JP2021167805A - ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するための方法および試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を初期診断するため、高感度、特異的で、より信頼できる手段および方法を提供する。
【解決手段】患者からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＡクラス抗体、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断する方法。さらにＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ感染症の間を好ましくは区別するための方法であって、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断する方法と、コロナウイルス感染症を鑑別診断(differential diagnosis)するための方法に関し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するため、またはコロナウイルス感染症の鑑別診断のため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１の感染症との間を好ましくは区別するための、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用に関し、さらに、好ましくは診断的に有用な担体にコーティングされた、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドと、配列番号１に対する抗体と、洗浄バッファーと、抗体（好ましくはＩｇＡクラス抗体）の存在を検出する手段と、好ましくはＩｇＡクラス抗体類に特異的に結合する二次抗体と、好ましくは検出可能な標識と希釈バッファーとを含む群の１つまたは複数、好ましくは全ての試薬とを含むキットに関する。

２０１９年の終わりに、未知の病原体による増大する数の肺炎患者が、中国湖北省の省都である武漢市から、中国のほぼ全土まで出現した。新型コロナウイルスがその系統発生学、分類学および慣行に基づいて分離された。コロナウイルス研究グループ（ＣＳＧ: Coronavirus Study Group)は、これを重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１）の姉妹型と認識し、これを重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）として分類した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は、一般的にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１および中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）よりも病原性が低いが、感染性が比較的高い。症状が軽度であり得、感冒と混同され得るため、患者が感染していると気づかずに、ウイルス拡散をさらに助ける危険がある。

ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は、４つの主要な構造タンパク質、具体的にはスパイク（Ｓ）タンパク質と、エンベロープ（Ｅ）タンパク質と、膜（Ｍ）タンパク質と、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質とを有するコロナウイルスである。Ｎタンパク質はＲＮＡゲノムを保持し、他の３つの構造のタンパク質はウイルスエンベロープの成分である。Ｓタンパク質は、ウイルスが宿主細胞の膜に付着および融合するのを可能にすることを担う。Ｓタンパク質は付着を媒介するＳ１ドメイン、およびウイルス細胞膜と宿主細胞の融合を媒介するＳ２ドメインを含む。Ｓ１ドメインは、ヒト宿主細胞上の受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）への結合部位である受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。したがって、ＲＢＤは、ウイルスとその宿主細胞との間の相互作用を遮断し、よって、免疫を与える中和抗体の結合部位である。高い死亡率および重病に関連するＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と対照的に、コロナウイルス２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３およびＨＫＵ１などの、軽度の一時的な病気に関連する他のコロナウイルスが存在する。これらのコロナウイルスは、一般的な感冒、特に子供の間での感冒に頻繁に関連している。

高い感染性および健康への影響のために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断する信頼できる方法が最も重要である。過去には、コロナウイルスによる感染症を検出および確認するために、血清学的方法とリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法の組み合わせが使用された。

ＲＴ−ＰＣＲ法は、目的のコロナウイルスの１つまたは複数の核酸、より具体的にはウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）の検出に基づく。ＲＴ−ＰＣＲ法は迅速で、咽頭または鼻咽頭スワブからの試料に基づき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出するために病気の最初の１週間の間に使用することができる。しかしながら、その有用性はいつまで核酸が試料中で検出可能であるかに大いに依存し、これはウイルスによって異なる。特に、疾患の初期段階で得られた試料で実施された診断検査からの陰性結果は無意味であり得る。さらに、一般的に、患者の上気道からの試料が必要である。このような試料の不適切もしくは不十分な回収、長い輸送時間および関連するウイルスＲＮＡの分解、または機器の異常も偽陰性結果につながり得る。そのため、感染の１週目の試料および３〜４週間後に得られた追跡試料の、いくつかの試料を検査すべきである。

Ｃｏｒｍａｎらは、ＷＨＯによってそのウェブページ上に２０２０年１月に最初に公開された、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検出についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを公開している（非特許文献1）。

血清学的検査も頻繁に使用される。これらの検査は、ある特定のウイルス特異的抗原に対する抗体の検出に基づく。しかしながら、血清学的アッセイも深刻な障害に悩まされている。１つの頻繁に観察される課題は、その限られた感度である。血清学的アッセイが陽性結果をもたらすためには、患者の血液中にウイルス抗原特異的抗体が存在することが必要である。一般的に、新たなウイルスによる感染後に、抗体が最初に産生され、検出可能になる時点は、ウイルス自体、ウイルス量、すなわち、所与の量の患者の血液中のウイルスの量、患者関連因子、例えば年齢、性別、健康状態、免疫状態等、目的の抗体の免疫グロブリンクラス、および診断検査を設定するために選択される抗原標的を含む、多数の因子に依存するので、予測することができない。特に、疾患の極めて初期段階、すなわち、患者の体が検出可能な量の特異的抗体応答を開始することができるようになる前では、感染が進行しているにもかかわらず、血清学的アッセイが陰性結果を与える可能性がある。検出される抗体がある特定の免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスに属するかどうかを考慮した、さらなる血清学的検査が、疾患の経過を監視し、急性感染症を過去の感染症またはワクチン接種と区別するのに役立ち得る。したがって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１感染症を含むウイルス感染症の検出に現在利用可能なほとんどの血清学的アッセイは、ＩｇＧ、またはＩｇＧとＩｇＭクラス抗体の検出に焦点を当てている。しかしながら、抗体応答の固有の遅延により、特に感染の極めて初期段階で、偽陰性結果を与えるリスクに加えて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１感染症を診断するための血清学的アッセイはまた、おそらく一般的な季節性コロナウイルス（ＣｏＶ）に対する抗体の集団における高い血清有病率および免疫原性ウイルスタンパク質の保存された部分に対する交差反応性抗体の関連する存在のために、偽陽性結果になりやすい。このような抗原的に密接に関連する季節性コロナウイルスに対するこの交差反応性はまた、鑑別診断、例えば生命を脅かす変異株ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１と他のコロナウイルスの区別も許可しなかった。コロナウイルスを診断および区別するための、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１を診断するための血清学的アッセイの課題および落とし穴は、非特許文献２に概説されている。初期コロナウイルスの血清学的診断に関連するこれらの複数の課題、例えば感染の初期段階での感度の低さと、交差反応性抗体の存在によって引き起こされる特異性の低さは、また、最近出現した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）を検出するための診断アッセイにも当てはまる。

進行中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のパンデミックによって引き起こされる現在の深刻な脅威および対応する感染症を診断するために利用可能なアッセイの上記の課題を考慮して、よりターゲットを絞ったウイルス特異的で、よってより有効な処置を可能にするために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断する、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を初期診断するため、さらに、一般的な季節性コロナウイルスなどの他のコロナウイルスによる感染症と区別するための改善された、特により高感度で、より特異的で、よってより信頼できる手段および方法が当該技術分野で緊急に必要とされている。

本発明は、これらの以前の障害を克服する診断の手段と方法を提供することによってこの必要性に対処する。
具体的には、本発明は、限定することを意図しないが、以下の課題に対処する。
本発明によって対処される１つの課題は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の初期血清学的検出のためのアッセイおよび試薬を提供することである。たとえ陰性ＰＣＲ結果が得られたとしても、患者は依然として活性疾患を患っており、感染性を有する場合があるので、これは特に重要である。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）が、患者は症状を発症してから少なくとも１０日間、そして重症の場合は最大２０日間隔離されたままであることを推奨していることに注意されたい。
本発明によって対処される別の課題は、既知のコロナウイルス感染症、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を他のコロナウイルス感染症、好ましくは軽度の感冒様症状に関連するコロナウイルスまたは他の病原体またはこのような症状の原因と区別するために使用され得るアッセイを提供することである。好ましくは、感染症を初期段階で区別することができるべきである。
本発明によって対処される別の課題は、特に感度および／または特異性、好ましくは感度に関して、高い最適化された信頼性を有するアッセイを提供することである。
本発明によって対処される別の課題は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質に対する抗体を欠くか、ＩｇＭクラス抗体を欠く患者についての高感度のアッセイを提供することである。
本発明によって対処される別の課題は、長期間継続する高い感度を有するアッセイを提供することである。

コロナウイルス感染症を診断するための以前のアッセイは、例えば、以下の文献に記載されている。特許文献１は、試料中のウイルスタンパク質性抗原に対する抗体を検出する血清学的アッセイを含む、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）感染症を診断するためのアッセイを開示している。しかしながら、このようなアッセイの実際的な証拠は示されていない。特許文献２は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１に関連する方法および薬剤を開示している。ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質が主要な診断抗原と考えられる。特許文献３は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１関連Ｓタンパク質の変異体および試料中のその存在、またはこれに結合する抗体の存在の検出を開示している。特許文献４は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１感染症を診断するためのペプチドを開示している。Ｈｓｕｅｈらは、ＩｇＧを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１感染症の発症４日後という早さで、ＩｇＭおよびＩｇＡと同時またはこれよりも１日早く検出することができることを報告した（非特許文献３）。Ｒｅｕｓｋｅｎらは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質断片に対する抗体の特異的であるが、必ずしも高感度ではない検出を開示している（非特許文献４）。非特許文献５は、具体的な抗原を示すことはなく、免疫学的方法がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を検出するために使用され得るが、低い感度および特異性を伴うことを開示している。

国際公開第２０１４／０４５２５４号 米国特許出願公開第２００５／０１１２５５９号 国際公開第２００５／１１８８１３号 米国特許出願公開第２００６／０１８８５１９号

Ｃｏｒｍａｎ ＶＭ，Ｌａｎｄｔ Ｏ，Ｋａｉｓｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９−ｎＣｏＶ）ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ．Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．２０２０；２５（３）：２００００４５．ｄｏｉ：１０．２８０７／１５６０−７９１７．ＥＳ．２０２０．２５．３．２００００４５ Ｍｅｙｅｒ， Ｄｒｏｓｔｅｎ ＆ Ｍｕｌｌｅｒ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９４（２０１４）；１７５−１８６ (Ｍｕｌｌｅｒのｕはウムラウト付) Ｈｓｕｅ，Ｐ．Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｋａｏ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ Ｐ．Ｃ．（２００４）Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＧ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１０（１２），１０６２−１０６６ Ｒｅｕｓｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｒｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ． Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．２０１３；１８（１４） Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｍｅａｓｕｒｅｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ａｎｄ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ ｉｎ Ｗｕｈｎ，Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２２（２０２０），７４−７９

上記課題は、本明細書および特許請求の範囲に記載されている本発明によって解決される。

第１の態様では、本発明は、患者からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＡクラス抗体、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断する方法を提供する。配列番号への言及が本明細書全体を通してなされ、配列番号がアミノ酸配列を示す場合はいつでも、その関連で、「ポリペプチド」という用語に具体的に言及されていない場合であっても、前記対応するアミノ酸列を含むポリペプチドを示すことを意図している。「含む」という用語は、本発明に関連して２つの意味、すなわち、「含有する」と「からなる」という意味を有する。

第２の態様では、本発明は、コロナウイルス感染症の鑑別診断のための、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ感染症の間を好ましくは区別するための方法であって、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含む方法を提供する。
好ましい実施形態では、配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体に加えて、配列番号１に対するＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体の存在が検出される。

本発明によると、「対象」または本明細書で互換的に呼ばれる「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指すが、代わりに、ヒト以外の霊長類もしくは他の哺乳動物などの異なる哺乳動物、または配列番号１もしくはその変異体に対する抗体を産生することができる哺乳動物以外の動物さえも指し得る。
本発明によると、対象からの「試料」という用語は、抗体を含み得る前記対象の任意の体液または組織の試料であり得る。例示的な体液としては、例えば、血液、唾液、鼻粘液またはリンパ液が挙げられる。好ましい実施形態では、試料が、好ましくは全血、血清、血漿、毛細管血、動脈血、静脈血またはこれらの任意の混合物を含む群から選択される血液試料である。毛細管血は、好ましくは乾燥した血液スポットの形態をとり、患者によって用意され、実験室に送られ、引き続いて血液を抽出され得る。当業者であれば、本明細書に開示される方法、生成物および使用の目的に適した、必要な量の対象からの試料を得るために適用され得るさまざまな手段および方法を知っている。ある特定の実施形態では、医師によって試料が対象から得られ、他の場合では、例えば、指先からの血液採取（「フィンガースティック血液」）などの最小限の侵襲的手段を使用することによって、対象自身が試料を用意することができる。

本明細書に開示される発明の目的のために、試料が、単一対象、すなわち、単一の個人に由来してもよいが、代わりに２人以上の対象からの試料を含んでもよく、２人以上の対象からの前記試料が単一試料にプールされることも理解される。例えば、ある特定の場合、最初に対象のグループ（例えば、共通の世帯、学校のクラス、スポーツチームまたは同じ会社の部門のメンバー）からの試料を含むプール試料を分析し、配列番号１またはその変異体に対する抗体の存在が検出された場合にのみ、個々の対象からの試料を別々にアッセイする第２の分析を行うことが、資源および実験時間の点でより効率的となり得る。

本発明によるさまざまな方法または使用を本明細書に記載される対象からの試料で行うことができる。これらの方法または使用はまた、「インビトロ」法または「インビトロ」使用として特徴付けることもできる。

本発明によると、「二次抗体」という用語は、広義に、選択された種、好ましくはヒト種の特定のＩｇクラスの定常ドメインなどの、ＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭクラス抗体あるいはこれらの断片に特異的に結合することができる任意の種類の「結合部分」（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）、好ましくは結合タンパク質を指すと理解されるべきである。結合部分の非限定的な例としては、抗体、例えば任意の種、例えばヒト、ニワトリ、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、サメ、ヤギ、齧歯類、ウシ、イヌ、ウサギ等から免疫学的または遺伝的に誘導された抗体、抗体断片、そのドメインまたは部分、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、ＶＬＲなど、ダイアボディ、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ｍＡｂｄＡｂ、ファージディスプレイ由来バインダー、アフィボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、二重特異性抗体、エビボディ（ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン、アンチカリン、アフィボディ、アビマー、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ、トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、Ｃ型レクチンドメイン、例えばテトラネクチン（ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン由来バインダー、例えばアフィリン、ＰＤＺドメイン由来バインダー；サソリ毒および／またはクニッツ型ドメインバインダー、フィブロネクチン由来バインダー、例えばアドネクチン、受容体、リガンド、レクチン、ストレプトアビジン、ビオチン（これらの結合分子の２つ以上から形成される二重／三重特異性フォーマットなどのこれらの誘導体および／または組み合わせを含む）が挙げられる。その作製方法を含む、さまざまな抗体由来および代わりの（すなわち、非抗体）結合タンパク質足場が当技術分野で知られている（例えば、Ｃｈｉｕ ＭＬ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂａｓｅｌ），（２０１９）；８（４）：５５； Ｓｉｍｅｏｎ Ｒ．＆Ｃｈｅｎ Ｚ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．（２０１８）；９（１）：３−１４； およびＣｈａｐｔｅｒ ７ Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｒｏｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２００７）ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌに概説）(Ｄｕｂｅｌのｕはウムラウト付)。

これら全ての種類の分子が当技術分野で周知である。いくつかの例を本明細書の以下でより詳細に説明する。

「エビボディ類」（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）は、Ｔ細胞表面受容体細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）の可変（Ｖ）セットＩｇ様足場に由来する操作された結合タンパク質である。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特異性を与えることができる。エビボディを作製する方法は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第７１６６６９７号に記載されている。

「リポカリン類」（Ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ）は、ステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質などの疎水性小分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。これらは、異なる標的抗原に結合するように操作され得る円錐構造の開いた末端にいくつかのループを有する硬いβシート二次構造を有する。本発明により「アフィリン」とも呼ばれる「アンチカリン」は、１６０〜１８０個の間のアミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する（Ｒｏｔｈｅ Ｃ＆Ｓｋｅｒｒａ Ａ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ．（２０１８）；３２（３）：２３３−２４３；Ｇｅｂａｕｅｒ Ｍ＆Ｓｋｅｒｒａ Ａ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１９）；６０：２３０−２４１）。

「アフィボディ類」（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）は、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに由来する抗体ミメティックのファミリーである。アフィボディは、構造的に三重らせん束ドメインに基づく。アフィボディは、およそ６ｋＤａの分子質量を有し、高温および酸性またはアルカリ性条件下で安定である。標的特異性は、親タンパク質ドメインの結合活性に関与する２つのαヘリックスに位置するアミノ酸のランダム化によって得られる（Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈ，Ｊ ＆ Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ，Ｖ．（２０１２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１０３−１２６）。アフィボディを作製する方法は当技術分野で知られており、Ｗｉｋｍａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．（２００４）；１７（５）：４５５−６２に記載されている。

「アビマー類」（Ａｖｉｍｅｒｓ）は、複数の結合部位を介してある特定の抗原に特異的に結合する人工的なマルチドメインタンパク質のクラスである。このタンパク質はまた、「マキシボディ」または低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）ドメインＡとしても知られている。これは、Ａドメインに基づく、２つ以上の（ポリ）ペプチド配列からなる。Ａドメインは、細胞外システインリッチ細胞表面受容体タンパク質に由来し、ジスルフィド結合形成およびカルシウムイオンの錯化によって安定化された３０〜２５アミノ酸足場（約４ｋＤａ）である。足場構造は１２個の保存されたアミノ酸によって維持され、残りの全ての非保存残基はランダム化およびリガンド結合に修正可能なままである。アビマーは高度な熱安定性を有する。サイズが小さいため、アビマーは通常、それぞれが標的上の異なる部位に結合する複数のＡドメインからなり、それによって、結合活性を通して増加した親和性を達成する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１５５６−１５６１）。

「ＤＡＲＰｉｎ類」は、設計されたアンキリンリピートドメインであり、それぞれβターンおよび２つの逆平行αヘリックスを形成する密接充填アンキリンリピートに基づく。ＤＡＲＰｉｎは通常、人工コンセンサス配列に対応する３つのリピートを有し、単一リピートは、典型的には３３個のアミノ酸からなり、そのうちの６個が結合表面を形成する。組換えライブラリー設計中、これらの部位を使用してランダムアミノ酸のコドンを導入する。ＤＡＲＰｉｎは、典型的には疎水性領域を遮蔽する、Ｎ末端モチーフとＣ末端モチーフとの間に含まれる結合モチーフのうちの２つまたは３つによって形成される。ＤＡＲＰｉｎは、極めて熱安定性で、プロテアーゼおよび変性剤に耐性の小タンパク質（約１４〜１８ｋＤａ）である（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２０１５）；５５：４８９−５１１）。(Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎの最初のｕはウムラウト付)

