTNGTK RFDN
SEQ ID NO：45(具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽)
MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPV TVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSE KGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMLTPGDSSSGWTAGLTPGDSSSGWTAG
SEQ ID NO：46(具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽)
MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPV TVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSE KGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMNNLDSKVGG NNLDSKVGG
SEQ ID NO：47(具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽)
MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPV TVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSE KGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMYQAGSTPCNGVYQAGSTPCNGV
SEQ ID NO：48(具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽) MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPV TVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSE KGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMYGFQPTNGVGYQYGFQPTNGVGYQ
SEQ ID NO：49(具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽，P1-P6)
MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPV TVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSE KGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMRTQLPPAYT NSSGTNGTKRFDNLTPGDSSSGWTAGNNLDSKVGGYQAGSTPC NGVYGFQPTNGVGYQ
SEQ ID NO：50(人ACE2的C-末端His标记的细胞外结构域)
MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSS LASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQ EIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTG KVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVG KQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDG YDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPI GCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQA WDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAV CHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMA YAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDF QEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKD QWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFN MLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQ NKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMY LFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFV TAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTL GPPNQPPVSLEGSGSGSHHHHHHHHGSGLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID NO：51(具有SARS-CoV-2英国变体B.1.1.7的突变的 SEQ ID NO：1–仅在序列表中
SEQ ID NO：52(具有SARS-CoV-2南非变体B.1.351的突变的 SEQ ID NO：1)：–仅在序列表中
SEQ ID NO：53(具有SARS-CoV-2巴西变体P.1的突变的SEQ ID NO：1)：–仅在序列表中
SEQ ID NO：54(具有来自丹麦的SARS-CoV-2水貂变体的突变的SEQ ID NO：1)：–仅在序列表中
SEQ ID NO：55：(与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽)
NNLDSKVGG
SEQ ID NO：56(具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽，P1-P6)
RTQLPPAYTNSSGTNGTKRFDNLTPGDSSSGWTAGNNLDSK VGGYQAGSTPCNGVYGFQPTNGVGYQ
通过下面的实施例、序列和附图进一步举例说明本发明，从中可以得到本发明的其他特征、实施方案、方面和优点。与本文描述的那些类似或等同的所有方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，其中本文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。
附图说明
图1显示了如实施例3中所述在两名患者中监测的针对SEQ ID NO：1(IgA、IgG)和N蛋白(IgG、IgM)的抗体水平的时间进程(图1)。
图2显示了感染SARS-CoV-2的患者的另一个时间进程。测定了针对SEQ ID NO：1的IgA类抗体(正方形)、针对SEQ ID NO：1 的IgG类抗体(三角形)和针对N蛋白的IgG类抗体(圆圈)。
图3显示了使用(A)在第一步中直接与抗His标签(1：200) 或患者血清(PS，1：100)和在第二步中与抗小鼠IgG-FITC或抗人 IgG-FITC孵育、(B)在如A中所述的与PS3进行两步孵育之前与 PBS孵育30分钟或(C)与PBS孵育30分钟，然后在第一步中与PS3 (1：100)孵育，在第二步中与抗人IgG-生物素(1：200)孵育和在第三步中与ExtrAvidin-FITC(1：2000)孵育的丙酮固定的表达S1 的或对照质粒转染的HEK293细胞的IFA。已经使用标准方法将表达S1的细胞用表达SEQ ID NO：2的pTriEx载体转染。用箭头标记鉴定为与患者抗体具有反应性的代表性细胞。
图4显示了基于斑点印迹分析使用包含RBD的融合蛋白从患者样品中检测IgG、IgA和IgM抗体。
图5显示了基于斑点印迹分析使用包含SEQ ID NO：1的多肽从患者样品中检测IgG、IgA和IgM抗体。
图6显示了基于斑点印迹分析使用SEQ ID NO：1的片段及其融合蛋白从患者样品中检测IgM抗体。
图7显示了基于斑点印迹分析使用SEQ ID NO：1的片段及其融合蛋白从患者样品中检测IgA抗体。
图8显示了基于斑点印迹分析使用SEQ ID NO：1的片段及其融合蛋白从患者样品中检测IgG抗体。
图9显示了基于斑点印迹分析使用SEQ ID NO：1的片段及其融合蛋白从患者样品中时间依赖性检测IgM抗体。
图10显示了基于斑点印迹分析使用SEQ ID NO：1的片段及其融合蛋白从患者样品中时间依赖性检测IgG抗体。
图11显示了基于斑点印迹分析使用SEQ ID NO：1的片段及其融合蛋白从患者样品中时间依赖性检测IgA抗体。
图12显示了基于蛋白质印迹分析使用包含RBD的多肽从患者样品中检测IgA抗体。
图13显示了基于蛋白质印迹分析使用包含RBD的多肽从患者样品中检测IgM抗体。
图14显示了基于蛋白质印迹分析使用包含RBD的多肽从患者样品中检测IgG抗体。
图15显示了基于蛋白质印迹分析使用包含SEQ ID NO：1的多肽从患者样品中时间依赖性检测IgA抗体。
图16显示了基于蛋白质印迹分析使用包含SEQ ID NO：1的多肽从患者样品中时间依赖性检测IgM抗体。
图17显示了基于蛋白质印迹分析使用包含SEQ ID NO：1的多肽从患者样品中时间依赖性检测IgG抗体。
实施例
实施例1：使用ELISA免疫测定检测针对SEQ ID NO：1的抗体
样品
如Corman等人(Corman等人,(2020)Diagnostic detection of 2019-nCoV byreal-time RT-PCR, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.p df？sfvrsn＝a9ef618c_2)所述通过PCR测试为SARS-CoV-2阳性的患者的八个样品在感染后6至14天获得，并且在感染后较早的时间点获得的来自这样的患者的14个样品是可用的。
此外，可获得一系列包含各种冠状病毒的样品，包括来自MERS 感染的患者的18个样品，来自SARS-CoV-1感染的患者的三个样品，四个NL63患者，三个229E患者，六个OC43患者和三个HKU1患者。
用抗原包被的微量滴定板的制备：使用将SEQ ID NO：4标准克隆到带有人工信号序列和C末端His标签的pTriEx-1质粒中来在 HEK293T细胞中表达SEQ ID NO：2，得到SEQID NO：2和去除信号肽后SEQ ID NO：3的表达。将转染的细胞在含有10％胎牛血清、 100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中于37℃和8.5％CO2下培养三到五天。收获细胞，重悬于20mM Tris-HCl pH 7.4、10％(w/v)蔗糖、5mM EDTA、1mM PMSF中，并保存在-80℃下直至进一步使用。
为了制备SEQ ID NO：3，将细胞培养上清液调节为pH 8.0的5 mmol/l三氯化物、164mmol/l氯化钠、50mmol/l氯化镁、20mmol/l 咪唑、0.1％Triton X-100，通过在17,600xg、4℃下离心30分钟而澄清，应用于用pH 8.0的5mmol/l三氯甲烷、300mmol/l氯化钠、20 mmol/l的咪唑平衡的Nickel Rapid Run(Agarose Bead Technologies， Miami，FL，USA)并通过将咪唑浓度增加至150mmol/l进行洗脱。合并所有含有SEQ ID NO：3的级分并通过超滤浓缩(VivaSpin， Sartorius，
Figure GDA0003130300840000811
Germany)。将最终制剂储存在-80℃下直至进一步使用。
在有或没有16mmol/l二硫苏糖醇的情况下处理SEQ ID NO：3 的最终蛋白质制剂，并在70℃或室温下孵育10分钟，然后进行SDS 凝胶电泳和考马斯亮蓝染色。蛋白质身份通过质谱法进行验证。
为了用于微量滴定ELISA，将纯化的蛋白在PBS中稀释至约1.5 μg/ml的终浓度，并用于包被ELISA微量滴定板(Nunc,Roskilde, Denmark)过夜。
实验程序：将样品在IgG样品缓冲液中以1:101稀释，施加至微量滴定板，并使用商购可得的试剂(例如EI 2260-9601G/A，其是具有在盐浓度和pH上基本上生理性条件的缓冲液)如市售 EUROIMMUN ELISA Test-Kit所述的进行孵育。遵循EI 2260-9601 G/A的手册。简而言之：在37℃下60分钟；使用洗涤缓冲液进行3 个洗涤步骤；每孔添加100μl过氧化物酶标记的抗人IgG缀合物(兔) 或抗人IgA缀合物(兔)；在37℃下孵育30分钟；使用EUROIMMUN 洗涤缓冲液进行3个洗涤步骤；每孔添加100μl色原/底物溶液 (TMB/H2O2)；在室温下孵育30分钟；添加100μl终止溶液(0.5M 硫酸)；针对作为参考的630nm，在450nm处进行光密度的测量。
使用可商购获得的校准物(产品编号EI 2606-9601 A， EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG)进行校准。通过将对照或患者样品的消光(extinction)除以校准物的消光来计算比率。低于0.8的结果被认为是阴性，0.8到1.1的结果被认为是临界的，以及超过1.1的结果被认为是阳性。
结果：主要数据如表1所示：
Figure GDA0003130300840000821
Figure GDA0003130300840000831
Figure GDA0003130300840000841
(*晚期阶段；**<6天)
结论
结果表明，针对SEQ ID NO：1的抗体可用于诊断来自人患者的样品中的SARS-CoV-2感染。
用识别IgG和IgA类抗体的第二抗体获得的数据的比较表明，至少在疾病的早期阶段，IgA抗体的检测更加灵敏：在感染的早期阶段、在疾病发作后六天之前采集的4/14个患者样品可以在检测到IgA类抗体时被正确鉴定为阳性，而在相同样品中IgG的检测则给出阴性结果。
两种测定均显示与来自SARS-CoV-1患者的样品的交叉反应性，但几乎没有来自感染MERS、NL63、229E、OC43和HKU1的患者的样品。基于不同的时间分辨的Ig类别特征，尤其是SARS-CoV-1 中IgA类抗体的较晚出现(Hsue,P.R.,Huang,L.M.,Chen,P.J.,Kao, C.L.和Yang P.C.(2004)Chronological evolution of IgM,IgA,IgG and neutralizationantibodies after infection with SARS-associated coronavirus,ClinicalMicrobiology and Infection,10(12),1062-1066)，有可能在SARS-CoV-1和SARS-CoV-2之间进行区分。最后，自 SARS-CoV-2爆发以来，几乎没有任何SARS-CoV病例的报道。
独立研究人员后期发表的各种出版物证实了发明人的发现：
Figure GDA0003130300840000851
等人从一项采用六种用于检测SARS-CoV-2IgG、 IgA和/或IgM抗体的可商购获得的血清学测定的比较研究得出结论，在所测试的六种测定中，基于针对S1的IgA的检测的EUROIMMUN 测定提供最高的灵敏度(
Figure GDA0003130300840000852
A.J.,Kuivanen,S.,
Figure GDA0003130300840000853
E.,Ahava,M.J.,Loginov,R.,Kallio-Kokko,H.,Vapalahti,O.,Jarva,H.,Kurkela和Lappalainen,M.(2020),J.Clin.Virology 129, 104512)。Okba等人获得了相似的结果(Okba等人,Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-SpecificAntibody Responses in Coronavirus Disease Patients.Emerg Infect Dis.2020 Jul；26(7):1478-1488，预先发表在medRxiv 2020.03.18.20038059)。 Beavis等人证实了根据本发明的基于IgA的测定的灵敏度在疾病的早期阶段是优越的，而IgG测定在晚期阶段是优越的(Beavis,K.G., Mathushek,S.M.,Abeleda,A.P.F.,Bethel,C.,Hunt,C.,Gillen,S.,Moran,A.和Tesic,V.(2020)Evalutaion of the EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2ELISAAssay for detection of IgA and IgG antibodies,J.Clin.Virology 129,104468)。
总之，根据本发明的测定可用于针对SEQ ID NO：1的诊断相关抗体的早期检测。在一些患者中，自症状发作经过六天之前就可以发现真正的阳性结果。因此，该测定有助于关闭或至少缩小可使用基于 PCR的测定和免疫测定的时期之间的诊断间隔。
实施例2：扩展的ELISA研究，旨在进一步表征用于检测针对SEQ ID NO：1的IgA抗体的测试的诊断可靠性和相关性
为了确定本测定的灵敏度，使用EUROIMMUN产品编号EI 2606-9601 A，基于类似于实施例1中所述的测定，在来自152个欧洲患者的166个样品中检测IgA抗体的存在或不存在。在每个受试者样品中，已经根据Corman VM等人Detection of 2019novel coronavirus(2019-nCoV)by real-time RT-PCR.Euro Surveill 25(3):pii＝2000045 (2020-01-23)，基于来自感染早期阶段的样品使用RT-PCR确认了 SARS-CoV-2感染。
简而言之，该测定基于ELISA，其使用包被了包含纯化的SEQ ID NO：1的抗原的微量滴定板。在与样品一起孵育并使用生理缓冲液进行大量洗涤步骤后，使用被酶活性标记物标记的针对IgA的第二抗体特异性修饰针对SEQ ID NO：1的IgA抗体，然后孵育显色底物。可以在产品(EUROIMMUN产品编号EI 2606-9601 A)随附的手册中找到更多详细信息，该产品手册通过引用并入本文。
基于在感染的后续过程中获得的样品进行血清学表征。
用直到症状发作后第10天获得的样品(或直到通过阳性RT-PCR 直接检测到感染后第10天获得的样品)确定了关于针对SEQ ID NO： 1的IgA的60.2％的灵敏度。对于第10天后获得的样品，灵敏度为 98.6％。
结果和免疫反应是高度个体化的。例如，少数患者可能根本不显示IgA、IgG或IgM反应。
总之，这项进一步的研究还一致地证明，针对SEQ ID NO：1的 IgA类抗体的特异性检测为检测已经在疾病早期阶段的SARS-CoV-2 感染提供了特别高的灵敏度。
实施例3：如通过ELISA所显示的，在SARS-CoV-2患者中各种诊断相关抗体随时间的持久性
在两名患者中监测了针对SEQ ID NO：1(IgA、IgG)和N蛋白 (IgG、IgM)的抗体水平的时间进程(图1)。两者均呈现轻度病程，但已通过RT-PCR确认了感染。观察到典型的特定症状，例如暂时失去嗅觉。EUROIMMUN产品EI 2606-9601 A和EI 2606-9601 G(以 S1蛋白作为抗原，分别IgA或IgG检测)以及EI 2606-9601-2 G和 EI 2606-9601-2 M(以N蛋白作为抗原，分别IgG或IgM检测)根据制造商的说明书(通过引用并入本文)进行使用。实施例2概述了测试的原理和主要组成部分。然而，取决于要检测的抗体，使用了不同的抗原(N蛋白作为抗原而不是包含SEQ ID NO：1的多肽)以及不同的第二抗体(结合IgA、IgG或IgM)。EI 2606-9601 A、EI 2606-9601 G、EI 2606-9601-2 G和EI 2606-9601-2 M(EUROIMMUN)的制造商说明书中提供了更多信息。
在超过四个月的时间内对病程进行了监测。最初可检测到针对 SEQ ID NO：1的IgA和IgG，但检测到针对N蛋白的IgG而非IgM。在这两个患者中，四个月后可检测到针对SEQID NO：1的IgA或IgG 中的至少一个，而在早至首次阳性PCR后的两个月针对N蛋白的IgG 是不存在的或很弱。
这些结果表明，至少在一些患者中，针对SEQ ID NO：1的抗体比针对N蛋白的抗体存在更长的时间。IgA抗体水平比IgG抗体水平更快下降，但由于它们最初的更高信号，IgA抗体在它们消失时仍可能占主导地位。
