WO2024029523A1 - コロナウイルス感染症の評価項目を判断するための情報を提供する方法 - Google Patents

Abstract

コロナウイルス感染症用ワクチン接種の必要性の判定、感染で重症化するハイリスク者の同定、コロナウイルス感染症罹患者の予後予測、コロナウイルス感染症の集団免疫の達成度の評価、コロナウイルス感染症用ワクチンの有効性の評価等の評価項目を判断するための情報を提供することを課題とする。　対象由来の試料中のコロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の抗体価と、抗原結合親和性抗体価とをプロットしたグラフにおいて、抗体の抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値をＹ軸と平行に記載し、抗原結合親和性抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値をＸ軸と平行に記載した四つの領域に分割されたグラフに基づき評価項目を判断するための情報を提供することができることを確認した。

Description

コロナウイルス感染症の評価項目を判断するための情報を提供する方法

　本発明は、コロナウイルス感染症の評価項目を判断するための情報を提供する方法に関し、より詳細には、抗体価と、抗原結合親和性抗体価とを指標として、コロナウイルス感染症の１又は２以上の評価項目を判断するための情報を提供する方法に関する。

　いわゆる新型コロナウイルス（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を主因とする感染症ＣＯＶＩＤ－１９（「コロナウイルス病２０１９」ともいう）の世界的蔓延に伴い、感染を予防し、重症化を防ぐためのワクチンの開発、そして接種は、各国において進んでいるが、実際に接種されるワクチンの有効性評価、及び、摂取された対象の感染予防に関する判断基準については確定したとは言い難い状況にある。例えば、接種後に測定された抗体価が高いワクチン接種者であっても再感染する場合があることが報告されている。

　従来、ワクチンの有効性を数値により評価する方法としては、ワクチン接種者の血液中に誘導される病原体抗原を特異的に認識する抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ等）の「量」を測定することにより、「抗体量（価）」として評価することが行われてきた。

　具体的には、体内で産生される抗体の感染防御評価はウイルス中和活性（例えば、非特許文献１参照）による評価が一般的に行われている。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが病原体として細胞内に侵入する際に特異的に結合するウイルスレセプターのＡＣＥ－２（Angiotensin-converting enzyme 2）（例えば非特許文献２参照）を発現している細胞に、病原体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（又は、疑似ウイルス）と抗ウイルス抗体を含有する検体を様々な濃度に調製して添加し、細胞にウイルス感染を起こさせてから、細胞培養を実施し、ウイルスの細胞内侵入によって生じる細胞障害の程度の強さをＩＣ５０値で表示する方法や、各種標識ウイルスを用いてウイルスの細胞内侵入を短時間・高感度にモニターする等のウイルス中和活性測定法が知られている。あるいはヒトへの感染性のあるウイルスを使用することなく、感染過程で作用する因子を取り出して模擬感染システムを作成し、感染抑制の程度を調査してこれをウイルス中和活性測定に代える方法がある。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染で作用する因子としての、細胞側レセプタータンパク質のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＣＥ２とウイルス側タンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１間の結合を、様々な濃度に希釈調製した抗ウイルス抗体を含む検体で阻害する反応をモニターしてＩＣ５０値で表示する測定キット（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）（非特許文献３参照）が、ウイルス中和活性測定法に代わる方法として市販されている。

　したがって、多数の者が感染する状況が長期間継続する場合、ワクチンの複数回接種を推奨するとともに、個々人においても自分の感染しやすさを把握するより優れた指標が必要である。また、新型コロナウイルス自体の症状が治まった後においても、嗅覚障害や頭痛等特異的症状が長期間持続する場合も多いことも問題として挙げられている。しかし、現時点では、感染防御の点において、ワクチン接種の必要性の判断基準やワクチン接種と予後との関係等について十分な知見があるとはいえない。

Muruato AE, Fontes-Garfias CR, Ren P, Garcia-Blanco MA, Menachery VD, Xie X, Shi P-Y., Nat Commun. 2020;11:4059. Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Kruger N, Herrler T, Erichsen S, Schiergens TS, Herrler G, Wu N-H, Nitsche A, Muller MA, Drosten C,Pohlmann S., Cell. 2020;181:271-280. www.bpsbioscience.com, ACE2: Spike S1 RBD(SARS-CoV-2) Inhibitor Screening Assay Kit. 新型コロナウイルス感染症ＣＯＶＩＤ－１９診療の手引き第５版https://www.ajha.or.jp/topics/admininfo/pdf/2020/200519_1.pdf

　上述のとおり、従来、ワクチンの有効性を数値により評価する際には、主として抗原を特異的に認識する抗体の量（抗体価）によって行われてきた。感染症領域における現行の抗体価の測定は、抗体分子の定常部（Ｃ領域)を認識する２次抗体を用いて抗体分子の「量」のみを測定する方法であって、抗体価の多寡がワクチンの感染防御性の優劣と必ずしも結び付くわけではないということが経験的に明らかになっていた。

　本発明の課題は、コロナウイルス感染症用ワクチン接種の必要性の判定、感染で重症化するハイリスク者の同定、コロナウイルス感染症罹患者の予後予測、コロナウイルス感染症の集団免疫の達成度の評価、コロナウイルス感染症用ワクチンの有効性の評価等の評価項目を判断するための情報を提供する方法を提供することにある。

　抗体分子の可変部（Ｖ領域）の抗原結合部位のアミノ酸配列は、体細胞高頻度突然変異(Somatic hypermutation)によって変化しうるのであって、ある時期に低抗原結合親和性抗体である抗体が、抗原暴露回数の増加に伴って高抗原結合親和性抗体に置き換わることもあり、個々のワクチン接種者毎に相違する抗体の抗原結合親和性の成熟（Affinity maturation）が起こるのであるが、ワクチンの有効性の評価において、その点について考慮されてこなかった。そのため、本発明者らは、抗体価に加え、抗体の抗原に対する結合親和性を表すＩＣ５０値等、他のパラメーターを使用することにより、ワクチン接種者の感染のしやすさや病態や予後の予測等を行うことができないかということについて検討をしてきたが、対象由来の試料中のコロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の抗体価と、抗体価にＩＣ５０（ｎＭ）の逆数とを乗じた抗原結合親和性抗体価とをプロットしたグラフにおいて、コロナウイルス抗原タンパク質に対する抗体の抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値をＹ軸と平行に記載し、抗体のコロナウイルス抗原タンパク質に対する抗原結合親和性抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値をＸ軸と平行に記載し、それぞれのカットオフ値を表す二本の直交する直線により左下エリア、右下エリア、左上エリア、右上エリアに四つの領域に分割されたグラフに基づき、（１）コロナウイルス感染症用ワクチン接種の必要性の判定、（２）感染で重症化するハイリスク者の同定、（３）コロナウイルス感染症罹患者の予後予測、（４）コロナウイルス感染症の集団免疫の達成度の評価、（５）コロナウイルス感染症用ワクチンの有効性の評価を行うことができることを確認し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］対象由来の試料中のコロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の、抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）と、抗原結合親和性抗体価（抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ））とを指標として、以下に示すコロナウイルス感染症の（１）～（５）の評価項目の１又は２以上の情報を提供する方法。
（１）コロナウイルス感染症用ワクチン接種の必要性の判定
（２）感染で重症化するハイリスク者の同定
（３）コロナウイルス感染症罹患者の予後予測
（４）コロナウイルス感染症の集団免疫の達成度の評価
（５）コロナウイルス感染症用ワクチンの有効性の評価
［２］抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする上記［１］記載の方法。
［３］指標が、コロナウイルス抗原タンパク質に対する抗体の抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値と、抗体のコロナウイルス抗原タンパク質に対する抗原結合親和性抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値とに基づき作成されることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法。

　また、本発明は、以下のとおりである。
［４］コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法。
［５］コロナウイルスの抗原タンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であることを特徴とする上記［４］記載の方法。
［６］抗体の結合部位が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合部位であることを特徴とする上記［５］記載の方法。

　本発明によると、対象がコロナウイルス感染症用ワクチンを接種することが必要であるかを判定し、新型コロナウイルスに感染した場合に重症化するハイリスク者を同定し、コロナウイルス感染症罹患者について、具体的な治療方針を策定するとともに予後予測をおこない、未感染者の感染リスクを判定し、コロナウイルス感染症の集団免疫がどれほど達成されているかを評価し、コロナウイルス感染症用各種ワクチンの有効性・性能の評価をすることができる。