「クニッツ型ドメインバインダー類」（Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｅｒｓ）は、アプロチニン（ウシ膵臓トリプシンインヒビター）、アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質および組織因子経路インヒビターなどのクニッツ型プロテアーゼ阻害剤の活性モチーフに由来する約６０アミノ酸ポリペプチド（約７ｋＤａ）である。クニッツ型ドメインの疎水性コアは、ジスルフィド結合の３つのペアによって安定化されたねじれた二本鎖逆平行βシートおよび２つのαヘリックスで構成される。３つのループの残基を、構造フレームワークを不安定化することなく置換することができる（Ｈｏｓｓｅ ＲＪ ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １５：１４−２７； Ｓｉｍｅｏｎ Ｒ．＆ Ｃｈｅｎ Ｚ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．（２０１８）；９（１）：３−１４）。

「アドネクチン類」（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる足場を有する結合タンパク質のクラスである。この分子は、いくつかの鎖が免疫グロブリンと同様に６つのループによって接続されているが、ジスルフィド結合を有さないβサンドイッチ折り畳みを採用する。βサンドイッチの一端の３つのループを操作して、アドネクチンが目的の標的を特異的に認識することができるようにすることができる。非ループ残基も利用可能な結合フットプリントを拡大することが分かっている。ナノモル濃度〜ピコモル濃度範囲の結合親和性を有するリガンド結合アドネクチン変異体は、ｍＲＮＡディスプレイ、ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイを介して選択されている（Ｈａｃｋｅｌ ＢＪ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８１：１２３８−１２５２）。

限定されないが、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体などの所望の標的構造に対する、本明細書の上記のものを含む、さまざまな足場の適切な結合分子の開発、スクリーニングおよび同定のための手段および方法が当技術分野で周知であり、日常的に使用されている。例示的な現在日常的に実施されている方法としては、限定することを意図するものではないが、ハイスループット（ＨＴ）コンビナトリアルライブラリーベースのディスプレイおよび選択方法、例えばファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイおよび細胞表面ディスプレイ（例えば、酵母ディスプレイ）が挙げられる。

好ましい実施形態では、二次抗体が、ヒト以外の種で産生される免疫グロブリン（Ｉｇ）、好ましくはＩｇＧであり、前記二次抗体が、別の選択された種、好ましくはヒト種の１つまたは複数の特異的Ｉｇクラスの免疫グロブリンまたはその断片（例えば、特定のＩｇクラスの定常ドメイン）に特異的に結合する。例としては、ヒトＩｇＡを特異的に認識する、ヤギで産生されるポリクローナル抗体（例えば、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体）がある。別の好ましい実施形態では、二次抗体が、別の選択された種、好ましくはヒト種の１つまたは複数の特異的Ｉｇクラスの免疫グロブリンまたはその断片（例えば、特定のＩｇクラスの定常ドメイン）に特異的に結合するモノクローナル抗体である。１つまたは複数の選択された標的抗原の特異的結合を可能にする（モノ−またはポリクローナル）抗体を作製するための手段および方法は当技術分野で周知である。

ある特定の実施形態では、二次抗体が、ただ１つの、ただ２つの、または３つ全てのクラスのＩｇ抗体、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭに特異的に結合するように選択され得る。ある特定の実施形態では、ただ１つの単一種類の二次抗体を使用する代わりに、いくつかの異なる二次抗体の混合物が使用され得、異なる二次抗体が同じ１つのもしくは異なるＩｇクラス（例えば、全てＩｇＡに結合する異なる抗体の混合物（例えば、ポリクローナル抗体））または例えば、ＩｇＡとＩｇＧまたはＩｇＭに結合する、あるいは異なる二次抗体が異なる個々の標的構造に結合する（例えば、ある種類の二次抗体がＩｇＡに特異的に結合し、別のものがＩｇＧに特異的に結合する）。

好ましい実施形態では、配列番号１に対する抗体が、標識二次抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭクラス抗体に結合する標識二次抗体を使用して検出される。

本明細書で使用される場合、二次抗体に関する「標識化」（ｌａｂｅｌｅｄ）という用語は、二次抗体が、限定することを意図するものではないが、フルオロフォア、例えば小型有機化学フルオロフォアもしくは蛍光タンパク質、または酵素活性標識、すなわち、その存在を基質物質との反応性および／またはその変換に基づいて評価および場合により定量化することができる酵素、例えばアルカリホスファターゼなどの、検出可能なシグナルを提供する放射性薬剤または他の分子などの検出可能な物質をカップリング、好ましくは物理的に連結することによって標識される実施形態を包含することを意図している。さまざまな適切な検出可能な標識が当技術分野で知られており、そのうちのいくつかを本明細書でも以下に説明する。

好ましい実施形態では、抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＭクラス抗体が、比色分析、免疫蛍光法、酵素活性の検出、化学発光および放射活性を含む群から選択される方法を使用して検出される。

好ましい実施形態では、感染症が初期段階で検出される。好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の経過の文脈において本明細書で言及される「初期段階」（ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ）という用語が、感染の時点が分かっている場合、例えば実験室実験での対象の感染では、感染の時点、すなわちウイルスと対象の体との間の初期接触の時点の後１４日未満、好ましくは６日未満以内の任意の時点を指す。別の好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の経過の文脈において本明細書で言及される「初期段階」という用語が、発症後（ウイルス学の分野では、「発症後日数（ｄｐｏｉ：ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｉｌｌｎｅｓｓ）」とも呼ばれる）、すなわち本明細書で定義されるような、１つまたは複数の典型的なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症関連臨床症状の最初の発生後、１４日未満、好ましくは６日未満以内の任意の時点を指す。当業者であれば、感染すると、コロナウイルスの成分を、例えば試料中の核酸を検出するためのＰＣＲおよびウイルス抗原を検出するためのイムノアッセイを使用して、直接検出することができることを知っている。おそらくは患者のウイルスとの最初の接触のほんの数日後、最大ウイルス量を有する感染症のピークののち、ウイルスの濃度は低下し、直接検出をどんどん困難にし、最後にウイルスが試料中に存在しないくなると、不可能となる。一方、ウイルス成分が患者の血液中に存在するとすぐに、ウイルス成分に対する抗体の産生が誘因される。別の好ましい実施形態では、「初期段階」という用語が、患者のウイルスとの最初の接触または発症、好ましくは発症と、ウイルスに対する検出可能なＩｇＧ抗体の産生、より好ましくはＩｇＧ抗体が主な免疫グロブリンクラスとなる、すなわち、ＩｇＡおよびＩｇＭよりも高濃度で存在する前や、最も好ましくはＩｇＧ濃度がピークに達する前との間の時間窓を指す。よって、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体の検出が、完全なＩｇＧ免疫応答が発生する前であるが、検出可能な症状を有しても有さなくても、急性の感染症の診断に寄与し得る。

第３の態様では、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するため、またはコロナウイルスの鑑別診断のため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の感染症と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１の感染症を好ましくは区別するための、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用を提供する。

好ましい実施形態では、使用が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の初期診断または初期段階診断のためのものである。

第４の態様では、本発明は、好ましくは診断的に有用な担体にコーティングされた、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドと、配列番号１に対する抗体、洗浄バッファー、好ましくは検出可能な標識を含む、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭクラス抗体、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出する手段、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ、より好ましくはＩｇＡクラス抗体に特異的に結合する二次抗体、および希釈バッファーを含む群の１つまたは複数、好ましくは全ての試薬とを含むキットを提供する。

好ましい実施形態では、診断的に有用な担体が、ビーズ、好ましくは磁気または常磁性ビーズ、試験片、マイクロタイタープレート、好ましくはニトロセルロースメンブレン、ウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットを含む群のメンブレン、側方流動装置、ガラス表面、スライド、マイクロアレイ、クロマトグラフィーカラムならびにバイオチップを含む群から選択され、好ましくはマイクロタイタープレートである。

好ましい実施形態では、キットが２つ以上、好ましくは３つ以上の較正物質を含む。

好ましい実施形態では、各較正物質が、好ましくはＩｇＡクラス抗体に結合する二次抗体によって認識される、配列番号１に結合する組換え抗体である。ある特定の好ましい実施形態では、較正物質が配列番号１またはその変異体に結合する組換え抗体であり、前記組換え抗体が、好ましくは二次抗体が結合するＩｇクラスと同じＩｇクラスの免疫グロブリン（Ｉｇ）である。

第５の態様では、本発明は、診断キットを製造するための、配列番号１もしくはその変異体を含むポリペプチドおよび／または配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用を提供する。この態様によると、本発明は特に、診断キットを製造するための、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明はまた、診断キットを製造するための、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＭ、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用を提供する。

診断キットは、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するため、またはコロナウイルス感染症の鑑別診断のため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の感染症と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１の感染症を好ましくは区別するためのものである。したがって、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するための診断キットを製造するための、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドの使用に関する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の前記診断は、例えば、対象からの試料中の、配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含む。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の前記診断はまた、対象から試料を得るステップと、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップとを含み得る。本発明はさらに、コロナウイルス感染症の鑑別診断のための、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１の感染症を好ましくは区別するための診断キットを製造するための、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドの使用に関する。前記鑑別診断は、例えば、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含み得る。前記鑑別診断はまた、対象から試料を得るステップと、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップとを含み得る。

この態様によると、本発明はまた、診断に使用するため、例えばヒトまたは動物の体で実行される診断方法に使用するための、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを提供する。特に、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の診断に使用するための、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを提供する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の前記診断は、例えば、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含み得る。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の前記診断はまた、対象から試料を得るステップと、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップとを含み得る。本発明はさらに、コロナウイルス感染症の鑑別診断に使用するための、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（好ましくは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１の感染症を好ましくは区別するための、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを提供する。前記鑑別診断は、例えば、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含み得る。前記鑑別診断はまた、対象から試料を得るステップと、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップとを含み得る。

本発明はさらに、診断に使用するため、例えばヒトまたは動物の体で実行される診断方法に使用するための、配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくはＩｇＡクラス抗体を提供する。特に、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の診断に使用するための、配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくはＩｇＡクラス抗体に関する。本発明はさらに、コロナウイルス感染症の鑑別診断に使用するための、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３とＨＫＵ１との間で感染症を区別するための、配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、最も好ましくはＩｇＡクラス抗体に関する。

第６の態様では、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の初期診断のための較正物質としての、好ましくはＩｇＡクラス抗体に結合する二次抗体によって認識される、配列番号１に結合する組換え抗体の使用を提供する。

この態様によると、本発明はまた、較正物質としての、好ましくは対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体を検出するための較正物質としての、組換え抗体、例えば配列番号１に結合する組換えＩｇＡクラス抗体の使用を提供する。このような較正物質を、特に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断する方法、またはコロナウイルス感染症の鑑別診断のための、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１との間で感染症を区別するための方法に使用することができる。よって、本発明はまた、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するための、特に初期診断するための較正物質としての組換え抗体、例えば配列番号１に結合する組換えＩｇＡクラス抗体の使用を提供する。

好ましい実施形態では、ヒト対象がワクチン接種されたヒト対象である。

好ましい実施形態では、本方法が、診断についての結果を評価するステップをさらに含む。好ましい実施形態では、本方法が、診断の結果または評価を異なる場所に移すステップをさらに含む。

さまざまな抗原および抗体、中でもウイルス全体またはその構造タンパク質もしくは断片のいずれかならびにこれらの抗原に結合する抗体がコロナウイルスの免疫学的検出の基礎として使用されている。

本発明は、配列番号１に対する抗体を感染症の初期段階で検出することができるという本発明者らの驚くべき発見に基づく。これらの抗体は、感染症の初期段階で感染症の存在を検出する目的で検出され得る。

換言すれば、本明細書で開示される結果は、感染症の初期段階で既にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するために、好ましくは検査される試料の総数に対して正しく陽性と決定される試料の数によって計測される感度が優れている。観察される感度増加への重要な寄与は、検出可能なＩｇＭ抗体を欠く患者の亜集団を含む多くの患者で、ＩｇＧ抗体などの他のＩｇクラスの抗体よりも早く配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体が検出可能になるという驚くべき発見から生じる。

さらに、本発明は、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＧおよび／またはＩｇＡが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質に対する抗体よりも長く持続し、長期間検出可能であるという驚くべき発見に基づく。

また、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２以外の、他のコロナウイルスに感染した患者からの試料中の抗体の範囲との交差反応性が驚くほど低く、このことが、正しく陰性と判定される試料数の多さ、すなわち、配列番号１に対する抗体の検出の偽陽性と判定される試料数の、検査される試料の総数に対する少なさによって好ましくは計測される優れた特異性に寄与している。特に、本発明者らは、抗原としての配列番号１の特異性が配列番号３３（Ｓ２ドメイン）と比較して優れていることを発見した（Ｏｋｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０２０ Ｊｕｌ；２６（７）：１４７８−１４８８，ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ ｍｅｄＲｘｉｖ ２０２０．０３．１８．２００３８０５９）。

好ましい実施形態では、本明細書で使用される「診断」という用語が、広義の可能な意味で理解されるべきであり、患者が、過去、診断時または将来に、ある特定の疾患または障害を患っていた、患っている、または患いそう、または平均もしくは比較対象（後者は好ましくは類似の症状を有する）よりも患いそうかどうかの評価の助けになる情報を得ること、どれくらい疾患が進行しているかまたは将来進行しそうかを知ること、あるいは一般的に処置、好ましくはワクチンに関する患者の応答性を評価すること、あるいは試料がこのような患者に由来するかどうかを知ることを目的とした任意の種類の手順を指し得る。このような情報は、臨床診断に使用され得るが、例えば、患者コホートまたは集団中で疾患を患っている対象の割合を決定するために、一般研究の目的で実験および／または研究実験室によって得られてもよい。換言すれば、「診断」という用語は、診断することだけでなく、薬物または候補薬物の投与に対する１人または複数人の患者の応答を監視して、例えばその有効性を決定することを含む、疾患または障害の経過を予知および／または監視することも含む。また、配列番号１に対するＩｇＡおよび／またはＩｇＧ抗体の初期出現および／または長期持続が利用され得る。結果は臨床診断用途のために特定の患者に割り当てられ、前記患者を処置している医師または施設に、例えば電話、ファックス、手紙もしくは電子フォーマット、例えばｅメールによって、またはデータベースを使用して伝えられ得るが、これは、他の用途、例えば研究目的での診断の場合には必ずしも当てはまらず、このような場合には匿名扱いの患者または患者コホートからの試料に結果を割り当てるだけで十分となり得る。好ましい実施形態では、診断される人、すなわち、「対象」または「患者」が、治療上有用な抗体を得るためにその血液が寄付または使用され得る匿名の献血者である。好ましくは、この疾患が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症、より好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を含むＳＡＲＳ感染症である。

好ましい実施形態では、本発明による方法、生成物および使用が、候補ワクチンまたは任意の身体化合物、例えば遮断抗体（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含む、薬物候補または他の化合物が存在し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する抗体の結合と干渉し得るかどうか、または任意の下流プロセスに影響を及ぼし得るかどうかを決定することを含む、相互作用研究に使用され得る。好ましい実施形態では、これらが、配列番号１またはその免疫原性変異体を含むポリペプチドを含む免疫原性組成物を、例えばヒト以外の哺乳動物であり得る哺乳動物、例えば実験室動物に投与した後の、免疫応答、より好ましくは配列番号１を含む、好ましくは配列番号１からなるポリペプチドに対する抗体の出現および／または力価を監視するために使用され得る。好ましくは対象の免疫化の後期の、より好ましくは検出の感度を増加させるまたは検出の感度を最適化する目的でのＩｇＡおよび／またはＩｇＧ抗体の検出が特に好ましい。好ましい実施形態では、免疫化が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の結果、または配列番号１もしくはその変異体を含むワクチンの投与の結果である。増加または最適化は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２またはその成分、例えば配列番号３０（Ｎタンパク質）に対する他の抗体、好ましくは配列番号３０に対するＩｇＧクラス抗体との比較であり得る。好ましい実施形態では、本明細書で使用される「後期」という用語が、疾患発症またはワクチンの最初の投与後２０日目、３０日目、４０日目、５０日目、６０日目、６１日目、７０日目、８０日目または９０日目、好ましくは６０日目に始まる期間を指す。好ましくは、これが２８日間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５か月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８か月、６０ヶ月またはそれ以上、好ましくは３ヶ月以上続く。好ましい実施形態では、方法または使用が免疫化の長期監視のためであり得る。免疫化は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症、または好ましくは配列番号１もしくはその変異体によるワクチン接種の結果であり得る。後期の間に得られた少なくとも１つの試料、好ましくは２つ以上が分析される。試料は、後期の間、１週間に１回または数ヶ月に１回得られ、分析され得る。

配列番号１に対するＩｇＡおよび／またはＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体が対象からの試料中で検出される場合、その対象はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を患っていそうであるか患っている可能性が高い。当業者であれば、抗体の存在または非存在を反映する結果の解釈に関するウイルス学における一般原則に精通している（例えば、Ｄｏｅｒｒ，Ｈ．Ｗ．，ａｎｄ Ｇｅｒｌｉｃｈ，Ｗ．，Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ：Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ，Ｐｒａｖｅｎｔｉｏｎ ｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅ，Ｔｈｉｅｍｅ ２０１０，ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ Ｆｉｇ．９．７ ｔｈｅｒｅｉｎ）。手短に言えば、ウイルス特異的抗原に対する特異的抗体の第１の検出が感染症の初期診断に使用され得る。ＩｇＡ抗体は、通常、エンテロウイルスによる感染症の場合などの特定の場合を除いて、診断上関連性はないが（Ｇｒｅｓｓｎｅｒ／Ａｒｎｄｔ，Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅｎ Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ，２．Ａｕｆｌａｇｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１３，ｐａｇｅ １３８７）、しかし、これらが現れる場合、その力価は、典型的にはＩｇＭおよびＩｇＧクラス抗体よりも低く、より後に現れ得る。好ましくはＩｇＭおよびＩｇＡクラス抗体の非存在下での、低濃度のＩｇＧクラス抗体は、過去の免疫化を示す。増加するＩｇＧクラス抗体価またはそれが高濃度であることは、急性の感染または再感染を示し得る。好ましい実施形態では、配列番号１に対する抗体の存在が、以前のもしくは進行中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染またはワクチン接種の結果としての免疫化を示す。好ましい実施形態では、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを含むワクチン（または配列番号１もしくはその変異体を含むポリペプチドをコードする核酸、例えばＲＮＡワクチン）による成功したワクチン接種が、配列番号１以外のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原に対する抗体の非存在を確認することや、好ましくは配列番号３０（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質）に対する抗体の非存在を確認することによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染と区別され得る。