在图2中显示了对第三位患者的另一个时间进程的监测。基本上，针对SEQ ID NO：1的IgA类抗体(正方形)、针对SEQ ID NO：1 的IgG类抗体(三角形)和针对N蛋白的IgG类抗体(圆圈)使用相同的方法进行测定。从图2可以明显看出，在所监测的整个时间段内，即即使在RT-PCR确认的SAR-CoV-2感染后40天之后，仍可检测到针对S1[SEQ ID NO：1]的IgA类抗体，而针对SEQ ID NO：1或针对SARS-CoV-2 N蛋白的IgG类抗体的水平保持在截断值以下(或接近截断值)。因此，这些数据另外证实了基于与SEQ ID NO：1抗原结合的IgA类抗体的特异性检测的本发明的测定的优越灵敏度。
实施例4：将用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的基于化学发光的测定用于随时间监测各种抗体
根据制造商的说明和默认设置，使用EUROIMMUN Random Access RA 10分析仪(YG0710-0101)，包括试剂盒(LS 1254-10010 G)。
甲苯磺酰活化的顺磁珠(M-280，Invitrogen)按照制造商的说明进行包被。简而言之，将珠子在IKA Roller 10(由VWR提供)上于 37℃在包被缓冲液(0.1M磷酸钠，pH 7.4)中洗涤10分钟，然后进行珠子的磁性浓缩并去除上清液。将根据实施例1纯化的重组多肽(SEQ ID NO：3)添加到相同的缓冲液中，然后添加3M硫酸铵并在相同条件下孵育19小时，然后使用洗涤缓冲液(PBS pH 7.4 0.1％ BSA 0.2％Tween-20)进行两个洗涤步骤，在相同缓冲液(PBS pH 7.4 0.1％BSA 0.2％Tween-20)中于37℃封闭4小时和进行另外两个洗涤步骤。将珠子在4℃保存在相同缓冲液中至少16h。
通过将顺磁性珠子与样品缓冲液(在Tris-HCl EDTA pH 7中的 BSA/Tween-20)混合进行测定。将珠子的20μl悬浮液(1mg/ml)与 5μl样品(即患者的血液样品)在总共200μl的样品缓冲液中接触。孵育10分钟后，将珠子在样品缓冲液中洗涤三次，然后加入160μlIgG/IgA缀合物(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostik AG, LK 0711-10010，基本上是用吖啶酯标记的IgG或IgA特异性第二抗体)并在37℃下孵育10分钟。在三个洗涤步骤后，迅速加入碱性过氧化氢并混合以触发光发射，然后立即进行10秒发光检测。结果如表 2所示：
Figure GDA0003130300840000891
Figure GDA0003130300840000892
Figure GDA0003130300840000901
这些结果表明，可以使用化学发光检测针对SEQ ID NO：1的抗体。与通过ELISA获得的结果具有良好的相关性。因此，化学发光可用于实施本发明。
实施例5：用表达SEQ ID NO：2的HEK-S1细胞进行的间接免疫荧光测定(IFA)
使用具有表达SARS-CoV-2 S1蛋白的重组HEK293细胞或 HEK293对照细胞的生物芯片阵列的载玻片进行IFA，以证明该方法可用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体。
将每个生物芯片嵌合体与35μL的1：100PBS稀释的血清样品在室温下孵育30分钟，用PBS-Tween洗涤，并浸入PBS-Tween中5分钟。在第二步中，应用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG，Lübeck)，并在室温下孵育30分钟。再次用PBS-Tween的冲洗洗涤载玻片，然后将其浸入PBS-Tween中5分钟。将载玻片包埋在PBS缓冲的包含 DABCO的甘油(每视野约10μL)中，并通过荧光显微术检查。可替代地，将载玻片与PBS孵育30分钟，然后进行血清孵育，并通过与抗人IgG-生物素(1：200，109-065-098，Dianova)孵育30分钟检测结合的人IgG，然后进行如上所述的洗涤步骤，并与ExtrAvidin-FITC (1：2000，E2761，Sigma-Aldrich)孵育30分钟，然后进行另一个洗涤步骤。直接与对照转染的细胞和对照样品比较，基于转染的细胞的荧光强度将样品分类为阳性或阴性。由两名独立的观察者使用 EUROStar II显微镜(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG,Lübeck,Germany)评估结果。如果没有另外说明，则试剂从 Merck,Darmstadt,Germany或Sigma-Aldrich,Heidelberg,Germany 获得。
S1 IgG ELISA阳性患者血清(PS)的血清显示与S1(SEQ ID NO： 2)但非对照转染的HEK细胞的阳性反应(图3)，而49个S1 IgG ELISA阴性对照血清均不反应。通过在血清孵育之前将HEK-S1细胞与PBS孵育并用抗人IgG-生物素/ExtrAvidin-FITC检测人IgG抗体来改善患者血清的信号强度。总共15/24个S1 IgG ELISA阳性患者血清在HEK-S1 IFA中显示与抗人IgG-生物素/ExtrAvidin-FITC的阳性反应。
因此，IFT是可用于实施本发明的另一种方法。
实施例6：疫苗接种研究
健康受试者在第1天接受生理PBS中12.86μg重组S1蛋白(SEQ ID NO：3)在四头肌中的注射。按照制造商的说明使用明矾佐剂(成人用的Twinrix，EMRA-MED ArzneimittelGmbH)。在第9、21和 28天，受试者接受生理PBS缓冲液中另外的12.86μg S1蛋白和500μl 氯化钠溶液中10μl Imject明矾佐剂(Thermo Scientific Imject Alum Adjuvant Alaun)的注射。在第10、23和29天获得血液样品。
根据制造商的说明使用血清学试剂盒(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG，EI 2606-9601 A，EI 2606-9601 G， EI 2606-9601-2 G和EI 2606-9601-2 M，如实施例2和3中所述)在来自健康受试者的血清样品中确定针对SEQ ID NO：1(S1)和N蛋白的IgG和IgA抗体的存在。表3显示了测定的抗体滴度。
表3：在使用S1蛋白接种的受试者中针对SARS-CoV-2抗原的抗体
Figure GDA0003130300840000921
作为阳性和阴性对照，使用来自患有SARS-CoV-2感染的患者的样品(即，预期存在针对SARS-CoV-2的抗体)和来自健康献血者的样品(即，预期不存在针对SARS-CoV-2的抗体)；分别参见表4和 5。
在两名患有SARS-CoV-2感染的患者(阳性对照)中，在症状发作(通常在感染后5-6天)后17天和19天获得样品。表4显示了确定的抗体滴度。
表4：两名患有SARS-CoV-2感染的患者中针对SARS-CoV-2抗原的抗体
Figure GDA0003130300840000922
在未接受任何疫苗接种的四个健康受试者(阴性对照)中，获得样品。抗体滴度示于表5。
表5：健康受试者中针对SARS-CoV-2抗原的抗体
Figure GDA0003130300840000931
这些结果表明，通过使用基于针对SEQ ID NO：1的抗体的检测的测定，可以将用SEQ ID NO：1或其变体进行疫苗接种的受试者与受感染的受试者或用不包含SEQ ID NO：1或其变体的疫苗处理的受试者区分开。虽然两者中都可以检测到针对疫苗中所含的S1的抗体，但是仅在受感染的患者中检测到针对N蛋白的抗体，而在接种疫苗的受试者中未检测到。
实施例7：使用斑点印迹检测针对RBD和S1的抗体
试剂：如实施例1中所述获得RBD(SEQ ID NO：34)和S1(SEQ ID NO：3)抗原。制备来自如阳性PCR测试所示患有SARS-CoV-2 的患者(1075、1076、1078、1079、1080、1084、1085、1098、1099、 1100)的样品在稀释缓冲液(1x通用缓冲液(10x浓缩液，产品编号 20125896)中的3％牛血清白蛋白)中的稀释物。来自健康献血者 (BS01、BS10、BS25、BS32、BS43)的样品用作额外的阴性对照。
用作阳性对照的单克隆抗体AK78、AK76和AK80各自为单克隆抗His标签抗体(Lindner P,Bauer K,Krebber A,Nieba L,Kremmer E,Krebber C,Honegger A,KlingerB,Mocikat R,Plückthun A. Specific detection of his-tagged proteins withrecombinant anti-His tag scFv-phosphatase or scFv-phagefusions.Biotechniques.1997 Jan；22(1):140-9)。
通过将1μl抗原溶液(2.69mg ml-1)转移到试纸条上，制成印迹条。膜是0.22μm的硝酸纤维素膜(Sartorius)。
针对IgA、IgG和IgM的第二抗体(分别是“抗人-IgA-AP”，“抗人-IgG-AP”和“抗人-IgM-AP”)来自EUROIMMUN(碱性磷酸酶标记的抗人IgA/G/M(山羊)，产品编号ZD 1129A/G/M)，NBT/BCIP 也一样，产品编号10 123964。
方法：通过在洗涤缓冲液(1x通用缓冲液(10x浓缩液，产品编号20125896)中的3％牛血清白蛋白)中孵育15分钟来封闭印迹条，然后将印迹条在室温下在适当稀释的样品中孵育3小时，然后使用洗涤缓冲液进行三个洗涤步骤，然后将印迹条在适当稀释的样品中孵育另外30分钟，然后再次进行三个洗涤步骤，然后通过在NBT/BCIP 溶液中孵育十分钟进行染色，其通过在去离子水中彻底洗涤印迹条三次来终止。
结果：图4和5显示了样品和对照的斑点印迹分析的结果。如通过使用单克隆抗体代替样品的阳性结果和如果使用阴性对照则无信号来判断的，可以成功建立测定。
尽管S1和RBD均可用于检测IgM、IgA和IgG抗体，但如果使用S1，则反应通常会稍强一些，这表明RBD及其侧翼的序列均包含表位或其部分。此外，抗原-抗体相互作用的一部分可能受到抗原折叠的影响。
有趣的是，在患者1085中可以检测到IgA和IgM，但未检测到 IgG抗体，证实了基于ELISA的结果，即IgA抗体的检测增强灵敏度，特别是附加于IgG。当尚未检测到IgG抗体时，可能已经在疾病的早期阶段对患者进行了检查。反之亦然，在患者1100中仅可检测到IgG抗体，其样品可能是在IgA抗体消失后在疾病的晚期阶段获得的。
与IgM抗体相比，IgA和IgG抗体通常给出更强的信号。
实施例8：使用斑点印迹检测针对衍生自RBD和S1的肽的抗体
肽P1(RTQLPPAYTNS，SEQ ID NO：41)、P2(SGTNGTKRFDN， SEQ ID NO：42)、P3(LTPGDSSSGWTAG，SEQ ID NO：35)、 P4(NNLDSKVGG，SEQ ID NO：55)、P5(YQAGSTPCNGV，SEQID NO：36)、P6(YGFQPTNGVGYQ，SEQ ID NO：37)和包含 P1-P6的融合体(SEQ ID NO：56)使用基于pET24d质粒的标准方法由大肠杆菌Rosetta(DE3)pLacI细胞于37℃在含有卡那霉素和氯霉素的LB培养基中持续3小时，使用IPTG诱导表达为包含蛋白酶切割位点的N末端His标签融合体(包含P1:SEQ ID NO：43；P2: SEQ ID NO：44；P3:SEQ ID NO：45；P4:SEQ ID NO：46；P5:SEQ ID NO：47；P6:SEQ ID NO：48的融合体的序列；包含P1-P6的融合体：SEQ ID NO：49)。收获细胞，将其悬浮于磷酸缓冲盐水中，并保存在-20℃下直至进一步使用。
图6、7和8显示了使用P1至P6构建体的斑点印迹测定的结果。无论是否检测到IgA、IgM或IgG，作为RBD的一部分的P6都表现出最强的反应，但使用P1、P2(除了IgM以外)、P3和P4(除了 IgM以外)和P5也可以表现出一些反应性。与IgG和IgA的反应通常强于IgM。
代表来自几个患者的多于一个样品的时间进程的样品表明，斑点印迹可用于监测患者。例如，患者SK1586(三个时间点)与第一个样品(1.3i)具有最强的IgM反应，而如果使用第二个样品(1.11.i) 和第三个样品(1.19)，则信号较弱，尤其是对于P3(图9)。如果使用肽P1和P6检测IgA，则相同样品显示出更强的反应(图10)。如果检测到IgG抗体，反应通常更强，但是可以使用相同的样品来监测时间依赖性反应，尤其是肽P6、P1和包含P1至P6的融合蛋白(图 11)。实施例7和8表明，可以使用斑点印迹和SEQ ID NO：1的各种片段来检测针对SEQ ID NO：1的抗体。
实施例9：使用蛋白质印迹检测针对RBD和S1的抗体
使用2μg RBD(SEQ ID NO：34)或S1(SEQ ID NO：3)进行非还原SDS PAGE。将包含10μl蛋白质的样品与4μl NuPAGE-PP (NuPage LDS样品缓冲液(4x)，Firma FisherScientific GmbH) 和1μl EU-PBS(磷酸缓冲盐水)混合，在70℃孵育10分钟。将每泳道12μl所得溶液加到非还原2D凝胶(NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel 1.0mm x 2D，FisherScientific GmbH)上，并在运行缓冲液(NuPage MOPS SDS运行缓冲液，Fisher ScientificGmbH)中进行电泳。将分离的蛋白带以400mA(PowerPac HC Power Supply，Firma Bio-Rad)转移到硝酸纤维素膜上60分钟。可以使用PonceauS对膜条进行染色，然后在50mM Tris中洗涤，但在任何情况下均在洗涤缓冲液(1x通用缓冲液(10x浓缩液，订货号：20125896)中的3％牛血清白蛋白) 中经受15分钟的封闭，然后在室温下将试纸条在适当稀释的样品中孵育3小时，然后使用洗涤缓冲液进行三个洗涤步骤，然后将试纸条在适当稀释的样品中孵育另外30分钟，然后再次进行三个洗涤步骤，然后通过在NBT/BCIP溶液中孵育十分钟进行染色，通过在去离子水中彻底洗涤试纸条三次来终止染色。
结果：阳性对照(如之前的抗His抗体)和来自SARS-CoV-2感染患者的阳性样品显示，除了RBD单体外，还检测到了二聚体、三聚体和四聚体。使用检测IgA类抗体的第二抗体检测到与六种血清的弱反应，与另外三种血清的弱反应和与一种血清的强反应。如果两个或更多个来自不同时间点的样品可用并具有反应性，则观察到IgA抗体浓度的降低，例如对于样品SK159822.1i至2.4i以及对于样品6i和 61i以及7i和7.1i(图12)。
对于IgG类抗体的检测，如通过ELISA判断为阳性的所有样品均显示反应(图13)。基于两种方法的结果，样品SK1606 169i为阴性。
对于IgM类抗体的检测，如果两个或更多个来自不同时间点的样品可用，则在一些情况下检测到抗体浓度的降低，尤其是SK15862.2 至SK15862.16以及SK159986i至SK1599861i(图14)。如果使用S1 而不是RBD作为抗原，则结果具有高度可比性(图15、16和17)。
结论是蛋白质印迹是可用于实施本发明的另一种方法。
实施例10：使用竞争性测试形式检测针对RBD的IgA、IgM和IgG抗体
除非另有说明，否则根据制造商的说明，将EUROIMMUN SARS-CoV-2 NeutraLISA试剂盒(EI 2606-9601-4)用于以下实验。
简而言之，使用包被有在人细胞系HEK293中重组表达的 SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1结构域(SEQ ID NO：3)的微量滴定板。在分析的第一步中，将对照和样品(受试者的血液样品)用含有可溶性生物素化人ACE2(SEQ ID NO：50)的样品缓冲液稀释，并在微量滴定板的试剂孔中孵育。样品中存在的中和抗体与ACE2竞争包被的SARS-CoV-2 S1刺突蛋白的结合位点。未结合的ACE2和未结合的样品在随后的洗涤步骤中被去除。为了检测结合的ACE2，使用过氧化物酶标记的链霉亲和素(其与固定在微量滴定板上的抗原上的生物素化的ACE2结合，并在第三步中催化显色反应)进行第二次孵育。产生的颜色的强度与样品中中和抗体的浓度成反比，如表6所示：
Figure GDA0003130300840000971
结果表明，阳性样品稀释度的增加，即中和抗体浓度的降低，导致产生的颜色的增加。相反，如果使用阴性样品，则信号较高，并且与样品的稀释度无关。
这证实了该测定可用于检测和定量样品中针对RBD的中和抗体。
实施例11：通过ELISA检测针对SARS-CoV-2抗原S1和N蛋白的抗体
将包含在感染后不同时间点从43名德国COVID-19患者中的每一个采集的几个样品的一组样品用来检测随时间推移抗体的存在或不存在。测试了所有血清的针对SARS-CoV-2刺突结构域的S1结构域 (SEQ ID NO：3)的抗体(IgA和IgG ELISA试剂盒，EUROIMMUN，如实施例2和3中的产品)和针对N蛋白的抗体(IgG和IgM ELISA 试剂盒，EUROIMMUN，如实施例2和3中所述)。
在疾病发作后>10到<21天之间，分别地，在70.4％和88.9％的样品中检测到针对SARS-CoV-2的S1的IgG和IgA抗体，而在86.2％和50％的样品中检测到针对N蛋白的IgG和IgM。在六名患者中，针对S1的IgA抗体是可以检测到的第一抗体，而仅在2个病例中，针对S1的非IgA的抗体是要检测的第一抗体。在30名患者中，任何时候都无法检测到针对N蛋白的IgM抗体。
疾病发作后超过60天，分别地，在85.1％和80.5％的样品中检测到针对SARS-CoV-2的S1的IgG和IgA抗体，而在81.4％和0％的样品中检测到针对N蛋白的IgG和IgM。在四名患者中，可检测到针对S1的IgG，但未检测到针对N蛋白的IgG。相比之下，仅在一名患者中可检测到针对N蛋白的IgG，但未检测到针对S1的IgG。
这些结果证实，针对S1的IgA的检测对于针对SARS-CoV-2(更具体地针对其S1蛋白)的抗体应答的早期检测是最灵敏的测定。相比之下，在感染的晚期阶段针对S1的IgG的检测特别灵敏。可以通过在一个反应中或在分开的反应中检测针对S1的IgA和针对S1的IgG来结合两种测定，以用于增加灵敏度，任选地还与其他测定结合以在延长的时间段内增加灵敏度。
实施例12：在SARS-CoV-2感染的晚期阶段通过ELISA检测针对SARS-CoV-2抗原S1和N蛋白的抗体
使用与实施例11中相同的方法，获得来自另一组15名患有 SARS-CoV-2感染的患者的样品(在疾病发作后21天或更晚时间采集) 并测试了针对N蛋白的IgG和IgM抗体以及针对S1蛋白的IgA和IgG 抗体的存在。结果示于表7：
测定 阳性 临界 阴性 灵敏度
NCP ELISA IgG 13 0 2 86,7％
NCP ELISA IgM 5 2 8 46,7％
S1 ELISA IgG 14 0 1 93,3％
S1 ELISA IgA 12 3 0 100％
对这一额外队列的研究证实，如果检测到针对S1蛋白的抗体，则在SARS-CoV-2感染的晚期阶段诊断的灵敏度最高。
实施例13：检测针对SARS-CoV-2抗原S1和N蛋白的抗体的特异性
抗SARS-CoV-2 ELISA(IgA，EI 2606-9601 A，根据制造商的说明书进行，实施例2和3中有更多详细信息)的特异性通过分析210 例阳性患者样品确定，例如，针对其他人病原体冠状病毒、其他病原体的抗体或类风湿因子。此外，分析了在SARS-CoV-2发生之前(2020 年1月之前)获得的来自献血者、儿童和孕妇的1052个样品。在临界范围中的结果(n＝9)未包括在特异性计算中。如表8所示，特异性为98.3％。
基于222个阳性患者样品和来自献血者、儿童和孕妇的1052个样品，以同样的方式确定了抗SARS-CoV-2 ELISA(IgG，EI 2606-9601 G，根据制造商的说明书进行，实施例2和3中有更多详细信息)的特异性。如表8所示，特异性为98.3％：
Figure GDA0003130300840001001
序列表
<110> 欧蒙医学实验诊断股份公司
<120> 诊断SARS-CoV-2感染的方法和试剂
<130> 20PP007WO
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自S蛋白的SARS-CoV-2 S1结构域
<400> 1
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
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Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
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Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
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Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
