DE202021100842U1

DE202021100842U1 - Methoden und Reagenzien zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion

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Publication number: DE202021100842U1
Application number: DE202021100842.3U
Authority: DE
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2020-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2031-02-20
Also published as: SG11202112544XA; MX2022010234A; JP7022969B2; EP3978927A3; WO2021165448A1; US20210190797A1; AU2021223701A1; EP3809137A1; RU2021134819A; BR102021003012A2; CA3109607C; EP3978927A2; AU2021223701B2; KR20220006125A; CA3109607A1; KR102570713B1; JP2021167805A; DE21158065T1; CN113557431A; ES2822295T1

Abstract

Kit umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, bevorzugt vorliegend als Beschichtung auf einem diagnostisch nützlichen Träger, und ein oder mehr als ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen Antikörper gegen SEQ ID NO1, einen Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt der Immunglobulin-Klasse IgA, bevorzugt einen sekundärer Antikörper, der spezifisch an Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA bindet, bevorzugt umfassend eine nachweisbare Markierung, und einen Verdünnungspuffer.

Description

Hierin offenbart wird ein Verfahren zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-Infektion umfassend den Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO:1, bevorzugt eines Antikörpers der Klasse IgA, in einer Probe von einem Subjekt, ein Verfahren zur Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion, eine Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers der Klasse IgA, zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion oder zur Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion, bevorzugt zum Unterscheiden zwischen einer SARS-CoV-2-, MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion. Die Erfindung betrifft einen Kit umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO:1 oder eine Variante davon, bevorzugt beschichtet auf einem diagnostisch nützlichen Träger, und ein oder mehr als ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen Antikörper gegen SEQ ID NO:1, ein Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers, bevorzugt eines Antikörpers der Klasse IgA, bevorzugt eines sekundären Antikörpers, der spezifisch gegen Antikörper der Klasse IgA bindet, bevorzugt umfassend eine nachweisbare Markierung, und einen Verdünnungspuffer.
Gegen Ende des Jahres 2019 zeigte sich eine zunehmende Anzahl von Patienten mit Lungenentzündung, verursacht durch ein unbekanntes Pathogen in Wuhan, der Hauptstadt der Provinz Hubei in China, und erstreckte sich beinahe über das gesamte Land China. Ein neues Coronavirus wurde isoliert und auf Basis seiner Phylogenie, Taxonomie und etablierten Vorgehensweisen erkannte die Coronavirus Study Group (CSG) es als Verwandten des Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV-1) und bezeichnete es als Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Obwohl SARS-CoV-2 im Allgemeinen weniger krankheitserregend als SARS-CoV-1 und Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) sind, weist es eine relativ hohe Übertragbarkeit auf. Weil die Symptome mild sein können und mit einer Erkältung verwechselt werden können, besteht die Gefahr, dass Patienten nicht bewusst ist, dass sie infiziert wurden, und dass sie dazu beitragen können, das Virus weiter zu verbreiten.
SARS-CoV-2 ist ein Coronavirus mit vier Haupt-Strukturproteinen, genauer den S (Spike)-, E (Envelope)-, M (Membran)- und N (Nukleokapsid)-Proteinen. Das N-Protein trägt das RNA-Genom, wohingegen die anderen drei Strukturproteine Bestandteile der viralen Hülle darstellen. Das S-Protein ist dafür verantwortlich, dass das Virus in die Lage versetzt wird, sich an die Membran einer Wirtszelle anzuheften und mit ihr zu fusionieren. Es umfasst eine S1-Domäne, die das Anheften vermittelt, und eine S2-Domäne, die die Fusion der viralen Zellmembran mit der Wirtszelle vermittelt. Die S1-Domäne umfasst die Rezeptorbindungsdomäne (RBD), die Bindestelle für den Rezeptor Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) auf menschlichen Wirtszellen. Daher ist die RBD eine Bindestelle von neutralisierenden Antikörpern, die die Interaktion zwischen dem Virus und seinen Wirtszellen blockieren und damit Immunität verleihen. Im Gegensatz zu SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2, die mit hoher Mortalität und schwerer Krankheit assoziiert sind, gibt es weitere Coronaviren, die mit einer milden und schnell vorübergehenden Krankheit assoziiert sind, wie die Coronaviren 229E, NL63, OC43 und HKU1. Diese Coronaviren sind häufig mit einer gewöhnlichen Erkältung assoziiert, insbesondere unter Kindern.
Aufgrund der hohen Übertragbarkeit und den Auswirkungen für die Gesundheit sind zuverlässige Verfahren zur Diagnose von SARS-CoV-2-Infektionen von höchster Bedeutung. In der Vergangenheit wurde eine Kombination von serologischen Verfahren und RT-PCR (real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction) verwendet, um Infektionen mit Coronaviren nachzuweisen und zu bestätigen.
RT-PCT-Verfahren basieren auf dem Nachweis von einer oder mehr als einer Nukleinsäure des interessierenden Coronavirus, genauer der viralen Ribonukleinsäure (RNA). RT-PCR-basierte Verfahren sind schnell und können, basierend auf Proben aus der Kehle oder Nase-/Rachen-Abstrichen, während der ersten Krankheitswoche zum Nachweis von SARS-CoV-2 verwendet werden. Ihre Nützlichkeit hängt jedoch sehr davon ab, wie lange die Nukleinsäure in Proben nachweisbar ist, was sich von Virus zu Virus unterscheidet. Insbesondere mangelt es einem negativen Ergebnis bei einem diagnostischen Test, der mit einer Probe durchgeführt wurde, die in einer Frühphase der Krankheit erhalten wurde, an Aussagekraft. Darüber hinaus wird im Allgemeinen eine Probe aus dem oberen Teil der Atemwege des Patienten benötigt. Eine nicht fachmännische Gewinnung einer solchen Probe oder eine nicht ausreichende Gewinnung einer solchen Probe, verlängerte Transportzeiten und ein damit einhergehender Abbau der viralen RNA oder eine Fehlfunktion eines Instruments kann ebenfalls zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Daher sollten mehrere Proben untersucht werden, eine aus der ersten Woche der Infektion und eine Folgeprobe, die drei bis vier Wochen später erhalten wurde.
Corman et al. veröffentlichten einen real-time RT-PCR-basierten Test (Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):2000045. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045), erstmalig veröffentlicht im Januar 2020 von der WHO auf ihrer Webseite.
Serologische Tests werden ebenfalls häufig verwendet. Diese Tests basieren auf dem Nachweis von Antikörpern gegen bestimmte virusspezifische Antigene. Jedoch gibt es bei serologischen Tests ebenfalls erhebliche Nachteile:

Ein häufig beobachtetes Problem ist ihre begrenzte Sensitivität. Damit serologische Tests ein positives Ergebnis zeigen, ist es erforderlich, dass virus-antigen-spezifische Antikörper im Blut des Patienten anwesend sind. Im Allgemeinen kann der Zeitpunkt, von dem ab ein Antikörper erstmalig produziert wird und nach einer Infektion mit einem neuen Virus nachweisbar ist, nicht vorhergesehen werden, weil er von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, darunter dem Virus selbst, der Viruskonzentration, das heißt der Menge des Virus in einer bestimmten Menge Blut des Patienten, patienten-spezifische Faktoren wie Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand, Immunstatus etc., der Immunglobulin-Klasse des Antikörpers von Interesse und dem Antigen-Ziel, das ausgewählt wird, um einen diagnostischen Test aufzubauen. Insbesondere zu sehr frühen Phasen der Krankheit, d.h. bevor der Körper der Patienten in der Lage ist, eine spezifische Antikörperantwort in nachweisbaren Mengen aufzubauen, können serologische Tests ein negatives Ergebnis ergeben, trotz anhaltender Infektion. Weitere serologischen Tests, wobei berücksichtigt wird, ob ein nachzuweisender Antikörper zu einer bestimmten Immunglobulin (Ig)-Klasse gehört, können dazu beitragen, den Verlauf der Krankheit zu überwachen und eine akute von einer vergangenen Infektion oder von einer Impfung zu unterscheiden. Die meisten derzeit für den Nachweis viraler Infektionen umfassend SARS-CoV-1-Infektion verfügbaren serologischen Tests konzentrieren sich daher auf den Nachweis von Antikörpern der Klassen IgG oder IgG und IgM. Jedoch besteht nicht nur das Risiko von falsch-negativen Ergebnissen spezifisch in sehr frühen Phasen der Infektion aufgrund der intrinsischen Verzögerung der Antikörperantwort, sondern serologische Tests zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-1-Infektion sind auch anfällig für falsch-positive Ergebnisse, vermutlich aufgrund einer hohen Seroprävalenz in der Population von Antikörpern gegen gewöhnliche Schnupfen-Coronaviren (CoV) und die damit verbundene Anwesenheit kreuzreaktiver Antikörper gegen konservierte Teile immunogener Virusproteine. Diese Kreuzreaktivität gegen solch antigenisch nahe verwandte Schnupfen-Coronaviren machen auch eine Differentialdiagnose unmöglich, zum Beispiel eine Differenzierung zwischen der lebensbedrohlichen Variante SARS-CoV-1 und anderen Coronaviren. Herausforderung und Fallstricke bei serologischen Assays zum Diagnostizieren und Differenzieren von Coronaviren, spezifisch beim Diagnostizieren von SARS-CoV-1, wurden von Meyer, Drosten & Müller in einem Übersichtsartikel dargestellt (Virus Research 194 (2014); 175-186). Diese vielfachen Herausforderungen, die mit der serologischen Diagnose früherer Coronaviren assoziiert sind, z.B. schlechte geringe Sensitivität bei Frühphasen der Infektion und geringe Spezifität aufgrund der Anwesenheit von kreuzreaktiven Antikörpern, betreffen auch die Entwicklung von diagnostischen Tests zum Nachweis des kürzlich aufgetretenen Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Vor dem Hintergrund der derzeitigen schweren Bedrohung durch die weltweite andauernde SARS-CoV-2-Pandemie und der oben genannten Probleme, verfügbare Tests zum Diagnostizieren einer entsprechenden Infektion, besteht ein erheblicher Bedarf auf dem Gebiet nach verbesserten, insbesondere sensitiveren, spezifischeren und daher zuverlässigeren Mitteln und Verfahren zum Diagnostizieren SARS-CoV-2-Infektion, insbesondere für die Frühdiagnose einer SARS-CoV-2-Infektion, und zur Differenzierung zwischen einer solchen Infektion und Infektionen mit anderen Coronaviren, wie üblichen Schnupfen-Coronaviren, um eine zielgerichteter virusspezifische und daher wirksamere Behandlung zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung adressiert diesen Bedarf durch das Bereitstellen diagnostischer Mittel, mit denen die vorherigen Schwierigkeiten überwunden werden können.
Spezifisch adressiert die vorliegende Erfindung, ohne Absicht eine Limitierung, die folgenden Probleme:

Ein von der vorliegenden Erfindung adressiertes Problem besteht darin, einen Assay und Reagenzien zum frühen serologischen Nachweis von SARS-CoV-2 bereitzustellen. Das ist besonders wichtig, weil Patienten immer noch an der aktiven Krankheit leiden und ansteckend sein können, selbst wenn ein negatives PCR-Ergebnis erhalten wurde. Es sei beachtet, dass das Center for Disease Control and Prevention (CDC) empfiehlt, dass Patienten wenigstens 10 Tage nach Ausbruch der Symptome isoliert bleiben, bis zu 20 Tage bei Fällen mit schwerem Krankheitsverlauf.