検体群１（ｎ＝１６３）の検体について、各被検者の検体番号をＸ軸にプロットし、ＳＡＲ Ｓ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ１タンパク質に対する抗原結合親和性を表すＩＣ５０値をＹ軸に表し、各被験者の検体のＩＣ５０値についてプロットし、（ａ）１回目接種後採血検体（ｂ）２回目接種後採血検体、（ｃ）３回目接種後採血検体の各検体のＩＣ５０値の推移を示したグラフ群である。採血時期は各ワクチンの接種後３－４週後とした。 検体群１の検体について、抗体価をＸ軸に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ１タンパク質に対する抗原結合親和性を表すＩＣ５０値をＹ軸に表し、各被験者の検体の抗体価とＩＣ５０値についてプロットし、（ａ）１回目接種後採血検体、（ｂ）２回目接種後採血検体、（ｃ）３回目接種後採血検体の各検体の抗体価とＩＣ５０値の推移（対応）を示したグラフ群である。 検体群１の検体について、抗原結合親和性抗体価(Antigen Binding -avidity Antibody Titer：ABAT)をＹ軸に表し、各検体の抗体量をＸ軸に表し、（ａ）１回目接種後採血検体、（ｂ）２回目接種後採血検体、（ｃ）３回目接種後採血検体の抗原結合親和性抗体価と抗体量とについてプロットしたグラフである。 検体群１の検体（ｎ＝１６３）について、３回目接種後採血検体の、抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットしたグラフにおいて、抗体価と抗原結合親和性抗体価の回帰直線とその予測値の９５％信頼区間の分布を示すグラフである。横軸のS1-specific Ab(ＳＡＲ Ｓ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ１タンパク質に対する抗原結合親和性抗体価)は、Ｘ軸について、ABATを対数で表示したものである。 検体群１の検体について、２回目接種後採血検体の、抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットしたグラフにおいて、抗体価と抗原結合親和性抗体価の回帰直線とその予測値の９５％信頼区間の分布を示すグラフである。 検体群１の検体について、１回目接種後採血検体の、抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットしたグラフにおいて、抗体価と抗原結合親和性抗体価の回帰直線とその予測値の９５％信頼区間の分布を示すグラフである。 検体群１の検体について、１～３回目接種後採血検体の、抗体価と抗原結合親和性抗体価の分布を示すグラフから得られた、高抗原結合親和性群の抗体と低抗原結合親和性群の抗体と、初期抗原結合親和性群の抗体とのそれぞれの回帰直線と各予測値の９５％信頼区間を示すグラフである。 入院（＋）被験者群と入院（－）被験者群間の（ａ）抗体価のカットオフ値、（ｂ）ＩＣ５０（ｎＭ）のカットオフ値、（ｃ）抗原結合親和性抗体価のカットオフ値についてのＲＯＣ解析結果を示す図表である。 検体群２の入院時採血検体（ｎ＝３３９）について、各被験者の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットし、入院時に重症度分類した患者を軽症（△）、中等症Ｉ（■）、中等症ＩＩ（□）、重症（×）に分類して表記したグラフである。図８（ａ）抗体価のカットオフ値（Ｘ軸）と（ｃ）抗原結合親和性抗体価のカットオフ値（Ｙ軸）とを、このグラフに追記している。 退院時又は入院後２－３週間経過した患者から採血した検体群２の検体について、各被験者の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットし、退院時に重症度分類した患者を軽症（△）、中等症I（■）、中等症II（□）、重症（×）に分類して表記したグラフである。さらに図８（ａ）抗体価のカットオフ値（Ｘ軸）と（ｃ）抗原結合親和性抗体価のカットオフ値（Ｙ軸）とを、このグラフに追記している。 抗コロナウイルスＳ１抗原タンパク質に対する疑似ウイルスを用いたウイルス中和活性（Ｙ軸）と、ＤＣＰチップ法を用いたＲＢＤに対する抗ウイルス抗体の競合的結合阻害活性ＩＣ５０（ｎＭ）（Ｘ軸）との相関を示すグラフである。

　本発明において、評価項目を判断するための情報を提供する方法としては、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する、試料中の抗体価と、抗原結合親和性抗体価（抗体量×抗原結合親和性；ＢＵｇ／ＩＣ５０）とを指標として、評価項目を判断するための情報を提供する方法であれば特に制限されず、上記評価項目は、（１）コロナウイルス感染症用ワクチン接種の必要性の判定、（２）感染で重症化するハイリスク者の同定、（３）コロナウイルス感染症罹患者の予後予測、（４）治療方針策定のための検査、（５）コロナウイルス感染症の集団免疫の達成度の評価、（６）コロナウイルス感染症用ワクチンの有効性の評価の１又は２以上であり、上記抗原結合親和性抗体価は、抗体の「抗原結合親和性の総和」を表す概念であって、パラメーターの一つとして使用される。上記治療方針策定のための検査により策定される治療の方針としては、感染防御抗体の総和値（抗原結合親和性抗体価の総和値、ABAT）が不十分と判定された場合に、ワクチンの追加接種をするか、感染リスクのある場所からの隔離、レムデシビル（remdesivir）やファビピラビル（favipiravir）等の抗ウイルス剤の投与などを挙げることができる。

　本発明における試料としては、対象（ヒト）から採取された、抗体を含む可能性のある試料であれば特に制限されないが、ＩｇＧ抗体を検出対象とする場合は、血清、血漿等の血液試料が好ましい。試料の調製方法としては、コロナウイルス感染症罹患者やワクチン接種者等の対象の上腕静脈より採血を行い、得られた血液を４℃にて一晩静置した後、遠心分離し、その上清を血清として用いる方法を挙げることができる。あるいは、低侵襲的に耳朶や指先を微量採血針等で穿刺して得られる５０～１００μＬの微量血液をマイクロキャピラリーチューブで採取してそのまま用いる方法を挙げることができる。

　本発明におけるコロナウイルスとは、ウイルス粒子の周囲に「太陽コロナ（光冠）」様の形態を確認することができるウイルスの総称であり、ヒトコロナウイルス（Human Coronavirus：ＨＣｏＶ）としては、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）等のアルファ型コロナウイルス；ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ－１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、重篤な肺炎を引き起こす２００２年に発生した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、２０１２年に発生し、ラクダに風邪症状を起こすウイルスがヒトに感染した中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、及び、中国・武漢で発生が確認され、ＣＯＶＩＤ－１９（「コロナウイルス病２０１９」ともいう）パンデミックの原因となった呼吸器疾患である、いわゆる新型コロナウイルス感染症を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）及びその変異株のウイルス等のベータ型コロナウイルス；とりわけオミクロン株ウイルス等を例示することができ、高熱、せき、頭痛、筋肉痛、関節痛、肺炎、息切れ、倦怠感、疲労、のどの痛み等の強い全身症状を伴う呼吸器感染症を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を好適に挙げることができる。

　上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異株としては、懸念される変異株（Variant of Concern : ＶＯＣ）に分類されてきたＢ．１．１．７系統の変異株（アルファ株）、Ｂ．１．３５１系統の変異株（ベータ株）、Ｐ．１系統の変異株（ガンマ株）、Ｂ．１．６１７．２系統の変異株（デルタ株）；感染性や重篤度・ワクチン効果などに影響を与える可能性が示唆される株に分類されるＲ．１（Ｅ４８４Ｋがある変異株）、Ｂ．１．４２７／Ｂ．１．４２９系統の変異株（イプシロン株）、Ｐ．３系統の変異株（シータ株）、Ｂ．１．６１７．１系統の変異株（カッパ株）；並びに、ＢＡ．２．１２．１株、ＢＡ．２．３株、ＢＡ．２.７５株（ケンタウロス）及び、ＢＡ．４系統、ＢＡ．５系統の株に分類されるオミクロン株亜系統、並びにこれらから派生した又は今後派生して変異する子孫系統（亜型）をすべて含めることができる。

　本発明におけるコロナウイルスの抗原タンパク質としては、抗体が認識するタンパク質であって、抗体価と、抗原結合親和性抗体価を算出することができるタンパク質であれば特に制限されず、ウイルス粒子形成中にらせん状のヌクレオカプシド形成を促進する役割を有するヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）；膜タンパク質（Ｍタンパク質）；エンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）；ウイルスが宿主細胞の膜に付着して融合することで細胞へのウイルス侵入を可能にするタンパク質であるスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）；を挙げることができる。

　上記コロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体としては、ＩｇＧ；ＩｇＡ；ＩｇＤ；ＩｇＥ；ＩｇＭ；の各抗体等があり、いずれも検査の対象とすることができるが、本発明において、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体としては、主として血液中に存在するＩｇＧ抗体や、血液、鼻汁、唾液に存在するＩｇＡ抗体を検査の対象とすることが好ましい。

　本発明において、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の抗体価としては、試料中のコロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体を定量的に測定した量を表す値であれば特に制限されず、抗体の抗体価を定量的に測定する方法としては、コロナウイルス抗原タンパク質を固定化した担体上に抗コロナウイルス抗体を捕捉させ、捕捉抗体を、標識二次抗体を用いて抗原抗体反応により検出し、抗原と結合した抗体の量を標準抗体の蛍光強度の検量線から測定して抗体価として評価するイムノアッセイにより検出するＥＬＩＳＡ法により測定する方法を好適に挙げることができる。

　本発明において、試料中のコロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の抗原結合親和性抗体価は、上記抗体価と、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体のＩＣ５０値の逆数である「１／ＩＣ５０」を乗じた数値、すなわち抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）により表現される値である。上記ＩＣ５０（ｎＭ）は、抗体の抗原への結合親和性を表すために用いられる一つのパラメーターであり、従来、競合的結合阻害活性値と呼ばれてきた値である。