試料は、好ましくは哺乳動物試料、すなわち、哺乳動物からの試料、より好ましくはヒト試料、すなわち、ヒトからの試料である。

「診断」という用語は、好ましくは本発明による診断方法または薬剤が決定的であり、単一検査（パラメータは言うまでもなく）に基づいて診断を完成させるのに十分であることを意味するのではなく、「鑑別診断」と呼ばれるもの、すなわち、一定範囲の診断パラメータに基づいて一定範囲の可能な状態の可能性を考慮する組織的診断手順への寄与を指し得る。本発明によると、患者、好ましくはコロナウイルス感染症を有することが既に疑われる患者が、ＳＡＲＳ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１および／またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症、または別のコロナウイルス感染症、好ましくはＭＥＲＳとＮＬ６３と２２９ＥとＯＣ４３とＨＫＵ１とを含む群の別のコロナウイルス感染症を患っているかどうかを区別することができる。ＮＬ６３と２２９ＥとＯＣ４３とＨＫＵ１は相当数の一般的な感冒症例に関連しているので、鑑別診断は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１および／またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と感冒を区別することを伴い得る。例えば、患者は、考えられるリスク環境への曝露により、ならびに／あるいは発熱や、咳、息切れなどの一般的な症状に基づいて、コロナウイルス感染症を患っていると最初に疑われ得る。次いで、ＰＣＲ（例えば、Ｃｏｒｍａｎ ＶＭ，Ｌａｎｄｔ Ｏ，Ｋａｉｓｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９−ｎＣｏＶ）ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ．Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．２０２０；２５（３）：２００００４５．ｄｏｉ：１０．２８０７／１５６０−７９１７．ＥＳ．２０２０．２５．３．２００００４５）および／またはイムノアッセイが行われ得る。例えば、試料が感染数日後たって採取されたために、ＰＣＲが陰性である場合、本発明の方法を使用して、配列番号１に対する抗体の存在または非存在を検出することができる。さらに、別のコロナウイルスからの抗原に対する抗体、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１を含む群からの別のコロナウイルス、より好ましくはＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１を含む群からの別のコロナウイルスからの抗原に対する抗体の存在または非存在を検出することができる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２からの配列番号１のホモログおよび変異体に対する抗体を検出することができる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１により特徴的な頭痛および体の痛み、またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２により特徴的な味覚および嗅覚の消失ならびに咽頭痛などの特定の臨床症状に基づいて、診断を完成させることができる。その患者が感染した患者に曝露されていたかどうかが考慮され得る。例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１症例は極めてまれであるので、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のパンデミック中に一般的なＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２症状を患っている多くの患者は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２による感染症を患っていると推定することができる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１とＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の区別は、異なる時間分解性（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスシグニチャー、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１におけるＩｇＡクラス抗体の後の出現に基づいて可能である（Ｈｓｕｅ，Ｐ．Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｋａｏ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ Ｐ．Ｃ．（２００４）Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＧ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１０（１２），１０６２−１０６６）。抗体レベルを、例えば数週間にわたって監視して、例えば目的の抗体の消失または出現を検出することができ、これが一次感染および二次感染もしくは例えばワクチン接種の結果としての免疫化を区別する、または２種以上のコロナウイルスによる感染症を認識するのに役立ち得る。

好ましい実施形態では、本明細書で使用される「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２」という用語が、寄託コードＭＮ９０８９４７でＧｅｎＢａｎｋに寄託されているゲノムまたは配列番号１３によって特徴付けられる、好ましくは配列番号１３に示されるウイルス、およびゲノムヌクレオチド配列全体にわたって少なくとも８０％、好ましくは８５％、好ましくは８８％、好ましくは９０％、好ましくは９１％、好ましくは９２％、好ましくは９３％、好ましくは９４％、好ましくは９５％、好ましくは９６％、好ましくは９７％、好ましくは９８％、好ましくは９９％、好ましくは９９．５％、好ましくは９９．８％、好ましくは９９．９％または９９．９９％の配列同一性を有するその類縁体を指す。本明細書で使用される全てのデータベースエントリまたは製品コードは、本出願の最先の優先日または出願日にオンラインのバージョンに対応する。例えば、寄託コードＭＮ９０８９４７で寄託されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム配列については、バージョンＭＮ９０８９４７．３（２０２０年１月１７日公開）が本出願の最先の優先日または出願日にオンラインであった。ＭＮ９０８９４７．３で開示されるヌクレオチド配列は、配列番号１３と同一である。より好ましくは、突然変異株、例えば英国変異株Ｂ．１．１．７、南アフリカ変異株Ｂ．１．３５１、ブラジル変異株Ｐ．１およびデンマークのミンク変異株を含む群のものが含まれる。

好ましい実施形態では、診断されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症が、配列番号１を参照して、Ｈｉｓ５４および／またはＶａｌ５５の欠失、Ｇｌｎ４８６Ｔｙｒ、Ａｌａ５５５Ａｓｐ、Ａｓｐ５９９ＧｌｙおよびＰｒｏ６６６Ｈｉｓを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全ての突然変異を有するスパイクタンパク質を特徴とする英国変異株Ｂ．１．１．７に関連するまたは関連し得る。好ましくは、Ｈｉｓ５４および／またはＶａｌ５５の欠失、Ｇｌｎ４８６Ｔｙｒ、Ａｌａ５５５Ａｓｐ、Ａｓｐ５９９ＧｌｙおよびＰｒｏ６６６Ｈｉｓを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全てを有する配列番号１の変異体が、本発明による試薬、方法および使用に使用される。これら全ての突然変異を含む配列番号１の変異体は配列番号５１によって表される。

好ましい実施形態では、診断されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症が、配列番号１を参照して、Ｌｙｓ４０２Ｇｌｎ、Ｇｌｕ４６９Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４８６ＴｙｒおよびＡｓｐ５９９Ｇｌｙを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全ての突然変異を有するスパイクタンパク質を特徴とする南アフリカ変異株Ｂ．１．３５１に関連するまたは関連し得る。好ましくは、Ｌｙｓ４０２Ｇｌｎ、Ｇｌｕ４６９Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４８６ＴｙｒおよびＡｓｐ５９９Ｇｌｙを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全てを有する配列番号１の変異体が、本発明による試薬、方法および使用に使用される。これら全ての突然変異を含む配列番号１の変異体は配列番号５２によって表される。

好ましい実施形態では、診断されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症が、配列番号１を参照して、Ｇｌｕ４６９ＬｙｓおよびＧｌｎ４８６Ｔｙｒを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全ての突然変異を有するスパイクタンパク質を特徴とするブラジル変異株Ｐ．１に関連するまたは関連し得る。好ましくは、Ｇｌｕ４６９ＬｙｓおよびＧｌｎ４８６Ｔｙｒを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全てを有する配列番号１の変異体が、本発明による試薬、方法および使用に使用される。これら全ての突然変異を含む配列番号１の変異体は配列番号５３によって表される。

好ましい実施形態では、診断されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症が、配列番号１を参照して、Ｈｉｓ５４および／またはＶａｌ５５の欠失、Ａｓｐ５９９ＧｌｙおよびＴｙｒ４３８Ｐｈｅを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全ての突然変異を有するスパイクタンパク質を特徴とするデンマークのミンク変異株に関連するまたは関連し得る。好ましくは、Ｈｉｓ５４および／またはＶａｌ５５の欠失、Ａｓｐ５９９ＧｌｙおよびＴｙｒ４３８Ｐｈｅを含む群の１つまたは複数の突然変異、好ましくは全てを有する配列番号１の変異体が、本発明による試薬、方法および使用に使用される。これら全ての突然変異を含む配列番号１の変異体は配列番号５４によって表される。

好ましい実施形態では、「診断」という用語が、方法または生成物または使用が疾患の診断を助けるまたは疾患を患っているリスクがある対象を同定するために使用され得ることを意味する。「診断」という用語はまた、患者にとって最も有望な処置体制を選択するために使用される方法または薬剤を指し得る。換言すれば、方法または薬剤が、対象のための処置レジメンを選択することに関し得る。

好ましい実施形態では、本発明による方法が、診断的に有用な担体および感染していることが疑われる患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト患者からの試料を用意するステップを含む。担体を配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドでコーティングする。次いで、担体を、任意の抗体と配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドの結合を可能にする条件下で、試料と接触することができる。次いで、試料を除去し、担体を洗浄して、残っている試料を除去することができる。次いで、検出される抗体に結合し、検出可能な標識を有する二次抗体または類似の試薬もしくは手段を、任意の結合抗体と二次抗体との間の複合体の形成を可能にする条件下で、担体と接触させることができる。次いで、担体を洗浄して、非結合二次抗体を除去することができる。最後に、二次抗体が検出され得るかどうかを確認することによって、抗体の存在を検出する。

好ましい実施形態では、本明細書で使用される「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症」という用語または類似の用語が、対象、好ましくはヒト対象のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２による感染症、すなわち、前記対象の体内の、より好ましくは検出可能なレベルのウイルス自体ならびに／あるいは構造タンパク質、特にＳおよびＮ、より好ましくはＳ１ドメインを含む群のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ポリペプチド、およびこれらに結合する抗体、および／またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の核酸（ＰＣＲによって検出可能）を含む群の１つまたは複数のバイオマーカーと合わせた、少なくとも一時的なウイルスの存在を指す。対象は、臨床症状、好ましくは発熱、疲労、乾性咳、鼻詰まり、鼻水および咽頭痛を含む群の１つまたは複数、より好ましくは全てを有し得る。より重度の症状としては、呼吸困難、胸痛または胸部圧迫感、および突然の意識障害が挙げられる。この疾患は、肺炎、急性呼吸促迫症候群、敗血症、敗血症性ショックおよび腎不全などの合併症をもたらし得る。しかしながら、多くの感染した対象は、軽度の症状しか有さず、感染に気づかない場合さえある。

好ましい実施形態では、本方法を、好ましくは異なる日に、２回以上使用して、同じ患者からの試料を検査する。例えば、抗体の存在または非存在を、１週間または２週間にわたって、毎日検出することができる。好ましい実施形態では、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の試料を異なる日に検査する。好ましい実施形態では、試料を少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間または１６週間の期間にわたって採取する。

本発明による方法、試薬および使用を使用して抗ウイルス薬またはワクチンまたはワクチン候補の効力および有用性をスクリーニングすることもできる。この点について、本発明の方法がワクチン接種されたヒトで検証されている、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体を、配列番号１を含むポリペプチドを含む組成物でワクチン接種されたヒトで検出することができたことに留意すべきである。これらを、ヒトおよび実験室動物を含む他の対象でのワクチンの量を確認すること、または対象の免疫系がワクチンの投与に応答することを確認することを目的としたワクチン接種試験および研究の一部として使用することができる。好ましくは、ワクチンが配列番号１またはその断片に基づく。本方法、試薬および使用を使用して、ワクチンの最初の投与前に患者を最初に診断して、前記患者が例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２による以前の感染または以前のワクチン接種の結果として既に免疫化されているかどうかを確認することができる。例えば、患者を研究もしくは試験への算入または研究もしくは試験からの除外について選択し、経時的に監視することができる。特に、既に感染している対象をワクチン候補の試験から除外することができる。好ましくは、配列番号１に対するＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体の検出に基づいて、以前のワクチン接種が依然として有効であるかどうかを確認することができる。

本発明による方法および試薬を、提供された血液をコロナウイルスが汚染しているかどうか、または、例えば治療的使用のために提供血液から抽出され得るＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２、好ましくは配列番号１に対する抗体を、献血者が産生しているかどうかをスクリーニングするために使用することもできる。配列番号１に対するＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡクラス抗体、好ましくはＩｇＧおよびＩｇＡ、より好ましくはＩｇＡの存在または非存在の検出後、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２、好ましくは配列番号１に対する抗体を、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、または本発明による担体を、提供された血液と、配列番号１に対する抗体と担体を含む複合体の形成に適合性の条件下で接触させ、残っている提供血液を除去し、担体から抗体を分離することによって、献血者の血液から精製することができる。好ましい実施形態では、提供された血液が、全血、血漿および血清を含む群から選択され、抗凝固試薬を含有し得る。クエン酸塩、リン酸塩、デキストロースおよびアデニンを含む群から選択される化合物、好ましくはこれらの全てが存在してもよい。

検出される抗体は、好ましくは配列番号１に特異的に結合する。特異的結合は、好ましくは結合反応が、ｐＨ７のＰＢＳバッファー中２５℃でＢｉａｃｏｒｅ機器を使用して表面プラズモン共鳴によって決定される１×１０^−５Ｍ、より好ましくは１×１０^−７Ｍ、より好ましくは１×１０^−８Ｍ、より好ましくは１×１０^−９Ｍ、より好ましくは１×１０^−１０Ｍ、より好ましくは１×１０^−１１Ｍ、より好ましくは１×１０^−１２Ｍの解離定数を特徴とする結合反応よりも強力であることを意味する。

本発明の教示は、本出願で明示的に言及される正確な配列、例えば配列番号１、例えば機能、性質、配列または寄託番号または６を有するポリペプチドを使用してのみ行うことができるわけではない。

本発明によると、本明細書で使用される「変異体」という用語はまた、言及される完全長配列の少なくとも１つの断片、または前記断片を含むポリペプチド、より具体的には完全長配列と比較して、１個または複数のアミノ酸が、一方または両方の末端で切断されている、１つまたは複数のアミノ酸または核酸配列を指す。このような断片は、元の配列またはその変異体の少なくとも１０個、１５個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個または６００個の連続アミノ酸を有する（ポリ）ペプチドを含むまたはコードする。例えば、配列番号１の断片は配列番号１２および配列番号１３を含む。断片の２つ以上のコピーを感度増加のために融合してもよい。

本明細書で使用される「変異体」という用語はまた、アミノ酸配列を含むこのようなポリペプチドまたはその断片、好ましくは言及される参照アミノ酸配列またはその断片と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である少なくとも２５個、より好ましくは５０個、より好ましくは２００個の連続アミノ酸を含む断片を包含し、生物活性、例えば目的の抗体に特異的に結合する、またはポリペプチドの折り畳みもしくは構造を維持する能力に必須のアミノ酸以外のアミノ酸が欠失していても置換されていてもよい、および／または１個もしくは複数のこのような必須アミノ酸が保存的に置き換えられていてもよい、および／またはポリペプチドの生物活性が少なくとも部分的に保存されるようにアミノ酸が付加もしくは欠失されている。例えば、配列番号１の断片は配列番号５、配列番号１２、配列番号１４〜２９、配列番号３５〜３７および配列番号４０〜４３を含む。先行技術は、２つの所与の核酸またはアミノ酸配列を整列し、同一性の程度を計算するために使用され得るさまざまな方法を含む。例えば、Ａｒｔｈｕｒ Ｌｅｓｋ（２００８），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００８，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。好ましい実施形態では、デフォルト設定を適用して、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェア（Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ，Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｐ．，Ｃｈｅｎｎａ，Ｒ．，ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎ，Ｐ．Ａ．，ＭｃＷｉｌｌｉａｍ，Ｈ．，Ｖａｌｅｎｔｉｎ，Ｆ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｉ．Ｍ．，Ｗｉｌｍ，Ａ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．（２００７）：Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３，２９４７−２９４８）が使用される。

特定のアミノ酸配列についてのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２関連の刊行物、例えばＢｅａｌら（Ｂｅａｌ，Ｊ．，Ｍｉｔｅｃｈｅｌｌ，Ｔ．，Ｗｙｓｃｈｏｇｒｏｄ，Ｗ．，Ｍａｎｔｈｅｙ，Ｊ，ａｎｄ Ｃｌｏｒｅ，Ａ．（２０２０）Ｈｉｇｈｌｙ Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ２０１９−ｎＣｏＶ（Ｗｕｈａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０１．３１．９２９４９７）ならびにＳＡＲＳ−ＣｏＶに関する刊行物、例えばＨｕａら（Ｈｕａ，Ｒ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｈｕａ，Ｙ ａｎｄ Ｔｏｎｇ，Ｔ．（２００４）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＢＲ ３１９，９２９−９３５）（相同性エピトープが見出され、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２エピトープがその相同性のために同定される）が、当業者が変異体を設計するのを助け得る。例えば、可能なエピトープは配列番号５に由来し得る。Ｄａｈｌｋｅらは、Ｓ１ポリペプチドに由来する重複１５ｍｅｒペプチドを含むマイクロアレイに基づくエピトープマッピングを提示している（Ｄａｈｌｋｅ，Ｃ．，Ｈｅｉｄｅｐｒｉｅｍ，Ｊ．，Ｋｏｂｂｅ，Ｒ．，Ｓａｎｔｅｒ Ｒ．，Ｋｏｃｈ，Ｔ．，Ｆａｔｈｉ，Ａ．，Ｌｙ，Ｍ．Ｌ，Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌ，Ｓ．，Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．，ＩＤ−ＵＫＥ ＣＯＶＩＤ−１９ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ，Ａｄｄｏ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｆ．Ｆ．（２０２０）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０４．１４．２００５９７３３ｄｏｉ）。より具体的には、Ｓ１タンパク質のアミノ酸配列ＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦ（配列番号１４、これは配列番号１の３０〜４４である）、ＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶ（配列番号１５、これは４８〜６８である）、ＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧ（配列番号１６、これは１１０〜１６６である）、ＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬ（配列番号１７、これは２００〜２１４である）、ＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹ（配列番号１８、これは２２６〜２５０である）、ＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰ（配列番号１９、これは２５６〜２７７である）、ＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲ（配列番号２０、これは３２８〜３４２である）、ＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦ（配列番号２１、これは３９９〜４１４である）、ＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰ（配列番号２２、これは４３４〜４４８である）、ＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩ（配列番号２３、これは５５０〜５７２である）、ＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥ（配列番号２４、これは５９０〜６０４である）、ＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰ（配列番号２５、これは６３２〜６５０である）を含むペプチドがＩｇＡ反応性エピトープとして同定された。Ｓ１タンパク質のアミノ酸配列ＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳ （配列番号２６、これは３５４〜３６８である）、ＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩ（配列番号２７、これは６２２〜６３６である）を含むペプチドがＩｇＧ反応性エピトープとして同定された。Ｓ１タンパク質のアミノ酸配列ＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦ（配列番号２８、これは３０〜４４である）およびＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹ（配列番号２９、これは２２６〜２５０である）を含むペプチドがＩｇＭ反応性エピトープとして同定された。さらに、本発明者らは、配列ＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳ（配列番号４１）、ＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧ（配列番号３５）、ＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（配列番号３６）およびＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ（配列番号３７）を有するペプチドが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２患者の抗体と反応性であることを示した。他の多くの刊行物が変異体を設計する際のガイダンスとして当業者によって使用され得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｍｉｎｉｎｇ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ｆｒｏｍ ＣＯＶＩＤ−１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３０，７０２−７０４（２０２０）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４２２−０２０−０３６６−ｘ；Ｐｏｈ，Ｃ．Ｍ．，Ｃａｒｉｓｓｉｍｏ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ ｌｉｎｅａｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｅｌｉｃｉｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ＣＯＶＩＤ−１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，２８０６（２０２０）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７−０２０−１６６３８−２； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｍａｐｐｉｎｇ ＣＯＶＩＤ−１９ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＡＣＳ Ｃｅｎｔ．Ｓｃｉ．２０２０，６，１２，２２３８−２２４９）。好ましい実施形態では、配列番号１またはその変異体を含み、折り畳まれており、より好ましくは配列番号１の少なくとも１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個または６００個の連続アミノ酸を含むポリペプチドが使用される。