Ein anderes von der vorliegenden Erfindung adressiertes Problem besteht darin, einen Test bereitzustellen, der verwendet werden kann, um zwischen bekannten Coronavirus-Infektionen zu unterscheiden, insbesondere eine SARS-CoV-2-Infektion von anderen Coronavirus-Infektionen, bevorzugt Coronaviren, die mit milden erkältungsartigen Symptomen assoziiert sind oder anderen Pathogenen oder Ursachen solcher Symptome. Bevorzugt können die Infektionen in einer Frühphase unterschieden werden. Ein anderes von der vorliegenden Erfindung adressiertes Problem besteht darin, einen Test bereitzustellen, der eine hohe optimierte Zuverlässigkeit aufweist, insbesondere mit Blick auf Sensitivität und/oder Spezifität, bevorzugt Sensitivität.
Ein weiteres von der vorliegenden Erfindung adressiertes Problem besteht darin, einen Assay mit einer hohen Sensitivität bereitzustellen, insbesondere für Patienten, denen Antikörper gegen das SARS-CoV-2 N Protein fehlen, oder denen die Antikörper der Klasse IgM fehlen.
Ein weiteres von der vorliegenden Erfindung adressiertes Problem besteht darin, einen Test mit langanhaltender hoher Sensitivität bereitzustellen.
Zuvor entwickelte Tests zum Diagnostizieren von Coronavirus-Infektionen sind z.B. in folgenden Dokumenten beschrieben: WO2014/045254 offenbart Tests zum Diagnostizieren einer Infektion mit Middle East Respiratory Syndrome-Related Coronavirus (MERS-CoV), umfassend serologische Tests, wobei Antikörper gegen virale proteinische Antigene in einer Probe nachgewiesen werden. Jedoch gibt es keine praktischen Belege für einen solchen Test. US2005/0112559 offenbart SARS-CoV-1 betreffende Verfahren und Agenzien. Das Nukleokapsid (N)-Protein wird als diagnostisches Hauptantigen betrachtet. WO2005/118813 offenbart eine Variante von SARS-CoV-1-spezifischem S-Protein und den Nachweis seiner Anwesenheit, oder der Anwesenheit von Antikörpern, die gegen es binden, in Proben. US2006/0188519 offenbart Peptide für die Diagnose einer SARS-CoV-1-Infektion. Hsueh et al. berichteten, dass Antikörper der Immunglobulin Klasse IgG bereits vier Tage nach Ausbruch einer SARS-CoV-1-Infektion nachgewiesen werden konnten, zum gleichen Zeitpunkt oder einen Tag früher als Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgM und IgA (Hsueh, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066). Reusken et al. offenbaren die spezifischen, aber nicht notwendigerweise sensitiven Nachweise von Antikörpern gegen ein SARS-CoV-2-Spike-Proteinfragment (Specific serology for emerging human coronaviruses by protein microarray. Euro Surveill. 2013;18(14). Yu et al. (2020) Measures for diagnosing and treating infections by a novel coronavirus responsible for a pneumonia outbreak originating in Wuhan, China, Microbes and Infection 22 (2020), 74-79 offenbaren, ohne Hinweis auf spezifische Antigene, dass immunologische Verfahren zum Nachweisen einer SARS-CoV-2-Infektion verwendet werden können, aber mit schlechter Sensitivität und Spezifität verbunden sind.
Die oben diskutierten Probleme werden durch die vorliegende Erfindung gelöst, wie in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen beschrieben ist.
Offenbart hierin ist ein Verfahren zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion dar, umfassend den Schritt zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO:1, bevorzugt Antikörper der Klasse oder Klassen IgM, IgG und/oder IgA, bevorzugter Antikörper der Klasse IgA, in einer Probe von einem Subjekt. Wenn in dieser Beschreibung Bezug auf eine SEQ ID NO genommen wird, und die SEQ ID NO eine Aminosäuresequenz bezeichnet, ist beabsichtigt, dass ein Polypeptid umfassend die entsprechende Aminosäurekette gemeint ist, selbst wenn in diesem Zusammenhang der Begriff „Polypeptid“ nicht spezifisch genannt ist. Der Begriff „umfassend“ hat zwei Bedeutungen im Zusammenhang mit dieser Erfindung, nämlich („umfassend“) und („bestehend aus“).
Offenbart hierin ist ein Verfahren zur Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion bereit, bevorzugt zum Unterscheiden zwischen einer SARS-CoV-; bevorzugt SARS-CoV-2-; MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion, umfassend den Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 in einer Probe von einem Subjekt, bevorzugt eines Antikörper der Klasse oder Klassen IgA und/oder IgG, bevorzugt ein Antikörper der Klasse IgA.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse IgG und/oder der Klasse IgM zusätzlich zur Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse IgA nachgewiesen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Subjekt“, oder austauschbar hierin als „Patient“ bezeichnet, ein Säugetier, bevorzugt ein Mensch, kann aber alternativ ein anderes Säugetier bedeuten, wie einen nicht menschlichen Primaten oder ein anderes Säugetier oder sogar ein Tier, bei dem es sich nicht um ein Säugetier handelt, das oder der in der Lage ist, einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon herzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Begriff „Probe“ von einem Subjekt eine Probe aus jeder Körperflüssigkeit oder jedem Gewebe des Subjektes sein, die oder das einen Antikörper umfassen kann. Beispielhafte Körperflüssigkeiten umfassen z.B. Blut, Speichel, Schleim der Nasenschleimhaut oder Lymphflüssigkeit. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Blutprobe, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum, Plasma, Kapillarblut, arterielles Blut, venöses Blut oder jegliche Mischung davon. Das Kapillarblut liegt bevorzugt in Form eines Dried Blot Spot vor, der von dem Patienten vorbereitet, zum Labor eingesandt werden kann, gefolgt von der Gewinnung des Blutes daraus. Dem Fachmann sind verschiedene Mittel bekannt, die angewandt werden können, um eine Probe von einem Subjekt zu erhalten, die für die Zwecke der hierin offenbarten Produkte und Verwendungen geeignet ist und in den benötigten Mengen gewonnen werden kann. In bestimmten Ausführungsformen kann die Probe von dem Subjekt durch einen Arzt gewonnen erhalten werden, wohingegen in anderen Fällen die Probe von dem Subjekt selbst gewonnen werden kann, z.B. unter Verwendung minimal invasiver Mittel, wie dem Anstechen eines Fingers, um Blut zu gewinnen („Finger-Stick Blood“).
Es wird auch verstanden, dass für die Zwecke der hierin offenbarten Erfindung, die Probe von einem einzelnen Subjekt stammen kann, das heißt einem einzelnen Individuum, aber auch Proben von mehr als einem Subjekt umfassen kann, wobei die Proben von mehr als einem Subjekt in einer einzelnen Probe zusammengegeben werden können. Z.B. könnte es in manchen Fällen effizienter hinsichtlich Ressourcen und Abarbeitungszeit sein, zunächst eine Probe mit zusammengegebenen Proben zu analysieren, die Proben von einer Gruppe von Subjekten umfasst (z.B. Mitglieder eines gemeinsamen Haushaltes, einer Schulklasse, einer Sportmannschaft oder aus der gleichen Abteilung einer Firma) und nur im Falle des Nachweises der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 und einer Variante davon eine zweite Analyse durchzuführen, wobei Proben von individuellen Subjekten separat getrennt getestet werden.
Verschiedene Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung können mit einer Probe von einem Subjekt wie hierin beschrieben ausgeführt werden. Diese Verwendungen können auch als „ als „In-Vitro-Verwendung“ charakterisiert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Begriff „sekundärer Antikörper“ in seinem breitesten Sinn so zu verstehen, dass er jede Art von „bindender Einheit“ bevorzugt bindendes Protein, fähig zum spezifischen Binden an einen Antikörper der Klasse oder Klassen IgA, IgG und/oder IgM oder ein Fragment davon, wie eine konstante Domäne einer bestimmten Immunglobulin-Klasse einer ausgewählten Spezies, bevorzugt Mensch, bedeutet. Nicht beschränkende Beispiele bindender Einheiten umfassen Antikörper, z.B. Antikörper, die immunologisch oder genetisch von irgendeiner Art abgeleitet sind, z.B. Mensch, Huhn, Kamel, Lama, Neunauge, Hai, Ziege, Nagetier, Kuh, Hund, Kaninchen, etc., Antikörperfragmente, Domänen oder Teile davon, z.B. Fab, Fab', F(ab')₂, scFab, Fv, scFv, VH, VHH, VL, VLRs, und dergleichen, Diabodies, monoklonale Antikörper (mAbs), polyklonale Antikörper (pAbs), mAbdAbs, mittels Phagen-Display abgeleitete Binder, Affibodies, Heterokonjugat-Antikörper, bispezifische Antikörper, Evibodies, Lipocaline, Anticaline, Affibodies, Avimere, Maxibodies, Heat Shock Proteine wie beispielsweise GroEL and GroES, Trans-Bodies, DARPins, Aptamere, C-Typ Lectin-Domänen wie beispielsweise Tetranektine; menschliches y-Crystallin und menschliche von Ubiquitin abgeleitete Binder wie Affiline, von PDZ Domäne-abgeleitete Binder; Skorpiontoxin und/oder Kunitz-Typ Domäne-Binder, von Fibronektin abgeleitete Binders wie Adnektine, Rezeptoren, Liganden, Lektine, Streptavidin, Biotin, umfassend Derivative und/oder Kombinationen davon wie bi-/multi-spezifische Formate, die aus zwei oder mehr als zwei dieser bindenden Moleküle gebildet werden. Verschiedene von Antikörpern abgeleitete und alternative (d.h. nicht von Antikörpern abgeleitete) bindende Protein-Gerüste umfassend Verfahren zu Ihrer Herstellung sind auf dem Gebiet bekannt (z.B. Übersichtsartikel von Chiu ML et al., Antibodies (Basel), (2019);8(4):55; Simeon R. & Chen Z., Protein Cell. (2018);9(1):3-14; und Kapitel 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007) herausgegeben von Stefan Dübel.
All diese Arten von Molekülen sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Einige Beispiele werden unten detaillierter beschrieben.
„Evibodies“ sind gentechnisch veränderte bindende Proteine, die aus den variable(V)-Set Ig-artigen Gerüst des mit T-Zellen-Oberflächen-Rezeptor von cytotoxischen T-Lymphozyten assoziierten Antigen 4 (CTLA-4) abgeleitet sind. Schleifen, die CDRs von Antikörpern entsprechen, können durch heterologe Sequenzen ausgetauscht werden, um andere Bindereigenschaften zu verleihen. Verfahren zur Herstellung von Evibodies sind auf dem Gebiet bekannt und z.B. in U.S. Patent Nr. 7,166,697 beschrieben.
„Lipokaline“ sind eine Familie extrazellulärer Proteine, die kleine hydrophobe Moleküle wie Steroide, Biline, Retinoide und Lipide transportieren. Sie haben eine rigide Sekundärstruktur mit Beta-Faltblättern mit einer Anzahl von Schleifen am offenen Ende der konischen Struktur, die gentechnisch verändert werden können, so dass sie an andere Zielantigene binden.
„Antikaline“, auch bezeichnet als „Affiline“, gemäß der vorliegenden Erfindung, haben eine Größe von 160-180 Aminosäuren und sind von Lipokalinen abgeleitet (Rothe C & Skerra A., BioDrugs. (2018);32(3):233-243; Gebauer M & Skerra A, Curr Opin Biotechnol. (2019); 60:230-241). „Affikörper“ sind eine Familie von Antikörper-Mimetika, die aus der Z-Domäne von staphylokokkalem Protein abgeleitet sind. Affikörper basieren strukturell auf einer Domäne mit einem drei-Helix Bündel. Ein Affikörper hat eine molekulare Masse von etwa 6 kDa und ist bei hohen Temperaturen und unter sauren oder alkalischen Bedingungen stabil. Die Target-Spezifität wird durch Randomisierung von Aminosäuren erreicht, die die in zwei Alpha-Helices lokalisiert sind, die an der Bindungsaktivität der älteren Protein-Domäne beteiligt sind (Feldwisch, J & Tolmachev, V. (2012) Methods Mol. Biol. 899:103-126). Verfahren zum Herstellen von Affikörpern sind auf dem Gebiet bekannt und in Wikman M et al., Protein Eng Des Sel. (2004);17(5):455-62 beschrieben.
„Avimere“, kurz für Aviditäts-Multimere, sind eine Klasse künstlicher Multi-Domänen-Proteine, die bestimmte Antigene spezifisch über multiple Bindestellen binden. Dieses Protein ist auch als „Maxibody“ oder Low-Density Lipoprotein Receptor (LDLR)-Domäne A bekannt. Es besteht aus zwei oder mehr als zwei (Poly)peptid-Sequenzen, die auf A-Domänen basiert sind. Die A-Domänen sind Gerüste (~4 kDa) mit 30 bis 35 Aminosäuren, die von extrazellulären cysteinreichen Zelloberflächen-Rezeptorproteinen abgeleitet sind und durch die Disulfid-Bindungsbildung und Komplexierung von Kalziumionen stabilisiert sind. Die Gerüststruktur wird durch zwölf konservierte Aminosäuren aufrechterhalten, so dass alle verbleibenden nicht konservierten Reste einer Randomisierung und die Ligandenbildung zugänglich bleiben. Avimere sind hochgradig thermostabil. Aufgrund ihrer geringen Größe bestehen Avimere häufig aus vielfachen als auch multiplen A-Domänen, von denen jede eine andere Bindestelle des Ziels bindet, sodass durch Avidität eine erhöhte Affinität erreicht wird (Silverman J et al. (2005), Nat Biotechnol 23:1556-1561).
„DARPins“ sind gestaltete Ankyrin Repeat-Domänen und basierend auf dicht gepackten Ankyrin-Repeats, von denen jede ein β-Turn und zwei antiparallele α-Helices bildet. DARPins tragen gewöhnlich drei Wiederholungen, die einer künstlichen Konsensussequenz entspricht, wobei eine einzelne Wiederholung typischerweise aus 33 Aminosäuren besteht, von denen sechs die bindende Oberfläche bilden. Beim Design von rekombinanten Bibliotheken werden diese Bindestellen verwendet, um die Kodons von zufälligen Aminosäuren einzuführen. DARPins werden typischerweise aus zwei oder drei der bindenden Motive gebildet, die zwischen den N- and C-terminalen Motiven enthalten sind, welche die hydrophoben Regionen abschirmen. DARPins sind kleine Proteine (-14-18 kDa), die extrem thermostabil und gegenüber Proteasen und denaturierenden Agenzien resistent sind (Plückthun A., Annu Rev Pharmacol Toxicol. (2015);55:489-511).
„Kunitz-Typ Domänen Binder“ sind Polypeptide mit ca. 60 Aminosäuren (~7 kDa), die aus den aktiven Motiv von Kunitz-Type-Protease Inhibitoren wie beispielsweise Aprotinin (Boviner pankreatischer Trypsin Inhibitor), dem Amyloid-Vorläufer-Protein von Alzheimer und Tissue Factor Pathway-Inhibitor abgeleitet sind. Der hydrophobe Kern der Kunitz-Domäne besteht aus einem verdrehten zweisträngigen antiparallelen β-Sheet and zwei α-Helices, die durch drei Paare Disulfidbindungen stabilisiert sind. Reste bei den drei Schleifen können substituiert werden, ohne dass das Strukturgebilde destabilisiert wird (Hosse RJ et al. (2006). Protein Sei 15:14-27; Simeon R. & Chen Z. Protein Cell. (2018);9(1):3-14).
„Adnektine“ sind eine Klasse von bindenden Proteinen, die ein Gerüst aufweisen, das aus dem Rückgrat der natürlichen Aminosäuresequenz der 10. Domäne der 15 sich wiederholenden Einheiten von menschlichem Fibronektin Typ III (FN3) besteht. Das Molekül nimmt eine β-Sandwich-Faltung mit sieben Strängen ein, die durch sechs Schleifen verbunden sind, ähnlich wie eine Immunglobulin Domäne, aber ohne irgendwelche Disulfidbindungen. Drei Schleifen an einem Ende des β-Sandwiches können verändert werden, um einen Adnektin in die Lage zu versetzen, ein interessierendes Target zielspezifisch zu erkennen. Reste außerhalb der Schleifen sind auch dafür bekannt, dass sie den verfügbaren Bindungs-Fußabdrucks erweitern können. Ligandenbindende Adnektin-Varianten mit Bindungsaffinitäten im nanomolaren bis picomolaren Bereich wurden mittels mRNA-, Phagen-, und Hefe-Display selektiert (Hackel BJ, et al. (2008) J Mol Biol 381:1238-1252).
Mittel und Verfahren zum Entwickeln, Screenen und Identifizieren geeigneter bindender Moleküle von verschiedenen Gerüsten, umfassend, ohne Einschränkung diejenigen, die oben beschrieben sind, gegen ins Auge gefasste Zielstrukturen, wie beispielsweise die Antikörper der Klassen IgA und/oder IgG, sind auf dem Gebiet wohl bekannt und werden routinemäßig verwendet. Beispielhafte heutzutage routinemäßig eingesetzte Verfahren umfassen, ohne dass eine Beschränkung beabsichtigt wäre, kombinatorischen, auf Bibliotheken basierenden Display im Hochdurchsatz und ebensolche Selektionsverfahren, wie beispielsweise Phagen-Display, Ribosomen-Display, mRNA-Display und Zelloberflächen-Display (z.B. Hefe-Display).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper ein Immunglobulin (Ig), bevorzugt IgG hochgezogen in einer nicht-menschlichen Art, wobei der sekundäre Antikörper spezifisch an die Immunglobuline oder das Immunglobulin von einer oder mehr als einer spezifischen IgG-Klasse oder Fragmente davon bindet (z.B. eine konstante Domäne einer bestimmten Ig-Klasse) die von einer anderen ausgewählten Art stammen, bevorzugt menschliche Antikörper. Ein Beispiel ist ein polyklonaler Antikörper, der in einer Ziege hochgezogen wird und spezifisch menschliche IgA erkennt (d.h. ein polyklonaler Ziegen-Anti-humaner IgA-Antikörper). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an Immunglobuline von einer oder mehr als einer spezifischen IgG-Klasse oder Fragmenten davon einer anderen Art, bevorzugt Mensch, bindet (z.B. eine konstante Domäne einer bestimmten Ig-Klasse). Mittel und Verfahren zum Herstellen (mono- oder polyklonaler) Antikörper, die in der Lage sind, spezifisch an ein oder mehr als ein ausgewähltes Target-Antigen zu binden, sind auf dem Gebiet wohl bekannt.
In bestimmten Ausführungsformen kann der sekundäre Antikörper so ausgewählt werden, dass er spezifisch nur an eine, nur an zwei oder an alle drei Klassen von Ig-Antikörpern, d.h. IgA, IgG und/oder IgM bindet. In bestimmten Ausführungsformen, statt dass nur eine einzelne Art von sekundärem Antikörper verwendet wird, wird eine Mischung von verschiedenen unterschiedlichen sekundären Antikörpern verwendet, wobei die verschiedenen sekundären Antikörpern entweder an die gleiche(n) oder an unterschiedliche Ig-Klassen binden (z.B. eine Mischung aus verschiedenen Antikörpern (z.B. polyklonale Antikörper), die alle an IgA binden) oder an IgA und IgG oder IgM oder wobei die verschiedenen sekundären Antikörper an verschiedene individuelle Targetstrukturen binden (z.B. bindet eine Art von sekundärem Antikörper, der spezifisch an IgA bindet, und eine andere Art, die spezifisch an IgG bindet).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 unter Verwendung eines markierten sekundären Antikörpers nachgewiesen, bevorzugt eines markierten sekundären Antikörpers, der an Antikörper der Klasse oder Klassen IgA, IgG und/oder IgM bindet. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „markiert“ mit Hinblick auf den sekundären Antikörper solche Ausführungsformen einschließen, wobei der sekundäre Antikörper durch Koppeln, bevorzugt physische Verbindung, einer nachweisbaren Substanz, wie eines radioaktiven Agens oder eines anderen Moleküls, das ein nachweisbares Signal bereitstellt, wie beispielsweise, ohne Absicht einer Einschränkung, einen Fluorophor, wie einen kleinen organischen Fluorophore oder ein fluoreszentes Protein, oder eine enzymatisch aktive Markierung, das heißt ein Enzym wie beispielsweise alkalische Phosphatase, deren Anwesenheit festgestellt und optional basierend auf seiner Reaktivität mit und/oder die Umwandlung einer Substratsubstanz quantifiziert werden kann. Verschiedene nachweisbare Markierungen sind auf dem Gebiet bekannt und einige davon sind unten auch beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper, bevorzugt Antikörper der Klasse oder Klassen IgA, IgG oder IgM nachgewiesen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Kolorimetrie, Immunfluoreszenz, Nachweis enzymatischer Aktivität, Chemilumineszenz and Radioaktivität umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Infektion in einer Frühphase nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Frühphase“, wie hierin im Zusammenhang mit dem Verlauf einer SARS-CoV-2-Infektion bezeichnet, jeglichen Zeitpunkt innerhalb des Zeitraumes von weniger als 14 Tagen, bevorzugt weniger als 6 Tagen nach dem Zeitpunkt der Infektion, in solchen Fällen, in denen der Zeitpunkt der Infektion bekannt ist, z.B. Infektion eines Subjektes in einem Laborexperiment, d.h. dem Zeitpunkt des ersten Kontaktes zwischen dem Virus und dem Körper des Subjektes. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Frühphase“, wie hierin im Zusammenhang mit dem Verlauf einer SARS-CoV-2-Infektion bezeichnet, einen Zeitpunkt innerhalb eines Zeitraumes von weniger als 14 Tagen, bevorzugt weniger als sechs Tagen nach dem Beginn der Krankheit (auch bezeichnet auf dem Gebiet der Virologie als „Days post onset of illness“ (dpoi)“), d.h. nach dem ersten Auftreten von einem oder mehr als einem typischen mit einer SAR-CoV-2-Infektion assoziierten klinischen Symptom, wie hierin definiert. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass nach der Infektion Bestandteile eines Coronavirus direkt nachgewiesen werden können, z.B. unter Verwendung von PCR zum Nachweis von Nukleinsäure und Immunassays zum Nachweis von Virusantigenen in Proben. Nach dem Höhepunkt der Infektion mit der maximalen Viruskonzentration, möglicherweise nur wenige Tage nach dem ersten Kontakt des Patienten mit dem Virus, sinkt die Konzentration des Virus, was den direkten Nachweis zunehmend schwierig und schließlich unmöglich macht, spätestens dann, wenn das Virus in den Proben nicht mehr anwesend ist. Gleichzeitig wird die Produktion von Antikörpern gegen Virusbestandteile ausgelöst, sobald Virusbestandteile im Blut des Patienten anwesend sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Frühphase“ das Zeitfenster zwischen dem ersten Kontakt zwischen Virus und Patient oder dem Beginn der Krankheit, bevorzugt den Beginn der Krankheit und der Produktion von nachweisbaren IgG-Antikörpern gegen das Virus, bevorzugter bevor IgG-Antikörper die vorherrschende Immunglobulin-Klasse sind, d.h. in höherer Konzentration vorliegen als IgA und IgM, am bevorzugtesten bevor die höchste Konzentration an IgG erreicht ist. Daher kann der Nachweis von IgA- und IgM-Antikörpern ein Beitrag zur Diagnose einer Infektion darstellen, die noch akut ist, mit oder ohne nachweisbare Symptome, aber bevor die volle IgG-lmmunantwort entwickelt ist.
In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers der Klasse IgA, zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion oder zur Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion dar, bevorzugt zum Unterscheiden einer zwischen einer SARS-CoV-, bevorzugt SARS-CoV-2-, MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion dar. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verwendung zur Frühdiagnose oder Diagnose in einer Frühphase einer SARS-CoV-2-Infektion.
In einem Aspekt stellt die Erfindung einen Kit umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davor dar, bevorzugt beschichtet auf einem diagnostisch nützlichen Träger, und umfassend ein oder mehr als ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, ein Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers der Klasse oder von Antikörpern der Klassen IgA, IgG und/oder IgM, bevorzugt eines Antikörpers der Klasse IgA, bevorzugt einen sekundären Antikörper, der spezifisch gegen Antikörper der Klassen IgA, IgG und/oder IgM bindet, bevorzugt IgA, bevorzugt umfassend eine nachweisbare Markierung, und einen Verdünnungspuffer.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der diagnostisch nützliche Träger ausgewählt aus der Gruppe umfassend einen Bead, bevorzugt einen magnetischen oder paramagnetischen Bead, einen Teststreifen, eine Mikrotiterplatte, eine Membran, bevorzugt aus der Gruppe umfassend eine Nitrozellulose-Membran, Western Blot, Linien-Blot und Dot Blot, eine Lateral-Flow-Vorrichtung, eine Glasoberfläche, einen Glasträger, einen Microarray, eine Chromatographiesäule und einen Biochip und bevorzugt eine Mikrotiterplatte.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit zwei oder mehr, bevorzugt drei oder mehr Kalibratoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist jeder Kalibrator ein rekombinanter Antikörper, der an SEQ ID NO: 1 bindet, bevorzugt erkannt durch einen sekundären Antikörper, der gegen Antikörper der Klasse IgA bindet. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Kalibrator ein rekombinanter Antikörper, der an SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon bindet, und der rekombinante Antikörper ist bevorzugt ein Immunglobulin (Ig) der gleichen Immunglobulin-Klasse wie die Immunglobulin-Klasse, an die der sekundäre Antikörper bindet.
In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon und/oder eines Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt einen Antikörper der Klasse IgA, zur Herstellung eines diagnostischen Kits gemäß dieses Aspektes dar, die Erfindung betrifft insbesondere eine Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon zur Herstellung eines diagnostischen Kits. Darüber hinaus stellt die Erfindung auch eine Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 bereit, bevorzugt eines Antikörpers der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugt IgA dar, zur Herstellung eines diagnostischen Kits.
Das diagnostische Kit dient bevorzugt zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion oder zur Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion, bevorzugt zum Unterscheiden zwischen einer SARS-CoV-, bevorzugt SARS-CoV-2-, MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion. Dementsprechend betrifft die Erfindung eine Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon zur Herstellung eines diagnostischen Kits zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. Die Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion kann z.B. einen Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt ein Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA, in einer Probe von einem Subjekt umfassen. Die Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion kann auch den Schritt Erhalten einer Probe von einem Subjekt und einen Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugt der IgA, in der Probe von dem Subjekt umfassen. Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon zur Herstellung eines diagnostischen Kits für die Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion, bevorzugt zum Unterscheiden zwischen einer SARS-CoV-, bevorzugt SARS-CoV-2-, MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion. Die Differenzialdiagnose kann z.B. einen Schritt zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 in einer Probe von einem Subjekt umfassen, bevorzugt eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA. Die Differentialdiagnose kann auch einen Schritt Erhalten einer Probe von einem Subjekt und einen Schritt zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 in der Probe von einem Subjekt, bevorzugt eines Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA umfassen.
Gemäß diesem Aspekt stellt die Erfindung gleichermaßen ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon zur Verwendung bei der Diagnose am menschlichen oder tierischen Körper. Insbesondere stellt die Erfindung ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon zur Verwendung bei der Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion bereit. Die Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion kann z.B. einen Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA, in einer Probe von einem Subjekt umfassen. Die Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion kann auch einen Schritt Erhalten einer Probe von einem Subjekt und einen Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA in der Probe von dem Subjekt bereit. Die Erfindung stellt weiter ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon zur Verwendung bei der Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion umfassen, bevorzugt zum Unterscheiden zwischen einer a SARS-CoV- (bevorzugt SARS-CoV-2)-MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion bereit. Diese Differentialdiagnose kann z.B. einen Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 in einer Probe von einem Subjekt umfassen bevorzugt eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA. Die Differentialdiagnose kann auch einen Schritt Erhalten einer Probe von einem Subjekt und einen Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 in der Probe von dem Subjekt, bevorzugt einem Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen, IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA umfassen.
Die Erfindung stellt weiter einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 bereit, bevorzugt einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA, zur Verwendung bei der Diagnose am menschlichen oder tierischen Körper. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugter ein Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA, zur Verwendung bei der Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. Die Erfindung betrifft weiter einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA und/oder IgG, am bevorzugtesten IgA, zur Verwendung bei der Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion, bevorzugt zum Unterscheiden zwischen einer SARS-CoV-, bevorzugt SARS-CoV-2-, MERS, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion.
In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Verwendung eines rekombinanten Antikörpers, der gegen SEQ ID NO: 1 bindet, als Kalibrator für die Frühdiagnose einer SARS-CoV-2-Infektion bereit, wo dieser bevorzugt von einem sekundären Antikörper erkannt wird, der gegen Antikörper der Klasse IgA bindet.
Gemäß dieses Aspektes stellt die Erfindung auch eine Verwendung eines rekombinanten Antikörpers, z.B. eines rekombinanten Antikörpers der Klasse IgA, der SEQ ID NO: 1 bindet, als Kalibrator bereit, bevorzugt als Kalibrator zum Nachweis eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse IgA, in einer Probe von einem Subjekt. Ein solcher Kalibrator kann insbesondere zum Diagnostizieren von einer SARS-CoV-2-Infektion für oder zur Differentialdiagnose einer Coronavirus-Infektion verwendet werden, bevorzugt zum Unterscheiden zwischen einer SARS-CoV-, bevorzugter SARS-CoV-2-, MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion. Die Erfindung stellt gleichermaßen eine Verwendung eines rekombinanten Antikörpers, der gegen SEQ ID NO: 1 bindet, z.B. eines Rekombinanten Antikörpers der Klasse IgA, als Kalibrator bereit, bevorzugt zur Diagnose, insbesondere zur Frühdiagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das humane Subjekt ein geimpftes humanes Subjekt. Offenbart hierin ist weiter das Evaluieren des Ergebnisses für die Diagnose. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst es weiterhin das Weitergeben des Ergebnisses der Diagnose oder die Evaluation an einem anderen Ort.
Verschiedene Antigene und Antikörper wurden als Basis für den immunologischen Nachweis von Coronaviren verwendet, darunter das ganze Virus oder irgendeines der Strukturproteine oder Fragmente davon, genauso wie Antikörper, die gegen diese Antigene binden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 in einer Frühphase der Infektion nachgewiesen werden können. Sie können zum Zwecke des Nachweises der Anwesenheit einer Infektion in einer Frühphase der Infektion nachgewiesen werden.
In anderen Worten zeigen die hierin offenbarten Ergebnisse eine überlegene Sensitivität, bevorzugt gemessen als Zahl der korrekt positiv bestimmten Proben relativ zur Gesamtzahl der untersuchten Proben, zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion bereits zu einer Frühphase der Infektion. Ein wichtiger Beitrag zu der beobachteten Steigerung der Sensitivität liegt in der überraschenden Erkenntnis, dass Antikörper der Klasse IgA gegen SEQ IDNO:1 in vielen Patienten früher nachweisbar sind als Antikörper anderer Ig-Klassen, wie beispielsweise Antikörper der Klasse IgG, darunter in einer Subpopulation von Patienten, denen es an nachweisbaren IgM-Antikörpern mangelt.
Darüber hinaus basiert die Erfindung auf der überraschenden Erkenntnis, dass Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, insbesondere IgG und/oder IgA länger persistieren und über einen längeren Zeitraum nachweisbar sind als Antikörper gegen das SARS-CoV-2 N Protein.
Weiterhin besteht überraschend geringe Kreuzreaktivität mit einer Reihe von Antikörperproben von Patienten, die mit anderen Coronaviren infiziert sind, bevorzugt anderen als SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2, was zu einer überlegenen Spezifität beiträgt, bevorzugt gemessen als hohe Anzahl korrekt identifizierter negativer Proben, d.h. eine geringe Zahl falsch-positiv bestimmter Proben relativ zur Gesamtzahl der untersuchten Proben, beim Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1. Insbesondere haben die Erfinder herausgefunden, dass die Spezifität von SEQ ID NO: 1 als Antigen im Vergleich zu SEQ ID NO: 33 (S2-Domäne) überlegen ist (Okba et al., Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease Patients. Emerg Infect Dis. 2020 Jul;26(7):1478-1488, vorveröffentlicht in medRxiv 2020.03.18.20038059).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Begriff „Diagnose“, wie hierin verwendet, in seinem breitesten möglichen Sinn zu verstehen und kann jegliche Vorgehensweise bedeuten, die darauf abzielt, Informationen zu erhalten, die für die Einschätzung, ob ein Patient in der Vergangenheit an einer bestimmten Krankheit litt, an der Krankheit leidet oder mit höherer Wahrscheinlichkeit als der Durchschnitt oder ein Vergleichssubjekt, das bevorzugt ähnliche Symptome aufweist, an einer bestimmten Krankheit litt, leidet oder leiden wird, zur Zeit der Diagnose oder in der Zukunft, um herauszufinden, wie die Krankheit fortschreitet oder wahrscheinlich in der Zukunft fortschreiten wird oder um das Ansprechen eines Patienten oder von Patienten im Allgemeinen mit Hinblick auf eine bestimmte Behandlung zu evaluieren, bevorzugt ein Vakzin, oder um herauszufinden, ob eine Probe von einem Patienten stammt. Solch eine Information kann für eine klinische Diagnose verwendet werden, kann aber auch von einem experimentellen und/oder Forschungs-Labor für den Zweck allgemeiner Forschung erhalten werden, z.B. um den Anteil von Subjekten in einer Patientenkohorte oder in einer Population zu bestimmen, die an der Krankheit leiden. In anderen Worten umfasst der Begriff „Diagnose“ nicht nur das Diagnostizieren, sondern auch das Prognostizieren und/oder das Überwachen des Verlaufs einer Krankheit oder Störung, umfassend das Überwachen der Reaktion von einem oder mehr als einem Patienten auf das Verabreichen eines Medikamentes oder Medikamentenkandidaten, z.B. um dessen Wirksamkeit zu bestimmen. Wiederum kann das frühe Auftreten und/oder das lange Persistieren von IgA- und/oder IgG-Antikörpern gegen SEQ ID NO:1 ausgenutzt werden. Während das Ergebnis einem spezifischen Patienten für klinische diagnostische Anwendungen zugeordnet werden und an einen Arzt oder an eine Einrichtung, die den Patienten behandelt, kommuniziert werden kann, z.B. mittels Telefon, Fax, Brief oder in einem elektronischen Format wie beispielsweise E-Mail oder unter Verwendung einer Datenbank, ist dies für andere Anwendungen nicht notwendigerweise der Fall z.B. bei der Diagnostik für Forschungszwecke, wo es ausreichend sein kann, die Ergebnisse einer Probe einem anonymisierten Patienten oder einer anonymisierten Patientenkohorte zuzuordnen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zu diagnostizierende Person, d.h. das „Subjekt“ oder der „Patient“ ein anonymer Blutspender, dessen Blut gespendet oder verwendet wird, um therapeutisch nützliche Antikörper zu erzeugen. Bevorzugt ist die Krankheit eine SARS- Infektion, einschließlich SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2, bevorzugter eine SARS-CoV-2 Infektion.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Produkte und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung für Interaktionsstudien verwendet werden, umfassend das Bestimmen, ob ein Wirkstoffkandidat oder eine andere Verbindung darunter ein Impfstoffkandidat, oder irgendeine Verbindung des Körpers wie ein blockierender Antikörper anwesend ist und das Binden eines Antikörpers gegen SARS-CoV-2 stören oder irgendeinen weiterführenden Prozess beeinflussen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform können sie zum Überwachen der Immunantwort benutzt werden, bevorzugt des erstmaligen Auftretens und/oder des Titers von Antikörpern gegen ein Polypeptid umfassend, bevorzugt bestehend aus SEQ ID NO: 1, folgend der Verabreichung einer immunogenen Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder immunogene Variante davon, z.B. an ein Säugetier, welches ein anderes Säugetier als ein Mensch sein kann, wie beispielsweise ein Versuchstier. Der Nachweis von IgA- und/oder IgG-Antikörpern, bevorzugt in der Spätphase der Immunisierung eines Subjektes, bevorzugt für den Zweck der Erhöhung der Sensitivität des Nachweises oder zum Optimieren der Sensitivität des Nachweises ist besonders bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Immunisierung das Ergebnis einer SARS-CoV-2-Infektion oder das Ergebnis einer Verabreichung eines Impfstoffes umfassend SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon. Die Erhöhung oder Optimierung kann im Vergleich zu anderen Antikörpern gegen SARS-CoV-2 oder Bestandteile davon auftreten, z.B. SEQ ID NO: 30 (N Protein), bevorzugt IgG oder Antikörper gegen SEQ ID NO30 der Klasse IgG. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Späte Phase“, wie hierin verwendet, die Zeitspanne beginnend mit Tag 20, 30, 40, 50, 60, 61, 70, 80 oder 90 nach dem Ausbruch der Krankheit oder nach der ersten Verabreichung eines Impfstoffes, bevorzugt Tag 60. Bevorzugt dauert sie 28 Tage, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 36, 48, 60 oder mehr Monate an, bevorzugt drei oder mehr Monate. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Verwendung für die langfristige Überwachung einer Immunisierung verwendet werden. Die Immunisierung kann das Endergebnis einer SARS-CoV-2 Infektion oder einer Impfung sein, bevorzugt mit SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon. Wenigstens eine Probe, die während der Spätphase erhalten wird, wird analysiert, bevorzugt zwei oder mehr. Eine Probe kann wenigstens einmal pro Woche oder ein Mal im Monat während der Spätphase erhalten und analysiert werden.
Das Subjekt leidet wahrscheinlich oder wahrscheinlicher an einer SARS-CoV-2-Infektion, wenn ein IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 in einer Probe von ihm nachgewiesen wird. Der Fachmann ist mit generellen Prinzipien in der Virologie zur Interpretation von Ergebnissen vertraut, die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern wiederspiegeln (z.B. Doerr, H. W., and Gerlich, W., Medizinische Virologie: Grundlagen, Diagnostik, Prävention und Therapie, Thieme 2010, z.B. 9.7 darin). Kurz gesagt kann der erste Nachweis von spezifischen Antikörpern gegen virusspezifische Antigene zur initialen Diagnose einer Infektion verwendet werden. IgA-Antikörper sind außer in spezifischen Fällen, wie in Fällen von Infektionen durch Enteroviren, normalerweise nicht diagnostisch relevant (Gressner/Arndt, Lexikon der Medizinischen Labordiagnostik, 2. Auflage, Springer, 2013, Seite 1387), aber wenn sie auftreten, ist ihr Titel typischerweise niedriger als der von Antikörpern der Klassen IgM oder IgG und sie treten wahrscheinlich später auf. Eine geringe Konzentration von Antikörpern in der Klasse IgG, bevorzugt in Abwesenheit von Antikörpern der Klassen IgM und IgA, zeigt eine Immunisierung in der Vergangenheit an. Ein zunehmender Titer von Antikörpern der Klasse IgG oder eine hohe Konzentration davon kann eine akute Infektion oder eine Reinfektion anzeigen. In einer bevorzugten Ausführungsform zeigt die Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 eine Immunisierung, entweder als Ergebnis einer vorherigen oder andauernden SARS-CoV-2 oder einer Impfung. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine erfolgreiche Impfung mit einem Vakzin umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon (oder mit einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon kodiert, z.B. RNA-basierter Impfstoff) von einer SARS-CoV-2-Infektion unterschieden werden, indem die Abwesenheit von Antikörpern gegen andere SARS-CoV-2-Antigene als SEQ ID NO: 1 bestätigt wird, bevorzugt durch Bestätigen der Abwesenheit von Antikörpern gegen ID NO: 30 (SARS-CoV-2 N-Protein).
Die Probe ist bevorzugt eine Probe von einem Säugetier, d.h. eine Probe von einem Säugetier, bevorzugter eine menschliche Probe, d.h. eine Probe von einem Menschen.
Der Begriff „Diagnose“ impliziert bevorzugt nicht, dass die diagnostischen Agenzien gemäß der vorliegenden Erfindung endgültig und ausreichend sind, um eine finale Diagnose auf Basis eines einzelnen Tests oder gar Parameters zu stellen, aber sie bedeutet einen Beitrag zu dem, was als „Differentialdiagnose“ bekannt ist, d.h. eine systematische diagnostische Vorgehensweise, bei der die Wahrscheinlichkeit einer Reihe von möglichen Krankheiten auf der Basis einer Reihe von diagnostischen Parametern berücksichtigt wird. Gemäß der Erfindung kann unterschieden werden, ob ein Patient, bevorzugt ein Patient, der bereits unter Verdacht steht, unter einer Coronavirus-Infektion zu leiden, unter einer SARS, bevorzugt SARS-CoV-1 und/oder SARS-CoV-2 Infektion oder einer anderen Coronavirus-Infektion leidet, bevorzugt aus der Gruppe umfassend MERS, NL63, 229E, OC43 und HKU1. NL63, 229E, OC43 and HKU1 sind mit einer erheblichen Anzahl von Fällen von üblicher Erkältung assoziiert, daher kann die Differentialdiagnose das Unterscheiden zwischen einer SARS-CoV-1- und/oder SARS-CoV-2-Infektion und einer Erkältung umfassen. Z.B. kann ein Patient zunächst unter Verdacht stehen, unter einer Coronavirus-Infektion zu leiden, aufgrund einer möglichen Exponierung gegenüber einer Umgebung mit Risiko und/oder basierend auf gemeinsamen Symptomen wie beispielsweise Fieber, Husten und Atemnot unter Verdacht stehen. Ein PCR (z.B. Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill.2020;25(3):2000045. doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045) und/oder Immunoassay kann anschließend ausgeführt werden. Wenn die PCR negativ ist, z.B. weil die Probe einige Tage nach der Infektion abgenommen wurde, kann die Erfindung verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 nachzuweisen. Zusätzlich kann die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen ein Antigen von einem anderen Coronavirus nachgewiesen werden, z.B. aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-1, MERS, NL63, 229E, OC43 und HKU1, bevorzugter MERS, NL63, 229E, OC43 und HKU1. Antikörper gegen Homologe und Varianten von SEQ ID NO: 1 von SARS-CoV-2 können nachgewiesen werden. Basierend auf spezifischen klinischen Symptomen wie Kopfschmerzen und Körperschmerzen, die eher für das SARS-CoV-1 charakteristisch sind, oder Verlust von Geschmacks- und Geruchssinn und angeschwollenem Rachen, die für SARS-CoV-2 charakteristischer sind, kann die Diagnose finalisiert werden. Es kann berücksichtigt werden, ob der Patient gegenüber infizierten Patienten exponiert war. Z.B. sind SARS-CoV-1-Fälle extrem selten, so dass angenommen sein kann, dass viele Patienten, die in einer SARS-CoV-2-Pandemie an gemeinsamen SARS-CoV-1- und SARS-CoV-2-Symptomen leiden, an einer Infektion mit dem letztgenannten Coronavirus leiden. Eine Unterscheidung zwischen SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 ist basierend auf der in der Zeitauflösung unterschiedlichen Immunglobulin (Ig)-Klassen-Signatur möglich, insbesondere dem späteren Erscheinen von Antikörpern der Klasse IgA bei SARS-CoV-1 (Hsueh, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066). Die Antikörperkonzentrationen können überwacht werden z.B. über einen Zeitraum von mehreren Wochen, z.B. um das Verschwinden oder das Auftreten eines interessierenden Antikörpers nachzuweisen, was dazu beitragen kann, eine primäre oder eine sekundäre Infektion oder Immunisierung zu unterscheiden, z.B. als Ergebnis einer Impfung, oder um eine Infektion mit mehr als einem Coronavirus zu erkennen.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „SARS-CoV-2“, wie hierin verwendet, ein Virus, das durch das Genom charakterisiert ist, das in GenBank unter der Zugangsnummer MN908947 hinterlegt ist oder durch SEQ ID NO: 13 charakterisiert ist, bevorzugt wie in SEQ ID NO: 13 gezeigt ist, und Derivate davon, die wenigstens 80, bevorzugt 85, bevorzugt 88, bevorzugt 90, bevorzugt 91, bevorzugt 92, bevorzugt 93, bevorzugt 94, bevorzugt 95, bevorzugt 96, bevorzugt 97, bevorzugt 98, bevorzugt 99, bevorzugt 99.5, bevorzugt 99.8, bevorzugt 99.9 oder in 99.99 Prozent Sequenzidentität über die gesamte genomische Nukleotidsequenz aufweisen. Alle Datenbankeinträge oder Produktcodes, die hierin verwendet werden, entsprechen der Version, die zum frühesten Prioritätstag oder zum Anmeldetag der Anmeldung online verfügbar waren. Z.B. war die SARS-CoV-2-Genomsequenz unter der Zugangsnummer MN908947, die Version MN908947.3 (veröffentlicht am 17. Januar 2020) am frühesten Prioritätstag oder Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung online verfügbar. Die in MN908947.3 offenbarte Nukleotidsequenz ist mit SEQ ID NO: 13 identisch. Bevorzugter sind Mutanten wie diejenigen aus der Gruppe umfassend die UK Variante B.1.1.7, die südafrikanische Variante B.1.351, die brasilianische Variante P.1 und die Mink-Variante aus Dänemark umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zu diagnostizierende SARS-CoV-2-Infektion eine Infektion mit der U.K. Variante B.1.1.7 oder kann mit ihr assoziiert sein, charakterisiert durch ein Spike-Protein, das mit Bezug auf SEQ ID NO: 1, eine oder mehr als eine Mutation auffasst, bevorzugt alle Mutationen aus der Gruppe umfassend die Deletion(en) in His54 und/oder Val55, Gln486Tyr, Ala555Asp, Asp599Gly und Pro666His. Bevorzugt wird eine Variante von SEQ ID NO: 1, die eine oder mehrere Mutationen aufweist, bevorzugt alle Mutationen aus der Gruppe umfassend Deletion in His54 und/oder Val55, Gln486Tyr, Ala555Asp, Asp599Gly und Pro666His, für die Reagenzien und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Eine Variante von SEQ ID NO: 1, die all diese Mutationen umfasst, ist in SEQ ID NO: 51 dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zu diagnostizierende SARS-CoV-2-Infektion eine Infektion mit der südafrikanischen Variante B.1.351 oder mit ihr assoziiert, charakterisiert durch ein Spike-Protein, das mit Bezug auf SEQ ID NO: 1 eine oder mehr als eine Mutation aufweist, bevorzugt alle Mutationen aus der Gruppe umfassend Lys402Gln, Glu469Lys, Gln486Tyr und Asp599Gly. Bevorzugt wird eine Variante von SEQ ID NO: 1, die eine oder mehr als eine Mutation aufweist, bevorzugt alle Mutationen aus der Gruppe umfassend Lys402Gln, Glu469Lys, Gln486Tyr und Asp599Gly, für die Reagenzien und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Eine Variante von SEQ ID NO: 1, die alle diese Mutationen aufweist, ist in SEQ ID NO: 52 dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zu diagnostizierende SARS-CoV-2-Infektion eine Infektion mit der brasilianischen Variante P.1 oder ist mit ihr assoziiert, charakterisiert durch ein Spike-Protein, das mit Bezug auf SEQ ID NO: 1 eine oder mehr als eine Mutation aufweist, bevorzugt alle Mutationen aus der Gruppe umfassend Glu469Lys und Gln486Tyr. Bevorzugt wird eine Variante von SEQ ID NO: 1, die eine oder mehr als eine Mutation aufweist, bevorzugt alle Mutationen aus der Gruppe umfassend Glu469Lys und Gln486Tyr, für die Reagenzien und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Eine Variante von SEQ ID NO: 1, die all diese Mutationen aufweist, ist in SEQ ID NO: 53 dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zu diagnostizierende SARS-CoV-2-Infektion eine Infektion mit der Mink-Variante aus Dänemark oder mit ihr assoziiert, charakterisiert durch ein Spike-Protein, das mit Bezug auf SEQ ID NO: 1 eine oder mehr als eine Mutation aufweist, bevorzugt alle Mutationen aus der Gruppe umfassend Deletion oder Deletionen in His54 und/oder Val55, Asp599Gly und Tyr438Phe. Bevorzugt wird eine Variante von SEQ ID NO: 1 mit einer oder mehr als einer Mutation, bevorzugt allen Mutationen umfassend Deletion oder Deletionen in His54 und/oder Val55, Asp599Gly und Tyr438Phe für die Reagenzien und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Eine Variante von SEQ ID NO: 1, die all diese Mutationen umfasst, ist in SEQ ID NO: 54 dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Diagnose“, dass das Produkt oder die Verwendung verwendet wird, um bei der Diagnose einer Krankheit zu helfen oder zum Identifizieren eines Subjektes mit einem Risiko, an einer Krankheit zu leiden. Der Begriff „Diagnose“ kann auch ein Agens bedeuten, das verwendet wird, um die vielversprechendste Behandlungsstrategie für einen Patienten zu wählen. In anderen Worten kann das Agens das Auswählen einer Behandlungsstrategie für ein Subjekt betreffen.
Offenbart hierin ist der Schritt Bereitstellen des diagnostisch nützlichen Trägers und einer Probe von einem Patienten, der unter Verdacht steht, infiziert zu sein, bevorzugt ein Säugetier, noch bevorzugter ein menschlicher Patient. Der Träger ist beschichtet mit dem Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon. Der Träger kann dann mit der Probe kontaktiert werden unter Bedingungen, die das Binden von irgendwelchen Antikörpern an das Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon gestattet. Die Probe kann dann entfernt werden, und der Träger kann dann gewaschen werden, um verbleibendes Probenmaterial zu entfernen. Ein sekundärer Antikörper oder ähnliches Reagenz oder Mittel, das an den nachzuweisenden Antikörper bindet und eine nachweisbare Markierung trägt, kann anschließend mit dem Träger kontaktiert werden, unter Bedingungen, die die Ausbildung eines Komplexes zwischen einem gebundenen Antikörper und den sekundären Antikörper gestatten. Der Träger kann gewaschen werden, um nichtgebundene sekundäre Antikörper zu entfernen. Schließlich wird die Anwesenheit des Antikörpers nachgewiesen, indem geprüft wird, ob der sekundäre Antikörper nachgewiesen werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeuten der Begriff „SARS-CoV-2-Infektion“ oder ähnliche Begriffe, wie hierin verwendet, eine Infektion eines Subjektes, bevorzugt eines menschlichen Subjektes, mit SARS-CoV-2, d.h. die Anwesenheit des Virus, wenigstens zeitweise, im Körper der Subjektes, bevorzugter zusammen mit nachweisbaren Konzentrationen des Virus selbst und/oder einem oder mehr als einem Biomarker aus der Gruppe umfassend ein SARS-CoV-2 Polypeptid aus der Gruppe umfassend die strukturellen Proteine, insbesondere S und N, bevorzugt die S1-Domäne, und Antikörper, die gegen sie binden, und/oder eine Nukleinsäure von SARS-CoV-2, die letztgenannte nachweisbar mittels PCR. Das Subjekt kann klinische Symptome aufweisen, bevorzugt eines oder mehr als eines, bevorzugt alle aus der Gruppe umfassend Fieber, Müdigkeit, trockener Husten, Nasenverstopfung, laufende Nase, und angeschwollener Rachen. Schwere Symptome umfassen Atemnot, Brustschmerzen oder -druck oder plötzliche Verwirrung. Die Krankheit kann zu Komplikationen wie Lungenentzündung, akutem respiratorischem Notsyndrom, Sepsis, septischem Schock und Nierenversagen führen. Jedoch haben viele infizierte Subjekte nur milde Symptome und sind sich ihrer Infektion möglicherweise nicht einmal bewusst.
Offenbart hierin ist die Verwendung, um Proben vom gleichen Patienten zu untersuchen, bevorzugt an verschiedenen Tagen. Z.B. wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern täglich über ein oder zwei Wochen nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Proben an verschiedenen Tagen untersucht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben wenigstens über einen Zeitraum von wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16 Wochen abgenommen.
Die Reagenzien und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch zum Screenen der Wirksamkeit und der Nützlichkeit eines antiviralen Wirkstoffes oder eines Impfstoffes oder Impfstoffkandidaten verwendet werden. In dieser Hinsicht ist zu berücksichtigen, dass die Erfindung in einem geimpften Menschen validiert wurde, d.h. ein Antikörper gegen das Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 konnte in einem Menschen nachgewiesen werden, der mit einer Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 geimpft worden war. Sie können als Teil von Impfstudien und Versuchsreihen verwendet werden, die das Ziel haben, die Qualität von Impfstoffen in Menschen und anderen Subjekten umfassend Versuchstiere zu bestätigen, oder zu bestätigen, dass das Immunsystem von einem Subjekt auf die Verabreichung des Impfstoffes anspricht. Bevorzugt basiert der Impfstoff auf SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon. Die Reagenzien und Verwendungen können verwendet werden, einen Patienten erstmalig zu diagnostizieren vor der erstmaligen Verabreichung eines Impfstoffes, um zu überprüfen, ob der Patient bereits immunisiert ist z.B. wegen einer vorherigen Infektion mit SARS-CoV-2 oder einer vorherigen Impfung. Z.B. kann der Patient für die Einbeziehung in eine oder den Ausschluss von einer Studie oder einer Versuchsreihe selektiert werden und über die Zeit überwacht werden. Insbesondere können bereits infizierte Subjekte von dem Testen eines Impfstoffkandidaten ausgeschlossen werden. Es kann bestätigt werden, ob eine vorherige Impfung noch wirksam ist, bevorzugt basierend auf dem Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA und/oder IgG.
Die Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um zu screenen, ob gespendetes Blut mit Coronavirus kontaminiert ist oder ob ein Blutspender Antikörper gegen SARS-CoV-2, bevorzugt gegen SEQ ID NO: 1, produziert, die aus seinem gespendeten Blut extrahiert werden können, z.B. für therapeutische Verwendungen. Nach dem Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern der Klasse oder Klassen IgG, IgM und/oder IgA, bevorzugt IgG und IgA, bevorzugter IgA, gegen SEQ ID NO: 1 kann ein Antikörper gegen SARS-CoV-2, bevorzugt gegen SEQ ID NO: 1, aus dem Blut des Blutspenders aufgereinigt werden, z.B. über Affinitätschromatographie oder durch Kontaktieren des Trägers gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem gespendeten Blut unter Bedingungen, die mit der Ausbildung eines Komplexes umfassend den Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 und den Träger kompatibel sind, entfernen von verbliebenem gespendeten Blut und Abtrennung des Antikörpers von dem Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform ist gespendetes Blut ausgewählt aus der Gruppe umfassend Ganzblut, Plasma und Serum, und kann ein die Gerinnung verhinderndes Reagenz beinhalten. Auch eine Verbindung aus der Gruppe umfassend Citrat, Phosphat, Dextrose und Adenin, bevorzugt alle davon, kann anwesend sein.
Der nachzuweisende Antikörper bindet bevorzugt spezifisch an SEQ ID NO: 1. Spezifisches Binden bedeutet bevorzugt, dass die Bindungsreaktion stärker als seine Bindungsreaktion ist, die durch eine Dissoziationskonstante von 1 × 10^-8 M, bevorzugter 1 × 10^-8 M, bevorzugter 1 × 10^-8 M, bevorzugter 1 × 10^-9 M, bevorzugter 1 × 10^-10 M, bevorzugter 1 × 10^-11 M, bevorzugter 1 × 10^-12 M gekennzeichnet ist, wie durch Surface Plasmon Resonance unter Verwendung von Biacore-Ausrüstung bei 25 °C in PBS-Puffer bei pH 7 bestimmt wird.
Die Lehre der vorliegenden Erfindung kann nicht nur unter Verwendung von Polypeptiden mit genau den Sequenzen ausgeführt werden, wie sie auf die in dieser Anmeldung explizit Bezug genommen wird, wie beispielsweise SEQ ID NO: 1, z.B. durch Funktion, Name, Sequenz oder Zugangsnummer, oder 6
Gemäß der Erfindung bedeutet der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet, wenigstens ein Fragment der Volllängen-Sequenz, auf die Bezug genommen wird, oder ein Polypeptid umfassend ein solches Fragment, spezifischer eine oder mehr als eine Aminosäure- oder Nukleinsäure-Sequenz, die relativ zur Volllängen-Sequenz, an einem Ende oder an beiden Enden um eine oder mehr als eine Aminosäure verkürzt ist. Ein solches Fragment umfasst oder kodiert für ein (Poly-)Peptid, das wenigstens 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 oder 600 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Original-Sequenz umfasst, oder für eine Variante davon. Z.B. umfassen Fragmente von SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 31. Zwei oder mehr Kopien eines Fragmentes können zwecks erhöhter Sensitivität fusioniert werden.
Es wird auch verstanden, dass der Begriff „Variante“ wie hierin verwendet, auch solche Polypeptide oder Fragmente davon umfasst, die Aminosäuresequenzen umfassen, bevorzugt ein Fragment umfassend wenigstens 25, bevorzugter 50, bevorzugter 200 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die wenigstens zu 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch zur Aminosäuresequenz sind, auf die Bezug genommen wird, oder zu dem Fragment davon, wobei andere Aminosäuren als die für die biologische Aktivität, z.B. die Fähigkeit, spezifisch an einem interessierenden Antikörper zu binden, oder die Faltung oder Struktur der Polypeptides essentiellen Aminosäure deletiert oder substituiert sind und/oder eine mehr oder mehr als eine solche essentielle Aminosäure konservativ ersetzt ist und/oder Aminosäuren hinzugefügt oder deletiert sind, so dass die biologische Aktivität des Polypeptides wenigstens teilweise erhalten bleibt. Z.B. umfassen Fragmente von SEQ ID NO:1 die Sequenzen SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:12, SEQ ID NOs:14-29, SEQ ID NOs:35-37 und SEQ IDNOs:40-43. Der Stand der Technik umfasst zahlreiche Verfahren, die verwendet werden können, um ein Alignment von gegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzen zu erstellen und um das Ausmaß der Identität zu berechnen. Siehe z.B. Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3. Ausgabe. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ClustalW-Software (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) verwendet, wobei Grundeinstellungen angewandt werden.