　上記ＩＣ５０（ｎＭ）を測定する方法としては、公知の抗体の競合的抗原結合阻害反応法を用いた生化学的アッセイにより、抗体の抗原結合親和性を測定する方法を挙げることができるが、抗原抗体反応における競合的抗原結合阻害を利用して、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の結合親和性を定量的に比較解析する、ＥＬＩＳＡ競合的結合阻害法を好適に例示することができる。具体的手順としては、抗原タンパク質に結合する抗体を含む試料に、濃度０（試料中に抗原タンパク質が存在しない）から、一定時間にすべての抗体に抗原タンパク質が結合できる十分な濃度に至るまで、段階的に調製された既知の濃度の抗原タンパク質を競合的結合阻害物質として添加し、一定時間反応させる（前段階反応）。特定の濃度の抗原タンパク質を含む溶液において、抗原タンパク質に対する親和性のより大きい抗体が、添加された抗原タンパク質に結合する割合はより高く、親和性のより小さい抗体が、添加された抗原タンパク質に結合する割合はより低くなる。

　上記段階的に調製された既知の濃度としては、試料中に存在する抗体量等に基づき、当業者が適宜決定した濃度を用いることができるが、例えば、血清や血漿等の試料に添加する、競合阻害に用いる段階的な競合的結合阻害物質の濃度（最終濃度）の例としては、０ｎＭ、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭの組合せ、０ｎＭ、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭの組合せ等を挙げることができるがこれらの濃度に限定されるものではない。また、上記前段階反応における反応時間としては、例えば、１５分～２時間、好ましくは３０分～１時間を挙げることができる。

　上記前段階反応後の溶液を、抗原タンパク質が固定化されているＤＣＰチップ等の結合感度の高い担体に供し、担体に固定化されている抗原タンパク質（固定化抗原タンパク質）に遊離抗体を結合させる平衡条件下の反応を、例えば、１５分～３時間、好ましくは３０分～１．５時間行うことを挙げることができる。上記の方法により反応させ、その後未反応抗体を洗浄により除去した後、さらに標識二次抗体と反応させた後に、固定化抗原タンパク質に結合した抗体の標識量を算出する。上記のように、結合親和性のより低い抗体については、前段階反応後の溶液中に存在する遊離一次抗体の量はより多くなり、固定化されている抗原タンパク質に結合する抗体量は多くなる。一方、上記のように、結合親和性のより高い抗体については、前段階反応後の溶液中に存在する遊離一次抗体の量はより少なくなるので、固定化されている抗原タンパク質に結合する抗体量は少なくなる。

　上記固定化抗原タンパク質としては、検出対象となる抗体の競合的結合反応測定を実施することができる抗原タンパク質であれば特に制限されないが、コロナウイルスの抗原タンパク質がスパイクタンパク質である場合、Ｓ１スパイクタンパク質が選択され、この場合ヒト細胞表面のアンジオテンシン変換酵素－２（Angiotensin-converting enzyme 2：ＡＣＥ２）に結合して、ウイルス侵入を開始させるスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（Receptor-binding domain：ＲＢＤ）を競合的結合親和性測定抗原タンパク質として好適に挙げることができる。

　前記標識二次抗体としては、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｔｔｏ５３２、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体などを挙げることができる。

　標識二次抗体の標識量として検出される抗体の抗原タンパク質に対する結合親和性は、検出量がより少なければより高く、検出量がより多ければより低いと判定される。抗体の抗原タンパク質との結合親和性の数値化は、前段階反応において、競合抗原結合タンパク質の存在しない濃度０の溶液について、検出される標識二次抗体の標識量を１００％とした場合に、標識量が５０％となる抗原濃度（例えば上記の例では（ｎＭ））をＩＣ５０値として表現することができる。

　本発明における、コロナウイルス感染症の、前記各評価項目を判断するための情報としては、対象者由来の試料中のコロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の、抗体価と抗原結合親和性抗体価（抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ））とを指標として、以下に示すコロナウイルス感染症の（１）～（５）の評価項目の１又は２以上の評価項目を判断するための情報であれば特に制限されないが、抗体価又は抗体価の対数値［ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ）］をＸ軸に、抗原結合親和性抗体価又は抗原結合親和性抗体価の対数値［ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）］をＹ軸に表し、抗体価のカットオフ値をＹ軸と平行に、抗原結合親和性抗体価のカットオフ値をＸ軸と平行に記載したグラフ（判定用グラフ）上に、被験者の検体中の抗体価の数値と抗体価の抗原結合親和性抗体価の数値との関係をプロットし、カットオフ値を表す二本の直交する直線により左下エリア、右下エリア、左上エリア、右上エリアに四つの領域に分割されたグラフに基づき、上記評価項目を判断するための情報を好適に挙げることができる。

　上記ＲＯＣとは、受信者操作特性又は受信者動作特性などと訳される用語であって、二分変数であるアウトカムに対する独立変数の予測能の比較や、アウトカムに対する独立変数のカットオフを設定するために利用される方法である。

　本発明において、上記二分変数であるアウトカムに対する独立変数の予測能の比較を行う方法としては、例えば異なるｎ種類のパラメーターにおいて、それぞれコロナウイルス感染者となる閾値の設定を変化させると、それに応じてコロナウイルス感染者に対する真陽性率及び偽陽性率が変化する。真陽性率及び偽陽性率を、縦軸に真陽性率、横軸を偽陽性率としてプロットして、ｎ種類のＲＯＣ曲線が作成された場合に、その曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど優れたパラメーターであって、予測能が高いと評価する方法を挙げることができる。

　上記ＲＯＣ解析においてカットオフ値を設定する方法としては、予測能を高めることができる方法であれば特に限定されないが、感度－（１－特異度）が最大の値をカットオフ値として決定する方法を例示することができ、かかるカットオフ値の設定は、以下に示すＲＯＣ解析装置や市販のソフトウェアを用いて公知の手順により決定することができ、公知の市販の解析装置としては、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．５．４（ＧｒａｐｈＰａｄ社）、ＪＭＰ１４（ｊｍｐ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．^ＴＭ）等のソフトウェアを挙げることができる。

　上記カットオフ値とは、定量的検査で、二群を識別する目的で定めた検査の陽性、陰性を分ける境界値のことをいい、診断の明らかな多数のデータを元にして決定することが好ましい。診断の実際の現場においては、カットオフ値をどのように決めても、例外ができるのが通常であり、特定の疾患に罹患していないのに検査を行うと陽性となる場合（偽陽性）や、特定の疾患の症状が認められるのに検査が陰性となる場合（偽陰性）となる場合があり、ある範囲に一部重なり合って分布している二群を分別するために、最も適当と考えられる一点に設定される値である。

　本願明細書において、９５％信頼区間とは、仮に１００回試験をした場合、１００回中５回くらいは真値を含まないことがある、ということを意味する。

　本発明における対象（ヒト）としては、採取された試料について、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の、抗体価と、抗原結合親和性抗体価とを算出することができる試料を採取できる対象者であれば特に制限されず、上記（１）～（５）の評価項目の１又は２以上の評価項目を判断することが必要であると判断された者が好ましく、例えば、ワクチン接種者や、感染していても発症していない可能性がある未発症者や、感染により発症した罹患者でもよいし、感染により発症したが、コロナウイルスは体内から消失して判断された治癒者でもよいし、発症後コロナウイルスは体内から消失したが、後遺症が残る者でもよい。

　なお、コロナウイルスに感染しているか否かについては、公知のＰＣＲ検査や抗原検査により陽性と判定された場合に感染した旨判断することができ、陰性と判定された場合に感染していない（未感染）と判断することができる。また、治癒したか否かは、発熱や咳等の症状が消失し、鼻腔や気管等からコロナウイルスが検出されなくなっているか否かで判定することができるが、具体的にはＰＣＲ検査で陰性と判定された場合に治癒したと判断することができ、陽性と判定された場合には未だ治癒に至っていないと判断することができる。

　本発明の評価項目を判断するための情報を提供する方法における、評価項目（１）のコロナウイルス感染症用ワクチン接種の必要性の判定の方法としては、以下の方法を例示することができる。

１）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、右上に該当する場合、当該対象は、当座において再度のワクチン接種の必要性はないと判定できる。
２）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、左下に該当する場合、抗体価と抗原結合親和性抗体価ともに低いので、当該対象は、速やかにワクチンを接種することが強く推奨される。既にワクチンを接種した者の場合は、前回のワクチン接種ののち公的機関、医療機関等により定められた期間の後、又は、好ましくは１月後、２月後、３月後、４月後、６月後、１年後、又はそれ以上後であっても再度接種することが推奨される。
３）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、右下に該当する場合、従来の基準により抗体価が高いので、ワクチンの追加接種の必要はないと判断された場合であっても、抗体の抗原結合親和性抗体価が十分に高くなっていないので、前回のワクチン接種ののち公的機関、医療機関等により定められた期間の後、又は、好ましくは１月後、２月後、３月後、４月後、６月後、１年後、又はそれ以上後であっても再度接種することが推奨される。
４）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、左上に該当する場合、抗体の抗原結合親和性抗体価が十分に高く、抗体の質としてはよいのであるが、抗体の量が不十分であるので、速やかにワクチンを接種することが推奨される。既にワクチンを接種した者の場合は、前回のワクチン接種ののち公的機関、医療機関等により定められた期間の後、又は、好ましくは１月後、２月後、３月後、４月後、６月後、１年後、又はそれ以上後であっても再度接種することが推奨される。