好ましい実施形態では、変異体が、さらに、化学修飾、例えば同位体標識もしくは検出可能な標識などの標識、またはグリコシル化、リン酸化、アセチル化、脱炭酸、シトルリン化、ヒドロキシル化などの共有結合修飾を含み得る。当業者であれば、ポリペプチドを修飾する方法に精通している。さらに、変異体を、他の既知のポリペプチドまたはその変異体、例えば人工リンカー、アフィニティータグ、他の抗原などとの融合によって作製することもできる。例えば、配列番号３、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３８は本発明による融合タンパク質である。

本発明によると、診断的に有用な担体などの医学または診断装置を、場合によりプロテアーゼ切断部位を含み得る人工リンカーと共にアフィニティータグを含む配列番号１の組換え変異体を、真核細胞（ＣＨＯもしくはＨＥＫ２９３細胞など）または原核細胞（大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）細胞など）などの細胞中で発現させ、発現された変異体を、固相に固定化された、アフィニティータグに特異的に結合するリガンドと接触させ、細胞から非特異的に結合した物質が除去されるように固相を洗浄し、好ましくは過剰の非固定化リガンドを添加することによって、発現された変異体を固相から溶出することによって調製することができる。次いで、変異体を装置上に固定化することができる。場合により、好ましくは固定化前に、変異体をプロテアーゼ、好ましくはプロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼと接触することによって、アフィニティータグを除去することができる。アフィニティータグは、Ｈｉｓ、１８Ａ、ＡＣＰ、アルデヒド、Ａｖｉ、ＢＣＣＰ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、Ｅ−Ｔａｇ、ＥＬＫ１６、ＦＬＡＧ、フラッシュ、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ＧＳＴ、緑色蛍光タンパク質、ＨＡ、マルトース結合タンパク質、ｍｙｃ、ｎｕｓ、ＮＥ、ＰｒｏｔＡ、ＰｒｏｔＣ、Ｔｈｏ１ｄ４、Ｓ−Ｔａｇ、ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ＳｏｆＴａｇ、ストレプトアビジン、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ、Ｔ７エピトープタグ、ＴＡＰ、ＴＣ、チオレドキシン、Ｔｙ、Ｖ５、ＶＳＶおよびＸｐｒｅｓｓ Ｔａｇを含むタグの群から選択され得る。有用なプロテアーゼとしては、それだけに限らないが、ＴＥＶ、トロンビン、第Ｘａ因子またはエンテロペプチダーゼが挙げられる。プロテアーゼ切断部位（例えば、配列番号１またはその変異体とアフィニティータグとの間）を含む適切なリンカーが変異体に含まれてもよく、市販の発現ベクター、例えば前記変異体の発現に使用され得るｐＥＴベクターシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のコード配列の一部となり得る。

ポリペプチドの変異体は生物活性を有する。好ましい実施形態では、このような生物活性が、それぞれの抗体に結合する能力である。好ましい実施形態では、変異体が、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を患っている患者からの試料からの、配列番号１に対する抗体、好ましくは配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体に結合する能力を有するエピトープを含む、またはこれ自体が能力を有し、より好ましくはエピトープが少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸残基を含む配列を含む。より好ましくは、これが、好ましくはＭＥＲＳ（配列番号６）と、ＮＬ６３（配列番号１０）と、２２９Ｅ（配列番号７）と、ＯＣ４３（配列番号８）と、ＨＫＵ１（配列番号９）とを含む群からの、より好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１（配列番号１）と、ＭＥＲＳと、ＮＬ６３と、２２９Ｅと、ＯＣ４３と、ＨＫＵ１とを含む群からの他のコロナウイルスからの配列番号１のホモログに特異的に結合しない。ここで、特異的結合は好ましくはＢｉａｃｏｒｅ機器を使用して、上に概説されるように定義および決定される。

当業者であれば、適切なアミノ酸配列に基づいて診断的に有用な試薬を調製する方法に精通しており、例えば化学合成による直鎖ペプチドと例えば組換え発現によるポリペプチドの両方を提供することができる。特に、当業者であれば、コンフォメーションエピトープと連続エピトープの両方が存在すること、ならびに配列番号１に対する抗体などの抗体を検出するために使用され得る診断的に有用なポリペプチドを得るために適切な発現および精製の戦略を選択しなければならないことを知っている（例えば、Ｒｅｉｓｃｈｌ，Ｕ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８，ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ ｃｈａｐｔｅｒｓ １２，１５，１６，１８ ａｎｄ １９）。当業者であれば、試験系のための組換えタンパク質の有用性を評価する方法にも精通している（例えば、Ｒｅｉｓｃｈｌ，Ｕ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８，ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ ｃｈａｐｔｅｒｓ ２１−２６）。

本発明による予後、診断、方法またはキットのための抗体または複合体の検出は、免疫拡散技術、免疫電気泳動技術、光散乱イムノアッセイ、凝集技術、標識イムノアッセイ、例えば放射標識イムノアッセイを含む群のもの、酵素イムノアッセイ、例えば比色分析法、化学発光イムノアッセイおよび免疫蛍光技術を含む群から選択される方法の使用を含む。好ましい実施形態では、複合体が、免疫拡散技術、免疫電気泳動技術、光散乱イムノアッセイ、凝集技術、放射標識イムノアッセイを含む群の標識イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、免疫蛍光技術および免疫沈澱技術を含む群から選択される方法を使用して検出される。当業者であればこれらの方法に精通しており、これらは先行技術、例えばＺａｎｅ，Ｈ．Ｄ．（２００１）：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＆Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，ｉｎ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒ １４にも記載されている。好ましくは、試験フォーマットがＥＬＩＳＡであり、ウェルを含むマイクロタイタープレートが診断的に有用な担体として使用される。

好ましくは、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドが診断的に有用な担体の固相に固定化される。これは、試料と接触させる場合、固相に直接固定化され得るが、直接または間接の、競合アッセイ、キャプチャーブリッジアッセイ（ｃａｐｔｕｒｅ ｂｒｉｄｇｅ ａｓｓａｙ）、免疫測定アッセイ、固相上のクラス特異的二次抗体、クラス捕捉アッセイも使用され得る。これらのフォーマットの各々の原理は、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００５に詳述される。より好ましくは、固相が試験片またはＥＬＩＳＡ用のマイクロタイタープレートのウェル、最も好ましくはＥＬＩＳＡ用のマイクロタイタープレートのウェルである。

好ましい実施形態では、検出される抗体が配列番号１に対する別の抗体または配列番号１に特異的に結合する別のリガンドと競合する、競合アッセイフォーマットが使用される。配列番号１に特異的に結合するリガンドは、配列番号１に結合するアプタマーまたは抗体およびヒトＡＣＥ２受容体（配列番号３９）またはその変異体、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質の天然結合パートナーを含む群から選択され得る。このような方法は、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドならびに好ましくは抗体、アプタマーおよびＡＣＥ受容体またはその変異体を含む群の、配列番号１に特異的に結合するリガンドを用意するステップを含み得る。検出される抗体が存在する場合、これが複合体の形成を妨害する、または配列番号１に特異的に結合するリガンドに部分的にもしくは完全に置き換わるので、複合体の数が減少する。次いで、検出される抗体を含む複合体を、例えば配列番号１を含むポリペプチドまたは二次抗体などの検出される抗体に結合する分子に付着したアフィニティーリガンドを使用して複合体を沈殿させることによって検出することができる。アフィニティーリガンドの例としてはグルタチオンおよびビオチンが挙げられる。それぞれＧＳＴまたはストレプトアビジンなどの、アフィニティーリガンドに結合するアフィニティーリガンドの結合パートナーを固相上にコーティングすることができる。次いで、沈殿した複合体を、それぞれ、好ましくは配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合するリガンドに付着した、または配列番号１を含むポリペプチドに付着した検出可能な標識を検出することによって、検出することができる。特定の競合試験が、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｏｆ ＡＣＥ２−ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３８（１０７３−１０７８）によって公開されている。

あるいは、配列番号１に特異的に結合するリガンドまたは配列番号１もしくは変異体を含むポリペプチドが担体の表面上にコーティングされる場合、複合体が前記表面上に形成され得る。通常、複合体形成に干渉するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧクラス抗体の存在または非存在はこのようなフォーマットを使用して検出される。特異的ＩｇＡクラス抗体は、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧまたは二次抗体を使用して、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧクラス抗体、好ましくはＩｇを含む群の目的のＩｇクラスの抗体を前に分離することによって検出され得る。当業者であれば、アプタマー（Ｔｈｉｖｉｙａｎａｔｈａｎ Ｖ，Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ ＤＧ．Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ．２０１２；６（１１−１２）：５６３−５７３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｃａ．２０１２０００４２）および抗体（Ｈｕｓｔ Ｍ，Ｆｒｅｎｚｅｌ Ａ，Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎ Ｔ，Ｄｕｂｅｌ Ｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１０１：３０５−２０；Ｈａｎａｃｋ Ｋ，Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｋ，Ｌｉｓｔｅｋ Ｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２０１６；９１７：１１−２２；Ｈａｒｏｌｄ Ｆ．Ｓｔｉｌｌｓ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒａｂｂｉｔ，Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ，Ｈａｍｓｔｅｒ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｏｄｅｎｔｓ，２０１２）の合成、選択および使用、ならびに特異的標的に結合する抗体の作製および選択（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ／Ｅｎｇｅｌｓ，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｔｈｅｒｅｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１２）に精通している。(Ｄｕｂｅｌのｕはウムラウト付)

別の好ましい実施形態では、抗体が、それぞれ配列番号１を含むポリペプチドに結合する２つ以上の結合部位を有するので、抗体が試料中に存在する場合、ＲＢＤなどの、配列番号１またはその変異体を含む第１および第２のポリペプチドと、検出される抗体とを含む複合体が、液相中に形成される。次いで、例えば、グルタチオンまたはビオチンなどの第１のポリペプチドに付着したアフィニティーリガンドと、ＧＳＴまたはストレプトアビジンなどのそれぞれアフィニティーリガンドに結合する固相（固相は例えばビーズであり得る）上にコーティングされた結合パートナーを使用して、複合体を沈殿させることによって、検出される抗体を含む複合体を検出することができる。次いで、好ましくは第２のポリペプチドに付着した検出可能な標識を検出することによって、沈殿した複合体を検出することができる。あるいは、配列番号１またはその変異体を含む第１のポリペプチドが担体の表面上にコーティングされている場合、複合体が前記表面上に形成され得る。あるいは、第１および第２のポリペプチドをそれぞれ、これらが近接している場合、例えば、検出される抗体によって架橋されている場合にのみ検出可能な２つの異なる標識で標識することができる。また、例えばプロテインＡまたはプロテインＧまたは二次抗体を使用して、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧクラス抗体、好ましくはＩｇＡを含む群の特異的Ｉｇクラス抗体を前に分離していない限り、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧクラス抗体の存在または非存在が検出される。好ましくは、ＩｇＧ抗体がまだ産生されていない感染の初期段階では、ＩｇＡ抗体が主にまたは唯一検出される。

任意のポリペプチド、例えば配列番号１を含むポリペプチドまたは二次抗体は、任意の形態でおよび任意の精製度で、内因性形態の前記ポリペプチドを含む組織、体液または細胞、より好ましくはポリペプチドを過剰発現している細胞、本質的に純粋であり得る精製および／または単離ポリペプチドまでのこのような細胞の粗または濃縮溶解液から提供され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドが天然ポリペプチドであり、本明細書で使用される「天然ポリペプチド」という用語が、折り畳まれたポリペプチド、より好ましくは細胞から、より好ましくは原核細胞または真核細胞から、好ましくは哺乳動物細胞から精製された折り畳まれたポリペプチドである。ポリペプチドのグリコシル化形態も使用され得る。二次抗体は、好ましくは例えばアフィニティーリガンドとしてのプロテインＡまたはプロテインＧに基づく精製後に純粋である。好ましい実施形態では、本発明により使用または提供される任意のポリペプチドが、有意な濃度のＤＴＴなどのチオール含有化合物などの変性試薬の非存在下で、折り畳まれた状態で使用または提供される。

好ましい実施形態では、配列番号１に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧクラス抗体の存在または非存在が検出される。別の好ましい実施形態では、ＩｇＡの存在または非存在のみが検出される。別の好ましい実施形態では、ＩｇＭの存在または非存在のみが検出される。別の好ましい実施形態では、ＩｇＧの存在または非存在のみが検出される。

好ましい実施形態では、ＩｇＡの存在または非存在とＩｇＧの存在または非存在が検出される。より好ましくは、ＩｇＡクラス抗体に対する二次抗体とＩｇＧクラス抗体に対する二次抗体がこの検出のために使用または提供される。別の好ましい実施形態では、ＩｇＭの存在または非存在とＩｇＧの存在または非存在が検出される。より好ましくは、ＩｇＭクラス抗体に対する二次抗体とＩｇＧクラス抗体に対する二次抗体がこの検出のために使用または提供される。別の好ましい実施形態では、ＩｇＭの存在または非存在とＩｇＡの存在または非存在が検出される。より好ましくは、ＩｇＭクラス抗体に対する二次抗体とＩｇＡクラス抗体に対する二次抗体がこの検出のために使用または提供される。

好ましい実施形態では、配列番号１に対する抗体、例えばＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧの存在または非存在が、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを使用して検出され得るが、ポリペプチドが追加の配列、好ましくは人工配列、例えばリンカーまたは結合エピトープを含み得る。しかしながら、このような追加の配列は、配列番号１もしくはその変異体が検出される抗体に特異的に結合する能力、または診断信頼性、特に感度および／または特異性が消失しないのは言うまでもなく、有意には変化しないように、選択される。例えば、配列番号１またはその断片に結合し、よって、エピトープを隠すドメインがポリペプチドと融合すべきでもなく、存在すべきでもない。本発明によると、好ましくは配列番号１またはその変異体を含む抗原、配列番号３０またはその変異体を含む抗原、配列番号３１またはその変異体を含む抗原および配列番号３３またはその変異体を含む抗原、好ましくは全てを含む群のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧクラス免疫グロブリンを検出する二次抗体が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の診断、好ましくは初期診断のために検出または使用され得る。配列番号３０またはその変異体を含む抗原、配列番号３１またはその変異体を含む抗原および配列番号３３またはその変異体を含む抗原、好ましくは全てを含む群から選択される抗原を診断的に有用な担体上に、好ましくは空間的に離間してまたは混合物で、コーティングし、それぞれの抗原に特異的に結合する抗体を検出するために試料と接触させることができる。好ましい実施形態では、配列番号１以外のこのようなＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原に対する抗体の検出に加えた配列番号１に対する抗体の検出が、アッセイ、特に初期段階でのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の診断または初期段階での鑑別診断の全体的な感度を増加させ得る。

好ましい実施形態では、本発明の生成物、方法および使用が、配列番号１に対する抗体の存在または非存在を、配列番号１上に存在するもの以外の別のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原または１つもしくは複数の他の抗原、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質、より好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｍタンパク質およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＥタンパク質を含む群、最も好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＭタンパク質、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＥタンパク質およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質エピトープを含む群の抗原に対する抗体の存在と区別することができるように構成される。より好ましい実施形態では、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドが、配列番号１に対する抗体の存在または非存在を検出するために使用される場合、このような他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原または他のコロナウイルス抗原から空間的に離間している。例えば、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドは純粋であり得るおよび／または担体上で分離され得る。例えば、これは他の抗原から空間的に離間した、ブロットまたはマイクロタイターウェルまたはビーズ上にあり得る。

好ましい実施形態では、本発明の生成物、方法および使用が、検出される抗体がある特定の免疫グロブリンクラスに属するかどうかを決定することなく、配列番号１に対する抗体の存在または非存在を検出することができるように構成される。これは通常、配列番号１などの１つまたは複数の抗原に対する「全抗体」の検出と呼ばれる。初期段階で存在するＩｇＡクラス抗体ならびに後期の配列番号１に対するＩｇＡおよびＩｇＧクラス抗体が配列番号１に対する全抗体の一部として検出されるので、ＩｇＡおよびＩｇＧを含む全抗体の検出はアッセイの感度を増加させる。より好ましくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原は存在しないもしくは空間的に離間している、またはこのような別のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する抗体は、配列番号１に対する抗体によって生成されるシグナルと区別することができるシグナルを生成するので、好ましくは、配列番号１に対する抗体を、Ｎタンパク質（配列番号３０）またはＳ２ドメイン（配列番号３２）などの別のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原に対する抗体と区別することができる。

好ましい実施形態では、本発明の生成物、方法および使用が、検出される抗体が配列番号１またはＮタンパク質もしくはＳ２タンパク質などの別のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原に結合するかどうかを決定することなく、配列番号１に対する抗体の存在または非存在を検出することができるように構成される。これは、配列番号１またはその変異体とＮタンパク質（配列番号３０）もしくはその変異体またはＳ２ドメイン（配列番号３２）もしくはその変異体を組み合わせて含む抗原の混合物を使用することによって達成され得る。より好ましい実施形態では、Ｓ１およびＳ２ドメイン（配列番号３２）を含むスパイクタンパク質全体が、場合によりＮタンパク質（配列番号３０）と組み合わせて使用され得る。また、初期段階で存在するＩｇＡクラス抗体ならびに後期の配列番号１に対するＩｇＡおよびＩｇＧクラス抗体が配列番号１に対する全抗体の一部として検出されるので、ＩｇＡおよびＩｇＧを含む配列番号１に対する抗体がアッセイの感度を増加させるため、このようなアッセイの感度が増加する。