SARS-CoV-2 betreffende Veröffentlichungen zu spezifischen Aminosäuresequenzen wie beispielsweise Beal et al können dem Fachmann dabei helfen, geeignete Varianten zu gestalten (Beal, J., Mitechell, T., Wyschogrod, W., Manthey, J, and Clore, A. (2020) Highly Distinguished Amino Acid Sequences of 2019-nCoV (Wuhan Coronavirus) doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.31.929497), genauso wie Veröffentlichungen, die SARS-CoV betreffen, z.B. Hua et al. (Hua, R., Zhou, Y., Wang, Y., Hua, Y and Tong, T. (2004) Identification of two antigenic epitopes on SARS-CoV spike protein, BBR 319, 929-935), wobei homologe Epitope aufgefunden werden können und SARS-CoV-2 Epitope auf Basis ihrer Homologie identifiziert werden können. Beispielsweise können mögliche Epitope von SEQ ID NO: 5 abgeleitet werden. Dahlke et al. zeigen ein Epitop Mapping basierend auf einem Microarray umfassend überlappende Peptide mit einer Länge von 15 Aminosäuren, die vom S1-Polypeptid abgeleitet sind (Dahlke, C., Heidepriem, J., Kobbe, R., Santer R., Koch, T., Fathi, A., Ly, M. L, Schmiedel, S., Seeberger, P. H., ID-UKE COVID-19 study group, Addo, M. M., and Loeffler, F. F. (2020) https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20059733doi). Genauer wurden Peptide umfassend die Aminosäurensequenzen SSVLHSTQDLFLPFF (SEQ ID NO: 14, wobei es sich um 30-44 von SEQ ID NO: 1 handelt), TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPV (SEQ ID NO: 15, wobei es sich um 48-68 handelt), NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVS-QPFLMDLEG (SEQ ID NO: 16, wobei es sich um 110-166 handelt), DLPQGFSALEPLVDL (SEQ ID NO: 17, wobei es sich um 200-214 handelt), LLALHRSYLTPGDSSSGW- TAGAAAY (SEQ ID NO: 18, wobei es sich um 226-250 handelt), QPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDP (SEQ ID NO: 19, wobei es sich um 256-277 handelt), NATRFASVYAWNRKR (SEQ ID NO20, wobei es sich um 328-342 handelt), TGKIADYNYKLPDDF (SEQ ID NO21, wobei es sich um 399-414 handelt), YNYLYRLFRKSNLKP (SEQ ID NO22, wobei es sich um 434-448), FGRDIADTTDAVRDPQTLEILDI (SEQ ID NO23, wobei es sich um 550-572 handelt), SNQVAVLYQDVNCTE (SEQ ID NO24, wobei es sich um 590-604 handelt), AGCLIGA-EHVNNSYECDIP (SEQ ID NO25, wobei es sich um 632-650 handelt) des S1-Proteins als IgAreaktive Epitope identifiziert wurden. Peptide umfassend die Aminosäuresequenzen YNSASFSTFKCYGVS (SEQ ID NO26, wobei es sich um 354-368 handelt), STGSNVFQTRAGCLI (SEQ ID NO27, wobei es sich um 622-636 handelt) des S1-Proteins wurden als IgG-reaktive Epitope identifiziert. Peptide umfassend die Aminosäuresequenzen SSVLHSTQDLFLPFF (SEQ ID NO28, wobei es sich um 30-44 handelt) and LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA AAY (SEQ ID NO29, wobei es sich um 226-250 handelt) des S1-Proteins wurden als IgM-reaktive Epitope identifiziert. Darüber hinaus haben die Erfinder gezeigt, dass Peptide mit den Sequenzen RTQLPPAYTNS (SEQ ID NO41), LTPGDSSSGWTAG (SEQ ID NO35), YQAGSTPCNGV (SEQ ID NO36) und YGFQPTNGV- GYQ (SEQ ID NO37) mit Antikörpern von SARS-CoV-2-Patienten reaktiv sind. Viele andere Veröffentlichungen können vom Fachmann als Leitfaden verwendet werden, wenn er Varianten gestaltet (Zhang et al. (2020) Mining of epitopes on spike protein of SARS-CoV-2 from COVID-19 patients, Cell Res 30, 702-704 (2020). https://doi.org/10.1038/s41422-020-0366-x; Poh, C.M., Carissimo, G., Wang, B. et al. Two linear epitopes on the SARS-CoV-2 spike protein that elicit neutralising antibodies in COVID-19 patients. Nat Commun 11, 2806 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-16638-2; Wang et al. (2020) SARS-CoV-2 Proteome Microarray for Mapping COVID-19 Antibody Interactions at Amino Acid Resolution, ACS Cent. Sci. 2020, 6, 12, 2238-2249). In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid verwendet, das SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon umfasst und gefaltet ist und bevorzugter wenigstens 150, 200, 250, 300, 400, 500 oder 600 aufeinander ab folgende Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Varianten zusätzliche chemische Modifikationen umfassen, z. B. Markierungen wie Isotopen-Markierungen oder nachweisbare Markierungen oder kovalente Markierungen wie Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Decarboxylierung, Citrullinierung, Hydroxylierung und dergleichen. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit Verfahren zur Modifikation von Polypeptiden vertraut. Darüber hinaus können auch Varianten durch Fusion mit anderen bekannten Polypeptiden oder Varianten davon, z. B. künstlichen Linkeren, Affinitäts-Tags, anderen Antigenen und dergleichen erzeugt werden. Z. B. sind SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 und SEQ ID NO:38 Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine medizinische oder diagnostische Vorrichtung wie der diagnostisch nützliche Träger durch Exprimieren einer rekombinanten Variante von SEQ ID NO: 1 umfassend ein Affinitätstag, optional mit einem künstlichen Linker, der eine Proteasespaltstelle umfassen kann, in einer Zelle wie einer eukaryontischen (wie beispielswese eine CHO- oder HEK293-Zelle) oder einer prokaryontischen Zelle (wie beispielsweise eine E. coli-Zelle) Zelle durch Kontaktieren der exprimierten Variante mit einem Liganden, der spezifisch an das Affinitätstag bindet, wobei der Ligand an einer Festphase immobilisiert ist, durch Waschen der Festphase derart, dass nicht spezifisch gebundenes Material aus der Zelle entfernt wird, und durch Eluieren der exprimierten Variante von der Festphase, bevorzugt durch Hinzufügen eines Überschusses von nicht immobilisiertem Ligand hergestellt werden. Die Variante kann ausschließlich auf der Vorrichtung immobilisiert werden. Optional kann der Affinitätstag durch Kontaktieren der Variante mit einer Protease entfernt werden, bevorzugt einer Protease, die die Proteasespaltstelle erkennt, bevorzugt vor der Immobilisierung. Der Affinitätstag kann aus der Gruppe von Tags ausgewählt werden, die His, 18A, ACP, Aldehyd, Avi, BCCP, Calmodulin-bindendes Protein (CBP), Chitin-bindendes Protein, E-Tag, ELK16, FLAG, Flash, Polyglutamat, Polyaspartat, GST, GFP, HA, Maltose-bindendes Protein, myc, nus, NE, ProtA, ProtC, Tho1d4, S-Tag, SnoopTag, SpyTag, SofTag, Streptavidin, Strep-tag II, T7-Epitop-Tag, TAP, TC, Thioredoxin, Ty, V5, VSV und Xpress-Tag umfasst. Nützliche Proteasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf TEV, Thombin, Faktor Xa oder Enteropeptidase. Geeignete Linker, die eine Proteasespaltstelle umfassen (z.B. zwischen SEQ ID NO:1 oder einer Variante davon und dem Affinitätstag) können von der Variante umfasst sein und können Teil der kodierten Sequenz von im Handel erhältlichen Expressionsvektoren sein, z.B. pET Vektor-Serie (Novagen), die für die Expression der Variante verwendet werden können.
Die Variante des Polypeptides hat biologische Aktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einer derartigen biologischen Aktivität um die Fähigkeit, an den entsprechenden Antikörper zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst sie ein Epitop, das die Fähigkeit hat, an einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 zu binden, oder die Variante hat selbst die Fähigkeit, an einen Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 zu binden, bevorzugt ein Antikörper der Klasse IgA, bevorzugt aus einer Probe von einem Patienten der an SARS-CoV-2 leidet, wobei bevorzugt das Epitop eine Sequenz umfassend wenigstens 5, 6, 7 8 Aminosäurereste umfasst. Bevorzugter bindet es nicht spezifisch an Homologe von SEQ ID NO: 1 von anderen Coronaviren, bevorzugt aus der Gruppe umfassend MERS (SEQ ID NO: 6), NL63 (SEQ ID NO: 10), 229E (SEQ ID NO: 7), OC43 (SEQ ID NO: 8) und HKU1 (SEQ ID NO: 9), bevorzugter aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-1 (SEQ ID NO: 11), MERS, NL63, 229E, OC43 and HKU1, wobei spezifisches Binden bevorzugt definiert und bestimmt wird wie oben ausgeführt, unter Verwendung von Biacoreausrüstung.
Der Fachmann ist mit der Herstellung diagnostisch nützlicher Reagenzien basierend auf geeigneten Aminosäuresequenzen vertraut und in der Lage, sowohl lineare Peptide, z. B. durch chemische Synthese, und Polypeptide bereitzustellen, z. B. durch rekombinante Expression. Insbesondere ist dem Fachmann bewusst, dass sowohl Konformations- als auch Sequenz-Epitope existieren, und dass eine geeignete Strategie zur Expression und Aufreinigung gewählt werden muss, um ein diagnostisch nützliches Polypeptid zu erhalten, die verwendet werden kann, um einen Antikörper wie den Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 nachzuweisen (z. B. Reischl, U., Molecular Diagnosis of Infectious diseases, Humana Press, 1998, z. B. Kapitel 12, 15, 16, 18 und 19). Der Fachmann ist auch mit Vorgehensweisen zum Evaluieren der Nützlichkeit von rekombinanten Proteinen für Testsysteme vertraut (z. B. Reischl, U., Molecular Diagnosis of Infectious diseases, Humana Press, 1998, z. B. Kapitel 21-26).
Der Nachweis des Antikörpers oder Komplexes für die Prognose, Diagnose oder das Kit gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immundiffusionstechniken, immunelektrophoretische Techniken, Lichtstreuungs-Immuntests, Agglutinationstechniken, Immuntests mit Markierung wie beispielsweise aus der Gruppe umfassend radiomarkierte Immuntests, Enzym-Immuntests wie beispielsweise kolorimetrische Tests, Chemilumineszenz-Immuntests und Immunfluoreszenz-Techniken. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex nachgewiesen unter Verwendung eines Mittels ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immundiffusionstechniken, immunelektrophoretische Techniken, Lichtstreuungs-Immuntests, Agglutinationstechniken, markierte Immuntests aus der Gruppe umfassend radiomarkierte Immuntests, Chemilumineszenz-Immuntests, Immunfluoreszenz-Techniken und Immunpräzipitation. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit diesem Verfahren vertraut, und sie sind auch im Stand der Technik beschrieben, z. B. in Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, insbesondere in Kapitel 14. Bevorzugt ist das Testformat ein ELISA, und eine Mikrotiterplatte umfassend Wells wird als diagnostisch nützlicher Träger verwendet.
Bevorzugt ist ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon auf einer Festphase des Trägers immobilisiert. Es kann direkt auf der Festphase immobilisiert sein, wenn es mit der Probe kontaktiert wird, aber ein kompetitiver Test, ein Capture Bridge-Test, ein immunometrischer Test, ein klassenspezifischer sekundärer Antikörper auf der Festphase, ein dass Capture-Test, direkt oder indirekt, kann ebenfalls verwendet werden. Das Prinzip von jedem dieser Formate ist in The Immunassay Handbook, 3rd edition, edited by David Wild, Elsevier, 2005, ausführlich beschrieben. Bevorzugter ist die Festphase ein Teststreifen oder ein Well von einer Mikrotiterplatte für ELISA, bevorzugt ein Well einer Mikrotiterplatte für ELISA.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wird ein kompetitives Testformat benutzt, wobei der nachzuweisende Antikörper mit einem Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 oder einem anderen Liganden, der spezifisch an SEQ ID NO: 1 bindet, konkurriert. Der an SEQ ID NO: 1 spezifische bindende Ligand kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die ein Aptamer oder Antikörper, das oder der an SEQ ID NO: 1 bindet, und den menschlichen ACE2-Rezeptor (SEQ ID NO: 39) oder eine Variante davon umfasst, den natürlichen Bindungspartner des SARS-CoV-2-Spike-Proteins. Dies kann das Bereitstellen eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon und des Liganden, der spezifisch an SEQ ID NO: 1 bindet, bevorzugt aus der Gruppe umfassend einen Antikörper, ein Aptamer und den ACE-Rezeptor oder eine Variante davon umfassen. Wenn der nachzuweisende Antikörper anwesend ist, wird er die Bildung eines Komplexes teilweise stören oder den Liganden, der spezifisch an SEQ ID NO: 1 bindet, vollständig verdrängen, so dass die Zahl der Komplexe verringert wird. Jeglicher Komplex umfassend den nachzuweisenden Antikörper kann anschließend durch Präzipitieren des Komplexes nachgewiesen werden, z.B. unter Verwendung eines Affinitätsliganden, der an dem Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 befestigt ist, oder an ein Molekül, das gegen den nachzuweisenden Antikörper bindet, wie beispielsweise ein sekundärer Antikörper. Beispiele für Affinitätsliganden umfassen Glutathion and Biotin. Ein Bindungspartner des Affinitätsliganden kann auf einer Festphase beschichtet vorliegen, die an den Affinitätsliganden wie beispielsweise GST bzw. Streptavidin bindet. Jeglicher präzipitierte Komplex kann anschießend nachgewiesen werden, bevorzugt durch Nachweisen eines nachweisbaren Labels befestigt an dem Liganden, der spezifisch an das Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1, bindet oder befestigt an dem Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1. Ein spezifischer kompetitiver Test wurde von Tan et al. (2020) A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein protein interation, Nature Biotechnology 38 (1073-1078) publiziert.
Alternativ kann der Komplex auf der Oberfläche eines Trägers gebildet werden, wenn der Ligand, der spezifisch an SEQ ID NO: 1 bindet oder das Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon auf der Oberfläche beschichtet vorliegt. Normalerweise wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern der Klasse oder Klassen IgA, IgM und IgG, die die Komplexbildung stören, unter Verwendung eines solchen Formates nachgewiesen. Spezifische Antikörper der Klasse IgA können nachgewiesen werden, indem die Antikörper der Immunglobulin Klasse von Interesse, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Antikörper der Klasse oder der Klassen IgA, IgM, IgG, bevorzugt Ig, vorher isoliert werden, z.B. unter Verwendung von Protein A oder Protein G oder einen sekundären Antikörper. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit der Synthese, Selektion, und der Verwendung von Aptameren (Thiviyanathan V, Gorenstein DG. Aptamers and the next generation of diagnostic reagents. Proteomics Clin Appl. 2012;6(11-12):563-573. doi:10.1002/prca.201200042) und Antikörpern (Hust M, Frenzel A, Schirrmann T, Dübel S. Selection of recombinant antibodies from antibody gene libraries. Methods Mol Biol. 2014;1101:305-20; Hanack K, Messerschmidt K, Listek M. Antibodies and Selection of Monoclonal Antibodies. Adv Exp Med Biol. 2016;917:11-22; Harold F. Stills, in The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents, 2012) und dem Generieren und Selektieren von Antikörpern, die an spezifische Zielstrukturen binden (Lottspeich/Engels, Bioanalytic, Chapter 6 and references therein, Springer 2012) vertraut.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein Komplex umfassend ein erstes und ein zweites Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, wie beispielsweise RBD, und der nachzuweisende Antikörper in einer Flüssigphase gebildet werden, wenn der Antikörper in der Probe vorhanden ist, weil der Antikörper zwei oder mehr als zwei Bindungsstellen hat, von denen jede an ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 bindet. Jeglicher Komplex umfassend den nachzuweisenden Antikörper kann dann durch das Präzipitieren des Komplexes nachgewiesen werden, z.B. unter Verwendung eines Affinitätsliganden, der an dem ersten Polypeptid befestigt ist, wie beispielsweise Glutathion oder Biotin, und eines Bindungspartners, der auf einer Festphase beschichtet vorliegt und an den Affinitätsliganden bindet, wie GST bzw. Streptavidin, wobei die Festphase z.B. ein Bead sein kann. Jeglicher präzipitierte Komplex kann anschließend nachgewiesen werden, bevorzugt durch Nachweisen einer nachweisbaren Markierung, die an dem zweiten Polypeptid befestigt ist. Alternativ kann der Komplex auf der Oberfläche des Träger gebildet werden, wenn das erste Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon auf der Oberfläche beschichtet vorliegt. Alternativ kann das erste und das zweite Polypeptid jeweils mit zwei unterschiedlichen Markierungen markiert sein, die nur nachweisbar sind, wenn sie in enger Nähe vorliegen, z.B. wenn sie durch den nachzuweisenden Antikörper verbrückt sind. Wiederum wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern der Klasse oder der Klassen IgA, IgM und IgG nachgewiesen, es sei den Antikörper einer spezifischen Ig Klasse wurden zuvor isoliert, z.B. aus der Gruppe umfassend Antikörper der Klasse oder der Klassen IgA, IgM und IgG, bevorzugt IgA, z.B. unter Verwendung von Protein A oder Protein G, oder eines sekundären Antikörpers. Bevorzugt werden in einer Frühphase der Infektion, wenn IgG Antikörper noch nicht produziert worden sind, überwiegend oder ausschließlich IgA-Antikörper nachgewiesen werden.
Jedes Polypeptid, z. B. ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder ein sekundärer Antikörper, kann in jeder Form und in jedem Reinheitsgrad bereitgestellt werden, von Geweben, Flüssigkeiten und Zellen umfassend das Polypeptid in einer endogenen Form, bevorzugter Zellen, die das Polypeptid exprimieren, kruden oder angereicherte Lysaten solcher Zellen, bis zu aufgereinigtem und/oder isoliertem Polypeptid, das im Wesentlichen rein sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein natives Polypeptid, wo- bei der Begriff „natives Polypeptid“, wie hierin verwendet, ein gefaltetes Polypeptid bedeutet, bevorzugter ein gefaltetes Polypeptid aufgereinigt aus Zellen, noch bevorzugter aus prokaryontischen oder eukaryontischen, bevorzugt Säugetier-Zellen. Es kann eine glykosylierte Form des Polypeptides verwendet werden. Sekundäre Antikörper sind bevorzugt rein, z. B. nach Reinigung basierend auf Protein A oder Protein G als Affinitätsligand. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jegliches Polypeptid, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet oder bereitgestellt wird, in einem gefalteten Zustand verwendet oder bereitgestellt, in Abwesenheit signifikanter Konzentrationen von denaturierenden Reagenzien, wie Thiol enthaltenen Verbindungen wie beispielsweise DTT.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers der Immunglobulin-Klasse oder -Klassen IgA, IgM und/oder IgG gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird nur die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgA nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform wird nur die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgM nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform wird nur die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgG nachgewiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgA und die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgG nachgewiesen. Bevorzugt wird ein sekundärer Antikörper der Klasse IgA und ein sekundärer Antikörper gegen Antikörper der Klasse IgG verwendet oder für diesen Nachweis bereitgestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgM und die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgG nachgewiesen. Bevorzugter werden ein sekundärer Antikörper gegen Antikörper der Klasse IgM und ein sekundärer Antikörper gegen Antikörper der Klasse IgG verwendet oder für diesen Nachweis bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgM und die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgG nachgewiesen. Bevorzugter wird ein sekundärer Antikörper der Klasse IgM und ein sekundärer Antikörper gegen Antikörper der Klasse IgA für diesen Nachweis verwendet oder bereitgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers, z. B. der Immunglobulin-Klassen IgA, IgM und IgG, gegen SEQ ID NO: 1, unter Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon, nachgewiesen, aber das Polypeptid kann zusätzliche Sequenzen umfassen, bevorzugt künstliche Sequenzen z.B. Linker oder bindende Epitope. Solche zusätzlichen Sequenzen sind jedoch derart ausgewählt, dass die Fähigkeit von SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon an den nachzuweisenden Antikörper spezifisch zu binden, oder die diagnostische Zuverlässigkeit, insbesondere Sensitivität und/oder Spezifität, nicht signifikant verändert, geschweige aufgehoben wird. Z. B. sollte eine Domäne, die an SEQ ID NO: 1 oder ein Fragment davon bindet und ein Epitop maskiert, nicht mit dem Polypeptid fusioniert oder anwesend sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein sekundärer Antikörper der Immunglobuline der Klassen IgA, IgM und/oder IgG gegen ein SARS-CoV-2 Antigen nachweist, bevorzugt aus der Gruppe umfassend ein Antigen umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, ein Antigen umfassend SEQ ID NO: 30 oder eine Variante davon, ein Antigen umfassend SEQ ID NO: 31 oder eine Variante davon und ein Antigen umfassend SEQ ID NO: 33 oder eine Variante davon, bevorzugt alle davon, für die Diagnose nachgewiesen oder verwendet, bevorzugt für die Frühdiagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. Ein Antigen ausgewählt aus der Gruppe umfassend ein Antigen umfassend SEQ ID NO: 30 oder eine Variante davon, ein Antigen umfassend SEQ ID NO: 31 oder eine Variante davon und ein Antigen umfassend SEQ ID NO: 33 oder eine Variante davon, bevorzugt alle davon, kann auf einen diagnostisch nützlichen Träger beschichtet werden, bevorzugt räumlich getrennt oder in einer Mischung, und mit einer Probe zum Nachweisen eines Antikörpers kontaktiert werden, der spezifisch an das jeweilige Antigen oder die jeweiligen Antigene bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Nachweis eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 zusätzlich zu dem Nachweis eines Antikörpers gegen ein anderes SARS-CoV-2-Antigen als SEQ ID NO: 1 die Gesamtsensitivität des Assays erhöhen, insbesondere zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion in einer Frühphase oder zur Differentialdiagnose in einer Frühphase.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Produkte und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung derart konfiguriert, dass die Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 von der Anwesenheit eines Antikörpers gegen ein anderes SARS-CoV-2 Antigen oder eines oder eines weiteren Antigens, bevorzugt aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-2 N-Protein, bevorzugter aus der Gruppe umfassend SARS-CoV 2-N-Protein, SARS-CoV 2-M-Protein und SARS-CoV-2 E-Protein, am bevorzugtesten aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-2 N-Protein, SARS-CoV-2 M-Protein und SARS-CoV-2 E-Protein und SARS-CoV-2 S-Protein-Epitope, soweit nicht in SEQ ID NO: 1 vorhanden, unterschieden werden kann. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon von solchen anderen SARS-CoV-2-Antigenen oder anderen Coronavirus-Antigenen räumlich getrennt, wenn es verwendet wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 nachzuweisen. Z. B. kann das Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon rein und/oder isoliert auf einem Träger vorliegen. Z. B. kann es auf einem Blot oder Mikrotiter-Well oder Bead räumlich getrennt von anderen Antigenen vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Produkte und Verwendungen der vorliegenden Erfindung derart konfiguriert, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden kann, ohne dass bestimmt wird, ob der nachgewiesene Antikörper zu einer bestimmten Immunglobulin-Klasse gehört. Dies wird häufig als Nachweisen der „Gesamt-Antikörper“ gegen ein mehr als ein Antigen wie SEQ ID NO: 1 bezeichnet. Das Nachweisen der Gesamtantikörper, umfassend IgA und IgG, erhöht die Sensitivität des Assays, weil Antikörper der Klasse IgA, die in der Frühphase anwesend sind, und Antikörper der Klasse IgA und IgG gegen SEQ ID NO: 1 während einer Spätphase als Teil der Gesamtantikörper gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden. Bevorzugt kann ein Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 von einem Antikörper gegen ein anderes SARS-CoV-2-Antigen wie dem N-Protein (SEQ ID NO: 30) oder der S2-Domäne (SEQ ID NO: 32) unterschieden werden, bevorzugter weil andere SARS-CoV-2-Antigene abwesend sind oder räumlich getrennt sind oder ein Antikörper gegen ein solches anderes SARS-CoV-2-Antigen ein Signal abgibt, das von einem Signal unterschieden werden, welches von einem Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 abgegeben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Produkte und Verwendungen der vorliegenden Erfindungen so konfiguriert, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden kann, ohne zu bestimmen, ob der nachgewiesene Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 oder an ein anderes SARS-CoV-2-Antigen wie das N-Protein oder das S2-Protein bindet. Das kann dadurch erreicht werden, dass eine Mischung von Antigenen umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon in Kombination mit N-Protein (SEQ ID NO: 30) oder einer Variante davon oder S2-Domäne (SEQ ID NO: 32) oder eine Variante davon verwendet wird. In einer bevorzugteren Ausführungsform wird das gesamte Spike-Protein umfassend S1- und S2-Domäne (SEQ ID NO: 32) verwendet, optional in Kombination mit N-Protein (SEQ ID NO: 30). Wiederum wird die Sensitivität eines solchen Assays erhöht, weil Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 umfassend IgA und IgG, die Sensitivität des Assays erhöhen, weil Antikörper der Klasse IgA in einer Frühphase anwesend sind und Antikörper der Klassen IgA und IgG gegen SEQ ID NO: 1 in einer Spätphase als Teil der Gesamt-Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Produkte und Verwendungen der vorliegenden Erfindung so konfiguriert, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden kann, ohne dass bestimmt wird, ob der nachgewiesen Antikörper zu einer bestimmten Immunglobulinklasse gehört. Diese Vorgehensweise wird häufig als das Nachweisen der „Gesamt-Antikörper“ gegen ein oder mehr als ein Antigen wie beispielsweise SEQ ID NO: 1 bezeichnet. Das Nachweisen der Gesamt-Antikörper umfassend IgA und IgG, erhöht die Sensitivität des Tests, weil Antikörper der Klasse IgA in einer Frühphase anwesend sind und als Teil der Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden unter Verwendung eines isolierten, reinen und/oder rekombinanten Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SARS-CoV-2 N-Protein, definiert durch SEQ ID NO30, zusätzlich bestimmt, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und/oder IgM, bevorzugter IgG oder IgM, am bevorzugtesten IgG. Der erfindungsgemäße Träger kann zu diesem Zweck mit einem Polypeptid umfassend das SARS-CoV-2-N-Protein definiert durch SEQ ID NO30 oder einer Variante davon beschichtet sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen die Rezeptorbindungsdomäne (RBD), definiert durch SEQ ID NO31, nachgewiesen. Der erfindungsgemäße Träger kann zu diesem Zweck mit einem Polypeptid umfassend SEQ ID NO31 oder eine Variante davon beschichtet sein
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen die S2-Domäne, definiert durch SEQ ID NO32, von SARS-CoV-2-Spike Protein nachgewiesen. Der erfindungsgemäße Träger kann zu diesem Zweck ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO32 oder eine Variante davon umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein sekundärer Antikörper ein Antikörper, der gegen alle Antikörper von einer Antikörper- oder Immunglobulin-Klasse bindet, bevorzugt einer menschlichen Antikörper- klasse, bevorzugt IgA und/oder IgG und/oder IgM, bevorzugt IgA-Antikörper. Sekundäre Antikörper erkennen typischerweise die konstante Domäne einer solchen Klasse oder haben polyvalente Bindungsstellen gegen verschiedene Epitope verteilt über die Sequenz oder dreidimensionale Struktur, die die Antikörper der Immunglobulin-Klasse gemeinsam haben. Sekundäre Antikörper stammen typischerweise aus einem Säugetier, bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, oder von einem Vogel, bevorzugt aus Huhn, Kaninchen, Maus, Ratte, Pferd, Schwein, Esel, Ziege, Kuh oder Primat. Eine Vielzahl von ihnen ist im Handel erhältlich.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die SARS-CoV-2-Infektion in einer Frühphase mit erhöhter Sensitivität nachgewiesen werden, bevorzugt 5 oder weniger Tage nach dem Beginn der Krankheitssymptome.
Offenbart hierin ist das Evaluieren des Ergebnisses für eine Diagnose. Die Evaluierung gemäß der vorliegenden Erfindung wird ausgeführt, um zu entscheiden, ob eine Behandlung für das getestete Individuum benötigt wird. Die Evaluierung des Ergebnisses der Diagnose kann unter Beteiligung eines Arztes erfolgen, um eine geeignete Behandlung auszuwählen, wenn die Diagnose positiv war. Wichtig ist, dass die Erfindung ohne die Evaluierung an einem Ort wie in einem Land ausgeführt werden kann und die Evaluierung der Ergebnisse der Diagnose an einem anderen Ort ausgeführt werden kann. Offenbart hierin ist weiter die Weitergabe des Ergebnisses der Diagnose und die Evaluierung an einem anderen Ort. Diese bevorzugte Ausführungsform betrifft Fälle, wo die Erfindung, optional, umfassend die Evaluierung, an einem Ort wie in einem Land ausgeführt wird und die Ergebnisse der Diagnose bzw. der Evaluierung an einen anderen Ort wie an ein anderes Land weitergegeben werden. Die Weitergabe kann durch jegliches Mittel erfolgen, das dem Fachmann zur Verfügung steht. Dies umfasst die elektronische Weitergabe der Daten genauso wie die faktische Weitergabe von ausgelesenem Material. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann insbesondere der Arzt oder die Klinik, die den Patienten behandeln, im Falle eines positiven Ergebnisses die angemessenen Schritte für eine erfolgreiche Behandlung durchführen. Der diagnostisch nützliche Träger bereitgestellt ist bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die einen Glasträger, bevorzugt zur Mikroskopie, ein Biochip, ein Mikroarray, eine Mikrotiterplatte, eine Lateral-Flow-Vorrichtung, ein Teststreifen, eine Membran, bevorzugt einen Lineblot, eine Chromatographie-Säule und einen Bead umfasst, bevorzugt eine Mikrotiterplatte.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem diagnostisch nützlichen Träger um einen Lineblot (Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65; WO2013041540 ). In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Lineblot“, wie hierin verwendet, ein Teststreifen, bevorzugter membranbasiert, der mit einem oder mehr als einem Mittel zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers beschichtet wurde, von denen jedes bevorzugt ein Polypeptid ist. Wenn zwei oder mehr Mittel verwendet werden, liegen sie bevorzugt räumlich getrennt auf dem Träger vor. Bevorzugt beträgt die Breite solcher Banden wenigstens 30, bevorzugter 40, 50, 60, 70 oder 80 % der Breite des Teststreifens. Der Lineblot kann eine oder mehr als eine Kontrollbande zum Bestätigen umfassen, dass er mit einer Probe ausreichend lang und unter geeigneten Bedingungen kontaktiert wurde, insbesondere in Anwesenheit von menschlichem Serum bzw. mit einem sekundären Antikörper. Ein Linienblot wurde bevorzugt au seiner Nitrozellulosemembran hergestellt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem diagnostisch nützlichen Träger um einen Bead. Verschiedene Beads für zahlreiche Anwendungen sind im Handel erhältlich, hauptsächlich basierend auf Kohlenhydrat, z. B. Sepharose oder Agarose, oder Plastik. Sie umfassen aktive oder aktivierbare chemische Gruppen wie eine Carboxyl- oder Tosyl- oder Estergruppe, die für die Immobilisierung eines Mittels zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers verwendet werden können. Bevorzugt haben die Beads einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 µm bis 10 µm, von 0,5 µm bis 8 µm, von 0,75 µm bis 7 µm oder von 1 µm bis 6 µm. Die Beads können mit dem Mittel zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers direkt oder über Affinitätsliganden beschichtet werden, z. B. Biotin oder Glutathion und Streptavidin und GST. Z.B. kann der Bead mit Biotin oder Glutathion beschichtet sein und das Antigen kann mit Streptavidin bzw. Glutathion- S-Transferase oder einer Variante davon fusioniert sein. Bevorzugt wird der Bead in Form einer wässrigen Lösung bereitgestellt, die einen Beadgehalt von 10 bis 90 %, bevorzugt von 20 bis 80 %, bevorzugt von 30 bis 70 %, bevorzugter von 40 bis 60 % (w/w) aufweist. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit solchen Beads vertraut (Diamindis, E. P., Chriopoulus, T. K., Immunoassays, 1996, Academic Press), die im Handel erhältlich sind, z.B. Bio-Plex COOH-Beads, MC10026-01 oder 171-506011 von Bio-Rad.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Beads magnetische Beads, die leicht mit Hilfe eines Magneten an einer Oberfläche konzentriert werden können. Zu diesem Zweck enthalten im Handel erhältliche magnetische Beads gewöhnlich ein magnetisches Mineral, z. B. Eisenoxid. Eine Vielzahl von geeigneten magnetischen Beads ist im Handel erhältlich. Ein Bead kann mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein magnetischer Bead in einem Puffer durch Anlegen eines magnetischen Feldes, um die Beads zu konzentrieren und zu immobilisieren, verwendet und gewaschen oder inkubiert, gefolgt vom Entfernen des vorhandenen Puffers und Hinzugabe von neuem Puffer. Das magnetische Feld kann dann abgestellt werden, um das Suspendieren der Beads in dem neuen Puffer effizienter zu gestalten. Ein Puffer kann jegliche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Lösung sein, umfassend eine verdünnte Patientenprobe, einen Inkubationspuffer oder einen Puffer umfassend einen sekundären Antikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper unter Verwendung einer chemilumineszenzfähigen Markierung nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein chemilumineszenzfähiges Enzym, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Luciferase, Peroxidase, alkalische Phosphatase und β-Galactosidase oder eine Variante davon, das oder die ein chemilumineszenzfähiges Substrat umsetzen kann, ohne dabei selbst verbraucht zu werden (Kricka, L. J. (2003). Clinical applications of chemilumi- nescence. Analytica chimica acta, 500(1): 279-286). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die chemilumineszenzfähige Markierung eine kleine organische Verbindung, die keine enzymatische Aktivität mit Hinblick auf das Katalysieren einer Chemilumineszenz-Reaktion aufweist, die ein Chemilumineszenz-Signal aussendet und abgebaut wird, wenn sie mit einer Chemilumineszenz-Substratlösung kontaktiert wird, die anorganische und/oder nicht-enzymatische organische Verbindungen enthält, welche für das Aussenden des Signals erforderlich sind. Bevorzugt ist die kleine organische Verbindung ohne enzymatische Aktivität aus der Gruppe ausgewählt, die Acridinium-Ester (Weeks, I., Beheshti, I., McCapra, F., Campbell, A. K., Woodhead, J. S. (1983) Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay. Clin Chem 29: 1474-1479) und Luminol oder ein chemilumineszenzfähiges Derivat davon, wie beispielsweise Isoluminol, umfasst. Solche kleinen organischen Verbindungen können an einen sekundären Antikörper gekoppelt sein. Im Falle von Luminol umfasst die Substratlösung H2O2 bei hohem pH-Wert. Im Falle eines Acridinium-Esters wird häufig eine Mischung aus H2O2 und Natriumhydroxid verwendet. Die kleine organische Verbindung wird beim Aussenden des Chemilumineszenz-Signals verbraucht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Chemilumineszenz der chemilumineszenzfähigen Markierung 1 bis 60 Sekunden, bevorzugt 2 bis 20 Sekunden, noch bevorzugter 3 bis 15 Sekunden lang nach dem Auslösen der Chemilumineszenz-Nachweisreaktion nachgewiesen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Chemilumineszenz der chemilumineszenzfähigen Markierung wenigstens 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 oder 3 Sekunden, bevorzugt 3 bis 15, bevorzugter 5 bis 10 Sekunden lang nachgewiesen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger eine Mikrotiterplatte umfassend wenigstens 8 Wells, die für einen ELISA verwendet werden können. Wenigstens eines der Wells ist mit dem Mittel zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers, entweder direkt oder indirekt, bevorzugt einem Polypeptid um- fassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, beschichtet. Wenigstens 3, bevorzugt 4, noch bevorzugter 5 Kalibratoren, mit definierten Konzentrationen, können verwendet werden, um eine Kalibrationskurve für eine semiquantitative Analyse aufzustellen. Es können die Kalibratoren parallel zu den Proben prozessiert und entwickelt werden. Ein sekundärer Antikörper umfassend eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine enzymatisch aktive Markierung, kann bereitgestellt werden, z. B. eine Markierung mit Meerettich-Peroxidase-Aktivität oder alkalischer Phosphatase-Aktivität oder einem Enzym, das chemilumineszenzfähig ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein Mikroarray. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Mikroarray“, wie hierein verwendet, ein Chip, auf dem eine Vielzahl räumlich getrennter Antigene gespottet sind, bevorzugt wenigstens 20, bevorzugt 30, 40, 50, 80 oder 100. Bevorzugt ist jedes Antigen ein Peptid umfassend oder bestehend aus 5 bis 25, bevorzugt 7 bis 15 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die ein Fragment von SEQ ID NO: 1 umfassen, bevorzugt die RBD (SEQ ID NO: 31). Ein sekundärer Antikörper umfassend eine Markierung, bevorzugt eine fluoreszenzfähige Markierung, kann für den Nachweis verwendet werden. Bevorzugt sind auch andere Antigene gespottet, bevorzugter aus der Gruppe von Polypeptiden umfassend SEQ ID NO: 30 (SARS-CoV-2-N-Protein) und SEQ ID NO: 33 (SARS-CoV-2-S2-Protein). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Glasträger verwendet, der auf einem oder ein Teil eines Trägers für eine mikroskopische Immunfluoreszenzanalyse ist. Eine Zelle, bevorzugt eine eukaryontische Zelle wie eine HEK293-Zelle befindet sich auf dem Träger. Sie kann mit einem Deckmedium bedeckt sein. Verschiedene Zusammensetzungen und Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in „Mountants and Antifades", published by Wright Cell Imaging Facility, Toronto Western Research Institute University Health Network (https://de.scribd.com/document/47879592/Mountants-Antifades), Krenek et al. (1989) Comparison of antifading agents used in immunofluorescence, J. Immunol. Meth 117, 91-97 and Nairn et al. (1969) Microphotometry in Immunofluorescence, Clin. Exp. Immunol. 4, 697-705. Die Zelle exprimiert, bevorzugt überexprimiert ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon. Der Träger kann eine zum Schein transfizierte Zelle umfassen, die mit dem gleichen Vektor wie die Zelle, die ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon überexprimiert, transfiziert ist, aber ohne die Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert. Eine solche zum Schein transfizierte Zelle kann als Negativ-Kontrolle dienen. Eine weitere Zelle kann ein weiteres Coronavirus umfassen, bevorzugt SARS, bevorzugter SARS-CoV-2-Antigen, z. B. N-Protein, S2-Protein oder RBD, um einen Antikörper nachzuweisen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Immunfluoreszenz verwendet werden, um ein Antikörper nachzuweisen. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit dem Verfahren vertraut (Storch, W. B., Immunofluorescence in Clinical Immunology: A Primer and Atlas, Birkhäuser, 2000; Wesseling JG, Godeke GJ, Schijns VE, Prevec L, Graham FL, Horzinek MC, Rottier PJ. Mouse hepatitis virus spike and nucleocapsid proteins expressed by adenovirus vectors protect mice against a lethal infection. J Gen Virol. 1993 Oct;74 (Pt 10):2061-9. doi: 10.1099/0022-1317-74-10-2061. PMID: 8409930.). Kurz gesagt, wird ein Antigen, bevorzugt ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, auf einem Träger immobilisiert, welcher eine Zelle exprimierend dem Antikörper sein kann und mit einer Probe kontaktiert. Gefolgt vom Nachweis des Antikörpers der nachzuweisen ist über Fluoreszenz, bevorzugt under Verwendung eines Mittels zum Nachweisen des Antikörpers markiert mit einer fluoreszenzfähigen Markierung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine eukaryotische, die das Polypeptid überexprimiert, wie eine Zelle die aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend HEK, Hela, CHO und Jurkat-Zellen und Derivate davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine rekombinante Zelle, die das Polypeptid überexprimiert, welches bevorzugt unter der Kontrolle eines heterologen starken Promotors steht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Lateral-Flow-Vorrichtung verwendet, um ein Antikörper nachzuweisen, der Fachmann auf dem Gebiet ist mit Lateral-Flow-Vorrichtungen für diesen Zweck vertraut (Lateral Flow Immunoassay, edited by Raphael Wong, Harley Tse, 2009, Springer; Paperbased diagnostics: Current Status and Future applications, Kevin J. Land, Springer 2019). Kurz gesagt, kann eine Lateral-Flow-Vorrichtung auf eine Membran wie einer Nitrozellulosemembran basieren, die ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon umfassend eine nachweisebare Markierung umfasst. Wenn die Membran mit einer Probe kontaktiert wird, wird ein nachzuweisender Antikörper gegen das Antigen binden. Der sich daraus ergebende Komplex wird sich dann über Kapillarkräfte an der Membran entlangbewegen und wird auf eine Testbande immobilisiert, die ein Mittel zum Nachweisen des Antikörpers umfasst, typischerweise ein sekundärer Antikörper, der an die Immunglobulin-Klasse oder -Klassen des Antikörpers oder der Antikörper bindet, der oder die nachzuweisen sind, wie beispielsweise IgG und/oder IgA und/oder IgM. Bevorzugt werden Nanopartikel oder Beads als Markierung verwendet, z.B. Gold-Nanopartikel oder Latex-Beads.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein bereitgestelltes Polypeptid, bevorzugt das Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, ein rekombinantes Protein sein, wobei der Begriff „rekombinant“, wie hierin verwendet, ein Polypeptid bedeutet, das bei irgendeiner Stufe des Produktionsprozesses unter Verwendung von gentechnischen Methoden hergestellt wurde, z. B. durch Fusionieren einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, an einen starken Promoter zur Überexpression in Zellen oder Geweben oder durch Verändern der Sequenz des Polypeptides selbst. Der Fachmann ist mit Verfahren zum gentechnischen Verändern von Nukleinsäuren und Polypeptiden, für die sie kodieren, vertraut (z. B. beschrieben in Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH or in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) und zum Herstellen und Aufreinigen von nativen oder rekombinanten Polypeptiden (z. B. Handbücher „Strategies for Protein Purification", „Antibody Purification", published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R. , Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein isoliertes Polypeptid, wobei der Begriff „isoliert“ bedeutet, dass das Polypeptid im Vergleich zu seinem Zustand bei der Produktion unter Verwendung eines biotechno- logischen oder synthetischen Ansatzes angereichert ist und bevorzugt rein ist, das heißt wenigstens 60, 70, 80, 90, 95 oder 99 Prozent des Polypeptides in der jeweiligen Flüssigkeit besteht aus dem Polypeptid, wie beurteilt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Coomassie-Blue-Färbung und Betrachtung mit dem Auge. Bevorzugt ist jedes Polypeptid auf einem Träger, der als Mittel zum Einfangen eines Antikörpers verwendet wird, rein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine nachweisbare Markierung verwendet, um einen Antikörper erfindungsgemäß nachzuweisen, wobei es sich um eine Markierung handelt, die verwendet werden kann, um eine Population von Molekülen von anderen unter Verwendung biophysikalischer Nachweisverfahren zu unterscheiden. Sie bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend eine fluoreszenzfähige eine radioaktive eine chemilumineszenzfähige Markierung ein Schwermetall wie eine Goldmarkierung, ein Nanopartikel, ein Bead oder eine enzymatisch aktive Markierung, bevorzugt eine, die eine kolorimetrische Reaktion katalysiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine fluoreszenzfähige Markierung aus der Gruppe ausgewählt, die Alexa-Farbstoffe, FITC, TRITC und grünes fluoreszentes Protein (GFP) umfasst. Iod-125 kann als radioaktive Markierung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine enzymatisch aktive Markierung aus der Gruppe ausgewählt, die Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, beta-Galaktosidase, alkalische Phosphatase und Luciferase umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist in der Lage, geeignete Markierungen auszuwählen und sie an Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Molekülen zu befestigen (Hassanzadeh L, Chen S, Veedu RN. Radiolabeling of Nucleic Acid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging. Pharmaceuticals (Basel). 2018;11(4):106. Published 2018 Oct 15. doi:10.3390/ph11040106 Hassanzadeh L, Chen S, Veedu RN. Radiolabeling of Nucleic Acid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging. Pharmaceuticals (Basel). 2018;11(4):106. Published 2018 Oct 15. doi:10.3390/ph11040106, Bioconjugate Techniques, 3rd Edition (2013) by Greg T. Hermanson, Obermaier C, Griebel A, Westermeier R. Principles of protein labeling techniques. Methods Mol Biol. 2015;1295:153-65), und eine Vielzahl von markierten Molekülen sind im Handel erhältlich.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit von Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein sekundärer Antikörper umfassend eine nachweisbare Markierung verwendet werden, um Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA und/oder IgG und/oder IgM, bevorzugt IgA nachzuweisen, bevorzugt gegen SEQ ID NO: 1 und ein weiteres Coronavirus-Antigen. Ein Protein mit Peroxidase-Aktivität kann als enzymatisch aktive Markierung verwendet werden. Bevorzugt erkennt der sekundäre Antikörper Säugetier, noch bevorzugter menschliche Antikörper. Wenn Antikörper aus mehr als einer Ig-Klasse nachzuweisen sind, können zwei sekundäre Antikörper verwendet werden, bevorzugt einer, der an Antikörper der Klasse IgA bindet und einer der Antikörper der Klasse IgG bindet. Die beiden sekundären Antikörper können in einer Mischung oder separat vorliegen, bevorzugt separat, um einen separaten Nachweis von Antikörpern aus unterschiedlichen Ig-Klassen wie beispielsweise Antikörper der Klassen IgA, IgM und IgG zu gestatten, bevorzugt IgG und IgA, z.B. um Informationen zum Verlauf der Krankheit zu gewinnen, basierend auf der Tatsache, dass Antikörper der Klasse IgA in vielen Patienten früher erscheinen als Antikörper der Klasse IgG. Alternativ kann ein Sekundärantikörper verwendet werden, der Antikörper aus mehr als einer Ig-Klasse bindet, wie beispielsweise aus der Gruppe umfassend Antikörper der Klasse oder Klassen IgG, IgA und IgM, bevorzugt einer, der gegen IgG und IgA bindet. Ein sekundärer Antikörper kann ein polyklonaler oder rein monoklonaler Antikörper sein. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der Antikörper aus einem Säugetier bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, aber bindet an menschliche Antikörper einer bestimmten Immunglobulin-Klasse, bevorzugt IgA, IgG und/oder IgM. Der Fachmann ist mit der Herstellung und Verwendung sekundärer Antikörper vertraut (Kalyuzhny, A., Immunohistochemistry, Essential Elements and Beyound, Springer, 2017, in particular chapter 4; Howard, G. C., and Bethell, D. R., Basic Methods in Antibody Production and Characterization, 2000, CRC press). Eine Vielzahl sekundärer Antikörper, optional mit Markierungen wie einer fluoreszenzfähigen Markierung, sind im Handel erhältlich, z.B. FITC-markierte sekundäre Antikörper Cat # H15101, Cat # 62-8411, Cat # A24459, mit Meerrettichperoxidase markierte sekundäre Antikörper Cat # 31420, Cat # SA1-35467, Cat # SA1-35467, Cat # SA1-35467 und andere von Thermo Fisher. Markierte Fragmente von sekundären Antikörpern oder Aptamere können alternativ verwendet werden. Der Fachmann ist mit der Synthese, Selektion und Verwendung von Aptameren vertraut, die auch als Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 verwendet werden können, z. B. wenn sie spezifisch an nachzuweisende Antikörper binden, bevorzugt IgG und/oder IgA und/oder IgM Antikörper (Thiviyanathan V, Gorenstein DG. Aptamers and the next generation of diagnostic reagents. Proteomics Clin Appl. 2012;6(11-12):563-573. doi:10.1002/prca.201200042) und mit der Generierung spezifischer Antikörper (Hust M, Frenzel A, Schirrmann T, Dübel S. Selection of recombinant antibodies from antibody gene libraries. Methods Mol Biol. 2014; 1101:305-20; Hanack K, Messerschmidt K, Listek M. Antibodies and Selection of Monoclonal Antibodies. Adv Exp Med Biol. 2016;917:11-22; Harold F. Stills, in The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents, 2012). Solche Aptamere können spezifisch an die konstante Region oder Epitope an anderen Stellen des Antikörpers oder der Antikörper binden, der oder die nachzuweisen sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein Polypeptid umfassen SEQ ID NO: 1 und eine Variante davon, bevorzugt die Rezeptorbindungsdomäne (SEQ ID NO: 31) verwendet werden als Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1. Genauer kann das Polypeptid auf einen diagnostisch nützlichen Träger als Beschichtung aufgebracht und verwendet werden, um jeglichen nachzuweisenden Antikörper einzufangen. Weil menschliche Antikörper mehr als eine Bindestelle haben, kann nur eine Antigen-Bindungsstelle von einem eingefangenen Antikörper besetzt werden. Die nachfolgende Zugabe eines anderen Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, das nicht als Beschichtung auf dem Träger vorliegt, kann zur Besetzung einer weiteren Bindestelle durch dieses neu hinzugegebene Polypeptid führen. Der Komplex umfasst dann ein als Beschichtung vorliegendes Polypeptid, den nachzuweisenden Antikörper und das andere Polypeptid und kann nachgewiesen werden. Bevorzugt weist das andere Polypeptid eine nachweisbare Markierung auf, und die wird verwendet, um den Komplex nachzuweisen. In dieser Ausführungsform werden alle Antikörper, genauer Antikörper der Klassen IgA, IgM und IgG, nachgewiesen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 39 (ACE2) oder eine Variante davon, die an die Rezeptorbindungsdomäne in SEQ ID NO: 1 bindet, optional in Kombination mit einem Polypeptid umfassend in SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, die an den ACE2-Rezeptor bindet, als Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 verwendet. Das kompetitive Testformat wird dann verwendet, um seine Anwesenheit festzustellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden spezifische Proteine, die an bestimmte Immunglobulin-Klassen binden, mit nachweisbaren Markierungen markiert und als Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1 verwendet. Z.B. sind die Proteine G, A und L bakterielle Protein, die gegen Antikörper der Klasse IgG binden (L. Bjorck, G. Kronvall: Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. In: Journal of Immunology. 133(2)/1984.), wohingegen Jacalin (Abcam, ThermoFisher) verwendet werden kann, um gegen Antikörper der Klasse IgA zu binden (siehe z.B. Choe et al., Materials (Basel). 2016 Dec; 9(12): 994; Wilkinson & Neville Vet Immunol Immunopathol. 1988 Mar;18(2):195-8).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon, bevorzugt in Form einer Beschichtung auf einem diagnostisch nützlichen Träger, bevorzugter einer Mikrotiterplatte, und weiter ein oder mehr als ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen Kalibrator, eine Positiv-Kontrolle, eine Negativ-Kontrolle, einen Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klasse oder - Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugt einen sekundärer Antikörper, der spezifisch an Antikörper bindet, bevorzugter Antikörper der Immunglobulin-Klasse oder -Klassen IgA, IgM und/oder IgG, wobei der sekundäre Antikörper eine nachweisbare Markierung umfassen kann, einen Probenpuffer, eine Nachweislösung, bevorzugt eine Chromogen-/Substrat-Lösung, eine Stop-Lösung und eine Schutzfolie.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Kalibrator ein Reagenz das an eine Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon bindet und bevorzugt von sekundären Antikörpern erkannt wird, die Antikörper der Immunglobulin-Klasse oder -Klassen IgA, IgM, und/oder IgG binden. Der Kalibrator kann ein Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO: 1 sein. Alternativ kann der Kalibrator ein chimärer Antikörper sein, der bevorzugt die konstante Region oder Regionen oder Epitope hat, die er gemeinsam mit spezifischen Immunglobulin-Klassen hat, bevorzugt IgA und/oder IgG und/oder IgM enthalten, sowie eine variable Region, insbesondere eine Bindungsstelle, die von einem künstlichen Antikörper abgeleitet ist. Der Fachmann ist mit der Gestaltung, Produktion und Verwendung solcher Kalibratoren vertraut (Lütkecosmann S, Faupel T, Porstmann S, Porstmann T, Micheel B, Hanack K. A cross-reaktive monoclonal antibody as universal detection antibody in autoantibody diagnostic assays. Clin Chim Acta. 2019 Dec;499:87-92. doi: 10.1016/j.cca.2019.09.003. Epub 2019 Sep 4. PMID: 31493374, Hackett J Jr, Hoff-Velk J, Golden A, Brashear J, Robinson J, Rapp M, Klass M, Ostrow DH, Mandecki W. Recombinant mouse-human chimeric antibodies as calibrators in immunoassays that measure antibodies to Toxoplasma gondii. J Clin Microbiol. 1998 May;36(5):1277-84. doi:, WO2009081165A1 ). In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Positiv-Kontrolle eine Lösung umfassend eine Verbindung wie ein Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Antikörper der Klasse oder Klassen IgA, IgG und IgM, bevorzugter IgA, aus einer Probe von einem Patienten, der unter SARS-CoV-2 leidet, in einer Menge, dass ein positives Ergebnis unter Verwendung der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann. Eine Negativ-Kontrolle ist ein Reagenz dem eine solche Verbindung fehlt und könnte Serum von einer gesunden Person umfassen. Ein Waschpuffer kann verwendet werden, um den Träger wie eine Mikrotiterplatte nach der Inkubation zu waschen, um unspezifische Antikörper zu entfernen, und könnte PBS sein. Das Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers könnte ein sekundärer Antikörper sein, der gegen die nachzuweisende Antikörperklasse bindet, bevorzugt menschliche Antikörper der Klasse oder der Klassen IgA, IgM und/oder IgG, und ist mit einer nachweisbaren Markierung markiert, bevorzugt mit einem Enzym, bevorzugter mit einem Enzym mit Peroxidase-Aktivität. Der Probenpuffer kann verwendet werden um Patientenproben zu verdünnen und kann PBS sein. Die Nachweislösung kann in Anwesenheit des markierten sekundären Antikörpers ein Signal erzeugen und ist bevorzugt eine farbentwickelnde Lösung und noch bevorzugter 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin/H₂O₂. Die Stoplösung kann zur Reaktion gegeben werden, um die Reaktionen der Nachweislösung anzuhalten und kann eine starke Säure enthalten, bevorzugt 0.5 M Schwefelsäure. Die Schutzfolie kann oben auf dem Träger wie einer Mikrotiterplatte platziert werden, um Verdunstung zu verhindern. Jegliches gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Reagenz kann ein Konservierungsmittel enthalten, z.B. Azid.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1 oder einer Variante davon oder ein Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt ein Antikörper der Klasse IgA, zur Herstellung eines diagnostischen Kits bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid oder der Antikörper als einer der Bestandteile eines solchen Kits verpackt. Das Polypeptid oder der Antikörper kann verwendet werden, um die Qualität bei der Herstellung des Kits zu Überprüfen. Z.B. kann der Antikörper als Positiv-Kontrolle verwendet werden, um die Reaktivität eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1, das ein Bestandteil des Kits ist, entweder separate oder beschichtet auf einem diagnostisch nützlichen Träger, zu bestätigen. Das Polypeptid kann verwendet werden, um die Reaktivität eine Antikörpers zu bestätigen, der spezifisch an SEQ ID NO: 1 bindet und Teil des Kits ist. Das Polypeptid kann verwendet werden um einen diagnostisch nützlichen Träger als Teil der Herstellung zu beschichten. Sowohl das Polypeptid, als auch der Antikörper können verwendet werden, um die Konzentration des Antikörpers bzw. Polypeptides in gepufferten Lösungen zu bestimmen, die verwendet werden, um den Träger oder Kit herzustellen, und zu überprüfen, ob eine Zelle ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 1 exprimiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt Antikörper gegen der Klasse IgA, zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion oder zur Differentialdiagnose gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Verwendung kann das Nachweisen des Antikörpers selbst oder in Kombination mit anderen Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 oder Antikörpern gegen andere SARS-CoV-2-Antigene umfassen, so dass die Gesamtsensitivität des diagnostischen Tests erhöht wird. In einer bevorzugteren Ausführungsform, wird ein Antikörper der Klasse IgA verwendet, um die Sensitivität eines diagnostischen Assays zu erhöhen, besonders in einer Frühphase der Infektion. Das kann dadurch erreicht werden, dass nicht nur Antikörper der Klasse IgG, sondern auch der Klasse IgA nachgewiesen werden optional auch Antikörper der Klasse gegen IgM, gegen SEQ ID NO: 1 oder nur IgA. Eine bevorzugteren Ausführungsform wird ein IgG und ein Antikörper der Klasse IgG verwendet, um die Sensitivität eines diagnostischen Tests zu erhöhen, besonders über eine Zeitspanne, in der ein Nachlassen der Konzentration von Antikörpern gegen andere Antigene zu verzeichnen ist, z.B. Antikörper der Klasse IgG gegen das End-Protein von SARS-CoV z.B. während der Spätphase einer SARS-CoV-2-Infektion. Dies kann erreicht werden, indem nicht nur Antikörper der Klasse IgG- sondern auch IgA nachgewiesen werden, optional auch Antikörper der Klasse IgM gegen SEQ ID NO: 1 oder nur IgG. In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper für die Diagnose verwendet werden durch Kalibrieren einer Vorrichtung oder eines Tests unter Verwendung eines Kalibrators umfassend den Antikörper, bevorzugt ein Antikörper der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugt alle. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse oder Klassen IgA und/oder IgG verwendet, um die Sensitivität in einer Spätphase der Immunisierung zu erhöhen. Dieser Antikörper kann für die Validierung eines Assays zur Kalibration, zum Bestätigen der Qualität von Reagenzien oder Testmaterialien wie einem diagnostisch nützlichen Träger oder als eine Positiv-Kontrolle verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon oder ein Antikörper gegen SEQ ID NO: 1, bevorzugt ein Antikörper der Klasse IgA zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet, bevorzugt für die Diagnose von SARS-CoV-2, wobei ein Antikörper der Klasse IgA, der spezifisch an SEQ ID NO:1 bindet, nachgewiesen wird.
Eine Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO:1, bevorzugt der Klasse oder Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugter IgA, zum Erhöhen der Sensitivität des Nachweises einer SARS-CoV-2-Infektion, bevorzugt in einer Frühphase der Infektion, bevorzugter fünf oder weniger Tage nach Ausbruch der Krankheitssymptome. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Verwendung in einer Spätphase der Infektion sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgA, IgM und IgG gegen SEQ DI NO1 nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Reihe von neuen Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen, umfassend insbesondere die Sequenzen, im Folgenden und/oder in Sequenzprotokoll beschrieben sind, und diese sind ein Teil der vorliegenden Beschreibung. Es wird verstanden, dass im Falle eines Konfliktes zwischen jeglicher Sequenz die hier unten gezeigt wird und der entsprechenden Sequenz im Sequenzprotokoll die vorliegende Erfindung spezifisch und individuell beide der entsprechenden Sequenzen entsprechen kann, d.h. die hierin unten beschriebene Sequenz und auch die im Sequenzprotokoll beschriebene Sequenz.