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Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
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Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
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Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
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Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
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Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
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450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
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515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
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Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
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Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
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Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
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<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自S蛋白的SARS-CoV-2 S1结构域，C-末端his标记的
<400> 2
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Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
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Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
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Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
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Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
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Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
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Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
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Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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<210> 3
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自S蛋白的SARS-CoV-2 S1结构域，C-末端his标记的, 如在切割信号肽后
<400> 3
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
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Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
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Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
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Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
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Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
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325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
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<210> 4
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自S蛋白的SARS-CoV-2 S1结构域，编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列
<400> 4
atgttcgtat tccttgttct gctgcctttg gttagcagtc agtgtgtcaa cctgacaact 60
cgcacgcaac tgccgccagc ttacaccaac tctttcacaa gaggcgtcta ctacccggac 120
aaagtgtttc gctcatcagt gctgcactct acacaagatt tgtttctgcc attcttctct 180
aacgtaacct ggtttcacgc gattcatgtg tctgggacaa atgggaccaa gcgcttcgac 240
aaccccgtgc tgccattcaa tgacggggtg tattttgcct ccaccgagaa atccaatatc 300
atccgaggat ggattttcgg tactacgctg gactctaaaa cgcagtctct cttgatcgtt 360
aataacgcca caaatgttgt cattaaggtg tgcgagtttc agttctgtaa tgatcccttt 420
ctgggtgtgt attaccacaa gaataacaag tcatggatgg aaagcgagtt tcgcgtgtac 480
tcaagtgcca ataactgcac attcgagtat gtgtcccagc ctttcctgat ggatctcgaa 540
ggcaaacagg ggaacttcaa gaatctgcgc gagttcgtgt ttaagaacat cgacggttat 600
ttcaagatct acagcaaaca tacacccatt aacctggtca gggatctccc tcagggattc 660
tccgccctgg aacccttggt ggacttgccc attgggatta acatcactag attccagacc 720
ctgctggccc ttcaccgttc ctatcttact cctggcgaca gtagcagtgg atggaccgca 780
ggagcagccg cttactatgt aggctatctg cagccacgga ccttcctcct caagtacaat 840
gaaaatggta ccataactga tgctgtggac tgcgctctgg atccactctc cgaaactaaa 900
tgcaccctta aaagcttcac ggtcgaaaag ggaatctacc agacaagtaa ctttcgggta 960
caacccactg agtccatcgt gcggtttcct aacatcacaa atctctgccc ctttggtgaa 1020
gtgtttaacg ccactaggtt cgcttctgtt tatgcgtgga atcggaagag gatttccaat 1080
tgcgtggcag actactctgt cctgtataat agcgctagct tcagcacctt caaatgttac 1140
ggggtaagcc caactaaact gaacgacctc tgttttacca acgtgtatgc cgatagcttt 1200
gtcatacgag gagatgaggt tcgtcagatt gctcctggcc aaacggggaa aatcgcagac 1260
tacaactaca agcttcccga cgacttcaca ggatgcgtga tcgcgtggaa ctcaaataat 1320
ctggatagca aggttggtgg caattataac tacctgtatc gactgttcag gaaaagcaac 1380
ctcaaaccct ttgagcgcga catcagcacc gagatatacc aagccggttc aacaccttgc 1440
aatggggtgg aagggtttaa ctgctatttc ccacttcaga gctatgggtt tcagccaacc 1500
aatggagtcg gctaccagcc ctatcgggtg gtagtcctgt cctttgagct gttgcatgcg 1560
cctgccacag tctgtggccc taagaagagt acgaatctgg tgaagaacaa gtgcgtcaac 1620
ttcaatttta acggcttgac tggaacagga gttctgaccg agtccaacaa gaaattcctt 1680
ccttttcagc agtttggaag ggatatagcc gacactaccg atgccgttcg ggatccacag 1740
acactggaga ttctggacat tactccgtgc tcatttggcg gtgtatctgt catcacacct 1800
gggaccaata cctcaaatca ggtggctgtg ctctaccagg atgtgaattg taccgaagtt 1860
ccagtggcaa ttcatgccga tcaactgact cccacctgga gagtgtacag tactggcagt 1920
aacgtgtttc agacaagagc tggctgtctc ataggcgcag aacacgtcaa caacagctat 1980
gagtgtgaca ttccgatcgg cgcaggcatc tgtgcatcct accagacgca aaccaactct 2040
cccagaagag ccaggctcga gcaccaccat caccatcacc atcactaa 2088
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可能的SARS-CoV-2 S1表位
<400> 5
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
1 5 10
<210> 6
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 [MERS_CoV]
<400> 6
Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu Val
1 5 10 15
Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile Asp
20 25 30
Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr Ser
35 40 45
Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp His
50 55 60
Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr Pro
65 70 75 80
Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe Ala
85 90 95
Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly Thr
100 105 110
Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Ser Ala Thr Ile Arg Lys Ile Tyr Pro
115 120 125
Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp Gly Lys Met
130 135 140
Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp Gly Cys Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly Asn
165 170 175
His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His Thr
180 185 190
Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser Leu
195 200 205
Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met Tyr
210 215 220
Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile Thr
225 230 235 240
Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp Leu
245 250 255
Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp Thr
260 265 270
Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln Ser
275 280 285
Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro Leu
290 295 300
Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala Ile
305 310 315 320
Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu Ser
325 330 335
Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe
355 360 365
Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg
370 375 380
Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu
385 390 395 400
Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile
405 410 415
Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro
420 425 430
Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser
435 440 445
Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu
450 455 460
Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr
465 470 475 480
Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu
485 490 495
Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Ile
500 505 510
Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu
515 520 525
Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val
530 535 540
Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr
545 550 555 560
Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn Asp
565 570 575
Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu Tyr
580 585 590
Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly Val
595 600 605
Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly Tyr
610 615 620
Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser Val
625 630 635 640
Pro Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr Leu
645 650 655
Phe Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln Tyr
660 665 670
Ser Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr Gly
675 680 685
Pro Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser Ser
690 695 700
Leu Phe Val Glu Asp Cys Lys Leu Pro Leu Gly Gln Ser Leu Cys Ala
705 710 715 720
Leu Pro Asp Thr Pro Ser Thr Leu Thr Pro Arg Ser Val Arg
725 730
<210> 7
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 [HCoV-229E]
<400> 7
Cys Gln Thr Thr Asn Gly Leu Asn Thr Ser Tyr Ser Val Cys Asn Gly
1 5 10 15
Cys Val Gly Tyr Ser Glu Asn Val Phe Ala Val Glu Ser Gly Gly Tyr
20 25 30
Ile Pro Ser Asp Phe Ala Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Thr Asn Thr
35 40 45
Ser Ser Val Val Asp Gly Val Val Arg Ser Phe Gln Pro Leu Leu Leu
50 55 60
Asn Cys Leu Trp Ser Val Ser Gly Leu Arg Phe Thr Thr Gly Phe Val
65 70 75 80