好ましい実施形態では、本発明による生成物、方法および使用が、検出される抗体がある特定の免疫グロブリンクラスに属するかどうかを決定することなく、配列番号１に対する抗体の存在または非存在を検出することができるように構成される。この手順は通常、配列番号１などの１つまたは複数の抗原に対する「全抗体」の検出と呼ばれる。初期段階で存在するＩｇＡクラス抗体が配列番号１に対する全抗体の一部として検出されるので、ＩｇＡおよびＩｇＧを含む全抗体の検出はアッセイの感度を増加させる。好ましい実施形態では、配列番号１またはその変異体を含む単離された、純粋なおよび／または組換えポリペプチドを使用して、配列番号１に対する抗体の非存在が検出され得る。

好ましい実施形態では、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体、より好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭ、最も好ましくはＩｇＧに加えて、配列番号３０によって定義される、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｎタンパク質に対する抗体の存在または非存在が決定される。本発明による担体を、この目的のために配列番号３０またはその変異体によって定義されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｎタンパク質を含むポリペプチドでコーティングすることができる。

好ましい実施形態では、配列番号３１によって定義されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１ドメインの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する抗体の存在または非存在が検出される。本発明による担体を、この目的のために配列番号３１またはその変異体を含むポリペプチドでコーティングすることができる。

好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質の配列番号３２によって定義されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ２ドメインに対する抗体の存在または非存在が検出される。本発明による担体は、この目的のために配列番号３２またはその変異体を含むポリペプチドを含み得る。

好ましい実施形態では、二次抗体が、抗体または免疫グロブリンクラス、好ましくはヒト抗体クラス、好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体、好ましくはＩｇＡの全ての抗体に結合する抗体である。二次抗体は、典型的には前記Ｉｇクラスの抗体によって共有される配列または３Ｄ構造にわたるさまざまなエピトープに対する結合部位で、前記クラスの定常ドメインを認識するまたは多価である。二次抗体は、典型的にはヒト以外の哺乳動物由来または鳥由来、好ましくはニワトリ、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、ブタ、ロバ、ヤギ、ウシ、ラクダ、ラマまたはヒト以外の霊長類由来である。これらの広範囲が市販されている。

本発明によると、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症は、初期段階で、好ましくは疾患症状の発症後５日以内に、増加した感度で検出され得る。

さらに好ましい実施形態では、本発明の方法が、診断についての結果を評価するステップをさらに含む。本発明による評価は、検査された個体のための処置が必要であるかどうかを決定するために行われる。診断の結果の評価は、診断が陽性であった場合、適切な処置を選択するために、医師が関与することを含み得る。重要なことに、評価を除く本発明の方法は、ある国などのある場所で行われ、診断の結果の評価は異なる場所で行われ得る。

異なる好ましい実施形態では、本発明の方法が、診断または評価の結果を異なる場所に移すステップをさらに含む。この好ましい実施形態は、場合により評価ステップを含む本発明の方法がある国などのある場所で行われ、診断および評価の結果がそれぞれ、異なる国などの異なる場所に移される場合に関する。移動は当業者に利用可能な任意の手段によって行われ得る。これには、データの電子的移動ならびに読み取り資料の実際の移動が含まれる。この好ましい実施形態によると、特に、陽性結果の場合に患者を処置する医師または診療所は、処置成功のために適切なステップをとることができる。診断的に有用な担体は、好ましくは顕微鏡法用のスライドガラス、バイオチップ、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、側方流動装置、試験片、メンブレン、例えばニトロセルロースメンブレン、好ましくはラインブロット、クロマトグラフィーカラムおよびビーズ、好ましくはマイクロタイタープレートを含む群から選択される。

好ましい実施形態では、診断的に有用な担体がラインブロットである（Ｒａｏｕｌｔ，Ｄ．，ａｎｄ Ｄａｓｃｈ，Ｇ．Ａ．（１９８９），Ｔｈｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ：ａｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｎｔｉｂｏｄ−ｉｅｓ．Ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５（１−２），５７−６５；国際公開第２０１３０４１５４０号）。好ましい実施形態では、本明細書で使用される「ラインブロット」という用語が、抗体を特異的に捕捉する１つまたは複数の手段でコーティングされた、より好ましくはメンブレンベースの試験片を指し、好ましくはこれらの手段の各々がポリペプチドである。２つ以上の手段が使用される場合、これらは好ましくは担体上で空間的に離間される。好ましくは、バンドの幅が、試験片の幅の少なくとも３０％、より好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％または８０％である。ラインブロットは、十分に長く、十分な条件下で、特にヒト血清の存在下で試料と、または二次抗体と、それぞれ接触したことを確認するために１つまたは複数の対照バンドを含み得る。ラインブロットは、好ましくはニトロセルロースメンブレンでできている。

別の好ましい実施形態では、診断的に有用な担体がビーズである。多数の用途のためのさまざまなビーズ、主に炭水化物、例えばセファロースまたはアガロース、またはプラスチックに基づくものが市販されている。これらは、抗体を特異的に捕捉する手段の固定化に利用することができる、カルボキシル基またはトシル基またはエステル基などの活性または活性化可能な化学基を含有し得る。好ましくは、ビーズが、平均直径０．１μｍ〜１０μｍ、０．５μｍ〜８μｍ、０．７５μｍ〜７μｍまたは１μｍ〜６μｍのビーズである。ビーズを、直接的にまたはアフィニティーリガンド、例えばそれぞれビオチンもしくはグルタチオン、およびストレプトアビジンもしくはＧＳＴを介して、抗体を特異的に捕捉する手段でコーティングすることができる。例えば、ビーズをビオチンまたはグルタチオンでコーティングし、抗原をストレプトアビジンまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはその変異体とそれぞれ融合することができる。好ましくは、ビーズは、１０〜９０％、好ましくは２０〜８０％、好ましくは３０〜７０％、より好ましくは４０〜６０％（ｗ／ｗ）のビーズ含有量を有する水性懸濁液の形態で提供される。当業者であれば、市販のこのようなビーズ（Ｄｉａｍｉｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．，Ｃｈｒｉｏｐｏｕｌｕｓ，Ｔ．Ｋ．，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ製のＢｉｏ−Ｐｌｅｘ ＣＯＯＨビーズＭＣ１００２６−０１または１７１−５０６０１１に精通している。

特に好ましい実施形態では、ビーズが、磁石を用いて表面上で容易に濃縮することができる、常磁性ビーズである。この目的のために、市販の常磁性ビーズは通常、常磁性鉱物、例えば酸化鉄を含有する。多様な適切な常磁性ビーズが市販されている。ビーズを検出可能な標識で標識することができる。

好ましい実施形態では、存在するバッファーを除去し、新たなバッファーを添加した後、磁場を印加して、ビーズを濃縮および固定化することによって、常磁性ビーズを使用し、バッファーで洗浄またはインキュベートする。次いで、磁場を中断して、ビーズの新たなバッファーへの懸濁をより効率的にすることができる。バッファーは、希釈した患者試料を含む本発明により使用される任意の緩衝化溶液、インキュベーションバッファーまたは二次抗体を含むバッファーであり得る。

好ましい実施形態では、抗体が、化学発光標識を使用して検出される。好ましい実施形態では、これが、好ましくは、自身が消費されることなく化学発光基質をターンオーバーし得る、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび□−ガラクトシダーゼまたはこれらの変異体を含む群から選択される、化学発光酵素である（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．（２００３）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ ａｃｔａ，５００（１）：２７９−２８６）。別の好ましい実施形態では、化学発光標識が、シグナルを放出するのに必要な無機および／または非酵素的有機化合物を含む化学発光基質溶液と接触した場合に、分解されると化学発光シグナルを放出する、化学発光反応を触媒する酵素活性を有さない小有機化合物である。好ましくは、酵素活性を有さない小有機化合物が、アクリジニウムエステル（Ｗｅｅｋｓ，Ｉ．，Ｂｅｈｅｓｈｔｉ，Ｉ．，ＭｃＣａｐｒａ，Ｆ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｋ．，Ｗｏｏｄｈｅａｄ，Ｊ．Ｓ．（１９８３）Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒｓ ａｓ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｌａｂｅｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２９：１４７４−１４７９）およびルミノールまたはイソルミノールなどのその化学発光誘導体を含む群から選択される。このような小有機化合物を二次抗体とカップリングすることができる。ルミノールの場合、基質溶液が、高ｐＨでＨ_２Ｏ_２を含む。アクリジニウムエステルの場合、Ｈ_２Ｏ_２と水酸化ナトリウムの混合物が頻繁に使用される。小有機化合物は化学発光シグナルの放出時に消費される。好ましい実施形態では、化学発光標識の化学発光が、化学発光検出反応の開始後１〜６０秒間、好ましくは２〜２０秒間、より好ましくは３〜１５秒間検出される。別の好ましい実施形態では、化学発光標識の化学発光が少なくとも０．５秒間、１秒間、１．５秒間、２秒間、２．５秒間または３秒間検出される。別の好ましい実施形態では、担体が、ＥＬＩＳＡに使用され得る少なくとも８つのウェルを含むマイクロタイタープレートである。ウェルの少なくとも１つは、直接的または間接的に、抗体を特異的に捕捉する手段、好ましくは配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドでコーティングされる。規定の濃度の少なくとも３つ、好ましくは４つ、より好ましくは５つの較正物質を使用して半定量分析のための検量線を設定することができる。本発明の方法を行う場合、典型的には検量線を網羅する範囲の濃度を網羅する較正物質を、試料と並行して処理および展開することができる。酵素活性標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ活性もしくはアルカリホスファターゼ活性または化学発光可能な酵素を有する標識などの検出可能な標識を含む二次抗体を提供することができる。

別の好ましい実施形態では、担体がマイクロアレイである。好ましい実施形態では、本明細書で使用される「マイクロアレイ」という用語が、さまざまな空間的に離間した抗原、好ましくは少なくとも２０個、好ましくは３０個、４０個、５０個、８０個または１００個をスポットしたチップを指す。好ましくは、各抗原が、配列番号１の断片に広がる、より好ましくはＲＢＤ（配列番号３１）に広がる５〜２５個、好ましくは７〜１５個の連続アミノ酸を含むまたはからなるペプチドである。標識、好ましくは蛍光標識を含む二次抗体を検出に使用することができる。好ましくは、他の抗原、より好ましくは配列番号３０（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｎタンパク質）および配列番号３３（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ２タンパク質）を含むポリペプチドの群の抗原がスポットされる。

別の好ましい実施形態では、顕微鏡免疫蛍光分析用の担体上にあるまたはその一部であるスライドガラスが使用される。細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞などの真核細胞がスライド上にある。これをマウンティングバッファーで覆うことができる。さまざまな組成物および方法が、先行技術において、例えば、“Ｍｏｕｎｔａｎｔｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅｓ”，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｒｉｇｈｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅ．ｓｃｒｉｂｄ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ／４７８７９５９２／Ｍｏｕｎｔａｎｔｓ−Ａｎｔｉｆａｄｅｓ），Ｋｒｅｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｆａｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ １１７，９１−９７およびＮａｉｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，６９７−７０５に記載されている。細胞は、好ましくは配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを過剰発現する。担体は、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを過剰発現している細胞と同じであるが、これをコードする核酸を含まないベクターでトランスフェクトされたモックトランスフェクト細胞を含み得る。このようなモックトランスフェクト細胞は陰性対照として機能し得る。別の細胞は、抗体を検出するための追加のコロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ、より好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原、例えばＮタンパク質、Ｓ２タンパク質またはＲＢＤを含み得る。

本発明によると、免疫蛍光を使用して抗体を検出することができる。当業者であればこの方法に精通している（Ｓｔｏｒｃｈ，Ｗ．Ｂ．，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，２０００；Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇ ＪＧ，Ｇｏｄｅｋｅ ＧＪ，Ｓｃｈｉｊｎｓ ＶＥ，Ｐｒｅｖｅｃ Ｌ，Ｇｒａｈａｍ ＦＬ，Ｈｏｒｚｉｎｅｋ ＭＣ，Ｒｏｔｔｉｅｒ ＰＪ．Ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｌｅｔｈａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９９３ Ｏｃｔ；７４（Ｐｔ １０）：２０６１−９．ｄｏｉ：１０．１０９９／００２２−１３１７−７４−１０−２０６１．ＰＭＩＤ：８４０９９３０）(Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒのａはウムラウト付)。手短に言えば、抗原、好ましくは配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを、前記抗体を発現している細胞であり得る担体上に固定化し、試料と接触させ、引き続いて好ましくは蛍光標識で標識された抗体を検出する手段を使用して、蛍光によって検出される抗体を検出する。好ましい実施形態では、細胞がポリペプチドを過剰発現している真核細胞、例えばＨＥＫ、Ｈｅｌａ、ＣＨＯおよびＪｕｒｋａｔ細胞ならびにこれらの類縁体を含む群から選択される細胞である。好ましい実施形態では、細胞が、好ましくは強力な異種プロモーターの制御下にある、ポリぺプチドを過剰発現している組換え細胞である。

本発明によると、側方流動装置を使用して抗体を検出することができる。当業者であれば、この目的のための側方流動装置に精通している（Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒａｐｈａｅｌ Ｗｏｎｇ，Ｈａｒｌｅｙ Ｔｓｅ，２００９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ｐａｐｅｒ−ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｅｖｉｎ Ｊ．Ｌａｎｄ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１９）。手短に言えば、側方流動アッセイは、検出可能な標識を含む、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドを含む、ニトロセルロースメンブレンなどのメンブレンに基づき得る。メンブレンを試料と接触させると、検出される抗体が抗原に結合する。得られた複合体は、メンブレン上で毛管力によって駆動されて移動し、抗体を検出する手段、典型的にはＩｇＧおよび／またはＩｇＡおよび／またはＩｇＭなどの検出される抗体の免疫グロブリンクラスに結合する二次抗体を含むメンブレン上で試験線上に固定化される。好ましくは、ナノ粒子またはビーズ、例えば金ナノ粒子またはラテックスビーズが標識として使用される。

本発明によると、ポリペプチド、好ましくは配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドが組換えタンパク質であり得、本明細書で使用される「組換え」という用語が、例えばポリペプチドをコードする核酸を、細胞もしくは組織中での過剰発現のための強力なプロモーターに融合することによって、またはポリペプチド自体の配列を操作することによって、産生プロセスの任意の段階で遺伝子操作アプローチを使用して産生されたポリペプチドを指す。当業者であれば、コードされる核酸およびポリペプチドを操作する方法（例えば、Ｇｒｅｅｎ Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨ ｏｒ ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ｔ．Ａ．（１９８６），Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌに記載される）ならびに天然または組換えポリペプチドを産生および精製する方法（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ，，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ“，，，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ“，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ａｎｄ ｉｎ Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．（２００９）：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に精通している。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドが単離されたポリペプチドであり、「単離された」という用語が、ポリペプチドが、生物工学または合成アプローチを使用して、産生時のその状態と比較して濃縮されており、好ましくは純粋である、すなわち、それぞれの液体中のポリペプチドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、引き続いてクーマシーブルー染色および目視検査によって判断されるように、前記ポリペプチドからなることを意味する。好ましくは、抗体を捕捉する手段として使用される担体上の任意のポリペプチドが純粋である。

好ましい実施形態では、生物物理学的検出方法を使用して分子の集団を他と区別するために使用され得る標識である、検出可能な標識を使用して本発明による抗体を検出する。検出可能な標識は、好ましくは蛍光、放射性、化学発光標識、重金属、例えば金標識、ナノ粒子、ビーズまたは酵素活性標識、好ましくは比色反応を触媒するものを含む群から選択される。好ましい実施形態では、蛍光標識が、Ａｌｅｘａ色素、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む群から選択される。ヨウ素−１２５を放射性標識として使用することができる。好ましい実施形態では、酵素活性標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびルシフェラーゼを含む群から選択される。当業者であれば、適切な標識を選択し、これらをタンパク質、核酸および他の分子に付着させることができ（Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ Ｌ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｖｅｅｄｕ ＲＮ．Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１８；１１（４）：１０６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１８ Ｏｃｔ １５．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈ１１０４０１０６ Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ Ｌ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｖｅｅｄｕ ＲＮ．Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１８；１１（４）：１０６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１８ Ｏｃｔ １５．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈ１１０４０１０６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｏｂｅｒｍａｉｅｒ Ｃ，Ｇｒｉｅｂｅｌ Ａ，Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ Ｒ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１２９５：１５３−６５）、広範囲の標識分子が市販されている。

本発明によると、配列番号１に対する抗体の存在を検出する手段が提供される。好ましい実施形態では、検出可能な標識を含む二次抗体を使用して、配列番号１、より好ましくは配列番号１および別のコロナウイルス抗原に対するＩｇＡおよび／またはＩｇＧおよび／またはＩｇＭ、好ましくはＩｇＡクラス抗体を検出することができる。ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を酵素活性標識として使用することができる。好ましくは、二次抗体が哺乳動物抗体、より好ましくはヒト抗体を認識する。１つのＩｇクラスの抗体を検出する場合、１つがＩｇＡクラス抗体に結合し、１つがＩｇＧクラス抗体に結合する２つの二次抗体を使用することができる。２つの二次抗体は混合物であっても別個であってもよいが、好ましくは別個であって、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧおよびＩｇＡなどの異なるＩｇクラスの抗体の別個の検出を可能にして、例えば、ＩｇＡクラス抗体が多くの患者でＩｇＧクラス抗体よりも初期に出現するという事実に基づいて、疾患の経過に関する情報を得ることができる。あるいは、２つ以上のＩｇクラスの、例えばＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを含む群の抗体に結合する１つの二次抗体、好ましくはＩｇＧおよびＩｇＡクラス抗体に結合するものを使用することができる。二次抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましい実施形態では、二次抗体が、ヒト以外の哺乳動物に由来するが、ある特定のＩｇクラス、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭのヒト抗体に結合する。当業者であれば、二次抗体の作製および使用に精通している（Ｋａｌｙｕｚｈｎｙ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｂｅｙｏｕｎｄ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１７，ｉｎ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｈａｐｔｅｒ ４；Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．Ｃ．，ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，２０００，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ）。場合により蛍光標識などの標識を含む、さまざまな二次抗体、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のＦＩＴＣ標識二次抗体カタログ番号Ｈ１５１０１、カタログ番号６２−８４１１、カタログ番号Ａ２４４５９、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体カタログ番号３１４２０、カタログ番号ＳＡ１−３５４６７、カタログ番号ＳＡ１−３５４６７、カタログ番号ＳＡ１−３５４６７などが市販されている。二次抗体またはアプタマーの標識断片を使用することもできる。当業者であれば、例えば検出される抗体、好ましくはＩｇＧおよび／またはＩｇＡおよび／またはＩｇＭ抗体に特異的に結合する場合、配列番号１に対する抗体の存在を検出する手段としても使用することができる、アプタマーの合成、選択および使用（Ｔｈｉｖｉｙａｎａｔｈａｎ Ｖ，Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ ＤＧ．Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ．２０１２；６（１１−１２）：５６３−５７３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｃａ．２０１２０００４２）ならびに特異的抗体の作製（Ｈｕｓｔ Ｍ，Ｆｒｅｎｚｅｌ Ａ，Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎ Ｔ，Ｄｕｂｅｌ Ｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１０１：３０５−２０；Ｈａｎａｃｋ Ｋ，Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｋ，Ｌｉｓｔｅｋ Ｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２０１６；９１７：１１−２２；Ｈａｒｏｌｄ Ｆ．Ｓｔｉｌｌｓ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒａｂｂｉｔ， Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ，Ｈａｍｓｔｅｒ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｏｄｅｎｔｓ，２０１２）に精通している。このようなアプタマーは、検出される抗体の他の部分の定常領域またはエピトープに特異的に結合し得る。(Ｄｕｂｅｌのｕはウムラウト付)