　なお、上記コロナウイルス感染症用ワクチンとしては、コロナウイルスに起因する感染症を予防する目的で接種されるワクチンを挙げることができ、とりわけＣＯＶＩＤ－１９を予防するためのワクチンを好ましく挙げることができる。上記接種の必要を判定するための情報とは、１回又は２回以上コロナワクチンを接種した対象が、再度当該コロナワクチンを接種する必要があるか否か判断するための情報を挙げることができる。

　上記評価項目（２）の重症化するハイリスク者を同定する方法としては、以下の方法を例示することができる。
１）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、右上に該当する場合、対象に基礎疾患がない場合、コロナウイルスに感染しても重症化する可能性は低いと判断することができる。一方、対象に基礎疾患がある場合、コロナウイルスに感染した場合、中等症Ｉ，ＩＩ又は重症に重症化する可能性があると判断することができ、医療機関への入院を推奨することもできる。
２）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、左下に該当する場合、抗体価と抗原結合親和性抗体価ともに低いので、該対象がコロナウイルスに感染した場合に中等症Ｉ，ＩＩ又は重症に重症化する可能性が高いと判断することができる。
３）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、右下に該当する場合、抗体価は高いが、抗原タンパク質に対する抗体の抗原結合親和性抗体価が十分に高くなっていないので、当該被検者が、コロナウイルスに感染したときに、中等症Ｉ，ＩＩ又は重症に重症化する可能性があると判断することができる。
４）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、左上に該当する場合、抗体の抗原結合親和性抗体価が十分に高く、抗体の質としてはよいのであるが、抗体の量が不十分であるので、コロナウイルスに感染したときに、中等症Ｉ，ＩＩ又は重症に重症化する可能性があると判断することができる。

　上記軽症、中等症Ｉ，ＩＩ又は重症の発症者に分類する方法としては、「新型コロナウイルス感染症ＣＯＶＩＤ－１９診療の手引き、第５版」（非特許文献４）に基づき、以下の４分類に分類する方法を挙げることができる。

・軽症　：　　「呼吸器症状なし、又は咳のみで呼吸困難なし」の状態で、
　　　　　　　胸部画像上、肺炎所見がなく、酸素飽和度が室内気で９６％
　　　　　　　以上ある患者
・中等症I： 　胸部画像上、肺炎所見があり、酸素飽和度が室内気で９４％
　　　　　　　～９５％あり、酸素投与の必要性がない患者
・中等症II：　酸素飽和度が室内気で９３％以下であり、酸素投与が必要な
　　　　　　　患者
・重症： 　　 集中治療室（ＩＣＵ）に入室、又は人工呼吸器が必要な患者
　酸素飽和度と臨床状態で重症度に差がある場合、高い方に分類する。

　なお、上記重症化するハイリスク者としては、呼吸器症状なし、又は咳のみで呼吸困難なしの症状である軽症にとどまらず、肺炎所見がある中等症Iや、酸素投与が必要になる中等症II、又は集中治療室（ＩＣＵ）に入室、又は人工呼吸器が必要になる重症になる可能性が高い対象をいう。

　対象がコロナウイルス感染症を既に発症した罹患者又は治癒した治癒者である場合、上記評価項目（３）のコロナウイルス感染症罹患者の予後予測の方法としては、以下の方法を例示することができる。

１）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、右上に該当する場合、当該対象の予後は基本的には良好であると判断できる。当該対象に基礎疾患がない場合は、重症化リスクが低いので、医療機関におけるひっ迫時には、自宅での療養に切り替えることを考慮することができる。基礎疾患がある場合は、予後が良好であると予測することはできず、基礎疾患の経過観察とともに後遺症の有無についても観察が必要である。
２）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、左下に該当する場合、抗体価と抗原結合親和性抗体価ともに低いので、当該対象が治癒に至るまでには長時間かかることが予想され、治癒した後にも後遺症が残る可能性があり、再感染の可能性が高いと判断できる。
３）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、右下に該当する場合、抗体価は高いが、抗体の抗原結合親和性抗体価が十分に高くないので、治癒した後にも後遺症が残る可能性があり、再感染のおそれがあると判断することができる。
４）対象の採血検体における抗体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、左上に該当する場合、抗体の抗原結合親和性抗体価は高いが、抗体価が低いので、治癒した後にも後遺症が残る可能性があり、再感染のおそれがあると判断することができる。

　上記後遺症としては、コロナウイルスに感染し、発症している間又は回復したと判断された後に現れて、一定期間持続する症状を挙げることができ、例えば、コロナウイルス感染症療養終了後も続く症状として、味覚障害、嗅覚障害、咳、倦怠感、めまい、頭痛、抑鬱症状、記憶障害、不眠、筋肉痛、関節痛等、を例示することができ、他の疾患の症状として説明できない症状を含めることができる。

　上記評価項目（４）のコロナウイルス感染症の集団免疫の達成度の評価としては、以下の方法を例示することができる。すなわち、１,０００～１０,０００人、好ましくは１０,０００～５０,０００人、より好ましくは５０,０００～２００,０００人、さらに好ましくは２００,０００～１,０００,０００人、特に好ましくは１,０００,０００人以上の被検者の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした場合に、以下のとおり判断することができる。なお、集団免疫としては、人口の一定割合以上の人が免疫を持つと、感染患者が出ても、他の人に感染しにくくなることで、感染症が流行しなくなる状態のことを例示することができる。
１）対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、９０％以上右上エリアに該当する場合は、集団免疫が成立していると判断することができる。
２）対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、７５％以上右上エリアに該当する場合は、集団免疫がほぼ成立していると判断することができる。
３）対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、５０％以上右上エリアに該当する場合は、集団免疫が成立しつつあると判断することができる。
４）対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、５０％未満右上エリアに該当する場合は、集団免疫が成立していないと判断することができる。

　上記評価項目（５）のコロナウイルス感染症用各種ワクチンの有効性・性能の評価としては、以下のとおり行うことを例示することができる。
１）コロナウイルス感染症用各種ワクチンを、ワクチン未接種者、かつ、抗体価がほぼゼロである者を対象としてワクチン接種を３～４週間隔で２回接種し、接種３～４週間後に当該対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、９０％以上右上エリアに該当する場合は、顕著に有効なワクチンであると判断することができ、８０％以上右上エリアに該当する場合は、非常に有効なワクチンであると判断することができ、左上エリア、左下エリア、及び右上エリアに該当する対象に対し、最後の接種から１～３月後に三回目の接種を推奨することができる。
２）コロナウイルス感染症用各種ワクチンを、対象をワクチン未接種者としてワクチン接種を３～４週間隔で２回接種し、接種３～４週間後に対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、４０％～６０％右上エリアに該当する場合は、有効なワクチンであるが免疫効果の達成が不十分と判定され、最後の接種から１～３月後に三回目の接種を強く推奨することが好ましいとすることができる。
３）コロナウイルス感染症用各種ワクチンを、対象をワクチン未接種者としてワクチン接種を３～４週間隔で２回接種し、接種３～４週間後対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、２０％～４０％右上エリアに該当する場合は、免疫効果の達成が不十分と判定され、最後の接種後も複数回追加接種して、９０％以上の接種者が右上エリアに該当するまで、接種することが好ましいワクチンであると判断することができる。
　なお、評価項目（５）における上記記載は、これまでにコロナウイルスに感染したことが無く、ワクチン未接種者について実施する初回接種とブースター接種の二回接種の組合せ例であるが、これまでにコロナウイルスに感染したことがあったり、ワクチン接種歴等、抗原感作既往歴のある被験者が対象の場合、「ワクチン接種を３～４週間隔で２回接種し」を「ワクチンを一回接種し」と読み替え、ワクチン接種後３～４週間後に当該対象の採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価とをプロットした領域が、９０％以上右上エリアに該当する場合は、顕著に有効なワクチンであると判断することができる。２）、３）についても同様に、「ワクチン接種を３～４週間隔で２回接種し」を「ワクチンを一回接種し」と読み替え、ワクチン「三回目の接種」を「二回目の接種」と読み替えて判断することができる。

　前記結合感度の高い担体の作製方法としては、以下に示す方法を例示することができる。

　上記担体の基板としては、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、プラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス等との混合体を挙げることができる。

　上記担体の表面に形成されるカーボン層としては、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等からなる層を挙げることができる。

　上記担体の表面又は担体の表面に形成されるカーボン層に導入される化学修飾基としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基等を挙げることができる。

　上記アミノ基を導入する方法としては、チップの担体の表面やカーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射する方法や、チップの担体の表面やカーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、かかる塩素化されたチップの担体の表面やカーボン層にアンモニアガス中で紫外線照射する方法や、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類を、塩素化されたチップの担体の表面やカーボン層と反応させる方法を挙げることができる。

　上記カルボキシル基を導入する方法としては、例えば、上記アミノ化したチップの担体の表面やカーボン層に、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等のジカルボン酸又はポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸等の多価カルボン酸を反応させる方法を挙げることができる。

　上記エポキシ基を導入する方法としては、例えば、前記のようにアミノ化したチップの担体の表面やカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させる方法や、カーボン層が含有する炭素＝炭素の二重結合に有機過酸を反応させる方法を挙げることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸等を挙げることができる。