SEQ ID NO: 1 (SARS-CoV-2 S1 Domäne vom S-Protein)
 VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPV
 LPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSW
 MESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGF
 SALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVD
 CALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRIS
 NCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPD
 DFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSY
 GFQPTNGVGYQPYRVWLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPF
 QQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTP
 TWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR

 SEQ ID NO: 2 (SARS-CoV-2 S1 Domäne vom-S Protein mit C-terminalem His-Tag, wie
 exprimiert in Zellen für das Beispiel)
 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIH
 VSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCND
 PFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYS
 KHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRT 
 FLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNA
 TRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAP
 GQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC
 NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLT
 GTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVN
 CTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRA
 RLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO: 3 (SARS-CoV-2 S1 Domäne vom S Protein, mit C-terminalem His-Tag, wie nach
 Abspaltung des Signalpeptides, verwendet in den Beispielen)
 VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPV
 LPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSW
 MESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGF
 SALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVD
 CALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRIS
 NCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPD
 DFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSY
 GFQPTNGVGYQPYRVWLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPF
 QQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTP
 TWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO: 4 (SARS-CoV-2 S1 Domäne vom S Protein, Nukleotidsequenz kodierend SEQ ID
 NO: 2) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 5 (mögliches SARS-CoV-2 S1 Epitop) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 6 (S1[MERS_CoV]) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 7 (S1[HCoV-229E]) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 8 (S1[HCoV-OC43]) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 9 (S1[HCoV-HKU1]) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 10 (S1[HCoV-NL63]) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 11 (S1[SARS_CoV]) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 12 (Fragment von SEQ ID NO: 1) - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 13 (Genom vom SARS-CoV-2-Isolat-Wuhan-Hu-1 Genom, identisch zu Genbank
 MN908947): [NUR IM SEQUENZPROTOKOLL]
 ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCT
 AAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAAT
 TAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGG
 TTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAA
 GATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTAC
 AGGTTCGCGACGTGCTCGTACGTGGCTTTGGAGACTCCGTGGAGGAGGTCTTATCAGAGGCACG 
 TCAACATCTTAAAGATGGCACTTGTGGCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGA
 ACAGCCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTG
 AGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGT
 CCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAG
 GAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTGGCAC
 TGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTAAACATAGCAGTGGTGTTACCCGTGAACT
 CATGCGTGAGCTTAACGGAGGGGCATACACTCGCTATGTCGATAACAACTTCTGTGGCCCTGATG
 GCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAGCACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCC
 GAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAAT
 TGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGC
 AAAGAAATTTGACACCTTCAATGGGGAATGTCCAAATTTTGTATTTCCCTTAAATTCCATAATCAAG
 ACTATTCAACCAAGGGTTGAAAAGAAAAAGCTTGATGGCTTTATGGGTAGAATTCGATCTGTCTAT
 CCAGTTGCGTCACCAAATGAATGCAACCAAATGTGCCTTTCAACTCTCATGAAGTGTGATCATTGT
 GGTGAAACTTCATGGCAGACGGGCGATTTTGTTAAAGCCACTTGCGAATTTTGTGGCACTGAGAA
 TTTGACTAAAGAAGGTGCCACTACTTGTGGTTACTTACCCCAAAATGCTGTTGTTAAAATTTATTGT
 CCAGCATGTCACAATTCAGAAGTAGGACCTGAGCATAGTCTTGCCGAATACCATAATGAATCTGG
 CTTGAAAACCATTCTTCGTAAGGGTGGTCGCACTATTGCCTTTGGAGGCTGTGTGTTCTCTTATGT
 TGGTTGCCATAACAAGTGTGCCTATTGGGTTCCACGTGCTAGCGCTAACATAGGTTGTAACCATA
 CAGGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCGAAGGTCTTAATGACAACCTTCTTGAAATACTCCAAAAAGAG
 AAAGTCAACATCAATATTGTTGGTGACTTTAAACTTAATGAAGAGATCGCCATTATTTTGGCATCTT
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 TTGTTGAATCCTGTGGTAATTTTAAAGTTACAAAAGGAAAAGCTAAAAAAGGTGCCTGGAATATTG
 GTGAACAGAAATCAATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTGCATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTACGAT
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 CAATACTAGATGGAATTTCACAGTATTCACTGAGACTCATTGATGCTATGATGTTCACATCTGATTT
 GGCTACTAACAATCTAGTTGTAATGGCCTACATTACAGGTGGTGTTGTTCAGTTGACTTCGCAGTG
 GCTAACTAACATCTTTGGCACTGTTTATGAAAAACTCAAACCCGTCCTTGATTGGCTTGAAGAGAA
 GTTTAAGGAAGGTGTAGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGAAATTGTTAAATTTATCTCAACCTGTGC
 TTGTGAAATTGTCGGTGGACAAATTGTCACCTGTGCAAAGGAAATTAAGGAGAGTGTTCAGACAT
 TCTTTAAGCTTGTAAATAAATTTTTGGCTTTGTGTGCTGACTCTATCATTATTGGTGGAGCTAAACT
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 GAGAAACACTTCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGAAGTTGTCTTGAAAACTGGTGATTTACAACCAT
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 AGAAGTGCAAGGTTACAAGAGTGTGAATATCACTTTTGAACTTGATGAAAGGATTGATAAAGTACT
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 TGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATT
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 ATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGT 