別の好ましい実施形態では、配列番号１またはその変異体、好ましくは受容体結合ドメイン（配列番号３１）を含むポリペプチドが、配列番号１に対する抗体の存在を検出する手段として使用され得る。より具体的には、前記ポリペプチドを診断的に有用な担体にコーティングし、使用して検出される抗体を捕捉することができる。ヒト抗体は２つ以上の結合部位を有するので、捕捉された抗体の１つの抗原結合部位のみが占有され得る。担体上にコーティングされていない、配列番号１またはその変異体を含む別のポリペプチドのその後の添加によって、この新たに添加されたポリペプチドによる別の結合部位の占有がもたらされ得る。次いで、コーティングされたポリペプチド、検出される抗体および他のポリペプチドを含む複合体を検出することができる。より好ましくは、他のポリペプチドが検出可能な標識を有し、これを使用して複合体を検出する。この実施形態では、全ての抗体、より具体的にはＩｇＡとＩｇＭとＩｇＧのクラス抗体を検出することができる。

別の好ましい実施形態では、配列番号１中の受容体結合ドメインに結合する配列番号３９（ＡＣＥ２）またはその変異体を含むポリペプチドを、場合によりＡＣＥ２受容体に結合する配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドと組み合わせて、配列番号１に対する抗体の存在を検出する手段として使用することができる。次いで、競合アッセイフォーマットを使用してその存在を検出する。

別の好ましい実施形態では、別個の免疫グロブリンクラスに結合する特異的抗体を検出可能な標識で標識し、配列番号１に対する抗体の存在を検出する手段として使用することができる。例えば、プロテインＧ、ＡおよびＬはＩｇＧクラス抗体に結合する細菌タンパク質であり（Ｌ．Ｂｊｏｒｃｋ，Ｇ．Ｋｒｏｎｖａｌｌ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ，ａ ｎｏｖｅｌ ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｉｎ： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１３３（２）／１９８４．）、ジャカリン（Ａｂｃａｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）はＩｇＡクラス抗体の結合に使用され得る（例えば、Ｃｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１６ Ｄｅｃ；９（１２）：９９４；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ＆Ｎｅｖｉｌｌｅ Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９８８ Ｍａｒ；１８（２）：１９５−８参照）。

好ましい実施形態では、本発明によるキットが、好ましくは診断的に有用な担体、より好ましくはマイクロタイタープレートにコーティングされた、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドと、較正物質、陽性対照、陰性対照、洗浄バッファー、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧクラス抗体の存在を検出する手段、好ましくは検出可能な標識を含み得る、抗体、より好ましくはＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧクラス抗体に特異的に結合する二次抗体、試料バッファー、検出溶液、好ましくは色素原／基質溶液、停止溶液および保護箔を含む群の１つまたは複数、好ましくは全ての試薬とを含む。

好ましい実施形態では、較正物質が、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドに結合し、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧのいずれか、いずれか二つ、すべてのクラス抗体を認識する二次抗体によって認識される試薬である。較正物質は配列番号１に対するＩｇＡ抗体であり得る。あるいは、較正物質が、好ましくは別個の免疫グロブリンクラス、好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧおよび／またはＩｇＭによって共有される定常領域または他の領域またはエピトープと、可変領域、特に人工抗体に由来する結合部位とを含むキメラ抗体であり得る。当業者であれば、このような較正物質の設計、作製および使用に精通している（Ｌｕｔｋｅｃｏｓｍａｎｎ Ｓ，Ｆａｕｐｅｌ Ｔ，Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ Ｓ，Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ Ｔ，Ｍｉｃｈｅｅｌ Ｂ，Ｈａｎａｃｋ Ｋ．Ａ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．２０１９ Ｄｅｃ；４９９：８７−９２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃａ．２０１９．０９．００３．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ｓｅｐ ４．ＰＭＩＤ：３１４９３３７４，Ｈａｃｋｅｔｔ Ｊ Ｊｒ，Ｈｏｆｆ−Ｖｅｌｋ Ｊ，Ｇｏｌｄｅｎ Ａ，Ｂｒａｓｈｅａｒ Ｊ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｊ，Ｒａｐｐ Ｍ，Ｋｌａｓｓ Ｍ，Ｏｓｔｒｏｗ ＤＨ，Ｍａｎｄｅｃｋｉ Ｗ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｔｈａｔ ｍｅａｓｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ Ｍａｙ；３６（５）：１２７７−８４．ｄｏｉ：、国際公開第２００９０８１１６５号）。好ましい実施形態では、陽性対照が、本発明による方法を使用して陽性結果が得られる量の、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を患っている患者の試料からの、好ましくはＩｇＡとＩｇＧとＩｇＭのクラス抗体、より好ましくはＩｇＡを含む群の、配列番号１に対する抗体などの化合物を含む溶液である。陰性対照はこのような化合物を欠き、健康な人の血清を含み得る試薬である。洗浄バッファーは、インキュベーション後にマイクロタイタープレートなどの担体を洗浄して非特異的抗体を除去するために使用され得、ＰＢＳであり得る。抗体の存在を検出する手段は、検出される抗体クラス、好ましくはヒトＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧのいずれか、いずれか二つ、またはすべてのクラス抗体に結合する二次抗体であり得、検出可能な標識、好ましくは酵素、より好ましくはペルオキシダーゼ活性を有する酵素で標識される。試料バッファーは、患者試料を希釈するために使用することができ、ＰＢＳであり得る。検出溶液は、標識された二次抗体の存在下でシグナルをもたらすことができ、好ましくは発色溶液、より好ましくは３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン／Ｈ_２Ｏ_２である。停止溶液は、検出溶液の反応を停止するために反応物に添加され得、強酸、好ましくは０．５Ｍ硫酸を含み得る。保護箔は、蒸発を回避するためにマイクロタイタープレートなどの担体の上に配置され得る。

本発明により使用されるいずれの試薬も保存剤、例えばアジドを含み得る。

本発明によると、診断キットを製造するための、配列番号１もしくはその変異体を含むポリペプチド、または配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用が提供される。好ましい実施形態では、ポリペプチドまたは抗体が、このようなキットの成分の１つとして包装される。ポリペプチドまたは抗体を使用してキットの製造時の品質を確認することができる。例えば、抗体を陽性対照として使用して、別個のまたは診断的に有用な担体上にコーティングされた、キットの成分である配列番号１を含むポリペプチドの反応性を確認することができる。ポリペプチドを使用して、キットの一部である、配列番号１に特異的に結合する抗体の反応性を確認することができる。ポリペプチドを使用して、製造の一部として診断的に有用な担体をコーティングすることができる。ポリペプチドと抗体の両方を使用して、担体およびキットを調製するために使用される緩衝化溶液中の、抗体もしくはポリペプチドそれぞれの濃度を決定する、または細胞が配列番号１を含むポリペプチドを発現しているかどうかを確認することができる。

本発明によると、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するため、または本発明による鑑別診断のために使用される。この使用は、単独のまたは配列番号１に対する他の抗体もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原に対する抗体と組み合わせた抗体を検出し、よって診断アッセイの全体的な感度を増加させることに関し得る。より好ましい実施形態では、ＩｇＡクラス抗体を使用して、特に感染症の初期段階での、診断アッセイの感度を増加させる。これは、ＩｇＧだけでなく、ＩｇＡクラス抗体も、場合により配列番号１に対するＩｇＭクラス抗体も、またはＩｇＡのみ検出することによって達成され得る。より好ましい実施形態では、ＩｇＧクラス抗体を使用して、特に他の抗原に対する抗体、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の後期の間などのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質に対するＩｇＧクラス抗体の濃度の低下を見る一定期間にわたって診断アッセイの感度を増加させる。これは、ＩｇＧだけでなく、ＩｇＡクラス抗体も、場合により配列番号１に対するＩｇＭクラス抗体も、またはＩｇＧのみ検出することによって達成され得る。別の好ましい実施形態では、抗体を、前記抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧクラス抗体、好ましくは全てを含む較正物質を使用して、装置またはアッセイを較正することによって診断に使用することができる。好ましい実施形態では、配列番号１に対するＩｇＡおよび／またはＩｇＧ抗体を使用して、免疫化の後期で感度を増加させる。抗体を、アッセイの検証のため、較正のため、診断的に有用な担体などの試薬もしくはアッセイ材料の品質の確認のため、または陽性対照として使用することができる。

本発明によると、配列番号１もしくはその変異体を含むポリペプチド、または配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体が、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を診断するための、診断キットの製造に使用され、配列番号１に特異的に結合するＩｇＡクラス抗体が検出される。

好ましくは感染症の初期段階での、より好ましくは疾患症状の発症後５日以内の、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の検出の感度を増加させるための、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧのいずれか、いずれか二つ、すべて、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用。別の好ましい実施形態では、使用が感染症の後期であり得る。好ましい実施形態では、配列番号１に対するＩｇＡとＩｇＭとＩｇＧの存在または非存在が検出される。

本発明は、特に以下および／または本明細書の配列表形成部に記載される配列を含む、新規な核酸およびポリペプチド配列の範囲を含む。本明細書の以下に示される配列と、配列表に記載される対応する配列との間に矛盾がある場合、本発明が、具体的かつ個別的に、それぞれの配列のそれぞれ１つずつ、すなわち、本明細書の以下に記載される配列および配列表に記載される配列にも関することが理解されよう。

配列番号１（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のＳ１ドメイン）

配列番号２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のＳ１ドメイン、Ｃ末端ｈｉｓタグ付き、例で細胞で発現される）

配列番号３（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のＳ１ドメイン、Ｃ末端ｈｉｓタグ付き、シグナルペプチドの切断後、例で使用される）

配列番号４（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のＳ１ドメイン、配列番号２をコードするヌクレオチド配列）−配列表のみ
配列番号５（考えられるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳ１エピトープ）−配列表のみ
配列番号６（Ｓ１［ＭＥＲＳ＿ＣＯＶ］）−配列表のみ
配列番号７（Ｓ１［ＨＣｏＶ−２２９Ｅ］）−配列表のみ
配列番号８（Ｓ１［ＨＣｏＶ−ＯＣ４３］）−配列表のみ
配列番号９（Ｓ１［ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１］）−配列表のみ
配列番号１０（Ｓ１［ＨＣｏＶ−ＮＬ６３］）−配列表のみ
配列番号１１（Ｓ１［ＳＡＲＳ＿ＣｏＶ］）−配列表のみ
配列番号１２（配列番号１の断片）−配列表のみ
配列番号１３（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２分離株のゲノム 武漢Ｈｕ−１ゲノム、Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＮ９０８９４７と同一）：［配列表のみ］

配列番号１４、配列番号１の３０〜４４である−配列表のみ
配列番号１５、配列番号１の４８〜６８である−配列表のみ
配列番号１６−配列番号１の１１０〜１６６である−配列表のみ
配列番号１７−配列番号１の２００〜２１４である−配列表のみ
配列番号１８−配列番号１の２２６〜２５０である−配列表のみ
配列番号１９−配列番号１の２５６〜２７７である−配列表のみ
配列番号２０−配列番号１の３２８〜３４２である−配列表のみ
配列番号２１−配列番号１の３９９〜４１４である−配列表のみ
配列番号２２−配列番号１の４３４〜４４８である−配列表のみ
配列番号２３−配列番号１の５５０〜５７２である−配列表のみ
配列番号２４−配列番号１の５９０〜６０４である−配列表のみ
配列番号２５−配列番号１の６３２〜６５０である−配列表のみ
配列番号２６−配列番号１の３５４〜３６８である−配列表のみ
配列番号２７−配列番号１の６２２〜６３６である−配列表のみ
配列番号２８−配列番号１の３０〜４４である−配列表のみ
配列番号２９−配列番号１の２２６〜２５０である−配列表のみ

配列番号３０：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＮタンパク質

配列番号３１：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のＳ１ドメインの断片、ＲＢＤ

配列番号３２：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のＳ１ドメインの断片、ＲＢＤ、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き

配列番号３３：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のＳ２ドメイン

配列番号３４：例で使用されるＲＢＤ

配列番号３５（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号３６（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号３７（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号３８：Ｈｉｓタグ付きＲＢＤ

配列番号３９：ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）

配列番号４０（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４１（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４３（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４４（ＧＳＴ融合物を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４５（ＧＳＴ融合物を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４６（ＧＳＴ融合物を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４７（ＧＳＴ融合物を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４８（ＧＳＴ融合物を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号４９（ＧＳＴ融合物、Ｐ１〜Ｐ６を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号５０（ヒトＡＣＥ２のＣ末端Ｈｉｓタグ付き細胞外ドメイン）

配列番号５１（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２英国変異株Ｂ．１．１．７の突然変異を有する配列番号１）−配列表のみ
配列番号５２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２南アフリカ変異株Ｂ．１．３５１の突然変異を有する配列番号１）：−配列表のみ
配列番号５３（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ブラジル変異株Ｐ．１の突然変異を有する配列番号１）：−配列表のみ
配列番号５４（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２デンマークのミンク変異株の突然変異を有する配列番号１）：−配列表のみ

配列番号５５：（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

配列番号５６（ＧＳＴ融合物、Ｐ１−Ｐ６を含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗体と反応性の配列番号１由来ペプチド）

本発明を以下の例、配列および図面によってさらに例示し、そこから本発明のさらなる特徴、実施形態、態様および利点を理解することができる。本明細書に記載されるものと類似または同等の全ての方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができ、適切な方法および材料が本明細書に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は全体が参照により本明細書に組み込まれる。

例３に記載される、２人の患者(図１）で監視した、配列番号１（ＩｇＡ、ＩｇＧ）およびＮタンパク質（ＩｇＧ、ＩｇＭ）に対する抗体レベルの時間経過を示す図である。 ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染した患者の別の時間経過の監視を示す図である。配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体（正方形）、配列番号１に対するＩｇＧクラス抗体（三角形）およびＮタンパク質に対するＩｇＧクラス抗体（丸形）を決定した。 （Ａ）第１のステップで抗Ｈｉｓタグ（１：２００）もしくは患者血清（ＰＳ、１：１００）、第２のステップで抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣもしくは抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣと直接インキュベートした、（Ｂ）Ａに記載されるＰＳ３との第２のステップのインキュベーションの前にＰＢＳと３０分間インキュベートした、または（Ｃ）ＰＢＳと３０分間インキュベートし、引き続いて第１のステップでＰＳ３（１：１００）と、第２のステップで抗ヒトＩｇＧ−ビオチン（１：２００）および第３のステップでＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ（１：２０００）とインキュベートした、アセトン固定Ｓ１発現または対照プラスミドトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を使用したＩＦＡを示す図である。Ｓ１発現細胞を、標準的な方法を使用して、配列番号２を発現するｐＴｒｉＥｘベクターでトランスフェクトした。患者抗体と反応性であると特定された代表的な細胞を矢印で示した。 ＲＢＤを含む融合タンパク質を使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体の検出を示す図である。 配列番号１を含むポリペプチドを使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体の検出を示す図である。 配列番号１の断片およびその融合タンパク質を使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＭ抗体の検出を示す図である。 配列番号１の断片およびその融合タンパク質を使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＡ抗体の検出を示す図である。 配列番号１の断片およびその融合タンパク質を使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＧ抗体の検出を示す図である。 配列番号１の断片およびその融合タンパク質を使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＭ抗体の時間依存的検出を示す図である。 配列番号１の断片およびその融合タンパク質を使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＧ抗体の時間依存的検出を示す図である。 配列番号１の断片およびその融合タンパク質を使用したドットブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＡ抗体の時間依存的検出を示す図である。 ＲＢＤを含むポリペプチドを使用したウエスタン分析に基づく、患者の試料からのＩｇＡ抗体の検出を示す図である。 ＲＢＤを含むポリペプチドを使用したウエスタンブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＭ抗体の検出を示す図である。 ＲＢＤを含むポリペプチドを使用したウエスタンブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＧ抗体の検出を示す図である。 配列番号１を含むポリペプチドを使用したウエスタンブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＡ抗体の時間依存的検出を示す図である。 配列番号１を含むポリペプチドを使用したウエスタンブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＭ抗体の時間依存的検出を示す図である。 配列番号１を含むポリペプチドを使用したウエスタンブロット分析に基づく、患者の試料からのＩｇＧ抗体の時間依存的検出を示す図である。

［例１］［ＥＬＩＳＡイムノアッセイ試料を使用した、配列番号１に対する抗体の検出］
Ｃｏｒｍａｎら（Ｃｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９−ｎＣｏＶ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ，https：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｄｏｃｓ／ｄｅｆａｕｌｔ−ｓｏｕｒｃｅ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ−ｖ２−１．ｐｄｆ？ｓｆｖｒｓｎ＝ａ９ｅｆ６１８ｃ＿２）によって記載されるＰＣＲによりＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２陽性と検査された患者からの８試料を感染６〜１４日後に入手し、感染後のより初期時点で得られたこのような患者からの１４試料が入手可能であった。