Tyr Phe Asn Gly Thr Gly Arg Gly Asp Cys Lys Gly Phe Ser Ser Asp
85 90 95
Val Leu Ser Asp Val Ile Arg Tyr Asn Leu Asn Phe Glu Glu Asn Leu
100 105 110
Arg Arg Gly Thr Ile Leu Phe Lys Thr Ser Tyr Gly Val Val Val Phe
115 120 125
Tyr Cys Thr Asn Asn Thr Leu Val Ser Gly Asp Ala His Ile Pro Phe
130 135 140
Gly Thr Val Leu Gly Asn Phe Tyr Cys Phe Val Asn Thr Thr Ile Gly
145 150 155 160
Asn Glu Thr Thr Ser Ala Phe Val Gly Ala Leu Pro Lys Thr Val Arg
165 170 175
Glu Phe Val Ile Ser Arg Thr Gly His Phe Tyr Ile Asn Gly Tyr Arg
180 185 190
Tyr Phe Thr Leu Gly Asn Val Glu Ala Val Asn Phe Asn Val Thr Thr
195 200 205
Ala Glu Thr Thr Asp Phe Cys Thr Val Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Asp
210 215 220
Val Leu Val Asn Val Ser Gln Thr Ser Ile Ala Asn Ile Ile Tyr Cys
225 230 235 240
Asn Ser Val Ile Asn Arg Leu Arg Cys Asp Gln Leu Ser Phe Asp Val
245 250 255
Pro Asp Gly Phe Tyr Ser Thr Ser Pro Ile Gln Ser Val Glu Leu Pro
260 265 270
Val Ser Ile Val Ser Leu Pro Val Tyr His Lys His Thr Phe Ile Val
275 280 285
Leu Tyr Val Asp Phe Lys Pro Gln Ser Gly Gly Gly Lys Cys Phe Asn
290 295 300
Cys Tyr Pro Ala Gly Val Asn Ile Thr Leu Ala Asn Phe Asn Glu Thr
305 310 315 320
Lys Gly Pro Leu Cys Val Asp Thr Ser His Phe Thr Thr Lys Tyr Val
325 330 335
Ala Val Tyr Ala Asn Val Gly Arg Trp Ser Ala Ser Ile Asn Thr Gly
340 345 350
Asn Cys Pro Phe Ser Phe Gly Lys Val Asn Asn Phe Val Lys Phe Gly
355 360 365
Ser Val Cys Phe Ser Leu Lys Asp Ile Pro Gly Gly Cys Ala Met Pro
370 375 380
Ile Val Ala Asn Trp Ala Tyr Ser Lys Tyr Tyr Thr Ile Gly Ser Leu
385 390 395 400
Tyr Val Ser Trp Ser Asp Gly Asp Gly Ile Thr Gly Val Pro Gln Pro
405 410 415
Val Glu Gly Val Ser Ser Phe Met Asn Val Thr Leu Asp Lys Cys Thr
420 425 430
Lys Tyr Asn Ile Tyr Asp Val Ser Gly Val Gly Val Ile Arg Val Ser
435 440 445
Asn Asp Thr Phe Leu Asn Gly Ile Thr Tyr Thr Ser Thr Ser Gly Asn
450 455 460
Leu Leu Gly Phe Lys Asp Val Thr Lys Gly Thr Ile Tyr Ser Ile Thr
465 470 475 480
Pro Cys Asn Pro Pro Asp Gln Leu Val Val Tyr Gln Gln Ala Val Val
485 490 495
Gly Ala Met Leu Ser Glu Asn Phe Thr Ser Tyr Gly Phe Ser Asn Val
500 505 510
Val Glu Leu Pro Lys Phe Phe Tyr Ala
515 520
<210> 8
<211> 745
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 [HCoV-OC43]
<400> 8
Ala Val Ile Gly Asp Leu Lys Cys Thr Ser Asp Asn Ile Asn Asp Lys
1 5 10 15
Asp Thr Gly Pro Pro Pro Ile Ser Thr Asp Thr Val Asp Val Thr Asn
20 25 30
Gly Leu Gly Thr Tyr Tyr Val Leu Asp Arg Val Tyr Leu Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Phe Leu Asn Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Arg Asn
50 55 60
Met Ala Leu Lys Gly Ser Val Leu Leu Ser Arg Leu Trp Phe Lys Pro
65 70 75 80
Pro Phe Leu Ser Asp Phe Ile Asn Gly Ile Phe Ala Lys Val Lys Asn
85 90 95
Thr Lys Val Ile Lys Asp Arg Val Met Tyr Ser Glu Phe Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Ile Gly Ser Thr Phe Val Asn Thr Ser Tyr Ser Val Val Val Gln
115 120 125
Pro Arg Thr Ile Asn Ser Thr Gln Asp Gly Asp Asn Lys Leu Gln Gly
130 135 140
Leu Leu Glu Val Ser Val Cys Gln Tyr Asn Met Cys Glu Tyr Pro Gln
145 150 155 160
Thr Ile Cys His Pro Asn Leu Gly Asn His Arg Lys Glu Leu Trp His
165 170 175
Leu Asp Thr Gly Val Val Ser Cys Leu Tyr Lys Arg Asn Phe Thr Tyr
180 185 190
Asp Val Asn Ala Asp Tyr Leu Tyr Phe His Phe Tyr Gln Glu Gly Gly
195 200 205
Thr Phe Tyr Ala Tyr Phe Thr Asp Thr Gly Val Val Thr Lys Phe Leu
210 215 220
Phe Asn Val Tyr Leu Gly Met Ala Leu Ser His Tyr Tyr Val Met Pro
225 230 235 240
Leu Thr Cys Asn Ser Lys Leu Thr Leu Glu Tyr Trp Val Thr Pro Leu
245 250 255
Thr Ser Arg Gln Tyr Leu Leu Ala Phe Asn Gln Asp Gly Ile Ile Phe
260 265 270
Asn Ala Glu Asp Cys Met Ser Asp Phe Met Ser Glu Ile Lys Cys Lys
275 280 285
Thr Gln Ser Ile Ala Pro Pro Thr Gly Val Tyr Glu Leu Asn Gly Tyr
290 295 300
Thr Val Gln Pro Ile Ala Asp Val Tyr Arg Arg Lys Pro Asn Leu Pro
305 310 315 320
Asn Cys Asn Ile Glu Ala Trp Leu Asn Asp Lys Ser Val Pro Ser Pro
325 330 335
Leu Asn Trp Glu Arg Lys Thr Phe Ser Asn Cys Asn Phe Asn Met Ser
340 345 350
Ser Leu Met Ser Phe Ile Gln Ala Asp Ser Phe Thr Cys Asn Asn Ile
355 360 365
Asp Ala Ala Lys Ile Tyr Gly Met Cys Phe Ser Ser Ile Thr Ile Asp
370 375 380
Lys Phe Ala Ile Pro Asn Gly Arg Lys Val Asp Leu Gln Leu Gly Asn
385 390 395 400
Leu Gly Tyr Leu Gln Ser Phe Asn Tyr Arg Ile Asp Thr Thr Ala Thr
405 410 415
Ser Cys Gln Leu Tyr Tyr Asn Leu Pro Ala Ala Asn Val Ser Val Ser
420 425 430
Arg Phe Asn Pro Ser Thr Trp Asn Lys Arg Phe Gly Phe Ile Glu Asp
435 440 445
Ser Val Phe Lys Pro Arg Pro Ala Gly Val Leu Thr Asn His Asp Val
450 455 460
Val Tyr Ala Gln His Cys Phe Lys Ala Pro Lys Asn Phe Cys Pro Cys
465 470 475 480
Lys Leu Asn Gly Ser Cys Val Gly Ser Gly Pro Gly Lys Asn Asn Gly
485 490 495
Ile Gly Thr Cys Pro Ala Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Cys Asp Asn Leu
500 505 510
Cys Thr Pro Asp Pro Ile Thr Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Cys Pro Gln
515 520 525
Thr Lys Ser Leu Val Gly Ile Gly Glu His Cys Ser Gly Leu Ala Val
530 535 540
Lys Ser Asp Tyr Cys Gly Gly Asn Ser Cys Thr Cys Arg Pro Gln Ala
545 550 555 560
Phe Leu Gly Trp Ser Ala Asp Ser Cys Leu Gln Gly Asp Lys Cys Asn
565 570 575
Ile Phe Ala Asn Phe Ile Leu His Asp Val Asn Ser Gly Leu Thr Cys
580 585 590
Ser Thr Asp Leu Gln Lys Ala Asn Thr Asp Ile Ile Leu Gly Val Cys
595 600 605
Val Asn Tyr Asp Leu Tyr Gly Ile Leu Gly Gln Gly Ile Phe Val Glu
610 615 620
Val Asn Ala Thr Tyr Tyr Asn Ser Trp Gln Asn Leu Leu Tyr Asp Ser
625 630 635 640
Asn Gly Asn Leu Tyr Gly Phe Arg Asp Tyr Ile Ile Asn Arg Thr Phe
645 650 655
Met Ile Arg Ser Cys Tyr Ser Gly Arg Val Ser Ala Ala Phe His Ala
660 665 670
Asn Ser Ser Glu Pro Ala Leu Leu Phe Arg Asn Ile Lys Cys Asn Tyr
675 680 685
Val Phe Asn Asn Ser Leu Thr Arg Gln Leu Gln Pro Ile Asn Tyr Phe
690 695 700
Asp Ser Tyr Leu Gly Cys Val Val Asn Ala Tyr Asn Ser Thr Ala Ile
705 710 715 720
Ser Val Gln Thr Cys Asp Leu Thr Val Gly Ser Gly Tyr Cys Val Asp
725 730 735
Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ser Arg Gly
740 745
<210> 9
<211> 744
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 [HCoV-HKU1]
<400> 9
Ala Val Ile Gly Asp Phe Asn Cys Thr Asn Ser Phe Ile Asn Asp Tyr
1 5 10 15
Asn Lys Thr Ile Pro Arg Ile Ser Glu Asp Val Val Asp Val Ser Leu
20 25 30
Gly Leu Gly Thr Tyr Tyr Val Leu Asn Arg Val Tyr Leu Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Leu Phe Thr Gly Tyr Phe Pro Lys Ser Gly Ala Asn Phe Arg Asp
50 55 60
Leu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Leu Trp Tyr Lys Pro
65 70 75 80
Pro Phe Leu Ser Asp Phe Asn Asn Gly Ile Phe Ser Lys Val Lys Asn
85 90 95
Thr Lys Leu Tyr Val Asn Asn Thr Leu Tyr Ser Glu Phe Ser Thr Ile
100 105 110
Val Ile Gly Ser Val Phe Val Asn Thr Ser Tyr Thr Ile Val Val Gln
115 120 125
Pro His Asn Gly Ile Leu Glu Ile Thr Ala Cys Gln Tyr Thr Met Cys
130 135 140
Glu Tyr Pro His Thr Val Cys Lys Ser Lys Gly Ser Ile Arg Asn Glu
145 150 155 160
Ser Trp His Ile Asp Ser Ser Glu Pro Leu Cys Leu Phe Lys Lys Asn
165 170 175
Phe Thr Tyr Asn Val Ser Ala Asp Trp Leu Tyr Phe His Phe Tyr Gln
180 185 190
Glu Arg Gly Val Phe Tyr Ala Tyr Tyr Ala Asp Val Gly Met Pro Thr
195 200 205
Thr Phe Leu Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Thr Ile Leu Ser His Tyr Tyr
210 215 220
Val Met Pro Leu Thr Cys Asn Ala Ile Ser Ser Asn Thr Asp Asn Glu
225 230 235 240
Thr Leu Glu Tyr Trp Val Thr Pro Leu Ser Arg Arg Gln Tyr Leu Leu
245 250 255
Asn Phe Asp Glu His Gly Val Ile Thr Asn Ala Val Asp Cys Ser Ser
260 265 270
Ser Phe Leu Ser Glu Ile Gln Cys Lys Thr Gln Ser Phe Ala Pro Asn
275 280 285
Thr Gly Val Tyr Asp Leu Ser Gly Phe Thr Val Lys Pro Val Ala Thr
290 295 300
Val Tyr Arg Arg Ile Pro Asn Leu Pro Asp Cys Asp Ile Asp Asn Trp
305 310 315 320
Leu Asn Asn Val Ser Val Pro Ser Pro Leu Asn Trp Glu Arg Arg Ile
325 330 335
Phe Ser Asn Cys Asn Phe Asn Leu Ser Thr Leu Leu Arg Leu Val His
340 345 350
Val Asp Ser Phe Ser Cys Asn Asn Leu Asp Lys Ser Lys Ile Phe Gly
355 360 365
Ser Cys Phe Asn Ser Ile Thr Val Asp Lys Phe Ala Ile Pro Asn Arg
370 375 380
Arg Arg Asp Asp Leu Gln Leu Gly Ser Ser Gly Phe Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Ile Asp Ile Ser Ser Ser Ser Cys Gln Leu Tyr Tyr Ser
405 410 415
Leu Pro Leu Val Asn Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Pro Ser Ser Trp
420 425 430
Asn Arg Arg Tyr Gly Phe Gly Ser Phe Asn Leu Ser Ser Tyr Asp Val
435 440 445
Val Tyr Ser Asp His Cys Phe Ser Val Asn Ser Asp Phe Cys Pro Cys
450 455 460
Ala Asp Pro Ser Val Val Asn Ser Cys Ala Lys Ser Lys Pro Pro Ser
465 470 475 480
Ala Ile Cys Pro Ala Gly Thr Lys Tyr Arg His Cys Asp Leu Asp Thr
485 490 495
Thr Leu Tyr Val Lys Asn Trp Cys Arg Cys Ser Cys Leu Pro Asp Pro
500 505 510
Ile Ser Thr Tyr Ser Pro Asn Thr Cys Pro Gln Lys Lys Val Val Val
515 520 525
Gly Ile Gly Glu His Cys Pro Gly Leu Gly Ile Asn Glu Glu Lys Cys
530 535 540
Gly Thr Gln Leu Asn His Ser Ser Cys Phe Cys Ser Pro Asp Ala Phe
545 550 555 560
Leu Gly Trp Ser Phe Asp Ser Cys Ile Ser Asn Asn Arg Cys Asn Ile
565 570 575
Phe Ser Asn Phe Ile Phe Asn Gly Ile Asn Ser Gly Thr Thr Cys Ser
580 585 590
Asn Asp Leu Leu Tyr Ser Asn Thr Glu Ile Ser Thr Gly Val Cys Val
595 600 605
Asn Tyr Asp Leu Tyr Gly Ile Thr Gly Gln Gly Ile Phe Lys Glu Val
610 615 620
Ser Ala Ala Tyr Tyr Asn Asn Trp Gln Asn Leu Leu Tyr Asp Ser Asn
625 630 635 640
Gly Asn Ile Ile Gly Phe Lys Asp Phe Leu Thr Asn Lys Thr Tyr Thr
645 650 655
Ile Leu Pro Cys Tyr Ser Gly Arg Val Ser Ala Ala Phe Tyr Gln Asn