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 GAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTT
 AGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAA
 AGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAAACATGGAGGAGGTGTTGCA
 GGAGCCTTAAATAAGGCTACTAACAATGCCATGCAAGTTGAATCTGATGATTACATAGCTACTAAT
 GGACCACTTAAAGTGGGTGGTAGTTGTGTTTTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCAT
 GTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGAAGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTT
 AATCAGCACGAAGTTCTACTTGCACCATTATTATCAGCTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTATACAT
 TCTTTAAGAGTTTGTGTAGATACTGTTCGCACAAATGTCTACTTAGCTGTCTTTGATAAAAATCTCT
 ATGACAAACTTGTTTCAAGCTTTTTGGAAATGAAGAGTGAAAAGCAAGTTGAACAAAAGATCGCTG
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 AAGATGATAAGAAAATCAAAGCTTGTGTTGAAGAAGTTACAACAACTCTGGAAGAAACTAAGTTCC
 TCACAGAAAACTTGTTACTTTATATTGACATTAATGGCAATCTTCATCCAGATTCTGCCACTCTTGT
 TAGTGACATTGACATCACTTTCTTAAAGAAAGATGCTCCATATATAGTGGGTGATGTTGTTCAAGA
 GGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGA
 AAGCTTTGAGAAAAGTGCCAACAGACAATTATATAACCACTTACCCGGGTCAGGGTTTAAATGGTT
 ACACTGTAGAGGAGGCAAAGACAGTGCTTAAAAAGTGTAAAAGTGCCTTTTACATTCTACCATCTA
 TTATCTCTAATGAGAAGCAAGAAATTCTTGGAACTGTTTCTTGGAATTTGCGAGAAATGCTTGCAC
 ATGCAGAAGAAACACGCAAATTAATGCCTGTCTGTGTGGAAACTAAAGCCATAGTTTCAACTATAC
 AGCGTAAATATAAGGGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGTGCTAGATTTTACTTTT
 ACACCAGTAAAACAACTGTAGCGTCACTTATCAACACACTTAACGATCTAAATGAAACTCTTGTTA
 CAATGCCACTTGGCTATGTAACACATGGCTTAAATTTGGAAGAAGCTGCTCGGTATATGAGATCTC
 TCAAAGTGCCAGCTACAGTTTCTGTTTCTTCACCTGATGCTGTTACAGCGTATAATGGTTATCTTA
 CTTCTTCTTCTAAAACACCTGAAGAACATTTTATTGAAACCATCTCACTTGCTGGTTCCTATAAAGA
 TTGGTCCTATTCTGGACAATCTACACAACTAGGTATAGAATTTCTTAAGAGAGGTGATAAAAGTGT
 ATATTACACTAGTAATCCTACCACATTCCACCTAGATGGTGAAGTTATCACCTTTGACAATCTTAAG
 ACACTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACTATTAAGGTGTTTACAACAGTAGACAACATTAACCTC
 CACACGCAAGTTGTGGACATGTCAATGACATATGGACAACAGTTTGGTCCAACTTATTTGGATGG
 AGCTGATGTTACTAAAATAAAACCTCATAATTCACATGAAGGTAAAACATTTTATGTTTTACCTAAT
 GATGACACTCTACGTGTTGAGGCTTTTGAGTACTACCACACAACTGATCCTAGTTTTCTGGGTAG
 GTACATGTCAGCATTAAATCACACTAAAAAGTGGAAATACCCACAAGTTAATGGTTTAACTTCTATT
 AAATGGGCAGATAACAACTGTTATCTTGCCACTGCATTGTTAACACTCCAACAAATAGAGTTGAAG
 TTTAATCCACCTGCTCTACAAGATGCTTATTACAGAGCAAGGGCTGGTGAAGCTGCTAACTTTTGT
 GCACTTATCTTAGCCTACTGTAATAAGACAGTAGGTGAGTTAGGTGATGTTAGAGAAACAATGAGT
 TACTTGTTTCAACATGCCAATTTAGATTCTTGCAAAAGAGTCTTGAACGTGGTGTGTAAAACTTGT
 GGACAACAGCAGACAACCCTTAAGGGTGTAGAAGCTGTTATGTACATGGGCACACTTTCTTATGA
 ACAATTTAAGAAAGGTGTTCAGATACCTTGTACGTGTGGTAAACAAGCTACAAAATATCTAGTACA
 ACAGGAGTCACCTTTTGTTATGATGTCAGCACCACCTGCTCAGTATGAACTTAAGCATGGTACATT
 TACTTGTGCTAGTGAGTACACTGGTAATTACCAGTGTGGTCACTATAAACATATAACTTCTAAAGA 