さらに、ＭＥＲＳに感染した患者からの１８試料と、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１に感染した患者からの３試料と、ＮＬ６３の４人の患者と、２２９Ｅの３人の患者と、ＯＣ４３の６人の患者と、ＨＫＵ１の３人の患者を含むさまざまなコロナウイルスを含有する試料範囲が入手可能であった。

［抗原でコーティングされたマイクロタイタープレートの調製］
配列番号４の人工シグナル配列およびＣ末端Ｈｉｓタグを有するｐＴｒｉＥｘ−１プラスミドへの標準的なクローニングを使用して、配列番号２をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させて、配列番号２、およびシグナルペプチドの除去後、配列番号３の発現を得た。トランスフェクト細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中、３７℃および８．５％ＣＯ_２で３〜５日間培養した。細胞を収穫し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦに再懸濁し、さらに使用するまで−８０℃で保管した。

配列番号３を調製するため、細胞培養物上清を、５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩化物ｐＨ８．０、１６４ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／塩化マグネシウム、２０ｍｍｏｌ／イミダゾール、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に調整し、４℃、１７６０００×ｇで３０分間の遠心分離によって清澄化し、５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩化物ｐＨ８．０、３００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／ｌイミダゾールで平衡化したＮｉｃｋｅｌ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎ（Ａｇａｒｏｓｅ Ｂｅａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マイアミ、ＦＬ、米国）に適用し、イミダゾール濃度を１５０ｍｍｏｌ／ｌまで増加させることによって溶出した。配列番号３を含有する全ての画分をプールし、限外濾過（ＶｉｖａＳｐｉｎ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）によって濃縮した。最終調製物をさらに使用するまで−８０℃で保管した(Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎのｏはウムラウト付)。

配列番号３の最終タンパク質調製物を、１６ｍｍｏｌ／ｌのジチオトレイトールで処理してまたはしないで、７０℃または室温で１０分間インキュベートし、引き続いてＳＤＳゲル電気泳動およびクーマシー染色をした。質量分析によってタンパク質同一性を検証した。

マイクロタイターＥＬＩＳＡに使用するために、精製したタンパク質をＰＢＳに希釈しておよそ１．５μｇ／ｍｌの最終濃度にし、これを使用してＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を一晩コーティングした。

［実験手順］
試料をＩｇＧ試料バッファーに１：１０１希釈し、マイクロタイタープレートに適用し、市販の試薬（例えば、塩濃度およびｐＨに関して本質的に生理学的条件を有するバッファーである、ＥＩ２２６０−９６０１Ｇ／Ａ）を使用して、市販のＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＥＬＩＳＡ検査キットに記載されるようにインキュベートした。ＥＩ２２６０−９６０１Ｇ／Ａのマニュアルに従った。手短に言えば、３７℃で６０分間；洗浄バッファーを使用した３回の洗浄ステップ；１ウェル当たり１００μｌのペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧコンジュゲート（ウサギ）または抗ヒトＩｇＡコンジュゲート（ウサギ）の添加；３７℃で３０分間のインキュベーション；ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ洗浄バッファーを使用した３回の洗浄ステップ；１ウェル当たり１００μｌの色素原／基質溶液（ＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２）の添加；室温で３０分間のインキュベーション；１００μｌの停止溶液（０．５Ｍ硫酸）の添加；参照としての６３０ｎｍでの光学濃度に対する４５０ｎｍでの光学濃度の測定。市販の較正物質（製品番号ＥＩ２６０６−９６０１Ａ、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＡＧ）を使用して較正を行った。対照または患者試料の吸光度を較正物質の吸光度で割ることによって比を計算した。０．８未満の結果を陰性とみなし、０．８〜１．１の間の結果を境界とみなし、１．１超の結果を陽性とみなした。

［結果] 一次データを表１に示す。

［結論］
結果は、配列番号１に対する抗体を使用して、ヒト患者からの試料でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断することができることを示している。

ＩｇＧおよびＩｇＡクラス抗体を認識する二次抗体で得られたデータの比較は、少なくとも疾患の初期段階では、ＩｇＡ抗体の検出がより高感度であることを示している。発症後６日より前の感染の初期段階で採取された４／１４患者試料を、ＩｇＡクラス抗体が検出された場合、陽性として正しく同定することができたが、同じ試料でのＩｇＧの検出は陰性結果をもたらした。

両アッセイは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１患者からの試料との交差反応性を示したが、ＭＥＲＳや、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１に感染した患者らからの複数の試料の事実上いずれとも交差反応性を示さなかった。異なる時間分解Ｉｇクラスシグニチャー、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１におけるＩｇＡクラス抗体の遅い出現に基づいて（Ｈｓｕｅ，Ｐ．Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｋａｏ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ Ｐ．Ｃ．（２００４）Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＧ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１０（１２），１０６２−１０６６）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−１とＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の区別が可能である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のアウトブレイク以来、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのケースはほぼ全く報告されていない。

独立した研究者らによるさまざまな過去に公開された刊行物が本発明者らの知見を裏付けている。Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎらは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ抗体を検出するための６つの市販の血清学的アッセイによる比較試験から、試験した６つのアッセイの中で、Ｓ１に対するＩｇＡの検出に基づくＥＵＲＯＩＭＭＵＮアッセイが最高の感度をもたらすと結論付けた（Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎ，Ａ．Ｊ．，Ｋｕｉｖａｎｅｎ，Ｓ．，Ｋｅｋａｌａｉｎｅｎ，Ｅ．，Ａｈａｖａ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｏｇｉｎｏｖ，Ｒ．，Ｋａｌｌｉｏ−Ｋｏｋｋｏ，Ｈ．，Ｖａｐａｌａｈｔｉ，Ｏ．，Ｊａｒｖａ，Ｈ．，Ｋｕｒｋｅｌａ，ａｎｄ Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ｍ．（２０２０），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２９，１０４５１２）（ＪａａｓｋｅｌａｉｎｅｎのａａとＫｅｋａｌａｉｎｅｎの二つのａは共にウムラウト付）。Ｏｋｂａらも同様の結果を得た（Ｏｋｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０２０ Ｊｕｌ；２６（７）：１４７８−１４８８，ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ ｍｅｄＲｘｉｖ ２０２０．０３．１８．２００３８０５９）。Ｂｅａｖｉｓらは、本発明によるＩｇＡに基づくアッセイの感度が疾患の初期段階で優れているが、ＩｇＧアッセイが後期段階で優れていることを確認した（Ｂｅａｖｉｓ，Ｋ．Ｇ．，Ｍａｔｈｕｓｈｅｋ， Ｓ．Ｍ．，Ａｂｅｌｅｄａ，Ａ．Ｐ．Ｆ．，Ｂｅｔｈｅｌ，Ｃ．，Ｈｕｎｔ，Ｃ．，Ｇｉｌｌｅｎ，Ｓ．，Ｍｏｒａｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｔｅｓｉｃ，Ｖ．（２０２０）Ｅｖａｌｕｔａｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ Ａｎｔｉ−ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＡ ａｎｄ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２９，１０４４６８）。

要約すると、本発明によるアッセイを、配列番号１に診断的に関連する抗体の初期検出に使用することができる。一部の患者では、症状の発症から６日経過する前に、真陽性結果を見出すことができる。そのため、このアッセイは、ＰＣＲに基づくアッセイを使用することができる期間とイムノアッセイを使用することができる期間との間の診断の差を埋めるまたは少なくとも狭めるのに役立つ。

［例２］［配列番号１に対するＩｇＡ抗体を検出するための検査の診断信頼性および妥当性をさらに特徴付けることを目的とした拡大ＥＬＩＳＡ検査］
本アッセイの感度を決定する目的で、例１に記載されるのと同様のアッセイに基づいて、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ製品番号ＥＩ２６０６−９６０１Ａを使用して、１５２人のヨーロッパ人患者からの１６６試料でＩｇＡ抗体の存在または非存在を検出した。対象の試料の各々で、感染の初期段階からの試料に基づいて、Ｃｏｒｍａｎ ＶＭ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９−ｎＣｏＶ）ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ．Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ ２５（３）：ｐｉｉ＝２００００４５（２０２０−０１−２３）に従って、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を確認した。

手短に言えば、このアッセイは、精製された配列番号１を含む抗原でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用したＥＬＩＳＡに基づく。試料とインキュベートし、生理学的バッファーを使用して大規模な洗浄ステップを行った後、酵素活性標識で標識されたＩｇＡに対する二次抗体を使用して、配列番号１に対するＩｇＡ抗体を特異的に装飾し、引き続いて発色基質のインキュベートを行う。さらなる詳細は、製品（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ製品番号ＥＩ２６０６−９６０１Ａ）と共に供給されるマニュアルに中に見出すことができ、この製品マニュアルは参照により本明細書に組み込まれる。

感染の経過後に得られた試料に基づいて、血清学的特性評価を行った。

症状の発症後１０日目までに得られた（または陽性ＲＴ−ＰＣＲによる感染の直接検出後１０日目までに得られた）試料で、配列番号１に対するＩｇＡに関する６０．２％の感度が決定された。１０日目より後に得られた試料では感度が９８．６％であった。

しかし、これらの結果および免疫応答は極めて個別的である。例えば、患者の少数はＩｇＡ応答もＩｇＧ応答もＩｇＭ応答も全く示さない場合がある。

まとめると、このさらなる検査もまた、配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体の特異的検出が、既に疾患の初期段階でのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の検出に特に高い感度を提供することを首尾一貫して示している。

［例３］［ＥＬＩＳＡによって示されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２患者における経時的なさまざまな診断的に関連する抗体の持続性］
配列番号１（ＩｇＡ、ＩｇＧ）およびＮタンパク質（ＩｇＧ、ＩｇＭ）に対する抗体レベルの時間経過を２人の患者で監視した（図１）。両者は軽度の疾患経過を呈したが、感染症がＲＴ−ＰＣＲによって確認されていた。一時的な嗅覚消失などの典型的な特定の症状が観察された。ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ製品ＥＩ２６０６−９６０１ＡおよびＥＩ２６０６−９６０１Ｇ（抗原としてＳ１タンパク質、それぞれＩｇＡまたはＩｇＧを検出）ならびにＥＩ２６０６−９６０１−２ＧおよびＥＩ２６０６−９６０１−２Ｍ（抗原としてＮタンパク質、それぞれＩｇＧまたはＩｇＭを検出）を、参照により本明細書に組み込まれる製造業者の説明書に従って使用した。検査の原理および主成分は例２に概説されるが、どの抗体を検出するかに応じて、異なる抗原（配列番号１を含むポリペプチドの代わりに、抗原としてＮタンパク質）ならびに異なる二次抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＭに結合する）を使用した。追加の情報は、ＥＩ２６０６−９６０１Ａ、ＥＩ２６０６−９６０１Ｇ、ＥＩ２６０６−９６０１−２ＧおよびＥＩ２６０６−９６０１−２Ｍ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ）の製造業者の説明書で入手可能である。

疾患の経過を４ヶ月超にわたって監視した。最初に配列番号１に対するＩｇＡおよびＩｇＧならびにＮタンパク質に対するＩｇＧは検出可能であったが、ＩｇＭは検出可能でなかった。両患者で、配列番号１に対するＩｇＡまたはＩｇＧの少なくとも一方が４ヶ月後に検出可能であったが、Ｎタンパク質に対するＩｇＧは存在しなかった、または最初の陽性ＰＣＲの２ヶ月後という早さでごく弱かった。

これらの結果は、配列番号１に対する抗体が少なくとも一部の患者でＮタンパク質に対する抗体が持続するより長く持続することを示している。ＩｇＡ抗体のレベルはＩｇＧ抗体レベルよりも急速に低下するが、ＩｇＡ抗体は、その最初に高いシグナルのために、消失しながら、依然として主要なままであり得る。第３の患者による別の時間経過の監視を図２に示す。本質的に、同じ方法を使用して、配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体（正方形）、配列番号１に対するＩｇＧクラス抗体（三角形）およびＮタンパク質に対するＩｇＧクラス抗体（円形）を決定した。図２から明らかなように、Ｓ１［配列番号１］に対するＩｇＡクラス抗体は監視した期間全体にわたって、すなわち、ＲＴ−ＰＣＲによって確認されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染後４０日後でさえ、検出可能であったが、配列番号１またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｎタンパク質に対するＩｇＧクラス抗体のレベルはカットオフ未満（またはこれに近い）ままであった。よって、これらのデータはさらに、配列番号１抗原に結合したＩｇＡクラス抗体の特異的検出に基づく本アッセイの優れた感度を確認している。

［例４］［経時的にさまざまな抗体を監視するために使用される配列番号１に対する抗体を検出するための化学発光に基づくアッセイ］
試薬カートリッジ（ＬＳ１２５４−１００１０Ｇ）を含む、製造業者の説明書およびデフォルト設定に従って、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ ＲＡ １０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＧ０７１０−０１０１）を使用した。製造業者の説明書を使用して、トシル活性化（ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ）常磁性ビーズ（Ｍ−２８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコーティングした。手短に言えば、ビーズを、ＩＫＡ Ｒｏｌｌｅｒ １０（ＶＷＲによって供給）で、コーティングバッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム ｐＨ７．４）中３５℃で１０分間洗浄し、引き続いてビーズを磁気濃縮し、上清を除去した。例１に従って精製した組換えポリペプチド（配列番号３）を同じバッファーに添加し、引き続いて３Ｍ硫酸アンモニウムを添加し、同じ条件下で１９時間インキュベートし、引き続いて洗浄バッファー（ＰＢＳ ｐＨ７．４ ０．１％ＢＳＡ ０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用して２回の洗浄ステップを行い、同じバッファー中、３７℃で４時間ブロッキングし（ＰＢＳ ｐＨ７．４ ０．１％ＢＳＡ ０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）、さらに２回洗浄ステップを行った。ビーズを同じバッファー中、４℃で少なくとも１６時間保管した。

常磁性ビーズを試料バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ＥＤＴＡ中ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０ ｐＨ７）と混合することによってアッセイを行った。２０μｌのビーズ懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌの試料（すなわち、患者の血液試料）と試料バッファー中合計２００μｌで接触させた。１０分間のインキュベーション後、ビーズを試料バッファーで３回洗浄し、引き続いて１６０μｌのＩｇＧ／ＩｇＡコンジュゲート（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ、ＬＫ０７１１−１００１０、本質的にアクリジニウムエステルで標識されたＩｇＧまたはＩｇＡ特異的二次抗体）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。３回の洗浄ステップ後、アルカリ性過酸化水素を迅速に添加し、混合して発光を誘因し、引き続いて１０秒間即時発光検出を行った。結果を表２に示す。

これらの結果は、化学発光を使用して配列番号１に対する抗体を検出することができることを示している。ＥＬＩＳＡによって得られる結果との良好な相関がある。したがって、化学発光を使用して本発明を実施することができる。

［例５］［配列番号２を発現するＨＥＫ−Ｓ１細胞による間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）］
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１タンパク質を発現する組換えＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３対照細胞のバイオチップアレイを含むスライドを使用してＩＦＡを行って、この方法を配列番号１に対する抗体の検出に使用することができることを示した。

各バイオチップモザイクを３５μＬの１：１００ ＰＢＳ希釈血清試料と室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに５分間浸漬した。第２のステップで、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＡＧ、Ｌｕｂｅｃｋ）（Ｌｕｂｅｃｋのｕはウムラウト付）を適用し、室温で３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ流で再度洗浄し、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに５分間浸漬した。スライドを、ＰＢＳ緩衝化、ＤＡＢＣＯ含有グリセロール（１フィールド当たりおよそ１０μＬ）に包埋し、蛍光顕微鏡法によって調べた。あるいは、スライドをＰＢＳと３０分間インキュベートした後、血清インキュベートし、結合したヒトＩｇＧを、抗ヒトＩｇＧビオチン（１：２００、１０９−０６５−０９８、Ｄｉａｎｏｖａ）と３０分間インキュベートし、引き続いて上記の洗浄ステップを行い、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ（１：２０００、Ｅ２７６１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と３０分間インキュベートし、引き続いてさらなる洗浄ステップを行うことによって検出した。対照トランスフェクト細胞および対照試料と直接比較したトランスフェクト細胞の蛍光強度に基づいて、試料を陽性または陰性として分類した。ＥＵＲＯＳｔａｒ ＩＩ顕微鏡（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＡＧ、Ｌｕｂｅｃｋ、ドイツ）を使用して２人の独立した観察者によって結果を評価した。試薬は、特に指定しない限り、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツから入手した。

Ｓ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ陽性患者血清（ＰＳ）の血清は、Ｓ１（配列番号２）との陽性反応を示したが、対照トランスフェクトＨＥＫ細胞は示さず（図３）、４９のＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ陰性対照血清のいずれも反応しなかった。患者血清のシグナル強度は、血清インキュベーション前にＨＥＫ−Ｓ１細胞をＰＢＳとインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ−ビオチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣでヒトＩｇＧ抗体を検出することによって改善された。まとめると、１５／２４のＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ陽性患者血清が、抗ヒトＩｇＧ−ビオチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣを用いたＨＥＫ−Ｓ１ ＩＦＡで陽性反応を示した。

したがって、ＩＦＴは本発明を実施するために使用することができる別の方法である。

［例６］［ワクチン接種試験］
健康な対象に、生理学的ＰＢＳ中１２．８６μｇの組換えＳ１タンパク質（配列番号３）の四頭筋への注射を１日目に受けさせた。製造業者の説明書に従って、アルムアジュバンス（ａｌｕｍ ａｄｊｕｖａｎｓ）（Ｔｗｉｎｒｉｘ成人用、ＥＭＲＡ−ＭＥＤ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ ＧｍｂＨ）を適用した。９日目、２１日目および２８日目に、対象に、さらなる生理学的ＰＢＳバッファー中１２．８６μｇのＳ１タンパク質の注射および５００μｌ塩化ナトリウム溶液中１０μｌのＩｍｊｅｃｔアラウンアジュバンス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｊｕｒａｎｔ Ａｌａｕｎ）を受けさせた。血液試料を１０日目、２３日目および２９日目に入手した。

製造業者の説明書に従って、血清学的キット（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＡＧ、ＥＩ２６０６−９６０１Ａ、ＥＩ２６０６−９６０１Ｇ、ＥＩ２６０６−９６０１−２ＧおよびＥＩ２６０６−９６０１−２Ｍ、例２および例３に記載）を使用して、健康な対象からの血清試料中の配列番号１（Ｓ１）およびＮタンパク質に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の存在を決定した。決定された抗体価を表３に示す。