660 665 670
Ser Ser Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Arg Asn Leu Lys Cys Ser Tyr Val
675 680 685
Leu Asn Asn Ile Ser Phe Ile Ser Gln Pro Phe Tyr Phe Asp Ser Tyr
690 695 700
Leu Gly Cys Val Leu Asn Ala Val Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Val Ser
705 710 715 720
Ser Cys Asp Leu Arg Met Gly Ser Gly Phe Cys Ile Asp Tyr Ala Leu
725 730 735
Pro Ser Ser Arg Arg Lys Arg Arg
740
<210> 10
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 [HCoV-NL63]
<400> 10
Phe Phe Thr Cys Asn Ser Asn Ala Asn Leu Ser Met Leu Gln Leu Gly
1 5 10 15
Val Pro Asp Asn Ser Ser Thr Ile Val Thr Gly Leu Leu Pro Thr His
20 25 30
Trp Phe Cys Ala Asn Gln Ser Thr Ser Val Tyr Ser Ala Asn Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Ile Asp Val Gly Asn His Arg Ser Ala Phe Ala Leu His Thr
50 55 60
Gly Tyr Tyr Asp Ala Asn Gln Tyr Tyr Ile Tyr Val Thr Asn Glu Ile
65 70 75 80
Gly Leu Asn Ala Ser Val Thr Leu Lys Ile Cys Lys Phe Ser Arg Asn
85 90 95
Thr Thr Phe Asp Phe Leu Ser Asn Ala Ser Ser Ser Phe Asp Cys Ile
100 105 110
Val Asn Leu Leu Phe Thr Glu Gln Leu Gly Ala Pro Leu Gly Ile Thr
115 120 125
Ile Ser Gly Glu Thr Val Arg Leu His Leu Tyr Asn Val Thr Arg Thr
130 135 140
Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Lys Leu Thr Lys Leu Ser Val Lys Cys
145 150 155 160
Tyr Phe Asn Tyr Ser Cys Val Phe Ser Val Val Asn Ala Thr Val Thr
165 170 175
Val Asn Val Thr Thr His Asn Gly Arg Val Val Asn Tyr Thr Val Cys
180 185 190
Asp Asp Cys Asn Gly Tyr Thr Asp Asn Ile Phe Ser Val Gln Gln Asp
195 200 205
Gly Arg Ile Pro Asn Gly Phe Pro Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Thr
210 215 220
Asn Gly Ser Thr Leu Val Asp Gly Val Ser Arg Leu Tyr Gln Pro Leu
225 230 235 240
Arg Leu Thr Cys Leu Trp Pro Val Pro Gly Leu Lys Ser Ser Thr Gly
245 250 255
Phe Val Tyr Phe Asn Ala Thr Gly Ser Asp Val Asn Cys Asn Gly Tyr
260 265 270
Gln His Asn Ser Val Val Asp Val Met Arg Tyr Asn Leu Asn Phe Ser
275 280 285
Ala Asn Ser Leu Asp Asn Leu Lys Ser Gly Val Ile Val Phe Lys Thr
290 295 300
Leu Gln Tyr Asp Val Leu Phe Tyr Cys Ser Asn Ser Ser Ser Gly Val
305 310 315 320
Leu Asp Thr Thr Ile Pro Phe Gly Pro Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Cys
325 330 335
Phe Ile Asn Ser Thr Ile Asn Thr Thr His Val Ser Thr Phe Val Gly
340 345 350
Ile Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Val Ala Arg Thr Gly Gln
355 360 365
Phe Tyr Ile Asn Gly Phe Lys Tyr Phe Asp Leu Gly Phe Ile Glu Ala
370 375 380
Val Asn Phe Asn Val Thr Thr Ala Ser Ala Thr Asp Phe Trp Thr Val
385 390 395 400
Ala Phe Ala Thr Phe Val Asp Val Leu Val Asn Val Ser Ala Thr Asn
405 410 415
Ile Gln Asn Leu Leu Tyr Cys Asp Ser Pro Phe Glu Lys Leu Gln Cys
420 425 430
Glu His Leu Gln Phe Gly Leu Gln Asp Gly Phe Tyr Ser Ala Asn Phe
435 440 445
Leu Asp Asp Asn Val Leu Pro Glu Thr Tyr Val Ala Leu Pro Ile Tyr
450 455 460
Tyr Gln His Thr Asp Ile Asn Phe Thr Ala Thr Ala Ser Phe Gly Gly
465 470 475 480
Ser Cys Tyr Val Cys Lys Pro His Gln Val Asn Ile Ser Leu Asn Gly
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gaacaggaag agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc 22680
attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac 22740
taatgtctat gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg 22800
gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt 22860
tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta 22920
tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta 22980
tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca 23040
atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact 23100
ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt 23160
ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac 23220
tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac 23280
tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat gttcttttgg 23340
tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca 23400
ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg 23460
gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc 23520
tgaacatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag 23580
ttatcagact cagactaatt ctcctcggcg ggcacgtagt gtagctagtc aatccatcat 23640
tgcctacact atgtcacttg gtgcagaaaa ttcagttgct tactctaata actctattgc 23700
catacccaca aattttacta ttagtgttac cacagaaatt ctaccagtgt ctatgaccaa 23760
gacatcagta gattgtacaa tgtacatttg tggtgattca actgaatgca gcaatctttt 23820
gttgcaatat ggcagttttt gtacacaatt aaaccgtgct ttaactggaa tagctgttga 23880
acaagacaaa aacacccaag aagtttttgc acaagtcaaa caaatttaca aaacaccacc 23940
aattaaagat tttggtggtt ttaatttttc acaaatatta ccagatccat caaaaccaag 24000
caagaggtca tttattgaag atctactttt caacaaagtg acacttgcag atgctggctt 24060
catcaaacaa tatggtgatt gccttggtga tattgctgct agagacctca tttgtgcaca 24120
aaagtttaac ggccttactg ttttgccacc tttgctcaca gatgaaatga ttgctcaata 24180
cacttctgca ctgttagcgg gtacaatcac ttctggttgg acctttggtg caggtgctgc 24240
attacaaata ccatttgcta tgcaaatggc ttataggttt aatggtattg gagttacaca 24300
gaatgttctc tatgagaacc aaaaattgat tgccaaccaa tttaatagtg ctattggcaa 24360
aattcaagac tcactttctt ccacagcaag tgcacttgga aaacttcaag atgtggtcaa 24420
ccaaaatgca caagctttaa acacgcttgt taaacaactt agctccaatt ttggtgcaat 24480
ttcaagtgtt ttaaatgata tcctttcacg tcttgacaaa gttgaggctg aagtgcaaat 24540
tgataggttg atcacaggca gacttcaaag tttgcagaca tatgtgactc aacaattaat 24600
tagagctgca gaaatcagag cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt cagagtgtgt 24660
acttggacaa tcaaaaagag ttgatttttg tggaaagggc tatcatctta tgtccttccc 24720
tcagtcagca cctcatggtg tagtcttctt gcatgtgact tatgtccctg cacaagaaaa 24780
gaacttcaca actgctcctg ccatttgtca tgatggaaaa gcacactttc ctcgtgaagg 24840
tgtctttgtt tcaaatggca cacactggtt tgtaacacaa aggaattttt atgaaccaca 24900
aatcattact acagacaaca catttgtgtc tggtaactgt gatgttgtaa taggaattgt 24960
caacaacaca gtttatgatc ctttgcaacc tgaattagac tcattcaagg aggagttaga 25020
taaatatttt aagaatcata catcaccaga tgttgattta ggtgacatct ctggcattaa 25080
tgcttcagtt gtaaacattc aaaaagaaat tgaccgcctc aatgaggttg ccaagaattt 25140
aaatgaatct ctcatcgatc tccaagaact tggaaagtat gagcagtata taaaatggcc 25200
atggtacatt tggctaggtt ttatagctgg cttgattgcc atagtaatgg tgacaattat 25260
gctttgctgt atgaccagtt gctgtagttg tctcaagggc tgttgttctt gtggatcctg 25320
ctgcaaattt gatgaagacg actctgagcc agtgctcaaa ggagtcaaat tacattacac 25380
ataaacgaac ttatggattt gtttatgaga atcttcacaa ttggaactgt aactttgaag 25440
caaggtgaaa tcaaggatgc tactccttca gattttgttc gcgctactgc aacgataccg 25500
atacaagcct cactcccttt cggatggctt attgttggcg ttgcacttct tgctgttttt 25560
cagagcgctt ccaaaatcat aaccctcaaa aagagatggc aactagcact ctccaagggt 25620
gttcactttg tttgcaactt gctgttgttg tttgtaacag tttactcaca ccttttgctc 25680
gttgctgctg gccttgaagc cccttttctc tatctttatg ctttagtcta cttcttgcag 25740
agtataaact ttgtaagaat aataatgagg ctttggcttt gctggaaatg ccgttccaaa 25800
aacccattac tttatgatgc caactatttt ctttgctggc atactaattg ttacgactat 25860
tgtatacctt acaatagtgt aacttcttca attgtcatta cttcaggtga tggcacaaca 25920
agtcctattt ctgaacatga ctaccagatt ggtggttata ctgaaaaatg ggaatctgga 25980
gtaaaagact gtgttgtatt acacagttac ttcacttcag actattacca gctgtactca 26040
actcaattga gtacagacac tggtgttgaa catgttacct tcttcatcta caataaaatt 26100
gttgatgagc ctgaagaaca tgtccaaatt cacacaatcg acggttcatc cggagttgtt 26160
aatccagtaa tggaaccaat ttatgatgaa ccgacgacga ctactagcgt gcctttgtaa 26220
gcacaagctg atgagtacga acttatgtac tcattcgttt cggaagagac aggtacgtta 26280
atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat tcttgctagt tacactagcc 26340
atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata ttgttaacgt gagtcttgta 26400
aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt aaaaatctga attcttctag agttcctgat 26460
cttctggtct aaacgaacta aatattatat tagtttttct gtttggaact ttaattttag 26520
ccatggcaga ttccaacggt actattaccg ttgaagagct taaaaagctc cttgaacaat 26580
ggaacctagt aataggtttc ctattcctta catggatttg tcttctacaa tttgcctatg 26640
ccaacaggaa taggtttttg tatataatta agttaatttt cctctggctg ttatggccag 26700
taactttagc ttgttttgtg cttgctgctg tttacagaat aaattggatc accggtggaa 26760
ttgctatcgc aatggcttgt cttgtaggct tgatgtggct cagctacttc attgcttctt 26820
tcagactgtt tgcgcgtacg cgttccatgt ggtcattcaa tccagaaact aacattcttc 26880
tcaacgtgcc actccatggc actattctga ccagaccgct tctagaaagt gaactcgtaa 26940
tcggagctgt gatccttcgt ggacatcttc gtattgctgg acaccatcta ggacgctgtg 27000
acatcaagga cctgcctaaa gaaatcactg ttgctacatc acgaacgctt tcttattaca 27060
aattgggagc ttcgcagcgt gtagcaggtg actcaggttt tgctgcatac agtcgctaca 27120
ggattggcaa ctataaatta aacacagacc attccagtag cagtgacaat attgctttgc 27180
ttgtacagta agtgacaaca gatgtttcat ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag 27240
atattactaa ttattatgag gacttttaaa gtttccattt ggaatcttga ttacatcata 27300
aacctcataa ttaaaaattt atctaagtca ctaactgaga ataaatattc tcaattagat 27360
gaagagcaac caatggagat tgattaaacg aacatgaaaa ttattctttt cttggcactg 27420
ataacactcg ctacttgtga gctttatcac taccaagagt gtgttagagg tacaacagta 27480
cttttaaaag aaccttgctc ttctggaaca tacgagggca attcaccatt tcatcctcta 27540
gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac 27600
ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga 27660
caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt 27720
ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact 27780
tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt 27840
ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat 27900
ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac 27960
agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt 28020
ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg 28080
atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct 28140
gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt 28200
cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa 28260
cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac 28320
gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg 28380
atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct 28440
cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac 28500
caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg 28560
tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg 28620
gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga 28680
gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc 28740
aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag 28800
cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa 28860
ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga 28920
tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg 28980
taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa 29040
gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag 29100
acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac 29160
tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg 29220
aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc 29280
catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca 29340
tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc 29400
tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc 29460
tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc 29520
aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc 29580
ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc 29640
acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta 29700
gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt 29760
acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820
tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 29903
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的30-44
<400> 14
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe
1 5 10 15
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的48-68
<400> 15
Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg
1 5 10 15
Phe Asp Asn Pro Val
20
<210> 16
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的110-166
<400> 16
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
1 5 10 15
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
20 25 30
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
35 40 45
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly
50 55
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的200-214
<400> 17
Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu
1 5 10 15
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的226-250
<400> 18
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr
20 25
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的256-277
<400> 19
Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr
1 5 10 15
Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro
20 25
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的328-342
<400> 20
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的399-414
<400> 21
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的434-448
<400> 22
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
1 5 10 15
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的550-572
<400> 23
Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln
1 5 10 15
Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile
20
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的590-604
<400> 24
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu
1 5 10 15
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的632-650
<400> 25
Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys
1 5 10 15
Asp Ile Pro
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的354-368
<400> 26
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的622-636
<400> 27
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的30-44
<400> 28
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe
1 5 10 15
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1的226-250
<400> 29
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr
20 25
<210> 30
<211> 419
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 30
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 31
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD，来自SARS-CoV-2 S蛋白的S1结构域的片段
<400> 31
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 32
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD，来自SARS-CoV-2 S蛋白的S1结构域的片段，具有C-末端His标签
<400> 32
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Leu
210 215 220
Glu His His His His His His His His
225 230
<210> 33
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自SARS-CoV-2 S蛋白的S2结构域
<400> 33
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn
20 25 30
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys
35 40 45
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
50 55 60
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
65 70 75 80
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
100 105 110
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
115 120 125
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
130 135 140
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
165 170 175
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
210 215 220
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
225 230 235 240
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
245 250 255
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
260 265 270
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
275 280 285
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
290 295 300
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
325 330 335
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
340 345 350
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
355 360 365
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
370 375 380
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
385 390 395 400
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
405 410 415
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
420 425 430
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
435 440 445
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
450 455 460
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
465 470 475 480
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
485 490 495
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
500 505 510
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
515 520 525
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met
530 535 540
Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys
545 550 555 560
Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser
565 570 575
Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
580 585
<210> 34
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中使用的RBD
<400> 34
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gly Pro Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
20 25 30
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
35 40 45
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
50 55 60
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
65 70 75 80
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
85 90 95
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
100 105 110
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
115 120 125
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
130 135 140
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
145 150 155 160
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
165 170 175
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
180 185 190
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
195 200 205
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
210 215 220
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
225 230 235 240
Lys Cys Val Asn Phe Leu Glu His His His His His His His His
245 250 255
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 35
Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 36
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 37
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
1 5 10
<210> 38
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标记的RBD
<400> 38
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gly Pro Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
20 25 30
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
35 40 45
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
50 55 60
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
65 70 75 80
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
85 90 95
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
100 105 110
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
115 120 125
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
130 135 140
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
145 150 155 160
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
165 170 175
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
180 185 190
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
195 200 205
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
210 215 220