 AACTTTGTATTGCATAGACGGTGCTTTACTTACAAAGTCCTCAGAATACAAAGGTCCTATTACGGA
 TGTTTTCTACAAAGAAAACAGTTACACAACAACCATAAAACCAGTTACTTATAAATTGGATGGTGTT
 GTTTGTACAGAAATTGACCCTAAGTTGGACAATTATTATAAGAAAGACAATTCTTATTTCACAGAGC
 AACCAATTGATCTTGTACCAAACCAACCATATCCAAACGCAAGCTTCGATAATTTTAAGTTTGTATG
 TGATAATATCAAATTTGCTGATGATTTAAACCAGTTAACTGGTTATAAGAAACCTGCTTCAAGAGAG
 CTTAAAGTTACATTTTTCCCTGACTTAAATGGTGATGTGGTGGCTATTGATTATAAACACTACACAC
 CCTCTTTTAAGAAAGGAGCTAAATTGTTACATAAACCTATTGTTTGGCATGTTAACAATGCAACTAA
 TAAAGCCACGTATAAACCAAATACCTGGTGTATACGTTGTCTTTGGAGCACAAAACCAGTTGAAAC
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 GCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTT
 ACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAA
 ATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAAT
 GCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAA
 ATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCA
 GACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTG
 CTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTG
 GAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGA
 CTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCAC 

 ACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTT
 ATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAA
 TTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATA
 AATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGT
 TGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCAT
 CGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTT
 TATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAG
 TTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAG
 TGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAAACGAACTTATGGATTTGTTTATGAGAATCTTCACA
 ATTGGAACTGTAACTTTGAAGCAAGGTGAAATCAAGGATGCTACTCCTTCAGATTTTGTTCGCGCT
 ACTGCAACGATACCGATACAAGCCTCACTCCCTTTCGGATGGCTTATTGTTGGCGTTGCACTTCTT
 GCTGTTTTTCAGAGCGCTTCCAAAATCATAACCCTCAAAAAGAGATGGCAACTAGCACTCTCCAA
 GGGTGTTCACTTTGTTTGCAACTTGCTGTTGTTGTTTGTAACAGTTTACTCACACCTTTTGCTCGTT
 GCTGCTGGCCTTGAAGCCCCTTTTCTCTATCTTTATGCTTTAGTCTACTTCTTGCAGAGTATAAACT
 TTGTAAGAATAATAATGAGGCTTTGGCTTTGCTGGAAATGCCGTTCCAAAAACCCATTACTTTATG
 ATGCCAACTATTTTCTTTGCTGGCATACTAATTGTTACGACTATTGTATACCTTACAATAGTGTAAC
 TTCTTCAATTGTCATTACTTCAGGTGATGGCACAACAAGTCCTATTTCTGAACATGACTACCAGATT
 GGTGGTTATACTGAAAAATGGGAATCTGGAGTAAAAGACTGTGTTGTATTACACAGTTACTTCACT
 TCAGACTATTACCAGCTGTACTCAACTCAATTGAGTACAGACACTGGTGTTGAACATGTTACCTTC
 TTCATCTACAATAAAATTGTTGATGAGCCTGAAGAACATGTCCAAATTCACACAATCGACGGTTCA
 TCCGGAGTTGTTAATCCAGTAATGGAACCAATTTATGATGAACCGACGACGACTACTAGCGTGCC
 TTTGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTT
 AATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTT
 ACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTT
 TACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACT
 AAATATTATATTAGTTTTTCTGTTTGGAACTTTAATTTTAGCCATGGCAGATTCCAACGGTACTATTA
 CCGTTGAAGAGCTTAAAAAGCTCCTTGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTCCTTACAT
 GGATTTGTCTTCTACAATTTGCCTATGCCAACAGGAATAGGTTTTTGTATATAATTAAGTTAATTTT
 CCTCTGGCTGTTATGGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTTTACAGAATAAATTG
 GATCACCGGTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTTCA
 TTGCTTCTTTCAGACTGTTTGCGCGTACGCGTTCCATGTGGTCATTCAATCCAGAAACTAACATTC
 TTCTCAACGTGCCACTCCATGGCACTATTCTGACCAGACCGCTTCTAGAAAGTGAACTCGTAATC
 GGAGCTGTGATCCTTCGTGGACATCTTCGTATTGCTGGACACCATCTAGGACGCTGTGACATCAA
 GGACCTGCCTAAAGAAATCACTGTTGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTGGGAGCTTC
 GCAGCGTGTAGCAGGTGACTCAGGTTTTGCTGCATACAGTCGCTACAGGATTGGCAACTATAAAT
 TAAACACAGACCATTCCAGTAGCAGTGACAATATTGCTTTGCTTGTACAGTAAGTGACAACAGATG
 TTTCATCTCGTTGACTTTCAGGTTACTATAGCAGAGATATTACTAATTATTATGAGGACTTTTAAAG
 TTTCCATTTGGAATCTTGATTACATCATAAACCTCATAATTAAAAATTTATCTAAGTCACTAACTGAG
 AATAAATATTCTCAATTAGATGAAGAGCAACCAATGGAGATTGATTAAACGAACATGAAAATTATTC
 TTTTCTTGGCACTGATAACACTCGCTACTTGTGAGCTTTATCACTACCAAGAGTGTGTTAGAGGTA
 CAACAGTACTTTTAAAAGAACCTTGCTCTTCTGGAACATACGAGGGCAATTCACCATTTCATCCTC 

 TAGCTGATAACAAATTTGCACTGACTTGCTTTAGCACTCAATTTGCTTTTGCTTGTCCTGACGGCG
 TAAAACACGTCTATCAGTTACGTGCCAGATCAGTTTCACCTAAACTGTTCATCAGACAAGAGGAAG
 TTCAAGAACTTTACTCTCCAATTTTTCTTATTGTTGCGGCAATAGTGTTTATAACACTTTGCTTCAC
 ACTCAAAAGAAAGACAGAATGATTGAACTTTCATTAATTGACTTCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTC
 TGCTATTCCTTGTTTTAATTATGCTTATTATCTTTTGGTTCTCACTTGAACTGCAAGATCATAATGAA
 ACTTGTCACGCCTAAACGAACATGAAATTTCTTGTTTTCTTAGGAATCATCACAACTGTAGCTGCA
 TTTCACCAAGAATGTAGTTTACAGTCATGTACTCAACATCAACCATATGTAGTTGATGACCCGTGT
 CCTATTCACTTCTATTCTAAATGGTATATTAGAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAAT
 TGTGCGTGGATGAGGCTGGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATATCGGTAATTATACAGTTT
 CCTGTTTACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGTCTTGTAGTGCGTTGTTCGT
 TCTATGAAGACTTTTTAGAGTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACGAACAAACT
 AAAATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTC
 AGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCC
 CAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCT
 TAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCT
 ACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGA
 TGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGG
 CATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATC
 CTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTAC
 GCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTT
 CAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGG
 TGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTA
 AAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCT
 CGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGA
 ACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGC
 CGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAA
 GTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAA
 TTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGA
 GCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAA
 CAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCC
 ATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAACTCATGCAGACCACACAAGGCAGATGGGCTATAT
 AAACGTTTTCGCTTTTCCGTTTACGATATATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGAATTCTCGTAACTAC
 ATAGCACAAGTAGATGTAGTTAACTTTAATCTCACATAGCAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGG
 GAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTG
 AACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCT
 ATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
 AAAA

 SEQ ID NO: 14, wobei es sich handelt um 30-44 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 15, wobei es sich handelt um 48-68 von SEQ ID NO: 1- Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 16, wobei es sich handelt um 110-166 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 17, wobei es sich handelt um 200-214 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 18, wobei es sich handelt um 226-250 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 19, wobei es sich handelt um 256-277 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 20, wobei es sich handelt um 328-342 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 21, wobei es sich handelt um 399-414 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 22, wobei es sich handelt um 434-448 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 23, wobei es sich handelt um 550-572 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 24, wobei es sich handelt um 590-604 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 25, wobei es sich handelt um 632-650 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 26, wobei es sich handelt um 354-368 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 27, wobei es sich handelt um 622-636 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 28, wobei es sich handelt um 30-44 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 29, wobei es sich handelt um 226-250 von SEQ ID NO: 1 - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 30: SARS-CoV-2 N-Protein
 MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLK
 FPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIW
 VATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTP
 GSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTA
 TKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTW
 LTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAAD
 LDDFSKQLQQSMSSADSTQA

 SEQ ID NO: 31: RBD, ein Fragment der S1 Domäne aus SARS-CoV-2 S-Protein
 RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL
 NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRL
 FRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRWVLSFELLHAPAT
 VCGPKKSTNLVKNKCVNF

 SEQ ID NO: 32: RBD, ein Fragment der S1 Domäne aus SARS-CoV-2 S-Protein, mit C-terminalem
His-Tag
 RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL
 NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRL
 FRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRWVLSFELLHAPAT
 VCGPKKSTNLVKNKCVNFLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO: 33: S2 Domäne aus SARS-CoV-2 S-Protein
 SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQY
 GSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKV
 TLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQI
 PFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVK 

 QLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVL
 GQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGT
 HWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVN NTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDI
 SGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSC
 CSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

 SEQ ID NO: 34: RBD wie verwendet in den Beispielen
 MKHLWFFLLLVAAPRWVLSGPMRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVAD
 YSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC
 VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT
 NGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO: 35 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 LTPGDSSSGWTAG

 SEQ ID NO: 36 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 YQAGSTPCNGV

 SEQ ID NO: 37 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 YGFQPTNGVGYQ

 SEQ ID NO: 38: Mit His-Tag versehene RBD
 MKHLWFFLLLVAAPRWVLSGPMRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVAD
 YSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC
 VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT
 NGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO: 39: humanes Angiotensin-konvertierendes Enzyme 2 (ACE2)
 MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGD
 KWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNP
 DNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGD
 YWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGD
 MWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLT
 DPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGF
 HEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPK
 DQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHE
 GPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENWGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSF
 VGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDV
 RVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSI
 WLIVFGWMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF

 SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 RTWLPPAYTNS

 SEQ ID NO: 41 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 RTQLPPAYTNS

 SEQ ID NO: 42 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 SGTNGTKRFDN

 SEQ ID NO: 43 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPAT
 NHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQWEKVVLVSLQSGIEGRMRTQLPPAYTNSRTQ
 LPPAYTNS

 SEQ ID NO: 44 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern mit GST- Fusion)
 
 MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPAT
 NHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQWEKVVLVSLQSGIEGRMMSHHHHHHHHSPM
 YSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANRE
 FKSEKGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGIEGRMSGTNGTKRFDNSGTNGTKRFDN

 SEQ ID NO: 45 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern mit GST-
 Fusion)
 MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPAT
 NHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQWEKVVLVSLQSGIEGRMLTPGDSSSGWTAGL
 TPGDSSSGWTAG

 SEQ ID NO: 46 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern mit GST- Fusion)
 
 MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPAT
 NHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQWEKVVLVSLQSGIEGRMNNLDSKVGGNNLDS
 KVGG

 SEQ ID NO: 47 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern mit GST- Fusion)
 
 MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPAT
 NHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQWEKVVLVSLQSGIEGRMYQAGSTPCNGVYQA
 GSTPCNGV

 SEQ ID NO: 48 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern mit GST- Fusion)
 
 MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPAT
 NHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQWEKVVLVSLQSGIEGRMYGFQPTNGVGYQY
 GFQPTNGVGYQ

 SEQ ID NO: 49 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern mit GST- Fusion,
 P1-P6)
 MSHHHHHHHHSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPAT
 NHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQWEKVVLVSLQSGIEGRMRTQLPPAYTNSSGT
 NGTKRFDNLTPGDSSSGWTAGNNLDSKVGGYQAGSTPCNGVYGFQPTNGVGYQ

 SEQ ID NO: 50 (mit C-terminalem His-Tag, extrazelluläre Domäne von menschlichem ACE2)
 MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGD
 KWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNP
 DNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGD
 YWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGD
 MWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLT
 DPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGF
 HEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPK
 DQWMKKWWEMKREIVGWEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHE
 GPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENWGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSF
 VGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDV
 RVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS
 LEGSGSGSHHHHHHHHGSGLNDIFEAQKIEWHE

 SEQ ID NO: 51 (SEQ ID NO1 mit Mutationen von SARS-CoV-2 U.K. variant B.1.1.7
 - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 52 (SEQ ID NO1 mit Mutationen von SARS-CoV-2 South African variant B.1.351):
 - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 53 (SEQ ID NO1 mit Mutationen von SARS-CoV-2 Brazilian variant P.1):
 - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 54 (SEQ ID NO1 mit Mutationen von SARS-CoV-2 Mink Variant from Denmark):
 - Nur im Sequenzprotokoll

 SEQ ID NO: 55 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern)
 NNLDSKVGG

 SEQ ID NO: 56 (SEQ ID NO: 1-Derivat-Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2-Antikörpern mit GST-
 Fusion, P1-P6)
 RTQLPPAYTNSSGTNGTKRFDNLTPGDSSSGWTAGNNLDSKVGGYQAGSTPCNGVYGFQPTNGVG
 YQ

Die vorliegende Erfindung wird weiter illustriert durch die folgenden Beispiele, Sequenzen und Figuren, aus denen weitere Merkmale, Ausführungsformen, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung entnommen werden können. Alle Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder zu ihnen äquivalent sind, können zum Ausführen und Ausprobieren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit geeigneten Verfahren und Materialien, wie sie hierin beschrieben sind. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen, die hierin erwähnt sind, sind in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen.

1 zeigt einen Zeitverlauf der Konzentration von Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 (IgA, IgG) und N-Protein (IgG, IgM), überwacht in zwei Patienten (1), wie in Beispiel 3 beschrieben.
2 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Zeitverlaufes mit einem Patienten, der mit SARS-Cov-2 infiziert ist. Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse IgA (Quadrate), Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 der Klasse IgG (Dreiecke) und Antikörper gegen N-Protein der Klasse IgG (Kreise) wurden bestimmt.
3 zeigt IFA unter Verwendung von Aceton-fixierten S1-exprimierenden oder mit Kontroll-Plasmid transfizierten HEK293-Zellen (A) inkubiert direkt mit anti-His-Tag-Antikörpern (1:200) oder Patientenserum (PS, 1:100) im ersten Schritt und anti-mouse-lgG-FITC oder anti-human-lgG-FITC im zweiten Schritt, (B) inkubiert 30 Minuten lang mit PBS gefolgt von der Inkubation mit PS3 in zwei Schritten, wie beschrieben in A, oder (C) inkubiert 30 Minuten lang mit PBS, gefolgt von einer Inkubation mit PS3 (1:100) im ersten Schritt, anti-human-lgG-Biotin (1:200) im zweiten Schritt und ExtrAvidin-FITC (1:2000) im dritten Schritt. S1-exprimierende Zellen waren mit einem pTriEx-Vektor, der SEQ ID NO: 2 exprimiert, unter Verwendung von Standardverfahren transfiziert worden.
Beispielhafte Zellen, die mit Patientenantikörper als reaktiv identifiziert wurden, wurden mit Pfeilen gekennzeichnet.
4 zeigt den Nachweis von IgG-, IgA- und IgM-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung eines Fusionsproteins umfassend RBD.
5 zeigt den Nachweis von IgG-, IgA- und IgM-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1.
6 zeigt den Nachweis von IgM-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Fragmenten von SEQ ID NO: 1 und Fusionsproteinen davon.
7 zeigt den Nachweis von IgA-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Fragmenten von SEQ ID NO: 1 und Fusionsproteinen davon.
8 zeigt den Nachweis von IgG-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Fragmenten von SEQ ID NO: 1 und Fusionsproteinen davon.
9 zeigt den zeitabhängigen Nachweis von IgM-Antikörpern aus Proben von Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Fragmenten von SEQ ID NO: 1 und Fusionsproteinen davon.
10 zeigt den zeitabhängigen Nachweis von IgG-Antikörpern aus Proben von Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Fragmenten von SEQ ID NO: 1 und Fusionsproteinen davon.
11 zeigt den zeitabhängigen Nachweis von IgA-Antikörpern aus Proben von Patienten basierend auf Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Fragmenten von SEQ ID NO: 1 und Fusionsproteinen davon.
12 zeigt den Nachweis von IgA-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Western-Analyse unter Verwendung eines Polypeptides umfassend RBD.
13 zeigt den Nachweis von IgM-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Polypeptides umfassend RBD.
14 zeigt den Nachweis von IgG-Antikörpern aus der Probe eines Patienten basierend auf Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Polypeptides umfassend RBD.
15 zeigt den zeitabhängigen Nachweis von IgA-Antikörpern aus Proben von Patienten basierend auf Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO: 1.
16 zeigt den zeitabhängigen Nachweis von IgM-Antikörpern aus Proben von Patienten basierend auf Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1.
17 zeigt den zeitabhängigen Nachweis von IgG-Antikörpern aus Proben von Patienten basierend auf Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 1.

Beispiel 1: Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 unter Verwendung eines ELISA-Immunassays

Proben

Acht Proben von Patienten, die unter Verwendung von PCR wie beschrieben von Corman et al. (Corman et al. (2020) Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c 2) positiv auf SARS-CoV-2 getestet worden waren, und 6 bis 14 Tage nach der Infektion erhalten worden waren, und 14 Proben von Patienten, die zu einem früheren Zeitpunkt nach der Infektion erhalten worden waren, standen zur Verfügung.

Zusätzlich war eine Reihe von Proben verfügbar, die verschiedene Coronaviren enthielten, umfassend 18 Proben von Patienten infiziert mit MERS, drei Proben von Patienten infiziert mit SARS-CoV-1, vier Patienten mit NL63, drei Patienten mit 229E, sechs Patienten mit OC43 und drei Patienten mit HKU1.