陽性対照および陰性対照として、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を患っている患者からの試料（すなわち、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する抗体の存在が予想される）および健康な献血者からの試料（すなわち、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する抗体の非存在が予想される）を使用した。表４および表５をそれぞれ参照されたい。

ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を患っている２人の患者（陽性対照）で、症状の発症（通常、感染５〜６日後）の１７日後および１９日後に試料を入手した。決定された抗体価を表４に示す。

ワクチン接種を受けなかった４人の健康な対象（陰性対照）から、試料を入手した。抗体価を表５に示す。

これらの結果は、配列番号１に対する抗体の検出に基づくアッセイを使用することによって、配列番号１またはその変異体をワクチン接種した対象を、感染対象または配列番号１もその変異体も含まないワクチンで処置された対象と区別することができることを示している。ワクチンに含まれるＳ１に対する抗体は両者で検出することができ、Ｎタンパク質に対する抗体は感染患者でのみ検出されるが、ワクチン接種対象では検出されない。

［例７］［ドットブロットを使用したＲＢＤおよびＳ１に対する抗体の検出］
［試薬］ ＲＢＤ（配列番号３４）およびＳ１（配列番号３）抗原を例１に記載されるように入手した。希釈バッファー（１×ユニバーサルバッファー（１０倍濃縮物、製品番号２０１２５８９６）中３％ウシ血清アルブミン）中の陽性ＰＣＲ検査によって示されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を患っている患者からの試料（１０７５、１０７６、１０７８、１０７９、１０８０、１０８４、１０８５、１０９８、１０９９、１１００）の希釈物を調製した。健康な献血者からの試料（ＢＳ０１、ＢＳ１０、ＢＳ２５、ＢＳ３２、ＢＳ４３）を追加の陰性対照として使用した。

陽性対照として使用されるモノクローナル抗体ＡＫ７８、ＡＫ７６およびＡＫ８０はそれぞれ、モノクローナル抗Ｈｉｓタグ抗体とした（Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｐ，Ｂａｕｅｒ Ｋ，Ｋｒｅｂｂｅｒ Ａ，Ｎｉｅｂａ Ｌ，Ｋｒｅｍｍｅｒ Ｅ，Ｋｒｅｂｂｅｒ Ｃ，Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ，Ｋｌｉｎｇｅｒ Ｂ，Ｍｏｃｉｋａｔ Ｒ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉ−Ｈｉｓ ｔａｇ ｓｃＦｖ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｏｒ ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９７ Ｊａｎ；２２（１）：１４０−９）。(Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎの最初のｕはウムラウト付)

１μｌの抗原溶液（２．６９ｍｇ ｍｌ^−１）をストリップ上に移すことによって、ブロットストリップを作製した。メンブレンは０．２２μｍニトロセルロースメンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）とした。

ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭに対する二次抗体（それぞれ、「抗ヒトＩｇＡ−ＡＰ」、「抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ」および「抗ヒトＩｇＭ−ＡＰ」）はＥＵＲＯＩＭＭＵＮ製であった（アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＡ／Ｇ／Ｍ（ヤギ）、製品番号ＺＤ１１２９Ａ／Ｇ／Ｍ）。ＮＢＴ／ＢＣＩＰも同様であった（製品番号１０ １２３９６４）。

［方法］ 洗浄バッファー（１×ユニバーサルバッファー（１０倍濃縮物 製品番号２０１２５８９６）中３％ウシ血清アルブミン）中で１５分間インキュベートし、引き続いて適切に希釈した試料中、室温で３時間ストリップをインキュベートし、引き続いて洗浄バッファーを使用した洗浄ステップを３回行い、引き続いて適切に希釈した試料中でさらに３時間ストリップをインキュベートし、引き続いて再度３回の洗浄ステップを行い、引き続いてＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液中で１０分間のインキュベーションによって染色し、ストリップを脱塩水中で３回完全に洗浄することによってこれを停止することによって、ブロットストリップをブロッキングした。

［結果］ 図４および図５は、試料および対照のドットブロット分析の結果を示している。試料の代わりにモノクローナル抗体を使用した陽性結果および陰性対照を使用した場合にシグナルがないことによって判断されるように、アッセイを首尾よく確立することができた。

Ｓ１とＲＢＤの両方を使用してＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を検出することができるが、反応は一般的に、Ｓ１を使用した場合にわずかに強く、ＲＢＤとこれに隣接する配列の両方がエピトープまたはその一部を含有することを示唆している。さらに、抗原−抗体相互反応の一部は、抗原の折り畳みによって影響され得る。

興味深いことに、患者１０８５ではＩｇＡおよびＩｇＭ抗体を検出することができたが、ＩｇＧ抗体を検出することができず、特にＩｇＧに加えて、ＩｇＡ抗体の検出が感度を増強するというＥＬＩＳＡに基づく結果を確認している。ＩｇＧ抗体がまだ検出可能でなかった疾患の初期段階で患者を検査したのかもしれない。逆に、患者１１００ではＩｇＧ抗体のみが検出可能であり、その試料はＩｇＡ抗体の消失後の、疾患の後期段階で得られたのかもしれない。ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体は一般的にＩｇＭ抗体よりも強力なシグナルをもたらした。

［例８］［ドットブロットを使用した、ＲＢＤおよびＳ１に由来するペプチドに対する抗体の検出］
ペプチドＰ１（ＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳ、配列番号４１）、Ｐ２（ＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮ、配列番号４２）、Ｐ３（ＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧ、配列番号３５）、Ｐ４（ＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、配列番号５５）、Ｐ５（ＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ、配列番号３６）、Ｐ６（ＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、配列番号３７）およびＰ１〜Ｐ６を含む融合物（配列番号５６）を、ＩＰＴＧ誘導を使用して、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地中、３７℃で３時間、ｐＥＴ２４ｄプラスミドに基づく標準的な方法を使用して、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞によって、プロテアーゼ切断部位を含むＮ末端Ｈｉｓタグ融合物（Ｐ１：配列番号４３；Ｐ２：配列番号４４；Ｐ３：配列番号４５；Ｐ４：配列番号４６；Ｐ５：配列番号４７；Ｐ６：配列番号４８；Ｐ１〜Ｐ６を含む融合物：配列番号４９を含む融合物の配列）として発現させた。細胞を収穫し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、さらに使用するまで−２０℃で保管した。

図６、図７および図８は、Ｐ１〜Ｐ６構築物を使用したドットブロットアッセイの結果を示している。ＲＢＤの一部であるＰ６が、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧが検出されたかどうかにかかわらず、最も強力な反応を示したが、Ｐ１、Ｐ２（ＩｇＭを除く）、Ｐ３およびＰ４（ＩｇＭを除く）ならびにＰ５でもいくらかの反応性を実証することができた。ＩｇＧおよびＩｇＡとの反応が一般的にＩｇＭよりも強力であった。

数人の患者からの２つ以上の試料を含む時間経過を表す試料は、ドットブロットを使用して患者を監視することができることを示した。例えば、患者ＳＫ１５８６（３つの時点）は、特にＰ３（図９）に関して、第１の試料（１．３ｉ）で最も強力なＩｇＭ反応を有するが、第２の試料（１．１１．ｉ）および第３の試料（１．１９）を使用するとシグナルは弱い。ペプチドＰ１およびＰ６を使用してＩｇＡを検出した場合、同じ試料はより強力な反応を示した（図１０）。ＩｇＧ抗体を検出する場合、反応は一般的により強力であるが、同じ試料、特にＰ６、Ｐ１およびＰ１〜Ｐ６を含む融合タンパク質を使用して、時間依存的反応を監視することができる（図１１）。例７および８は、ドットブロットおよび配列番号１のさまざまな断片を使用して、配列番号１に対する抗体を検出することができることを示している。

［例９］［ウエスタンブロットを使用したＲＢＤおよびＳ１に対する抗体の検出］
２μｇのＲＢＤ（配列番号３４）またはＳ１（配列番号３）を使用して、非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥを実行した。１０μｌのタンパク質を含む試料を、４μｌのＮｕＰＡＧＥ−ＰＰ（ＮｕＰａｇｅ ＬＤＳ試料バッファー（４倍）、Ｆｉｒｍａ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ）および１μｌのＥＵ−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）と混合し、７０℃で１０分間インキュベートした。１レーン当たり１２μｌの得られた溶液を非還元２Ｄゲル（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル １．０ｍｍ×２Ｄ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ）に適用し、泳動バッファー（ＮｕＰａｇｅ ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動バッファー、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ）で電気泳動に供した。分離したタンパク質バンドを、４００ｍＡ（ＰｏｗｅｒＰａｃ ＨＣ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ、Ｆｉｒｍａ Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で６０分間、ニトロセルロースメンブレンに移した。ポンソーＳを使用してメンブレンストリップを染色し、引き続いて５０ｍＭ Ｔｒｉｓで洗浄したが、いずれにしても洗浄バッファー（１×ユニバーサルバッファー（１０倍濃縮物 注文番号：２０１２５８９６）中３％ウシ血清アルブミン）で１５分間のブロッキングに供し、引き続いて適切に希釈した試料中、室温で３時間、ストリップをインキュベートし、引き続いて洗浄バッファーを使用した洗浄ステップを３回行い、引き続いて適切に希釈した試料中でさらに３０分間ストリップをインキュベートし、引き続いて再度３回の洗浄ステップを行い、引き続いてＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液中で１０分間のインキュベーションによって染色し、ストリップを脱塩水中で３回完全に洗浄することによってこれを停止した。

［結果］ 陽性対照（前の通りの抗Ｈｉｓ抗体）およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染患者からの陽性試料は、ＲＢＤ単量体に加えて、二量体、三量体および四量体が検出されたことを示している。ＩｇＡクラス抗体を検出する二次抗体を使用すると、６つの血清で弱い反応が検出され、別の３つの血清で弱い反応、１つの血清で強力な反応が検出された。異なる時点からの２つ以上の試料が入手可能で、反応性であった場合、例えば試料ＳＫ１５９８２２．１ｉ〜２．４ｉならびに試料６ｉおよび６１ｉと７ｉおよび７．１ｉで、ＩｇＡ抗体の濃度の低下が観察された（図１２）。

ＩｇＧクラス抗体の検出に関して、ＥＬＩＳＡによって判断されるように、陽性であった全ての試料が、反応を示した（図１３）。両方法の結果に基づいて、試料ＳＫ１６０６ １６９ｉは陰性であった。

ＩｇＭクラス抗体の検出に関して、異なる時点からの２つ以上の試料が入手可能であった場合、一部の場合、特にＳＫ１５８６２．２〜ＳＫ１５８６２．１６ならびにＳＫ１５９９８６ｉ〜ＳＫ１５９９８６１ｉで、抗体の濃度低下が検出された（図１４）。抗原としてＲＢＤではなくＳ１を使用した場合に、結果が極めて同等であった（図１５、図１６および図１７）。

ウエスタンブロット法が、本発明を実施するために使用することができる別の方法であると結論付けられる。

［例１０］［競合試験フォーマットを使用したＲＢＤに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の検出］
特に指定がない限り、製造業者の説明書に従って、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＮｅｕｔｒａＬＩＳＡキット（ＥＩ２６０６−９６０１−４）を以下の実験に使用した。

手短に言えば、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３で組み換え的に発現されるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のスパイクタンパク質のＳ１ドメイン（配列番号３）でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用した。分析の第１のステップで、対照および試料（対象の血液試料）を、可溶性ビオチン化ヒトＡＣＥ２（配列番号５０）を含有する試料バッファーで希釈し、マイクロタイタープレートの試薬ウェルでインキュベートした。試料中に存在する中和抗体が、コーティングされたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ Ｓ１スパイクタンパク質の結合部位についてＡＣＥ２と競合する。非結合ＡＣＥ２および非結合試料をその後の洗浄ステップで除去した。結合したＡＣＥ２を検出するために、第３のステップで、マイクロタイタープレート上の抗原に固定化されたビオチン化ＡＣＥ２に結合し、呈色反応を触媒するペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを使用して、第２のインキュベーションを実施した。発色の強度は、表６に示されるように、試料中の中和抗体の濃度に反比例する。

結果は、陽性試料の希釈増加、すなわち、中和抗体の濃度低下が、発色の増加をもたらすことを示している。対照的に、陰性試料を使用すると、シグナルは高く、試料の希釈と相関しない。

このことは、このアッセイを使用して、試料中のＲＢＤに対する中和抗体を検出および定量化することができることを確認している。

［例１１］［ＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原Ｓ１およびＮタンパク質に対する抗体の検出］
４３人のドイツ人ＣＯＶＩＤ−１９患者の各々からの感染後の異なる時点で採取したいくつかの試料を含むパネルを使用して、経時的な抗体の存在または非存在を検出した。全ての血清を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクドメインのＳ１ドメイン（配列番号３）に対する抗体（ＩｇＡおよびＩｇＧ ＥＬＩＳＡキット、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ、例２および３の製品）およびＮタンパク質に対する抗体（ＩｇＧおよびＩｇＭ ＥＬＩＳＡキット、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ、例２および３の通り）について検査した。

発症の１０日後超〜２１日後未満の間に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳ１に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体が試料の７０．４％および８８．９％で検出された一方、Ｎタンパク質に対するＩｇＧおよびＩｇＭがそれぞれ８６．２％および５０％で検出された。６人の患者で、Ｓ１に対するＩｇＡ抗体が、検出することができた最初の抗体であった一方、Ｓ１に対するＩｇＡ以外の抗体が、検出される最初の抗体であったのはわずか２例であった。３０人の患者では、Ｎタンパク質に対するＩｇＭ抗体はいかなる時にも検出することができなかった。

発症６０日後超では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳ１に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体が試料の８５．１％および８０．５％で検出された一方、Ｎタンパク質に対するＩｇＧおよびＩｇＭがそれぞれ８１．４％および０％で検出された。４人の患者で、Ｓ１に対するＩｇＧが検出可能であったが、Ｎタンパク質に対するＩｇＧが検出可能でなかった。対照的に、わずか１人の患者で、Ｎタンパク質に対するＩｇＧが検出可能であったが、Ｓ１に対するＩｇＧが検出可能でなかった。

これらの結果は、Ｓ１に対するＩｇＡの検出が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２、より具体的にはそのＳ１タンパク質に対する抗体応答の初期検出にとって最も高感度なアッセイであることを確認している。対照的に、Ｓ１に対するＩｇＧの検出は、感染症の後期段階で特に高感度である。場合により長期間にわたる感度増加のために追加のアッセイと組み合わせて、感度増加のために１つの反応でまたは別個の反応で、Ｓ１に対するＩｇＡの検出およびＳ１に対するＩｇＧの検出による両アッセイを組み合わせることができる。

［例１２］［ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の後期の間のＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原Ｓ１およびＮタンパク質に対する抗体の検出］
例１１と同じ方法論を使用して、発症の２１日後以降に採取したＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を患っている１５人の患者の別のコホートからの試料を入手し、Ｎタンパク質に対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体ならびにＳ１タンパク質に対するＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の存在について検査した。結果を表７に示す。

この追加のコホートでの検査は、診断感度が、Ｓ１タンパク質に対する抗体を検出する場合にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の後期で最高となることを確認している。

［例１３］［ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２抗原Ｓ１およびＮタンパク質に対する抗体の検出の特異性］
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＥＬＩＳＡ（ＩｇＡ、ＥＩ２６０６−９６０１Ａ、製造業者の説明書に従って行った、さらなる詳細は例２および３）の特異性を、例えば、他のヒト病原性コロナウイルス、他の病原体に対する抗体、またはリウマチ因子が陽性である２１０の患者試料を分析することによって決定した。さらに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の発生前（２０２０年１月より前）に入手した献血者、子供および妊婦からの１０５２試料を分析した。境界範囲の結果（ｎ＝９）は特異性の計算に含めなかった。これにより、表８に示されるように９８．３％の特異性が得られた。

抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ、ＥＩ２６０６−９６０１Ｇ、製造業者の説明書に従って行った、さらなる詳細は例２および３）の特異性を、２２２の陽性患者試料ならびに献血者、子供および妊婦からの１０５２の試料に基づいて、同様に決定した。これにより、表８に示されるように９８．３％の特異性が得られた。

Claims (15)

1. 対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断する方法。
2. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１との感染症の間を好ましくは区別するための方法であって、対象からの試料中の配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡおよび／またはＩｇＧクラス抗体、より好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在または非存在を検出するステップを含むコロナウイルス感染症の鑑別診断のための方法。
3. 配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体に加えて、配列番号１に対するＩｇＧおよび／またはＩｇＭクラス抗体の存在が検出される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記試料が、好ましくは全血、血清または血漿を含む群から選択される血液試料である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 配列番号１に対するＩｇＡクラス抗体が、好ましくはＩｇＡクラス抗体に結合する、標識二次抗体を使用して検出される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ＩｇＡ抗体が、比色分析、免疫蛍光法、酵素活性の検出、化学発光および放射活性を含む群から選択される方法を使用して検出される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記感染症が初期段階で検出される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症を診断するため、またはコロナウイルス感染症の鑑別診断のため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症と、ＭＥＲＳ、ＮＬ６３、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１の感染症との間を区別するための、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用。
9. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の初期診断のための請求項８に記載の使用。
10. 好ましくは診断的に有用な担体にコーティングされた、配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドと、配列番号１に対する抗体、洗浄バッファー、好ましくは検出可能な標識を含む、配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の存在を検出する手段、好ましくはＩｇＡクラス抗体に特異的に結合する二次抗体、および希釈バッファーを含む群の１つまたは複数、好ましくは全ての試薬とを含むキット。
11. 前記診断的に有用な担体が、ビーズ、好ましくは常磁性ビーズ、試験片、マイクロタイタープレート、好ましくはウエスタンブロット、ラインブロットおよびドットブロットを含む群のメンブレン、側方流動装置、ガラス表面、スライド、マイクロアレイならびにバイオチップを含む群から選択され、好ましくはマイクロタイタープレートである、請求項１０に記載のキット。
12. ２つ以上、好ましくは３つ以上の較正物質を含む、請求項１０または１１に記載のキット。
13. 各較正物質が、好ましくはＩｇＡクラス抗体に結合する二次抗体によって認識される、配列番号１に結合する組換え抗体である、請求項１２に記載のキット。
14. 診断キットを製造するための、配列番号１もしくはその変異体を含むポリペプチド、または配列番号１に対する抗体、好ましくはＩｇＡクラス抗体の使用。
15. ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の初期診断のための較正物質としての、好ましくはＩｇＡクラス抗体に結合する二次抗体によって認識される、配列番号１に結合する組換え抗体の使用。
    

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