　上記ホルミル基を導入する方法としては、上記アミノ化したチップの担体の表面やカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させる方法を挙げることができる。

　上記化学修飾基を導入したチップは、活性化試薬により活性化処理をした後に抗原タンパク質や抗原ペプチドを固定化させることもできる。これらの抗原を固定化する方法としては、基板表面に導入されたカルボキシル基（－ＣＯＯＨ基）を利用し、アミノ基（－ＮＨ_２基）を持つ抗原タンパク質等を1-Etyl-3-(3-dimethylamino propyl)-carbodiimide hydrochloride（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ:Water-Soluble Carbodiimide Hydrochloride）や、N-Hydroxy-succinimide（ＮＨＳ）やその他の化学架橋剤を用いて共有結合により固定化させる方法を挙げることができる。

　前記ＤＣＰチップとしては、シリコン基板表面にカーボン層をＤＬＣ処理した基板、あるいは、ガラススライドの表面に、アミノ基含有化合物かその重合体及び／又は共重合体を処理した静電層を施し、さらにジカルボン酸又は多価カルボン酸等を重ねて処理後、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及び／又はガルボジイミド類で活性化したチップや、担体の表面や上記カーボン層に化学修飾基が導入されたチップや、さらに活性化処理が行われたチップなどを挙げることができる。

（担体へのコロナウイルス抗原タンパク質の固定化処理）
　コロナウイルス抗原タンパク質を担体（チップ）に固定化する際には、タンパク質機能を維持するため、及び／又は、タンパク質の基板への結合量を増加させるために、ＰＥＧ（polyethylene glycol）；ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）；グリシン；ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）；グリセロール、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、又はシクロデキストリン等の溶解液；から選ばれる１又は２以上をスポッティング添加剤として混合してスポッティングする方法を挙げることができる。これらのスポッティング添加剤は、ＣＡＰＳ（N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液に溶解して用いることもできる。

（ブロッキング処理）
　上記コロナウイルス抗原タンパク質をチップに固定化した後には、ブロッキング処理を行うことが好ましい。かかるブロッキング処理は、バックグラウンドを低下させると同時に、相対的に蛍光強度や発色強度を上昇させ、測定感度を向上させることができる。具体的には、Pierce Protein-Free Blocking Buffer（サーモフィッシャー社）、blφkノイズキャンセリング試薬（メルクミリポア社）、Ｐｒｏ－Ｂｌｏｃｋ（ＳｃｙＴｅｃ社）、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社）等のプロテインフリー・ブロッキングバッファーを挙げることができる。これらのブロッキング剤を希釈せずに添加後、一晩ブロッキング反応を行った後、ブロッキング剤を洗浄し、水分を除去することが好ましい。

　上記チップを用いて抗体価を定量測定する方法としては、少なくとも試料中の抗原タンパク質に対する抗体を検出し、抗体価を定量測定することができる公知のイムノアッセイであれば特に限定されず、前述のとおり、上記チップ上で行う標識二次抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を好適に挙げることができる。

　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［実施例１］
［検体群１］
　本実施例における検討は、徳島大学病院・生命科学・医学系研究倫理審査委員会の承認を受け、承認番号＃４０６７－１及び＃４０６８－１の下、十分なインフォームドコンセントを行い、承諾が得られた被験者の血清を検体として解析に用いた。なお、ヒト免疫不全ウイルス感染者を除外した。研究対象者（及び代諾者）より参加拒否の申入があった場合や、その他、研究責任者又は研究者が選択除外基準に抵触していると判断した場合、研究の中止が妥当と判断した場合を、中止基準・脱落基準とした。

　国立病院機構三重病院の医療従事者について、２０２１年３月、４月、９月の間にファイザー社製のｍＲＮＡワクチン［ＢＮＴ１６２ｂ２（Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ）］を合計３回接種した１６３名（平均年齢＝４２．１歳、男性２３．９％、女性７６．１％）を被験者としてデータを解析した。

　上記被検者から採取した検体については、ワクチン初回接種３ヶ月前までの２０２０年度の定期健康診断時の採血検体をワクチン接種前採血検体とした。そして、１回目のワクチン接種後抗体価がピークに達する接種後３～４週後に１回目の接種後採血を実施し、１回目接種後採血検体とした。その後２回目のワクチンの接種を行い、抗体価がピークに達する接種後３～４週後に２回目の接種後採血を実施し、２回目接種後採血検体とした。３回目のワクチンは、２回目から６～８ヶ月目に接種し、抗体価がピークに達する接種後３～４週後に３回目の接種後採血を実施し、３回目接種後採血検体とした。なお、検体群１において、調査を実施した２０２１年１０月末までの期間中に接種者の中にＣＯＶＩＤ－１９の感染事例や入院事例が無いことが確認されている。

　なお、上記ワクチン接種前採血検体については、従前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染も無いことから、抗体価、ＩＣ５０値は共に検出限界以下を示した。そのため、データとしては、これ以降の表やグラフには含めていない。

［コロナウイルスタンパク質特異的ＩｇＧ抗体の抗体価の算出］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１抗原タンパク質をコロナウイルスの抗原タンパク質として用い、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する、抗体の抗体価として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ１タンパク質特異抗体量（ＢＵｇ／ｍＬ）を測定した。

（抗体価測定用ＤＣＰチップの作製）
　シリカガラス表面に、アミノ基含有静電層を施し、さらにポリアクリル酸による負の電荷を帯びるカルボキシル基を導入した基板を化学架橋剤（１００ｍＭ ＷＳＣ・ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮＨＳ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））中で、遮光した状態で室温にて３０分間振盪しながら再活性化処理を行った。反応後の化学架橋剤を廃棄後、基板をＭｉｌｌｉＱ水で振盪しながら１分間の洗浄を２回行った後、直ちに卓上遠心機（ＰｌａｔｅＳｐｉｎ３（商標） (ＫＵＢＯＴＡ社製)）を用いて水分を除去し、活性化チップを調製した。

（抗原タンパク質のＤＣＰチップへの固定化）
　１０％ＤＭＳＯを添加したＨＥＰＥＳ (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid)溶液に、抗原タンパク質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１（Ａｃｒｏ社製）を０．６ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して、抗原タンパク質溶液を調製した。かかる調製された抗原タンパク質溶液を３８４穴プレート平底（コーニング社製）に分注し、マイクロアレイ作製装置（ＯｍｎｉＧｒｉｄＡｃｃｅｎｔ，ＤＩＧＩＬＡＢ社製）により、上記活性化チップ上に８ｎＬスポット後、１５℃～３０℃にて１～１８時間乾燥し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１抗原タンパク質をＤＣＰチップ上に固定化した。

（未反応活性基のブロッキング反応）
　上記抗原タンパク質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１が固定化されたチップにブロッキング試薬のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社）を反応穴槽（ウェル）に添加し、遮光下冷蔵（４℃）にて静置し終夜反応させた。上記ブロッキング試薬をアスピレーター（ＡＳＰＩＲＡＴＯＲ（ＳＡＰ－１０２）（ＳＡＮＳＹＯ社製）で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）で１分間揺動（ＭＵＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ（ＥＹＥＬＡ社製））した後にアスピレーターで洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した。卓上遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)して、チップ表面の水滴を除去し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１固定化ＤＣＰチップを作製した。

（特異抗体の捕捉反応）
　サンプル希釈液（２０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で各被験者の血清試料を１００倍（測定限界値を超える血清試料については５００倍又は１０００倍）に希釈して、血清希釈溶液（一次抗体液）を調製した。かかる一次抗体液を、反応穴槽に８μＬ添加し、遮光下３７℃にて９０分間静置した。

（二次抗体との反応）
　上記の操作で得られた捕捉反応後の一次抗体液をアスピレーター(ＳＡＰ－１０２）（ＳＡＮＳＹＯ社製)で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(ＴＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５, １５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．９５％Ｔｗｅｅｎ２０）を１０ｍＬ添加後、振盪機（Ｍｕｌｔｉ Ｓｈａｋｅｒ（ＥＹＥＬＡ社製））を用いた洗浄作業を５分間３回繰り返した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去（２０００ｒｐｍにて１分間）してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）（二次抗体希釈液、２０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／１％ＢＳＡ、最終希釈濃度３０ｎｇ／ｍＬ））を二次抗体液として調製した。かかる二次抗体液を、スライド上の各反応穴槽に８μＬ分注し、遮光下３７℃にて１時間静置した。

(抗原に捕捉された抗体の検出)
　上記希釈二次抗体液をアスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに入れ振盪機を用いて洗浄作業を５分間３回繰返し行った。その後、精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加え１分間３回すすぎ、上記遠心機で水滴を除去し乾燥させた。蛍光スキャナー（ＩｎｎｏＳｃａｎ、スクラム社製）で蛍光強度を測定（Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ）し、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。

　蛍光強度の数値化にあたり、抗体価の測定単位は、抗原と抗原抗体反応により結合したＩｇＧ抗体価として、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｕｎｉｔ（ＢＵｇ）で表し、チップに固定化した既知の濃度のそれぞれの標準抗体の蛍光強度の検量線から測定して表した。１ＢＵｇ≒１μｇとして表記する。