Herstellung von Mikrotiterplatten beschichtet mit Antigen: SEQ ID NO2 wurde in HEK293T-Zellen exprimiert mittels Standard-Klonierung von SEQ ID NO4 in ein pTriEx-1-Plasmid mit einer künstlichen Signalsequenz und einem C-terminalen His-Tag, was zur Expression von SEQ ID NO2 führt, und nach Entfernung des Signalpeptides, zu SEQ ID NO3. Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C und 8,5 % CO₂ in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 0.1 mg/ml Streptomycin drei bis 5 Tage lang kultiviert. Die Zellen wurden geerntet, in 20 mM Tris-HCL pH 7.4, 10 % (w/v) Saccharose, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.

Um SEQ ID NO3 herzustellen, wurde der Überstand der Zellkultur auf 5 mmol/l Tris-Chlorid pH 8.0, 164 mmol/l Natriumchlorid, 50 mmol/l Magnesiumchlorid, 20 mmol/l Imidazol, 0,1 % Triton X-100 eingestellt, durch Zentrifugation 30 Minuten lang bei 17.600xg, 4 °C geklärt und an eine Nickel Rapid Run-Säule (Agarose Bead Technologies, Miami, FL, USA) aufgetragen, die mit 5 mmol/l Tris-Chlorid pH 8,0, 300 mmol/l Natriumchlorid, 20 mmol/l Imidazol eingestellt worden war und durch Erhöhung der Imidazol-Konzentration bis auf 150 mmol/l eluiert. Alle SEQ ID NO3 enthaltenen Fraktionen wurden zusammen gegeben und mittels Ultrafiltration (VivaSpin, Sartorius, Göttingen, Deutschland) konzentriert. Die finale Präparation wurde bis zur weiteren Benutzung bei -80 °C gelagert.

Die finale Protein-Präparation von SEQ ID NO3 wurde mit oder ohne 16 mmol/l Dithiotreitol behandelt und 10 Minuten lang bei 70 °C oder bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von SDS-Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung. Die Proteinidentität wurde mittels Massenspektrometrie verifiziert.

Zur Verwendung für einen Mikrotiterplatten-ELISA wurde das gereinigte Protein in PBS bis zur Endkonzentration von ungefähr 1.5 µg/ml verdünnt und verwendet, um ELISA-Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Denmark) über Nacht zu beschichten.

Experimentelle Vorgehensweise: Die Proben wurden 1:101 in IgG-Probenpuffer verdünnt, auf Mikrotiterplatten aufgebracht und inkubiert, wie es für im Handel erhältliche EUROIMMUN-ELISA Test-Kits beschrieben ist, unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien (z. B. EI 2260-9601 G/A, wobei es sich um einen Puffer handelt, der im Wesentlichen physiologische Bedingungen mit Hinblick auf Salz-Konzentration und pH aufweist). Dabei wurde die Anleitung EI 2260-9601 G/A befolgt. Kurz gesagt: 60 Minuten bei 37 °C; drei Waschschritte unter Verwendung von Waschpuffer; Zugabe von 100 µl Peroxidase-markiertem anti-humanem IgG-Konjugat (Kaninchen) oder anti-humanem IgA-Konjugat (Kaninchen) pro Well; Inkubation 30 Minuten lang bei 37 °C; drei Waschschritte unter Verwendung von EUROIMMUN-Waschpuffer; Zugabe von 100 µl Chromogen-/Substrat-Lösung (TMB/H₂O₂) pro Well; Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur; Zugabe von 100 µl Stop-Lösung (0,5 M Schwefelsäure); Messung der optischen Dichte bei 450 nm gegen 630 nm als Referenz.

Die Kalibration wurde unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kalibratoren ausgeführt (Produkt Nummer EI 2606-9601 A, EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG). Ein Verhältnis wurde dadurch berechnet, dass die Extinktion der Kontrolle oder des Patientenserums durch die Extinktion des Kalibrators geteilt wurde. Ergebnisse unter 0,8 wurden als negative Ergebnisse betrachtet, Ergebnisse zwischen 0,8 und 1,1 als grenzwertig und Ergebnisse von mehr als 1,1 als positiv. Ergebnisse: Die Primärdaten sind in Tabelle 1 gezeigt:

		Rohdaten		Cut-Off OD	Rohdaten		Cut-Off OD
		Rohdaten		0,100	Rohdaten		0,200
		IgG (OD)	Verdünnung 1:	IgG (Verhältnis)	IgA (OD)	Verdünnung 1:	IgA (Verhältnis)
				pos: ≥ 1,1			pos: ≥ 1,1
		-	-	grenzwertig 0,8-1,0	-	-	grenzwertig 0.8-1.0
1	Kalibrator	1,911	300	19,1	3,055	600	15,3
2	Kalibrator	1,593	600	15,9	2,204	1200	11,0
3	Kalibrator	1,077	1200	10,8	1,068	2400	5,3
4	Kalibrator	0,697	2400	7,0	0,529	4800	2,6
5	Kalibrator	0,441	4800	4,4	0,314	9600	1,6
6	Kalibrator	0,248	9600	2,5	0,155	19200	0,8
7	Kalibrator	0,132	19200	1,3	0,078	38400	0,4
8	Kalibrator	0,066	38400	0,7	0,051	76800	0,3
9	SARS-CoV-2, späte Phase	0,157		1,6	1,402		7,0
10	SARS-CoV-2, späte Phase	0,075		0,8	0,377		1,9
11	SARS-COV-2, späte Phase	0,276		2,8	9,999		50,0
12	SARS-COV-2, späte Phase	0,027		0,3	0,027		0,1
13	SARS-COV-2, späte Phase	0,023		0,2	0,064		0,3
14	SARS-COV-2, späte Phase	0,119		1,2	1,142		5,7
15	SARS-COV-2, späte Phase	0,031		0,3	0,203		1,0
16	SARS-COV-2, späte Phase	0,079		0,8	0,385		1,9
17	SARS-COV-2, < Tag 6	0,021		0,2	0,055		0,3
18	SARS-COV-2, < Tag 6	0,019		0,2	0,084		0,4
19	SARS-COV-2, < Tag 6	0,021		0,2	0,225		1,1
20	SARS-COV-2, < Tag 6	0,018		0,2	0,192		1,0
21	SARS-COV-2, < Tag 6	0,033		0,3	0,599		3,0
22	SARS-COV-2, < Tag 6	0,029		0,3	0,331		1,7
23	SARS-COV-2, < Tag 6	0,013		0,1	0,030		0,2
24	SARS-COV-2, < Tag 6	0,017		0,2	0,097		0,5
25	SARS-COV-2, < Tag 6	0,027		0,3	0,214		1,1
26	SARS-COV-2, < Tag 6	0,016		0,2	0,021		0,1
27	SARS-COV-2, < Tag 6	0,014		0,1	0,073		0,4
28	SARS-COV-2, < Tag 6	0,014		0,1	0,042		0,2
29	SARS-COV-2, < Tag 6	0,015		0,2	0,030		0,2
30	SARS-COV-2, < Tag 6	0,015		0,2	0,079		0,4
31	MERS 1	0,013		0,1	0,042		0,2
32	MERS 2	0,008		0,1	0,017		0,1
33	MERS 3	0,011		0,1	0,038		0,2
34	MERS 4	0,008		0,1	0,011		0,1
35	MERS 5	0,008		0,1	0,027		0,1
36	MERS 6	0,008		0,1	0,035		0,2
37	MERS 7	0,009		0,1	0,013		0,1
38	MERS 8	0,017		0,2	0,036		0,2
39	MERS 9	0,010		0,1	0,024		0,1
40	MERS 10	0,007		0,1	0,012		0,1
41	MERS 11	0,020		0,2	0,026		0,1
42	MERS 12	0,008		0,1	0,026		0,1
43	MERS 13	0,015		0,2	0,021		0,1
44	MERS 14	0,012		0,1	0,036		0,2
45	MERS 15	0,024		0,2	0,066		0,3
46	MERS 16	0,021		0,2	0,080		0,4
47	MERS 17	0,008		0,1	0,039		0,2
48	MERS 18	0,029		0,3	0,104		0,5
49	SARS-1	0,214		2,1	0,285		1,4
50	SARS-1	0,596		6,0	0,227		1,1
51	SARS-1	0,128		1,3	0,260		1,3
52	OC43	0,035		0,4	0,126		0,6
53	OC43	0,029		0,3	0,098		0,5
54	OC43	0,016		0,2	0,041		0,2
55	OC43	0,011		0,1	0,048		0,2
68	NL63	0,013		0,1	0,023		0,1
69	NL63	0,027		0,3	0,039		0,2
70	NL63	0,036		0,4	0,057		0,3
71	NL63	0,019		0,2	0,030		0,2
72	229E	0,041		0,4	0,045		0,2
73	229E	0,022		0,2	0,024		0,1
74	229E	0,030		0,3	0,034		0,2
75	OC43	0,050		0,5	0,100		0,5
76	OC43	0,079		0,8	0,201		1,0
77	HKU1	0,023		0,2	0,054		0,3
78	HKU1	0,019		0,2	0,055		0,3
79	HKU1	0,010		0,1	0,029		0,1

Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper gegen SEQ ID NO1 verwendet werden können, um eine SARS-CoV-2-Infektion in Proben von menschlichen Patienten zu diagnostizieren.

Ein Vergleich der Daten, die mit sekundären Antikörpern erhalten wurden, die Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgG bzw. IgA erkennen, zeigt, dass der Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA sensitiver ist, wenigstens in einer Frühphase der Krankheit: 4/14 Patientenproben, die in einer Frühphase der Infektion abgenommen wurden, vor Ablauf von sechs Tagen nach Ausbruch der Krankheit (post onset of illness), konnten korrekt als positiv identifiziert werden, wenn Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA nachgewiesen wurden, wohingegen der Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgG in den gleichen Proben negative Ergebnisse ergab.

Beide Tests zeigten Kreuzreaktivität mit Proben von SARS-CoV-1-Patienten, aber mit praktisch keiner der Proben von Patienten, die mit MERS, NL63, 229E, OC43 and HKU1 infiziert waren. Eine Unterscheidung zwischen SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 ist basierend auf der unterschiedlichen zeitaufgelösten Immunglobulin-Klassen-Signatur möglich, insbesondere des späteren Erscheinens von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA in SARS-CoV-1 (Hsueh, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066). Nicht zuletzt wurde seit dem Ausbruch von SARS-CoV-2 kaum von SARS-CoV-Fällen berichtet.

Mehrere nachveröffentlichte Veröffentlichungen von unabhängigen Forschern bestätigten die Erkenntnisse der Erfinder. Jääskelainen et al. zogen in einer vergleichenden Studie die Schlussfolgerung, dass unter sechs im Handel verfügbaren serologischen Tests zum Nachweis von SARS-CoV-2 IgG, IgA und/oder IgM-Antikörpern der EUROIMMUN-Assay basierend auf der dem Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA gegen S1 die höchste Sensitivität aufwies (Jääskelainen, A. J., Kuivanen, S., Kekäläinen, E., Ahava, M.J., Loginov, R., Kallio-Kokko, H., Vapalahti, O., Jarva, H., Kurkela, and Lappalainen, M. (2020), J. Clin. Virology 129, 104512). Okba et al. erhielten ähnliche Ergebnisse (Okba et al., Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-specific antibody responses in Coronavirus Disease Patients. Emerg Infect Dis. 2020 Jul; 26/7): 1478-1488, vorveröffentlicht auf medRxiv 2020.03.18.20038059). Beavis et al. bestätigten, dass die Sensitivität des IgA-basierten Tests gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Frühphase der Krankheit überlegen ist, wohingegen der IgG-basierte Assay zu Spätphasen überlegen ist (Beavis, K. G., Mathushek, S. M., Abeleda, A. P. F., Bethel, C., Hunt, C., Gillen, S., Moran, A., and Tesic, V. (2020) Evaluation of the EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA Assay for detection of IgA and IgG antibodies, J. Clin. Virology 129, 104468).

Insgesamt kann der Test gemäß der vorliegenden Erfindung für den Frühnachweis diagnostisch relevanter Antikörper gegen SEQ ID NO1 verwendet werden. In einigen Patienten können korrekt positive Ergebnisse vor Ablauf von sechs Tagen nach dem Ausbruch der Symptome erzielt werden. Daher trägt der Test dazu bei, die diagnostische Lücke zwischen der Zeit, in der PCR-basierte Tests verwendet werden können und der Zeit, in der Immuntests verwendet werden können, zu schließen oder wenigstens zu verkleinern.

Beispiel 2: Eine erweiterte ELISA-Studie mit dem Ziel, die diagnostische Zuverlässigkeit und Relevanz der Tests zum Nachweis von IgA-Antikörpern gegen SEQ ID NO1 weiter zu charakterisieren

Um die Sensitivität des vorliegenden Tests zu bestimmen, wurde die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA in 166 Proben von 152 europäischen Patienten unter Verwendung von EUROIMMUN-Produkt Nr. EI 2606-9601 A nachgewiesen, basierend auf einem Test, der dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist. Das Vorliegen einer SARS-CoV-2-Infektion war zuvor unter Verwendung der RT-PCR gemäß Corman VM, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 25(3): pii=2000045 (2020-01-23) basierend auf einer Probe aus einer Frühphase der Infektion bestätigt worden.

Kurz gesagt basiert dieser Test auf einem ELISA unter Verwendung einer Mikrotiterplatte, die mit einem Antigen beschichtet ist, das aufgereinigtes SEQ ID NO1 umfasst. Nach einer Inkubation mit Proben und umfangreichen Waschschritten unter Verwendung von physiologischen Puffern wird ein sekundärer Antikörper gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA, der mit einer enzymatisch aktiven Markierung versehen ist, verwendet, um Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO1 spezifisch mit einer Markierung zu versehen, gefolgt von einer Inkubation mit einem chromogenen Substrat. Weitere Details können der Anleitung entnommen werden, die mit dem Produkt geliefert wird (EUROIMMUN Produkt EI 2606-9601 A), die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.

Die serologischen Charakterisierungen wurden mit Proben ausgeführt, die im Verlauf der Infektion abgenommen wurden.

Mit Proben, die bis zum Tag 10 nach Ausbruch der Symptome (oder der direkten Detektion mittels positiver RT-PCR) abgenommen worden waren, konnte eine Sensitivität von 60,2 % betreffend Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO1 bestimmt werden. Die Sensitivität betrug 98,6 %, wenn nach Tag 10 erhaltene Proben verwendet wurden.

Die Ergebnisse und Immunantworten sind jedoch hochgradig individuell. Z. B. kann eine Minderheit von Patienten gar keine IgA-, IgG- oder IgM-Antworten zeigen.

Zusammen genommen demonstriert diese weitere Studie konsistent, dass der spezifische Nachweis von Antikörpern der Klasse IgA gegen SEQ ID NO: 1 eine besonders hohe Sensitivität zum Nachweisen einer SARS-CoV-2-Infektion bereits in einer Frühphase der Krankheit bereitstellt.

Beispiel 3: Persistieren von diagnostisch relevanten Antikörpern über die Zeit bei SARS-CoV-2-Patienten, gezeigt mittels ELISA

Der Zeitverlauf von Konzentrationen von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 (IgA, IgG) und N-Protein (IgG, IgM) wurde in zwei Patienten überwacht (1). Beide stellten sich mit einem milden Verlauf der Krankheit vor, aber die Infektion war durch RT-PCR bestätigt worden. Es wurden typische spezifische Symptome wie beispielsweise der zeitweilige Verlust des Geruchsinns beobachtet. Die EUROIMMUN-Produkte EI 2606-9601-A und EI 2606-9601-G (S1-Protein als Antigen, IgA- bzw. IgG-Nachweis) und EI 22606-9601-2-G und EI 22606-9601-2-M (N-Protein als Antigen, IgG- bzw. IgM-Nachweis) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Das Prinzip und die wesentlichen Bestandteile der Tests sind wie in den Beispielen 1 und 2 dargestellt; jedoch wurden unterschiedliche Antigene (N-Protein statt Polypeptid umfassend SEQ ID NO1) wie auch verschiedene sekundäre Antikörper (bindend an IgA, IgG oder IgM) verwendet, abhängig davon, welcher Antikörper nachzuweisen war. Weitere Informationen sind in den Anweisungen des Herstellers von EI 2606-9601-A, EI 2606-9601-G, EI 22606-9601-2-G und EI 22606-9601-2-M (EUROIMMUN) enthalten.

Der Verlauf der Krankheit wurde länger als vier Monate überwacht. Zunächst waren IgA und IgG gegen SEQ ID NO: 1 und IgG, aber kein IgM gegen N-Protein nachweisbar. In beiden Patienten war nach vier Monaten wenigstens IgA oder IgG gegen SEQ ID NO: 1 nachweisbar, wohingegen IgG gegen N-Protein schon zwei Monate nach der ersten positiven PCR abwesend oder nur noch schwach nachweisbar war.

Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 wenigstens in einigen Patienten länger anzutreffen sind als Antikörper gegen N-Protein. Die Konzentration der IgA-Antikörper verringert sich schneller als die Konzentration der IgG-Antikörper, aber IgA-Antikörper können aufgrund ihres anfänglich höheren Signals auch beim Verschwinden noch dominant sein.

Das Überwachen eines weiteren Zeitverlaufs mit einem dritten Patienten ist in 2 gezeigt. Im Wesentlichen wurden Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO: 1 (Quadrate), Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG gegen SEQ ID NO: 1 (Dreiecke) und Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG gegen N-Protein (Kreise) unter Verwendung der gleichen Verfahren bestimmt. Wie aus 2 hervorgeht, waren Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen S1 [SEQ ID NO: 1] über die gesamte überwachte Zeitspanne nachweisbar, das heißt selbst 40 Tage nach der mit RT-PCR-bestimmten SARS-CoV-2-Infektion, wohingegen die Konzentration der Antikörper der Klasse IgG gegen entweder SEQ ID NO: 1 oder SARS-CoV-2-N-Protein unter dem cut-off blieben (oder nahe beim cut-off blieben). Daher bestätigen diese Daten zusätzlich die erhöhte Sensitivität des vorliegenden Tests, die auf dem spezifischen Nachweis von Antikörpern der Klasse IgA basiert, die an das Antigen mit SEQ ID NO: 1 gebunden sind.

Beispiel 4: Chemilumineszenz-basierter Assay für den Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 zum Überwachen verschiedener Antikörper über die Zeit

Ein EUROIMMUN Random Access RA 10 Analyzer (YG 0710-0101) wurde gemäß Anweisung des Herstellers und mit den Grundeinstellungen verwendet, umfassend eine Reagenzienkartusche (LS 1254-10010 G).

Tosylaktivierte paramagnetische Beads (M-280, Invitrogen) wurden zur Beschichtung unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt wurden die Beads in Beschichtungspuffer gewaschen (0,1 M Natriumphosphat pH 7,4) 10 Minuten lang bei 37 °C auf einem IKA Roller 10 (geliefert durch VWR), gefolgt durch magnetische Konzentrierung der Beads und Entfernung des Überstandes. Rekombinantes Polypeptid (SEQ ID NO: 3) aufgereinigt gemäß Beispiel 1 wurde im gleichen Puffer hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von 3 M Ammoniumsulphat und Inkubation unter den gleichen Bedingungen 19 Stunden lang, gefolgt von zwei Waschschritten unter Verwendung von Waschpuffer (PBS pH 7,4 0,1% BSA 0,2% Tween-20), vom Blockieren im gleichen Puffer 4 Stunden lange bei 37 °C (PBS pH 7,4 0,1% BSA 0,2% Tween-20) und zwei zusätzlichen Waschschritten. Die Beads wurden im gleichen Puffer wenigstens 16 Stunden lang bei 4 °C gelagert. Der Assay wurde durch Vermischen von paramagnetische Beads mit dem Probenpuffer (BSA/Tween-20 in Tris-HCl EDTA pH 7) ausgeführt. 20 µl Bead-Suspension (1 mg/ml) wurde mit 5 µl Probe kontaktiert (d. h. eine Blutprobe eines Patienten) in einer Gesamtmenge von 200 µl in Probenpuffer. Nach zehnminütiger Inkubation wurden die Beads dreimal in Probenpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 160 µl IgG / IgA-Konjugat (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostik AG, LK 0711-10010, im Wesentlichen ein IgG- or IgA-spezifischer sekundärer Antikörper markiert mit Acridiniuim-Ester) und Inkubation 10 Minuten lang bei 37 °C. Nach drei Waschschritten wurden alkalisches Wasserstoffperoxid schnell hinzugegeben und gemischt um die Emission von Licht auszulösen, gefolgt von der sofortigen Lumineszenzdetektion der Reaktion 10 Sekunden lang. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt:

		ELISA	ELISA
		IgA	IgG
		Verhältnis pos: ≥ 1,1 qrenzw.: 0.8-<1.1	Verhältnis pos: ≥ 1,1 qrenzw: 0.8-<1.1
Nr.		Verhältnis pos: ≥ 1,1 qrenzw.: 0.8-<1.1	Verhältnis pos: ≥ 1,1 qrenzw: 0.8-<1.1
1	IgG / IgA positive Proben	8,2	2,2
2		12,7	6,3
3		13,1	5,4
4	Negative Proben	0,3	0,3
5		0,3	0,1
6		0,3	0,0
7		0,4	0,1
8		0,5	0,3
15	IgM positive	2,3	2,1
16	IgM positive	1,1	5,6
17	Proben	0,9	6,5
20	blank

	Chemilumineszenz		Chemilumineszenz		Chemilumineszenz
	IgG		IgA		IgM
	MW (RLU) Cutoff 40.000	Verhältnis pos: ≥ 1,1 bl: 0.8-1.1	MW (RLU) Cutoff 50.000	Verhältnis pos: ≥ 1,1 bl: 0.8-1.1	MW (RLU) Cutoff 50.000	Verhältnis pos: ≥ 1,1 bl: 0.8-1.1
1	36.051	0,9	79.014	1,6	9.535	0,2
2	128.217	3,2	244.029	4,9	24.354	0,5
3	223.597	5,6	307.108	6,1	21.478	0,4
4	3.222	0,1	6.861	0,1	4.495	0,1
5	4.152	0,1	4.707	0,1	2.095	0,0
6	2.005	0,1	3.943	0,1	2.133	0,0
7	15.280	0,4	9.498	0,2	4.929	0,1
8	11.401	0,3	10.970	0,2	2.745	0,1
15					9.292	1.0
16					50.715	1,3
17					62.684	0,0
20		576			1.826	0,0

Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper gegen SEQ ID NO: 1 unter Verwendung von Chemilumineszenz nachgewiesen werden können. Es besteht eine gute Korrelation mit den ELISA-Ergebnissen. Daher kann Chemilumineszenz verwendet werden, um die vorliegende Erfindung auszuführen.

Beispiel 5: Indirekter Immunofluoreszenz-Assay (IFA) mit HEK-S1-Zellen, die SEQ ID NO: 2 exprimieren

IFA wurde unter Verwendung von Trägern mit einem Biochip Array mit rekombinanten HEK293-Zellen durchgeführt, die SARS-CoV-2-S1-Protein enthielten oder mit HEK293-Kontrollzellen, um zu zeigen, dass dieses Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 verwendet werden kann.

Jedes Biochip-Mosaik wurde mit 35 µL 1:100 PBS-verdünnten Serumproben bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, mit PBS-Tween gewaschen und in PBS-Tween 5 Minuten lang eingetaucht. Im zweiten Schritt wurde Fluorescein-Isothiocyanat-(FITC)-markierter Ziegen-anti-human IgG (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck) angewandt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Träger wurden mit einer Spülung PBS-Tween gewaschen und dann 5 Minuten lang in PBS-Tween eingetaucht. Die Träger wurden in PBS-gepuffertes Glycerin umfassend DABCO (ungefähr 10 µL pro Feld) eingebettet und mit Fluoreszenz-Mikroskopie analysiert. Alternativ wurden die Träger 30 Minuten lang mit PBS vor der Serum-Inkubation inkubiert und gebundene Human-lgGs wurde mit einer 30 Minuten langen Inkubation mit anti-human-lgG-Biotin (1:200, 109-065-098, Dianova) nachgewiesen, gefolgt von einem Waschschritt wie oben beschrieben und 30 Minuten Inkubation mit ExtrAvidin-FITC (1:2000, E2761, Sigma-Aldrich), gefolgt von einem weiteren Waschschritt. Die Proben wurden als positiv oder negativ klassifiziert basierend auf der Fluoreszenz-Intensität der transfizierten Zellen im direkten Vergleich mit Kontroll-transfizierten Zellen und Kontrollproben. Die Ergebnisse wurden durch zwei unabhängige Beobachter unter Verwendung eines EUROStar-II-Mikroskops (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck, Deutschland) evaluiert. Die Reagenzien wurden von Merck, Darmstadt, Deutschland oder Sigma-Aldrich, Heidelberg, Deutschland bezogen, wenn nicht anders angegeben.

Die Seren eines S1 IgG ELISA-positiven Patientenserums (PS) zeigten eine positive Reaktion mit S1 (SEQ ID NO: 2) aber nicht mit kontroll-transfizierten HEK-Zellen (3), wohingegen keine der 49 S1 IgG ELISA-negativen Kontrollseren reagierte. Die Signalintensität des Patientenserums wurde verbessert durch Inkubieren der HEK-S1-Zellen mit PBS vor der Serum-Inkubation und vor dem Nachweis von humanen IgG-Antikörpern mit anti-human-lgG-Biotin/ExtrAvidin-FITC. Insgesamt zeigten 15 von 24 S1-lgG-ELISA-positiven Patientenseren eine positive Reaktion in HEK-S1-IFA mit anti-human-lgG-Biotin/ExtrAvidin-FITC.
Daher kann IFT verwendet werden, um die Erfindung auszuführen.

Beispiel 6: Impfstudien

Ein gesundes Subjekt erhielt an Tag 1 ein Injektion mit 12.86 µg rekombinanten S1-Protein in physiologischem PS (SEQ ID NO: 3) in den musculus quadriceps. Alum Adjuvans (Twinrix für Erwachsene, EMRA-MED Arzneimittel GmbH) wurde gemäß Anweisung des Herstellers angewandt. An den Tagen 9, 21 und 28 erhielt das Subjekt eine weitere Injektion mit 12,86 µg S1-Protein in physiologischem PBS-Puffer und 10 µl Imject alaun adjuvans (Thermo Scientific Imject Alum Adjuvant Alaun) in 500 µl Natriumchlorid-Lösung. An den Tagen 10, 23 und 29 wurden Blutproben abgenommen.