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
225 230 235 240
Lys Cys Val Asn Phe Leu Glu His His His His His His His His
245 250 255
<210> 39
<211> 805
<212> PRT
<213> Homo sapiens（智人）
<400> 39
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val
740 745 750
Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg
755 760 765
Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile
770 775 780
Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp
785 790 795 800
Val Gln Thr Ser Phe
805
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 40
Arg Thr Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 41
Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 42
Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 43
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 43
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala
115 120 125
Tyr Thr Asn Ser Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
130 135 140
<210> 44
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 44
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Met Ser His His His His His
115 120 125
His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg
130 135 140
Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly
145 150 155 160
Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu
165 170 175
Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr Asn His Met
180 185 190
Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu
195 200 205
Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln
210 215 220
Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly
225 230 235 240
Arg Met Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Ser Gly Thr
245 250 255
Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
260
<210> 45
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 45
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
115 120 125
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp
130 135 140
Thr Ala Gly
145
<210> 46
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 46
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135
<210> 47
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 47
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
115 120 125
Cys Asn Gly Val Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
130 135 140
<210> 48
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 48
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn
115 120 125
Gly Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
130 135 140
Gln
145
<210> 49
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽，P1-P6
<400> 49
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala
115 120 125
Tyr Thr Asn Ser Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Leu
130 135 140
Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Asn Asn Leu Asp
145 150 155 160
Ser Lys Val Gly Gly Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
180 185
<210> 50
<211> 773
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ACE2的C-末端His标记的细胞外结构域
<400> 50
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser His His His His
740 745 750
His His His His Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
755 760 765
Ile Glu Trp His Glu
770
<210> 51
<211> 648
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有SARS-CoV-2英国变体B.1.1.7的突变的SEQ ID NO：1
<400> 51
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
50 55 60
Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys
85 90 95
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
100 105 110
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
115 120 125
His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser
130 135 140
Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met
145 150 155 160
Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val
165 170 175
Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro
180 185 190
Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro
195 200 205
Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu
210 215 220
Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly
225 230 235 240
Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val
260 265 270
Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser
275 280 285
Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
290 295 300
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
305 310 315 320
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
325 330 335
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
340 345 350
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
355 360 365
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
370 375 380
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
385 390 395 400
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
405 410 415
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
420 425 430
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
435 440 445
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
450 455 460
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
465 470 475 480
Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
485 490 495
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
500 505 510
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
515 520 525
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
530 535 540
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
545 550 555 560
Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly
565 570 575
Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala
580 585 590
Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His
595 600 605
Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn
610 615 620
Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn
625 630 635 640
Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile His
645
<210> 52
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有SARS-CoV-2南非变体B.1.351的突变的SEQ ID NO：1
<400> 52
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro
645 650
<210> 53
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有SARS-CoV-2巴西变体P.1的突变的SEQ ID NO：1
<400> 53
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro
645 650
<210> 54
<211> 648
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有来自丹麦的SARS-CoV-2水貂变体的突变的SEQ ID NO：1
<400> 54
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
50 55 60
Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys
85 90 95
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
100 105 110
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
115 120 125
His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser
130 135 140
Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met
145 150 155 160
Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val
165 170 175
Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro
180 185 190
Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro
195 200 205
Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu
210 215 220
Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly
225 230 235 240
Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val
260 265 270
Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser
275 280 285
Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
290 295 300
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
305 310 315 320
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
325 330 335
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
340 345 350
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
355 360 365
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
370 375 380
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
385 390 395 400
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
405 410 415
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
420 425 430
Asn Tyr Leu Phe Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
435 440 445
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
450 455 460
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
465 470 475 480
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
485 490 495
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
500 505 510
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
515 520 525
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
530 535 540
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
545 550 555 560
Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly
565 570 575
Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala
580 585 590
Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His
595 600 605
Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn
610 615 620
Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn
625 630 635 640
Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro
645
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽
<400> 55
Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
1 5
<210> 56
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有GST融合体的与SARS-CoV-2抗体具有反应性的SEQ ID NO：1衍生的肽，P1-P6
<400> 56
Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Ser Gly Thr Asn Gly
1 5 10 15
Thr Lys Arg Phe Asp Asn Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp
20 25 30
Thr Ala Gly Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Tyr Gln Ala Gly
35 40 45
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
50 55 60
Gly Tyr Gln
65

Claims (15)

1.一种用于诊断SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括以下步骤：检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体优选IgA类抗体的存在或不存在。