［抗体の抗原結合親和性抗体価の算出］
　従来の抗体価や抗原親和性（ＩＣ５０）といったパラメーターに加え、新たなパラメーターとして、抗体の抗原結合親和性抗体価の算出を行うこととした。すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１抗原タンパク質として用い、コロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の抗原結合親和性抗体価（抗体量×抗原結合親和性；ＢＵｇ／ＩＣ５０）を算出した。

［コロナウイルスタンパク質特異的ＩｇＧ抗体のＩＣ５０の算出］
　上記［コロナウイルスタンパク質特異的ＩｇＧ抗体の抗体価の算出］における（抗体価測定用ＤＣＰチップの作製）、（抗原タンパク質のＤＣＰチップへの固定化）、（未反応活性基のブロッキング反応）、（特異抗体との捕捉反応）、（二次抗体との反応）と同様の手順で抗体の検出を行った。

（抗体量の算出）
　希釈二次抗体液をアスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに入れ振盪機（ＭＵＬＴＩ　ＳＨＡＫＥＲ（ＥＹＥＬＡ社製））を用いて洗浄作業を５分間３回繰返し行った。その後、精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加え１分間３回すすぎ、上記遠心機で水滴を除去し乾燥させた。蛍光スキャナー（Iｎｎｏｓｃａｎ、スクラム社製）で蛍光強度を測定(Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ)し、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。測定単位は、抗原と抗原抗体反応により結合したＩｇＧ抗体量として、抗体量の測定単位は、蛍光スキャナー（Iｎｎｏｓｃａｎ、スクラム社製）が示す蛍光強度値で表し、ＩＣ５０値を測定するための血清試料希釈率を算出した。

（競合的抗原結合阻害反応）
　サンプル希釈液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／０．３ＭＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で各被験者の血清試料を蛍光強度値が８０００から３５０００の範囲になるように希釈して、血清希釈溶液（一次抗体溶液）を調製した。

（前段階予備反応）
　競合的抗原結合阻害物質としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１に存在するＲＢＤのリコンビナントタンパク質であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質 １ＲＢＤを使用し、ＲＢＤリコンビナントタンパク質溶液を、０ｎｇ／１６μＬ（０ｎＭ）、２０ｎｇ／１６μＬ（４７．２ｎＭ）、及び２００ｎｇ／１６μＬ（４７２ｎＭ）の３段階の濃度に上記サンプル希釈液で調整し、競合的阻害物質溶液として使用した。３種類の濃度のＳＡＲＳ－ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１ＲＢＤ溶液を、１種類ずつ８μＬを上記血清希釈溶液（ ８μＬ）に添加し（合計１６μＬ)、２５℃にて３０分間静置した。

（一次抗体反応）
　前段階予備反応後それぞれの反応液について８μＬを採取して、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１が固定化されたチップ反応穴槽に８μＬ添加し、遮光下３７℃にて９０分間静置した。

（二次抗体との反応）
　上記の操作で得られた競合反応後の一次抗体液をアスピレーター(ＡＳＰＩＲＡＴＯＲ（ＳＡＰ－１０２、ＳＡＮＳＹＯ社製)）で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(ＴＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５, １５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．９５％Ｔｗｅｅｎ２０）を１０ｍＬ添加後、振盪機（Ｍｕｌｔｉ Ｓｈａｋｅｒ、ＥＹＥＬＡ社製）を用いた洗浄作業を５分間３回繰り返した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）（希釈液、２０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／０．３ＭＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／１％ＢＳＡ、最終希釈濃度３００ｎｇ／ｍＬ））を二次抗体液として調製した。かかる二次抗体液を、スライド上の各反応穴槽に８μＬ分注し、遮光下３７℃にて１時間静置した。

　その後アスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０ｍＬ添加後、振盪機を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。残存蛍光量を蛍光スキャナー（Ｉｎｎｏｓｃａｎ、スクラム社製）で蛍光強度を測定(Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ)することにより、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。

　各検体において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１が存在しない溶液、すなわち競合的抗原結合阻害物質濃度が０の場合の蛍光強度を１００％としたときに、蛍光強度が５０％を示すＲＢＤタンパク質濃度を「ＩＣ５０」値として抗原結合親和性を表示する単位として示した。

［参考例１］
　図１（ａ）～（ｃ）に示すグラフは、ファイザー社製のｍＲＮＡワクチンを合計３回接種した１６３名（検体群１）の１～３回目の各回の接種後採血検体について、各被検者の検体番号をＸ軸にプロットし、ＲＢＤ抗原への結合親和性（Ｂｉｎｄｉｎｇ－Ａｖｉｄｉｔｙ：１／ＩＣ５０）を示す、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ１タンパク質の抗原結合親和性値としてのＩＣ５０値をＹ軸に表し、各被検者のワクチン接種後採血検体におけるＩＣ５０値の推移を示した。

　１回目ワクチン接種後のＩＣ５０（ｎｇ）値は、被験者間に高抗原結合親和性を示す低値から低抗原結合親和性抗体を示す高値まで幅広く分布し、最大で約１００倍の違いがあり、一回目の接種による抗体の抗原結合親和性の獲得（成熟度）の程度は個人差が非常に大きいことが判明した。

　２回目のワクチン接種後ではＩＣ５０値が低値に収斂し始め８４．３％の被検者が、ＩＣ５０値が１０ｎｇ前後である高抗原親和性抗体を保持していたが、一部（１５．７％）の被験者の抗体は、未だＩＣ５０値が高値を示し、抗体の抗原結合親和性成熟度が低かった。

　３回目のワクチン接種後では被験者の検体に含まれる抗体がすべて高抗原結合親和性を示し、その平均値は１２．８±１．２ｎｇ（３０．２±２．９ｎＭ）であった。以上のとおり、ファイザー社製のｍＲＮＡワクチンは、３回目接種により被験者全員が、強いウイルス感染防御能を獲得したと推定された。

　上記非特許文献３には、強いウイルス中和活性（ウイルス感染防御能）を示したヒト血清のＣｌｏｎｅ：４１４－２，Ｃｌｏｎｅ：ＡＭ００１４１４４のＲＢＤ抗原結合親和性のＩＣ５０値が１５．７７～２８．５８ｎＭであって、上記３回目ワクチン接種者のＩＣ ５０値、３０．２±２．９ｎＭ（ＲＢＤ蛋白値、１２．８±１．２ｎｇ）（図１）とほぼ一致しており、ＲＢＤ抗原結合親和性の成熟度が進み、強いウイルス中和活性を示すに至っていると考えられる。

［参考例２］
　図２（ａ）～（ｃ）に示すグラフは、ファイザー社製のｍＲＮＡワクチンを合計３回接種した１６３名（検体群１）の１～３回目の各回の接種後採血検体について、各被検者の抗体価をＸ軸にプロットし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ１タンパク質ＲＢＤ抗原の結合親和性の値としてＩＣ５０値をＹ軸に表し、各被検者のワクチン接種後採血検体におけるＩＣ５０値が示すＲＢＤ抗原結合親和性成熟度の推移を示した。

　１回目ワクチン接種後のＩＣ５０（ｎＭ）値は、被験者間に高抗原結合親和性を示す低値から、低抗原結合親和性抗体を有することを示す高値まで幅広く分布し、最大で約１００倍の違いがあり、一回目の接種による抗体の抗原結合親和性の獲得（成熟度）の程度は個人差が非常に大きいことが判明した。

　図２（ａ）から明らかなとおり、１回目接種後採血検体における抗体の抗体価は高抗原結合親和性を示す低値から、低抗原結合親和性抗体を有することを示す高値まで幅広く分布した。また、上述のとおり、ＩＣ５０（ｎＭ）値は、低値から高値まで広い範囲で分布し、被験者間に最大で１００倍の違いがあり、１回目接種後においては、抗体価、ＩＣ５０値ともに個人差の大きなことが判明した。図２（ｂ）から明らかなとおり、２回目接種後採血検体においては、ＩＣ５０値が低値に収斂し始めたが、一部の検体は高い値に留まっている。抗体価は、上昇傾向にはあるが、個人差が大きい状況である。図２（ｃ）から明らかなとおり、３回目接種後３～４週間経過後に採血した検体において、ＩＣ５０値の平均値は３０．２±２．９ｎＭと低値に収斂し高い抗体価が観察された。

［抗体の抗原結合親和性抗体価の算出］
　３回目接種後採血検体においては、ＩＣ５０値の平均値は最も低くなり、抗体価は高値にまとまった。これまでの抗体価や抗原結合親和性（ＩＣ５０）といったパラメーターに加え、新たなパラメーターとして、抗体の抗原結合親和性抗体価の算出を行うこととした。すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質１抗原タンパク質を用い、コロナウイルススパイクタンパク質１のＲＢＤ抗原に対する抗体の抗原結合親和性抗体価（抗体量×抗原結合親和性；［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎｇ）］）を算出した。

［参考例３］
　図３（ａ）～（ｃ）に示すグラフは、ファイザー社製のｍＲＮＡワクチンを合計３回接種した１６３名（検体群１）の１～３回目の各回の接種後採血検体について抗体量とＩＣ５０（ｎＭ）の逆数とを乗じた、抗体量（ＢＵｇ／ｍＬ）をＸ軸に、抗原結合親和性抗体価［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎｇ）］をＹ軸に表し、各検体の抗体量（ＢＵｇ／ｍＬ）をＸ軸に表し、各検体の抗原結合親和性抗体価と抗体量とをプロットしたグラフである。