Die Anwesenheit von IgG- und IgA-Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 (1) und N-Protein wurde in Serumproben aus dem gesunden Subjekt unter Verwendung von serologischen Kits bestimmt (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, EI 2606-9601 A, EI 2606-9601 G, EI 2606-9601-2 G und EI 2606-9601-2 M, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die bestimmten Antikörper-Titer sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Antikörper gegen SARS-CoV-2-Antigene in einem unter Verwendung von S1-Protein geimpften Subjekt

Tag	IgA (S1) (Cut off: <0.8)	IgG (S1) (Cut off: <0.8)	IgG (NCP) (Cut off: <0.8)	IgM (NCP) (Cut off: <0.8)
10	0.5	0.5	-	-
23	1.0	0.2	-	-
29	3.5	6.2	0.6	0.7

Als positive und negative Kontrollen wurden Proben von Patienten mit einer SARS-CoV-2-Infektion (d.h. erwartete Anwesenheit von Antikörpern gegen SARs-CoV-2) und Proben von gesunden Blutspendern (d.h. erwartete Abwesenheit von Antikörpern gegen SARS-CoV-2) verwendet; siehe Tabelle 4 bzw. Tabelle 5.

In zwei Patienten mit SARS-CoV-2-Infektion (Positivkontrollen) wurden Proben 17 bzw. 19 Tage nach dem Beginn der Symptome erhalten (gewöhnlich 5-6 Tage nach der Infektion). Die bestimmten Antikörper-Titer sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: Antikörper gegen SARS-CoV-2-Antigene in zwei Patienten mit SARS-CoV-2-Infektion

Tag	IgA (S1)	IgG(S1)	IgG (N)	IgM (N)
	(Cut off: <0.8)	(Cut off: <0.8)	(Cut off: <0.8)	(Cut off: <0.8)
Patient 1	2,6	1,8	1,7	1,3
Patient 2	1.3	6.3	3.5	11.4

Bei vier gesunden Subjekten, die keinerlei Impfung erhielten (Negativ-Kontrollen), wurden Proben erhalten. Die Antikörper-Titer sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5: Antikörper gegen SARS-CoV-2-Antigene in gesunden Subjekten

Tag	IgA (S1)	IgG (S1)	IgG (NCP)	IgM (NCP)
	(Cut off: <0.8)	(Cut off: <0.8)	(Cut off: <0.8)	(Cut off: <0.8)
Patient 1	0,0	0,1	0,0	0,5
Patient 2	0,2	0,3	0,1	0,4
Patient 3	0,1	0,1	0,1	0,2
Patient 4	0,1	0,1	0,1	0,1

Diese Ergebnisse zeigen, dass mit SEQ ID NO: 1 oder einer Varianten davon geimpfte Subjekte von infizierten Subjekten oder Subjekten, die mit einem Vakzin behandelt wurden, das nicht SEQ ID NO: 1 oder eine Variante davon umfasst, unter Verwendung eines Tests basierend auf dem Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO: 1 unterschieden werden können. Während Antikörper gegen S1, wie es in dem Vakzin enthalten ist, in beiden nachgewiesen werden kann, könnten Antikörper gegen das N-Protein nur in infizierten Patienten nachgewiesen, aber nicht in den geimpften Subjekten.

Beispiel 7: Nachweisung von Antikörpern gegen RBD und S1 unter Verwendung von Dot-Blot Reagenzien: RBD (SEQ ID NO: 34) und S1 (SEQ ID NO: 3)-Antigene wurden erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben. Verdünnungen der Proben von Patienten mit SARS-CoV-2, wie mit einem positiven PCR-Test gezeigt wurde (1075, 1076, 1078, 1079, 1080, 1084, 1085, 1098, 1099, 1100) in Verdünnungspuffer (3% Rinder-Serum-Albumin in 1x Universalpuffer (10x Konzentrat, Produktnummer 20125896) wurden vorbereitet. Proben von gesunden Blutspendern (BS01, BS10, BS25, BS32, BS43) wurden als zusätzliche Negativkontrollen verwendet.

Die monoklonalen Antikörper AK78, AK76 und AK80, verwendet als Positivkontrollen, waren jeweils monoklonale anti-His-tag-Antikörper (Lindner P, Bauer K, Krebber A, Nieba L, Kremmer E, Krebber C, Honegger A, Klinger B, Mocikat R, Plückthun A. Specific detection of mit His-Tag versehene proteins with recombinant anti-His tag scFv-phosphatase or scFv-phage fusions. Biotechniques. 1997 Jan;22(1):140-9).

Blotstreifen wurden hergestellt durch Übertragung von 1 µl der Antigenlösung (2,69 mg ml^-1) auf den Streifen. Die Membran war eine 0,22 µm Zellulose-Nitrat-Membran (Sartorius).

Sekundäre Antikörper gegen IgA, IgG und IgM („Anti-human-IgA-AP“, „Anti-human-IgG-AP“ und „Antihuman-IgM-AP“) waren von EUROIMMUN (anti-human IgA/G/M (Ziege), markiert mit alkalischer Phosphatase, Produktnr. ZD 1129 A / G / M) wie auch NBT/BCIP (Produktnr. 10 123964).

Verfahren: Blotstreifen wurden durch Inkubation 15 Minuten lang in Waschpuffer (3% Rinder-Serum-Albumin in 1x Universalpuffer (10x Konzentrat, Produktnummer 20125896) blockiert, gefolgt von der Inkubation des Streifens in angemessen verdünnter Probe 3 Stunden lang bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Waschschritten unter Verwendung von Waschpuffer, gefolgt von Inkubation des Streifens in entsprechend verdünnter Probe 30 weitere Minuten lang, gefolgt wiederum von Waschschritten, gefolgt von Färben durch Inkubation in NBT/BCIP-Lösung zehn Minuten lang, gestoppt durch Waschen der Streifen dreimal gründlich in demineralisiertem Wasser.

Ergebnisse: Die 4 und 5 zeigen die Ergebnisse der Dot-Blot-Analyse der Proben und Kontrollen. Der Assay konnte erfolgreich aufgebaut werden, beurteilt anhand der positiven Ergebnisse unter Verwendung der monoklonalen Antikörper statt Proben und der nicht vorhandenen Signale bei Verwendung von Negativ-Kontrollen.

Während sowohl S1 als auch RBD verwendet wurden können, um IgM-, IgA- und IgG-Antikörper zu detektieren, sind die Reaktionen im Allgemeinen etwas stärker, wenn S1 verwendet wird, was nahelegt, dass sowohl die RBD als auch flankierende Sequenzen Epitope oder Teile davon enthalten. Darüber hinaus kann die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung durch die Faltung des Antigens beeinflusst werden.

Interessanterweise konnten IgA- und IgM-, aber nicht IgG-Antikörper in Patient 1085 nachgewiesen werden, was die ELISA-basierten Resultate bestätigt, dass der Nachweis von IgA-Antikörpern die Sensitivität erhöht, insbesondere zusätzlich zu IgG. Der Patient wurde vielleicht in einer Frühphase der Krankheit untersucht, als noch keine IgG-Antikörper nachweisbar waren. Umgekehrt waren nur IgG-Antikörper in Patient 1100 nachweisbar, dessen Probe möglicherweise zu einer Spätphase der Krankheit nach dem Verschwinden der IgA-Antikörper erhalten worden war.

Im Allgemeinen ergeben IgA- und IgG-Antikörper stärkere Signale als IgM-Antikörper.

Beispiel 8: Nachweis von Antikörpern gegen Peptide abgeleitet von RBD und S1 unter Verwendung von Dot-Blot

Die Peptide P1 (RTQLPPAYTNS, SEQ ID NO: 41), P2 (SGTNGTKRFDN, SEQ ID NO: 42), P3 (LTPGDSSSGWTAG, SEQ ID NO: 35), P4 (NNLDSKVGG, SEQ ID NO: 55), P5 (YQAGSTPCNGV, SEQ ID NO: 36), P6 (YGFQPTNGVGYQ, SEQ ID NO: 37) und eine Fusion umfassend P1-P6 (SEQ ID NO: 56) wurden als Fusionen mit N-terminalem His-tag umfassend eine Protease-Spaltstelle (Sequenz der Fusion umfassend P1: SEQ ID NO: 43; P2: SEQ ID NO: 44; P3: SEQ ID NO: 45; P4: SEQ ID NO: 46; P5; SEQ ID NO: 47; P6: SEQ ID NO: 48; Fusion umfassend P1-P6: SEQ ID NO: 49) durch E. coli Rosetta(DE3)pLacl-Zellen unter Verwendung von Standardverfahren basierend auf dem pET24d-Plasmid bei 37°C drei Stunden lang in LB-Medium umfassend Kanamycin and Chloramphenicol unter Verwendung von IPTG-Induktion exprimiert. Die Zellen wurden geerntet, in phosphatgepufferter Saline resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

Die 6, 7 und 8 zeigen die Ergebnisse der Dot-Blot-Assays unter Verwendungen der Konstrukte P1 bis P6. P6, welches Teil von RBD ist, zeigte die stärkste Reaktion, unabhängig davon, ob IgA, IgM oder IgG nachgewiesen wurde, aber es konnte auch mit P1, P2 (außer mit IgM), P3 und P4 (außer IgM) und P5 etwas Reaktivität gezeigt werden. Die Reaktion mit IgG und IgA waren im Allgemeinen stärker als mit IgM.

Die Proben, die Zeitverläufe mit mehr als einer Probe von mehreren Patienten repräsentierten, zeigten, dass der Dot-Blot verwendet werden kann, um Patienten zu überwachen. Zum Beispiel zeigte Patient SK1586 (drei Zeitpunkte) die stärkste IgM-Reaktion mit der ersten Probe (1.3i), während das Signal schwächer ist, wenn die zweite (1.11.i) und die dritte Probe (1.19) verwendet werden, insbesondere im Verhältnis zu P3 (9). Die gleichen Proben zeigten eine stärkere Reaktion, wenn die Peptide P1 und P6 verwendet wurden, um IgA nachzuweisen (10). Die Reaktion war im Allgemeinen starker, wenn IgG-Antikörper nachgewiesen wurden, aber eine zeitabhängige Reaktion kann unter Verwendung der gleichen Proben überwacht werden, insbesondere Peptide P6, P1 und das Fusionsprotein P1 bis P6 (11). Die Beispiele 7 und 8 zeigen, dass Antikörper SEQ ID NO: 1 unter Verwendung von Dot-Blot und verschiedenen Fragmenten von SEQ ID NO: 1 nachgewiesen werden können.

Beispiel 9: Nachweis von Antikörpern gegen RBD und S1 unter der Verwendung von Western-Blot

Eine nicht-reduzierende SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 2 µg RBD (SEQ ID NO: 34) oder S1 (SEQ ID NO: 3) durchgeführt. Eine Probe umfassend 10 µl des Proteins wurde mit 4 µl NuPAGE-PP (NuPage LDS Probenpuffer (4x), Firma Fisher Scientific GmbH) und 1 µl EU-PBS (phosphatgepufferte Saline) gemischt, zehn Minuten lang bei 70 °C inkubiert. 12 µl der sich daraus ergebenden Lösung wurden pro Spur auf ein nicht-reduzierendes 2D-Gel geladen (NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm x 2 D, Fisher Scientific GmbH) und einer Elektrophorese in Laufpuffer (NuPage MOPS SDS Running Buffer, Fisher Scientific GmbH) unterzogen. Getrennte Proteinbanden wurden auf eine Nitrozellulose-Membran 60 Minuten lang bei 400 mA übertragen (PowerPac HC Power Supply, Firma Bio-Rad) transferiert. Die Membranstreifen konnten unter Verwendung von PonceauS gefärbt werden, gefolgt von Waschen in 50 mM Tris, aber wurden in jedem Fall einer Blockierung 15 Minuten lang in Waschpuffer (3% Rinder-Serum-Albumin in 1x Universalpuffer (10x Konzentrat, Bestellnummer: 20125896) unterzogen, gefolgt von Inkubation des Streifens in entsprechend verdünnter Probe drei Stunden lang bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Waschschritten unter Verwendung von Waschpuffer, gefolgt von Inkubation des Streifens in entsprechend verdünnter Probe 30 weitere Minuten lang, gefolgt von drei Waschschritten, gefolgt von Färben durch Inkubation in NBT/BCIP-Lösung zehn Minuten lang, gestoppt durch Waschen der Streifen dreimal gründlich in demineralisiertem Wasser.

Ergebnisse: Positivkontrolle (anti-His-Antikörper wie zuvor) und positive Proben von mit SARS-CoV-2 infizierten Patienten zeigen, dass Dimere, Trimere und Tetramere zusätzlich zu RBD-Monomeren nachgewiesen wurden. Eine schwache Reaktion wurde unter Verwendung von sekundären Antikörpern, die Antikörper der Klasse IgA nachweisen, mit sechs Seren nachgewiesen, eine schwache Reaktion mit drei weiteren Seren und eine starke Reaktion mit einem Serum. Wenn zwei oder mehr Proben von verschiedenen Zeitpunkten zur Verfügung standen und reaktiv waren, konnte ein Absinken der Konzentration der IgA-Antikörper beobachtet werden, zum Beispiel bei Proben SK159822.1i bis 2.4i, genauso mit Proben 6i und 61i und 7i und 7.1i (12).

Was den Nachweis von Antikörpern der Klasse IgG betrifft, zeigten alle Proben eine Reaktion, die mittels ELISA als positiv gezeigt werden konnten (13). Die Probe SK1606 169i war basierend auf den Ergebnissen beider Methoden negativ.

Was den Nachweis von Antikörpern der Klasse IgM betrifft, wurde eine sinkende Konzentration von Antikörper in einigen Fällen beobachtet, insbesondere SK15862.2 bis SK15862.16 genauso wie SK159986i bis SK1599861i, wenn zwei oder mehr Proben von verschiedenen Zeitpunkten zur Verfügung standen (14). Die Ergebnisse waren hochgradig vergleichbar, falls S1 statt RBD als Antigen verwendet wurde (15, 16 und 17).

Es wird geschlussfolgert, dass mit Western-Blotting die vorliegende Erfindung ausgeführt werden kann.

Beispiel 10: Nachweis von IgA-, IgM- und IgG-Antikörpern gegen RBD unter Verwendung eines kompetitiven Testformates

Ein EUROIMMUN SARS-CoV-2-NeutraLISA-Kit (EI 2606-9601-4) wurde für das folgende Experiment gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, soweit nicht anders angegeben.

Kurz gesagt wurde eine mit der S1-Domäne des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 beschichtete Mikrotiterplatte, das rekombinant in der humanen Zelllinie HEK293 exprimiert worden war (SEQ ID NO: 3), verwendet. Im ersten Schritt der Analyse wurden die Kontrollen und Proben (Blutproben eines Subjektes) mit einem Probenpuffer umfassend lösliches biotinyliertes humanes ACE2 (SEQ ID NO: 50) verdünnt und in den Reagenzien-Wells einer Mikrotiterplatte inkubiert. Neutralisierende Antikörper, die in der Probe vorhanden sind, konkurrieren mit dem ACE2 um die Bindestellen des SARS-CoV-2-S1-Spike-Proteins, mit dem die Wells beschichtet worden waren. Ungebundenes ACE2 und ungebundene Probe wurden in einem nachfolgenden Waschschritt entfernt. Um gebundenes ACE2 nachzuweisen, wurde eine zweite Inkubation unter Verwendung von Peroxidase-markiertem Streptavidin durchgeführt, das an das biotinylierte ACE2 bindet, das auf dem Antigen auf der Mikrotiterplatte immobilisiert ist und im dritten Schritt eine Farbreaktion katalysiert. Die Intensität der produzierten Farbe verhält sich umgekehrt proportional zur Konzentration der neutralisierenden Antikörper in der Probe, wie in Tabelle 6 gezeigt:

	ACE2-Konzentration 6,0 µg/ml
Probe		Positive Probe	Positive Probe	Negative Probe
1:2,5		0,248	0,166	1,177
1:5		0,342	0,294	1,208
1:10		0,521	0,446	1,213
1:20		0,697	0,605	1,190
1:40		0,870	0,738	1,231
1:80		0,910	0,829	1,172
1:160		0,932	0,877	1,187
Blank		0,878	0,911	1,107

Die Ergebnisse zeigen, dass eine zunehmende Verdünnung einer positive Probe, das heißt eine sinkende Konzentration der neutralisierenden Antikörper, zu einer Zunahme der produzierten Farbe führt. Umgekehrt ist das Signal hoch und korreliert nicht mit der Verdünnung der Probe, wenn eine negative Probe verwendet wird.
Das bestätigt, dass der Assay verwendet werden kann, um neutralisierenden Antikörper gegen RBD in einer Probe nachzuweisen und zu quantifizieren.

Beispiel 11: Nachweis von Antikörpern gegen die SARS-CoV-2-Antigene S1- und N-Protein durch ELISA

Ein Kollektiv mit mehreren Proben, abgenommen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion, von jedem von 43 deutschen COVID-19-Patienten, wurde verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern über die Zeit nachzuweisen. Alle Sera wurden auf Antikörper gegen die S1-Domäne (SEQ ID NO: 3) der SARS-CoV-2-Spike-Domäne (IgA-und IgG-ELISA-Kits, EUROIMMUN, Produkte wie in den Beispielen 2 und 3) und auf Antikörper gegen das N-Protein (IgG-und IgM-ELISA-Kits, EUROIMMUN, wie in den Beispielen 2 und 3).

Zwischen den Tagen >10 und <21 nach dem Beginn der Krankheit wurden IgG-und IgA-Antikörper gegen S1 von SARS-CoV-2 in 70,4% bzw.88,9% der Proben nachgewiesen, während IgG und IgM gegen das N-Protein in 86.2% bzw. 50% der Proben nachgewiesen wurden. Bei sechs Patienten war der IgA-Antikörper gegen S1 der erste Antikörper, der nachgewiesen werden konnte, wohingegen nur in zwei Fällen ein anderer Antikörper als IgA gegen S1 der erste Antikörper war, der nachgewiesen werden konnte. Bei 30 Patienten konnte zu keiner Zeit IgM-Antikörper gegen N-Protein nachgewiesen werden.

Mehr als 60 Tage nach dem Ausbruch der Krankheit wurden in 85,1% bzw. 80,5% der Proben IgG-und IgA-Antikörper gegen S1 von SARS-CoV-2 nachgewiesen, wohingegen IgG und IgM gegen N-Protein in 81,4% bzw. 0% nachgewiesen wurden. In vier Patienten war IgG gegen S1 nachweisbar, aber kein IgG gegen N-Protein. Im Gegensatz dazu war IgG gegen N-Protein, aber kein IgG gegen S1 nur in einem Patienten nachweisbar.

Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Nachweis von IgA gegen S1 der sensitivste Test für den Frühnachweis einer Antikörperantwort SARS-CoV-2, genauer gegen sein S1-Protein ist. Im Gegensatz dazu ist der Nachweis von IgG gegen S1 in einer Spätphase der Infektion besonders sensitiv. Beide Tests können durch das Nachweisen von IgA gegen S1 und IgG gegen S1 in einer Reaktion oder in getrennten Reaktionen für eine erhöhte Sensitivität kombiniert werden, optional in Kombination mit weiteren Assays für eine erhöhte Sensitivität über eine verlängerte Zeitspanne.

Beispiel 12: Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV-2-Antigene S1 und N-Proteine über ELISA in der Spätphase einer SARS-CoV-2-Infektion

Unter Verwendung der gleichen Methode wie in Beispiel 11 wurden Proben aus einer anderen Kohorte mit 15 Patienten mit einer SARS-CoV-2-Infektion 21 Tage oder später nach Ausbruch er Krankheit erhalten und auf IgG- und IgM-Antikörper gegen N-Proteine und IgA- und IgG-Antikörper gegen das S1-Protein getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt:

Assay	Positive	Grenzwertig	Negative	Sensitivität
NCP ELISA IgG	13	0	2	86,7%
NCP ELISA IgM	5	2	8	46,7%
S1 ELISA IgG	14	0	1	93,3%
S1 ELISA IgA	12	3	0	100%

Die Studie mit dieser zusätzlichen Kohorte bestätigt, dass die Sensitivität der Diagnose in der späten Phase einer SARS-CoV-2-Infektion am höchsten ist, wenn Antikörper gegen das S1-Protein nachgewiesen werden.

Beispiel 13: Die Spezifität des Nachweises von Antikörpern gegen SARS-CoV-2-Antigene S1 und N-Protein

Die Spezifität des Anti-SARS-CoV-2-ELISA (IgA, EI 2606-9601 A, ausgeführt gemäß Anweisung des Herstellers, mehr Details in den Beispielen 2 und 3) wurde bestimmt durch Analysieren von 210 Patientenproben, die positiv waren, zum Beispiel auf Antikörper gegen andere humane pathogene Corona-Vieren, andere Pathogene oder rheumatoide Faktoren. Zusätzlich 1052 Proben von Blutspendern, Kindern und Schwangeren untersucht, die vor dem Auftreten von SARS-CoV-2 (vor Januar 2020) erhalten wurden. Ergebnisse im grenzwertigen Bereich (n=9) wurde nicht in die Berechnung der Spezifität einbezogen. Dies ergab eine Spezifität von 98,3%,wie gezeigt in Tabelle 8.

Die Spezifität des Anti-SARS-CoV-2-ELISA (IgG, EI 2606-9601 G, ausgeführt gemäß Anweisung des Herstellers, mehr Details in den Beispielen 2 und 3) wurde auf die gleiche Weise bestimmt, basierend auf 222 positiven Patientenproben und 1052 Proben von Blutspendern, Kindern und Schwangeren. Dies ergab eine Spezifität von 98,3%, wie gezeigt in Tabelle 8:

Kohorte	n	Spezifität IgA ELISA in %	Kohorte	n	Spezifität IgG ELISA in %
Blutspender	849	98.2	Blutspender	849	99.5
Schwangere Frauen	99	97	Schwangere Frauen	199	99.5
Kinder	104	100	Kinder	74	100
Ältere	97	99	Ältere	97	100
Infektion mit anderen humanen pathogenen Corona-Viren	11	100	Infektion mit anderen humanen pathogenen Corona-Viren	23	100
Influenza (frisch geimpft)	40	100	Influenza (frisch geimpft)	40	100
Akute EBV-Infektionen & heterophile Antikörper	22	90.5	Akute EBV-Infektionen & heterophile Antikörper	22	100
Rheumatoide Faktoren	40	100	Rheumatoide Faktoren	40
Gesamt	1262	98.3	Gesamt	1344	99.6

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Claims

Kit umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, bevorzugt vorliegend als Beschichtung auf einem diagnostisch nützlichen Träger, und ein oder mehr als ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen Antikörper gegen SEQ ID NO1, einen Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt der Immunglobulin-Klasse IgA, bevorzugt einen sekundärer Antikörper, der spezifisch an Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA bindet, bevorzugt umfassend eine nachweisbare Markierung, und einen Verdünnungspuffer.
Kit nach Anspruch 1, wobei der diagnostisch nützliche Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, die einen Bead, bevorzugt einen paramagnetischen Bead, einen Teststreifen, eine Mikrotiterplatte, eine Membran, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Western Blot, Linienblot und Dot Blot, eine Lateral Flow-Vorrichtung, eine Glasoberfläche, einen Objektträger, einen Mikroarray und einen Biochip umfasst und bevorzugt eine Mikrotiterplatte ist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der Kit zwei oder mehr, bevorzugt drei oder mehr Kalibratoren umfasst.
Kit gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei jedem Kalibrator um einen rekombinanten Antikörper handelt, der an SEQ ID NO1 bindet und bevorzugt von einem sekundären Antikörper erkannt wird, der an Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA bindet.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Variante eine Sequenzidentität von wenigstens 88, bevorzugt 90, 92, 94, 96, 97, 98 oder 99 % zu SEQ ID NO1 oder einem Fragment davon aufweist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Variante wenigstens 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 oder 600 aufeinander abfolgende Aminosäuren der Sequenz von SEQ ID NO1 aufweist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid rekombinant, isoliert und/oder aufgereinigt ist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend wenigstens eine weitere Komponente aus der Gruppe umfassend einen Kalibrator, eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle, einen Waschpuffer, eine Nachweislösung, bevorzugt eine Substratlösung, eine Stopplösung und eine Schutzfolie.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers ein sekundärer Antikörper ist, der menschliche Antikörper erkennt, bevorzugt gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA und/oder IgG und/oder IgM, bevorzugter IgA.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der sekundäre Antikörper eine nachweisbare Markierung aufweist, bevorzugt aus der Gruppe umfassend eine fluoreszenzfähige, radioaktive, chemilumineszenzfähige oder enzymatisch aktive Markierung.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der nachzuweisende Antikörper ein Säugetier-, bevorzugt ein humaner Antikörper ist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Kit einen ersten sekundären Antikörper gegen eine Immunglobulin-Klasse, bevorzugt IgA, enthält und einen zweiten sekundären Antikörper gegen eine andere Immunglobulin-Klasse, bevorzugt IgG.
Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt der Immunglobulin-Klasse IgA, zur Herstellung eines diagnostischen Kits, bevorzugt zum Nachweis einer SARS-CoV-2-Infektion.
Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, der bevorzugt von einem sekundären Antikörper erkannt wird, der an Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA bindet, als Kalibrator zur frühen Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion.
Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt der Immunglobulin-Klasse IgA, oder des Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion oder zur Differenzialdiagnose einer Coronavirus-Infektion, bevorzugt zum Unterscheiden einer SARS-CoV-2-, MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei die Diagnose eine frühe serologische Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion darstellt oder den Nachweis der Infektion in einer Frühphase der Infektion umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei die Diagnose den Nachweis von SARS-CoV-2 mit erhöhter Sensitivität in einer Frühphase der Infektion umfasst.