2.一种用于冠状病毒感染的鉴别诊断的方法，优选用于区分SARS-CoV；优选SARS-CoV-2；MERS、NL63、229E、OC43和HKU1感染的方法，其包括以下步骤：检测来自受试者的样品中针对SEQ ID NO：1的抗体、优选IgA和/或IgG类抗体、更优选IgA类抗体的存在或不存在。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中除了检测针对SEQ ID NO：1的IgA类抗体之外，还检测针对SEQ ID NO：1的IgG和/或IgM类抗体的存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品，优选地选自包含以下的组：全血、血清或血浆。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中使用标记的第二抗体检测针对SEQ IDNO：1的IgA类抗体，所述第二抗体优选结合IgA类抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中使用选自包含比色法、免疫荧光、酶活性检测、化学发光和放射活性的组的方法检测IgA抗体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在早期阶段检测到感染。
8.针对SEQ ID NO：1的抗体、优选IgA类抗体用于诊断SARS-CoV-2感染或用于鉴别诊断冠状病毒感染的用途，优选用于区分SARS-CoV、优选SARS-CoV-2、MERS和NL63、229E、OC43和HKU1感染。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述用途用于SARS-CoV-2感染的早期诊断。
10.一种试剂盒，其包含含有SEQ ID NO：1或其变体的多肽，所述多肽优选包被在诊断上有用的承载体上，以及选自包含以下的组的一种或多种、优选所有试剂：针对SEQ ID NO：1的抗体；洗涤缓冲液；用于检测针对SEQ ID NO：1的抗体的存在的工具，所述抗体优选为IgA类抗体；优选与IgA类抗体特异性结合的第二抗体，所述第二抗体优选包含可检测标记；和稀释缓冲液。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述诊断上有用的承载体选自包含以下的组：珠子，优选顺磁性珠子，测试条，微量滴定板，膜，优选选自包含蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹的组，侧向流动装置，玻璃表面，载玻片，微阵列和生物芯片，并且优选为微量滴定板。
12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含两个或更多个、优选三个或更多个校准物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中每个校准物是与SEQ ID NO：1结合的重组抗体，所述重组抗体优选被结合IgA类抗体的第二抗体识别。
14.包含SEQ ID NO：1或其变体的多肽或针对SEQ ID NO：1的抗体优选IgA类抗体在制备诊断试剂盒中的用途。
15.结合SEQ ID NO：1的重组抗体作为校准物用于SARS-CoV-2感染的早期诊断的用途，所述重组抗体优选被结合IgA类抗体的第二抗体识别。
CN202180001126.9A 2020-02-19 2021-02-19 诊断SARS-CoV-2感染的方法和试剂 Pending CN113557431A (zh)

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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112028978A (zh) * 2020-09-07 2020-12-04 重庆医科大学 新冠病毒特异性cd8+t细胞表位肽及其应用
CN113087777A (zh) * 2020-04-17 2021-07-09 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及用该蛋白制备的疫苗
CN114057846A (zh) * 2020-08-07 2022-02-18 清华大学 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114075553A (zh) * 2021-10-30 2022-02-22 西北工业大学 一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法
CN114262694A (zh) * 2021-12-06 2022-04-01 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
CN114315990A (zh) * 2022-03-10 2022-04-12 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 新型冠状病毒特异性单克隆抗体的制备及其应用
CN114774412A (zh) * 2022-03-15 2022-07-22 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 新冠病毒vmiRNA前体序列、新冠病毒vmiRNA及应用
CN117144063A (zh) * 2023-09-15 2023-12-01 果然基因科技(山东)股份有限公司 一种12种呼吸道病原体荧光pcr熔解曲线试剂盒

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112300251B (zh) * 2020-02-24 2022-04-05 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗
US11644456B2 (en) * 2020-04-28 2023-05-09 Brandon Heeger Rapid testing mechanism and method for respiratory viral pathogens
IT202000009625A1 (it) * 2020-04-30 2021-10-30 Takis S R L Polinucleotidi codificanti antigeni di sars-cov-2 e relativo uso in campo medico come vaccini.
GB202006815D0 (en) * 2020-05-07 2020-06-24 Senseutics Ltd Method
WO2021222988A1 (en) * 2020-05-07 2021-11-11 Griffith University Cell entry-modulating agents and uses therefor
WO2022020234A2 (en) * 2020-07-20 2022-01-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Immunoassay for sars-cov-2 neutralizing antibodies and materials therefor
US20220139567A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 The Boeing Company Methods for modeling infectious disease test performance as a function of specific, individual disease timelines
JP6976621B1 (ja) * 2021-02-04 2021-12-08 株式会社Icst 検査器具、検査キットおよび検査方法
WO2022231320A1 (ko) * 2021-04-27 2022-11-03 국민대학교산학협력단 Sars-cov-2 s 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도
KR102426782B1 (ko) * 2021-04-27 2022-07-28 국민대학교산학협력단 SARS-CoV-2 RBD 항원 특이적 항체를 포함하는 진단용 조성물 또는 키트
CN113046370B (zh) * 2021-05-31 2021-09-07 北京华芢生物技术有限公司 新型冠状病毒b．1．1．7英国突变株rbd的基因及其应用
WO2022253260A1 (zh) * 2021-06-01 2022-12-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 新型冠状病毒及其突变株中和抗体的检测试剂盒
GB202110391D0 (en) 2021-07-19 2021-09-01 Tissue Click Ltd A detection kit and methods of detection of infectious agents
KR20230038626A (ko) * 2021-09-06 2023-03-21 국민대학교산학협력단 SARS-CoV-2에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
KR102602561B1 (ko) * 2021-09-16 2023-11-17 한국공학대학교산학협력단 2019 신종 코로나바이러스 중화항체 검출용 측면유동분석 기반의 바이오센서
CN113801963B (zh) * 2021-09-17 2024-03-26 佛山科学技术学院 一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法
CN113929773B (zh) * 2021-10-08 2023-02-28 国际遗传工程和生物技术中心泰州区域研究中心 一种抗SARS-CoV-2 S1-RBD单克隆抗体及其应用
WO2023064631A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Engineering antigen binding to, and orientation on, adjuvants for enhanced humoral responses and immunofocusing
CN114014940B (zh) * 2021-11-25 2022-11-15 华兰基因工程有限公司 一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法
CN114814216B (zh) * 2022-06-30 2022-10-18 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法
WO2024029523A1 (ja) * 2022-08-02 2024-02-08 応用酵素医学研究所株式会社 コロナウイルス感染症の評価項目を判断するための情報を提供する方法
CN115951051B (zh) * 2022-10-18 2024-01-12 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 一种高灵敏度新型冠状病毒抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004109289A1 (en) * 2003-06-10 2004-12-16 Agency For Science, Technology And Research Method of diagnosing sars corona virus infection
CN1609617A (zh) * 2003-09-29 2005-04-27 香港中文大学 诊断与预防严重急性呼吸道综合症（sars）的组合物和方法
WO2005118813A2 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Institut Pasteur Nucleic acids, polypeptides, methods of expression, and immunogenic compositions associated with sars corona virus spike protein
US20060188519A1 (en) * 2004-06-14 2006-08-24 To Cheung Peptides, antibodies, and methods for the diagnosis of SARS
CN101039955A (zh) * 2004-06-04 2007-09-19 巴斯德研究院 与sars冠状病毒刺突蛋白相关的核酸、多肽、表达方法和免疫原性组合物

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US7491397B2 (en) * 2004-01-09 2009-02-17 National Health Research Institutes Receptor binding polypeptides
GB0725239D0 (en) 2007-12-24 2008-02-06 Oncimmune Ltd Calibrator for autoantibody assay
DE202011106093U1 (de) 2011-09-24 2011-10-19 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Kalibrationsstreifen für einen Immunoblot
SG11201502189UA (en) 2012-09-23 2015-04-29 Univ Erasmus Medical Ct Human betacoronavirus lineage c and identification of n-terminal dipeptidyl peptidase as its virus receptor
CN113624977A (zh) * 2020-05-09 2021-11-09 中国科学技术大学 SARS-CoV-2感染诊断方法
CN111518175B (zh) * 2020-05-11 2021-02-26 广东珩达生物医药科技有限公司 Sars-cov-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用
EP4105228A4 (en) * 2020-05-11 2023-10-11 Hengda Biomedical Technology Co., Ltd. ANTIGENIC POLYPEPTIDE OF SARS-COV-2, RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS THEREOF, AND USE IN VACCINE PREPARATION

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004109289A1 (en) * 2003-06-10 2004-12-16 Agency For Science, Technology And Research Method of diagnosing sars corona virus infection
CN1609617A (zh) * 2003-09-29 2005-04-27 香港中文大学 诊断与预防严重急性呼吸道综合症（sars）的组合物和方法
WO2005118813A2 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Institut Pasteur Nucleic acids, polypeptides, methods of expression, and immunogenic compositions associated with sars corona virus spike protein
CN101039955A (zh) * 2004-06-04 2007-09-19 巴斯德研究院 与sars冠状病毒刺突蛋白相关的核酸、多肽、表达方法和免疫原性组合物
US20060188519A1 (en) * 2004-06-14 2006-08-24 To Cheung Peptides, antibodies, and methods for the diagnosis of SARS

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIBO JIANG ET AL: "An emerging coronavirus causing pneumonia outbreak in Wuhan, China: calling for developing therapeutic and prophylactic strategies", 《EMERGING MICROBES & INFECTIONS》, vol. 9, no. 1, pages 275 - 277, XP055785642, DOI: 10.1080/22221751.2020.1723441 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113087777A (zh) * 2020-04-17 2021-07-09 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及用该蛋白制备的疫苗
CN114057846A (zh) * 2020-08-07 2022-02-18 清华大学 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057846B (zh) * 2020-08-07 2024-04-02 清华大学 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN112028978B (zh) * 2020-09-07 2023-06-16 重庆医科大学 新冠病毒特异性cd8+t细胞表位肽及其应用
CN112028978A (zh) * 2020-09-07 2020-12-04 重庆医科大学 新冠病毒特异性cd8+t细胞表位肽及其应用
CN114075553B (zh) * 2021-10-30 2023-10-03 西北工业大学 一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法
CN114075553A (zh) * 2021-10-30 2022-02-22 西北工业大学 一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法
CN114262694A (zh) * 2021-12-06 2022-04-01 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 以b型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
CN114262694B (zh) * 2021-12-06 2023-11-03 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 以B型流感病毒为载体的SARS-CoV-2疫苗候选株及其构建方法和应用
CN114315990B (zh) * 2022-03-10 2022-05-27 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 新型冠状病毒特异性单克隆抗体的制备及其应用
CN114315990A (zh) * 2022-03-10 2022-04-12 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 新型冠状病毒特异性单克隆抗体的制备及其应用
CN114774412A (zh) * 2022-03-15 2022-07-22 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 新冠病毒vmiRNA前体序列、新冠病毒vmiRNA及应用
CN117144063A (zh) * 2023-09-15 2023-12-01 果然基因科技(山东)股份有限公司 一种12种呼吸道病原体荧光pcr熔解曲线试剂盒
CN117144063B (zh) * 2023-09-15 2024-04-19 果然基因科技(山东)股份有限公司 一种12种呼吸道病原体荧光pcr熔解曲线试剂盒

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