　図３（ａ）から明らかなとおり、Ｙを目的変数、Ｘを説明変数として最小二乗法により回帰直線を算出することにより、高抗原結合親和性抗体の式（Ｙ＝０．０５０３Ｘ＋１．２９３）と、低抗原結合親和性抗体の式（Ｙ＝０．００７７Ｘ＋０．７２２）と、初期抗原結合親和性抗体（Ｙ＝０．０００７９Ｘ＋０．７）の式の三種類の式を得た。１回目接種後採血検体において、高い抗原結合親和性を示した検体は全体の３４．４％で、低い抗原結合親和性を示した検体は全体の４９．７％、初期抗原結合親和性を示した検体は１６．０％であった。

　図３（ｂ）から明らかなとおり、Ｙを目的変数、Ｘを説明変数として最小二乗法により回帰直線を算出することにより、高抗原結合親和性抗体の式（Ｙ＝０．０２５１Ｘ－５．７７２）と、低抗原結合親和性抗体の式（Ｙ＝０．０００６Ｘ＋０．９６５４）の式の二種類の式を得た。２回目接種後採血検体において、高い抗原結合親和性を示した検体は全体の ８０．４％で、低い抗原結合親和性を示した検体は全体の１９．６％であった。したがって、ワクチンの２回目の追加接種により抗原結合親和性（アフィニティ）の成熟が進んだことが示された。また、各検体における抗体価が増加しても、高抗原結合親和性、低抗原結合親和性の性質はそのまま維持される傾向があることが、それぞれの線上を抗体価の増加に伴って右に移動する様式で進展して行くことにより確認された。

　図３（ｃ）から明らかなとおり、３回目接種後採血検体において、Ｙを目的変数、Ｘを説明変数として最小二乗法により回帰直線を算出することにより、高抗原結合親和性抗体の式（Ｙ＝０．０３３Ｘ－２．０１８）を得た。そして、高い抗原結合親和性を示した検体は１００％となったことが確認され、アフィニティの成熟はピークに達した。抗原結合親和性の成熟の速さに個人差はあるものの、ワクチン接種を３回繰り返すことで、接種者全員が感染防御能の高い高抗原結合親和性抗体を取得できることが明らかになった。図３（ａ）～（ｃ）には、ワクチンの１回目から３回目接種で観察された初期抗原結合親和性抗体価群、低抗原結合親和性抗体価群、高抗原結合親和性抗体価群の分布する回帰直線が示されている。

　なお、２回目接種後採血検体の検査結果が図３（ｂ）に示されているが、図にはデータを示していないが、その後３回目接種までの６－８ヶ月間に抗体価の減少がみられた。しかし、一度高抗原結合親和性を示すＩＣ５０値にまで成熟した抗体では、抗体量が減少しても抗原結合親和性には変化がないことが確認された。

　上述のとおり、ワクチンの接種回数の増加に伴って、図３（ａ）に示す１回目接種後採血検体で確認された初期抗原結合親和性抗体価群、低抗原結合親和性抗体価群、高抗原結合親和性抗体価群の３群の抗体が、２回目接種後採血検体で低抗原結合親和性抗体価群、高抗原結合親和性抗体価群の２群の抗体となり、３回目接種後採血検体で高抗原結合親和性抗体価群のみの１群の抗体となった。各群の抗体が、どのように有力な評価基準として使用できるかについてさらに検討を進めた。

　３回目接種後採血検体すべてにおける抗体が、高抗原結合親和性抗体価群のみの１群となったことから、Ｘ軸の抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）とＹ軸の抗原結合親和性抗体価［（ＢＵ ｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］とを対数表示（ｌｎ）による分布を示すことにより、高抗原結合親和性抗体価の確定的分布領域設定が可能と考えて、この回帰直線（Ｙ＝－３．１２６＋０．９６６９Ｘ）と９５％信頼区間から算出して、これを高抗原結合親和性抗体価の分布領域とし、その回帰直線と予測値の９５％信頼区間を図４に示した。

　図５では、２回目接種後採血検体抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）と抗原結合親和性抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）の対数表示による分布を示すことにより、高抗原結合親和性群の回帰直線と低抗原結合親和性群の回帰直線とそれぞれの予測値の９５％信頼区間を示した。２回目接種後採血検体の高抗原結合親和性群の回帰直線は、３回目接種後採血検体の高抗原結合親和性群の回帰直線と近似しており、高抗原結合親和性群では２回目から３回目へとほぼ同じ領域を抗体価の高い右側に移行していると推定された。一方、図４との比較において、ワクチン２回目接種者で高抗原結合親和性群と異なる群として初めて出現した群が、低抗原結合親和性抗体価群であるため、低抗原結合親和性抗体価群の領域定義に用いた。この群は最終的な高抗原結合親和性群への移行途上群であることから、９５％信頼区間は幅広い。

　図６では、１回目接種後採血検体の抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）と抗原結合親和性抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）の対数表示による分布を示すことにより、高抗原結合親和性群（Ｙ＝－３．８０７＋１．０１８Ｘ）と低抗原結合親和性群（Ｙ＝－６．２３１＋１．０８Ｘ）、初期抗原結合親和性群（Ｙ＝－６．３７＋０．８４９Ｘ）のそれぞれの回帰直線とその予測値の９５％信頼区間を示した。ここで見られる高抗原結合親和性群の回帰直線は、２回目接種後採血検体、３回目接種後採血検体についての回帰直線と類似しており、高抗原結合親和性群は１回目接種から３回目接種に渡って抗体価の増加に伴って進んで行くと想定された。一方、図５との比較において、１回目接種後採血検体で低抗原結合親和性群と定義した群の回帰直線とその予測値の９５％信頼区間に類似する領域が左側（抗体価の低い領域）への延長線に１回目接種後採血検体の低抗原結合親和性群の領域が位置していると推定した。さらに、高抗原結合親和性群、低抗原結合親和性群には当てはまらない新たな極低親和性の抗体群の存在が確認され、これを初期抗原結合親和性群と定義した。この領域は親和性成熟の移行期の初期段階と想定され、予測値の９５％信頼区間も最も広い。

　図７は、３回目接種後採血検体から得られた高抗原結合親和性群、２回目接種後採血検体から得られた低抗原結合親和性群、１回目接種後採血検体から得られた初期抗原結合親和性群のそれぞれの抗体について、対数表示抗体価　ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ）と抗原結合親和性抗体価 ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）をプロットしたグラフにおける回帰直線とその予測値の９５％信頼区間を示す。

（検体の統計処理）
　１回目接種後採血検体（１ｐｏｓｔ）、２回目接種後採血検体（２ｐｏｓｔ）、３回目接種後採血検体（３ｐｏｓｔ）について、それぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ１タンパク質特異抗体の抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）と、ＩＣ５０（ｎＭ）値、そして新たに（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）の単位で示される抗原親和性抗体価を解析することとした。データは、解析のため自然対数変換され、総乗のｎ乗根をとることによって得られる幾何平均値（ＧＭ）と幾何ＳＤ（ＧＳＤ）により要約された。接種後採血検体における抗体価、ＩＣ５０、抗原親和性抗体価についての幾何平均値（ＧＭ ｖａｌｕｅ）と幾何平均ＳＤ値（ＧＭ ＳＤ）の推移をまとめた結果を以下の表１に示す。データは、統計ソフトウェアＳＰＳＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２２）（ＩＢＭ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を用いて解析した。

（抗体価の推移）
　１回目接種後採血検体に比べて、２回目接種後採血検体の抗体価の幾何平均値の増加率は約３．９倍であり、１回目接種後採血検体に比べて、３回目接種後採血検体の抗体価の幾何平均値増加率は約５倍であった。したがって、２回目の接種効果が特に大きいことがわかった。

（抗原結合親和性抗体価の推移）
　１回目接種後採血検体に比べて２回目接種後採血検体の抗原結合親和性抗体価の幾何平均値の増加率は約１４．８８倍であった。１回目接種後採血検体に比べて、３回目接種後採血検体の抗原結合親和性抗体価の幾何平均値の増加率は３２倍であり、接種回数が多くなるに伴い増加率が大きくなった。したがって、抗原結合親和性抗体価［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］を感染防御能や入院予防効果、又は感染重症化阻止能の指標として用いることが有用である可能性が提示された。

［実施例２］
［検体群２］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者の抗原特異的親和性抗体価調査は、２０２０年３月から２０２１年６月末までの期間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が疑われ、ＰＣＲ検査でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認されたワクチン未接種者であって、昭和大学病院、琉球大学病院、国立病院機構沖縄病院に入院した患者を調査対象とした。インフォームドコンセントのもとに承諾が得られた被験者の血清を検体として解析に用いた。したがって、これらの被験者は、全員ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン未接種者である。

　上記昭和大学病院の内科、呼吸器・アレルギー内科、琉球大学感染症・呼吸器・消化器内科、国立病院機構沖縄病院呼吸器内科へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染入院患者で、入院時検体と退院時の検体（退院時の検体の無い場合は、発症から２－３週目の検体）のそろっている合計３３９例を調査対象とすることとした。入院時の検体と、２－３週目に退院した患者（被験者）の退院時の検体、及び発症から２－３週目の検体を採取した被験者について、４分類の重症度(非特許文献４)の結果を以下の表２に示す。

　重症度について４分類された患者（ｎ＝３３９）の入院時と退院時の抗ウイルス抗体価（抗体量）（ＢＵｇ／ｍＬ）と、ＲＢＤに対する抗原結合親和性パラメーターのＩＣ５０（ｎＭ）値、抗原結合親和性抗体価［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］の値を以下の表３に示す。

　上記表３に示すように、入院時から、大多数の患者が退院する発症から２－３週目までの期間中に感染者は抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）、抗原結合親和性パラメーターのＩＣ５０（ｎＭ）値、抗原結合親和性抗体価［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］は共に増加の傾向を示したが、前記表１に示す１回目ワクチン接種後採血検体における抗体価、ＩＣ５０（ｎＭ）値、抗原結合親和性抗体価［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］と比べて増加傾向は弱く、最も増加傾向が大きく感染防御能の増進した中等症IIの患者の退院時抗体価とＩＣ５０値が、検体群１における初回のワクチン接種後の値に近似していた。その他の軽症者、中等症I、重症者の発症から２－３週目の抗体価、ＩＣ５０値、抗原結合親和性抗体価は、検体群１における初回のワクチン接種後の値に及ばなかった。

［ＲＯＣ解析］
　より精密な解析を行うために、ＲＯＣ解析を行った。日本におけるコロナウイルスオミクロン株出現以前で、コロナウイルス感染環境の大きく変化していない２０２０年３月から２０２１年１０月末までの期間で、２０２１年２月～９月の間に３回のワクチンを接種し、コロナウイルス感染が発症しておらず、抗体産生が相当程度なされていると考えられる前記１６３名（検体群１＝入院（－）群）の３回目接種後採血検体における数値を陰性（非入院者陰性）とし、上記とほぼ同じ時期の２０２０年３月から２０２１年６月末までの期間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染がＰＣＲ検査で確認されて入院した上記３３９名のいわゆる新型コロナウイルス罹患した患者（検体群２＝入院（＋）群）の入院時採血検体における数値を陽性として、抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）、抗原結合親和性パラメーターのＩＣ５０（ｎＭ）値、抗原結合親和性抗体価［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］の値についてそれぞれＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ（ＲＯＣ曲線、ＪＭＰｆｒｏｍＳＡＳ解析）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒ．５．４（ＧｒａｐｈＰａｄ社）、ＪＭＰ１４（ｊｍｐ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ^ＴＭ）を用いて解析を行い、抗原結合親和性抗体価、ＩＣ５０値、抗体価について、それぞれの入院を必要としないカットオフ値を算出した。

　上記ＲＯＣ解析の結果、図８に示すとおり、抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）のカットオフ値は、２４２１．０（ＢＵｇ／ｍＬ）（７．８ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ））と計算され、ＡＵＣ： ０．９７５、感度：０．９５９、特異度：１．０であった（図８（ａ））。さらにＩＣ５０（ｎＭ）のカットオフ値は、４０．６ｎＭで、ＡＵＣ：０．９８７、感度：０．９５９、特異度：０．９９４であった（図８（ｂ））。抗原結合親和性抗体価［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］のカットオフ値は、７４．４［（ＢＵｇ／ｍ Ｌ）／ＩＣ５０（ｎＭ）］４．３ｌｎ［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］と計算され、曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９８０、感度：０．９７４、特異度：１．０であった（図８（ｃ））。

　図９に、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者（検体群２）の入院時採血検体について、Ｘ軸に抗体価［ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ）］でＹ軸に抗原結合親和性抗体価［ｌｎ（ＢＵｇ／ｍ Ｌ）／ＩＣ５０（ｎＭ）］で表したグラフにプロットし、さらに上記ＲＯＣで得られた抗体価のカットオフ値（７．８ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ））をＹ軸と平行に、抗原結合親和性抗体価のカットオフ値（４．３ｌｎ［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）］）をＸ軸と平行に記載したグラフを作製した。さらに、図７において作成したワクチン接種後採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価の対数表示による分布を示すグラフにおいて、高抗原結合親和性群と低抗原結合親和性群、初期抗原結合親和性群の回帰直線とその予測値の９５％信頼区間を重ね、検体群２の入院時採血検体について、入院時に重症度分類した患者を軽症（△）、中等症I（■）、中等症II（□）、重症（×）に分類して表記した。

　図９から明らかなとおり、入院時採血検体については、９名のみが、図７における高抗原結合親和性群が属する区画にプロットされたが、残りの３３０名（９７．３５％：３３０／３３９×１００）が上記ＲＯＣ解析によるカットオフ値７４．４［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］以下、及び／又は、４．３ｌｎ［（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０ｎＭ］以下を示した。

　図１０に、上記検体群２の退院時を含む発症２－３週後の採血検体について、Ｘ軸に抗体価［ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ）］でＹ軸に抗原結合親和性抗体価［ｌｎ（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ）］で表したグラフにプロットし、さらに上記ＲＯＣで得られた抗体価のカットオフ値をＹ軸と平行に、抗原結合親和性抗体価のカットオフ値をＸ軸と平行に記載したグラフを作製した。さらに、図７において作成したワクチン接種後採血検体の抗体価と抗原結合親和性抗体価の対数表示による分布を示すグラフにおいて、高抗原結合親和性群と低抗原結合親和性群、初期抗原結合親和性群の回帰直線とその予測値の９５％信頼区間を重ね、検体群２の退院時採血検体について、退院時に重症度分類した患者を軽症（△）、中等症I（■）、中等症II（□）、重症（×）に分類して表記した。

　図１０から明らかなとおり、退院時において、２７名（８．０％）のみが、図７における高抗原結合親和性群が属する区画にプロットされたが、残りの９２.０％は高抗原結合親和性群以外が属する区画にプロットされた。このように、入院期間内の患者の感染防御能は、抗体価、抗原親和性抗体価において、再感染防御を示唆する区画にまでの増加は認められなかった。しかし入院期間中に低抗原結合親和性群、初期抗原結合親和性群の区画にプロットされている症例が増加していることから、感染防御能の獲得に向けて進んでいることは確認された。

　以上のとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者は、入院期間を経ても、再感染防御能を有する程度の抗原結合親和性の高い抗体をほとんど獲得していないことが確認され、ワクチン接種が推奨されることが確認できた。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスレセプター（ＡＣＥ２）を発現しているｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ ２９３Ｔ細胞とＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞を用いて、Zhang S, Gao C, Das T, Luo S, Tang H, Yao X, et al., J Immunol Methods. 2022; 503:113244に記載されている疑似ウイルスを用いる方法に従い、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ^ＴＭ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐａｃｈａｇｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｈｏｔｓキット（Ｄ６１４Ｇ Ｓｐｉｋｅ，Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染機序を保ちながら、ヒト細胞内で感染性ウイルスを産生しない疑似Ｌｅｎｔｉウイルスを作成して試験を実施した。ウイルスの細胞への感染測定は、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＧｏＳｔｉｘ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社製）のキットを用い、図１１のＹ軸に示すとおり、感染細胞を染色して感染細胞数を測定した。図１１のＸ軸に示すＩＣ５０（ｎＭ）は、図２の測定時のＩＣ５０（ｎＭ）と同じである。

　図１１に示すように、低値のＩＣ５０（ｎＭ）値（高抗原結合親和性）を示す検体では、感染細胞数は０－１０％の低値を示し、高値のＩＣ５０（ｎＭ）値(初期、低抗原結合親和性）を示す検体では、感染細胞数は５０－９０％の高値を示した。このように両者の測定値には高い相関（ｒ＝０．８１１）があることを確認した。このことから、ＩＣ５０（ｎＭ）を用いたパラメーターの抗原結合親和性抗体価の総和値、ＡＢＡＴは、感染防御能の総和値として使用できることが示された。これによりＲＢＤに対する抗ウイルス抗体のＩＣ５０（ｎＭ）が感染防御能を示している明確な根拠が示された。

Claims (6)

1. 対象由来の試料中のコロナウイルスの抗原タンパク質に対する抗体の、抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）と、抗原結合親和性抗体価（抗体価（ＢＵｇ／ｍＬ）／ＩＣ５０（ｎＭ））とを指標として、以下に示すコロナウイルス感染症の（１）～（５）の評価項目の１又は２以上の情報を提供する方法。
   （１）コロナウイルス感染症用ワクチン接種の必要性の判定
   （２）感染で重症化するハイリスク者の同定
   （３）コロナウイルス感染症罹患者の予後予測 
   （４）コロナウイルス感染症の集団免疫の達成度の評価
   （５）コロナウイルス感染症用ワクチンの有効性の評価
2. 抗体がＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 指標が、コロナウイルス抗原タンパク質に対する抗体の抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値と、抗体のコロナウイルス抗原タンパク質に対する抗原結合親和性抗体価に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値とに基づき作成されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
4. コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
5. コロナウイルスの抗原タンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であることを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 抗体の結合部位が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合部位であることを特徴とする請求項５記載の方法。