DE202020105117U1 - Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion - Google Patents

Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion Download PDF

Info

Publication number
DE202020105117U1
DE202020105117U1 DE202020105117.2U DE202020105117U DE202020105117U1 DE 202020105117 U1 DE202020105117 U1 DE 202020105117U1 DE 202020105117 U DE202020105117 U DE 202020105117U DE 202020105117 U1 DE202020105117 U1 DE 202020105117U1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
seq
antibody
sars
cov
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
DE202020105117.2U
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Original Assignee
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP20158626.0A external-priority patent/EP3715847A1/de
Application filed by Charite Universitaetsmedizin Berlin, Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG filed Critical Charite Universitaetsmedizin Berlin
Publication of DE202020105117U1 publication Critical patent/DE202020105117U1/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Diagnostisch nützlicher Träger umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, die an einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 aus einer Probe von einem Patienten binden kann, der an einer SARS-CoV-2-Infektion leidet, wobei das Polypeptid bevorzugt auf der Festphase des Trägers immobilisiert ist.

Description

  • Die Erfindung betrifft einen diagnostisch nützlichen Träger umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, die an einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 aus einer Probe von einem Patienten binden kann, der an einer SARS-CoV-2-Infektion leidet, wobei das Polypeptid bevorzugt auf der Festphase des Trägers immobilisiert ist, und einen Kit umfassend den Träger.
  • Gegen Ende des Jahres 2019 zeigte sich eine zunehmende Anzahl von Patienten mit Lungenentzündung verursacht durch ein unbekanntes Pathogen in Wuhan, der Hauptstadt der Provinz Hubei in China, und erstreckte sich beinahe über das gesamte Land China. Ein neues Coronavirus wurde isoliert, und auf Basis seiner Phylogenie, Taxonomie und etablierten Vorgehensweisen erkannte die Corona Study Group (CSG) es als Verwandten des Severe Acute Respiratory Syndrome Corona-Virus (SARS-CoV-1) und bezeichnete es als Severe Acute Respiratoy Syndrome Corona-Virus 2 (SARS-CoV-2).
  • Obwohl SARS-CoV-2 im Allgemeinen weniger pathogen als SARS-CoV-1 und Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) ist, zeigt es eine vergleichsweise hohe Übertragbarkeit. Da die Symptome mild sein können und mit einer Erkältung verwechselt werden können, besteht die Gefahr, dass Patienten sich ihrer Infizierung nicht bewusst sind und zur weiteren Verbreitung des Virus beitragen.
  • SARS-CoV-2 ist ein Coronavirus mit vier Strukturproteinen, genauer den Spike (S)-, E (Envelope)-, M (Membran)- und N (Nukleokapsid)-Proteinen. Das N-Protein trägt das RNA-Genom, wohingegen die anderen drei Strukturproteine Bestandteile der viralen Hülle darstellen. Das S-Protein ist dafür verantwortlich, dass das Virus in die Lage versetzt wird, sich an die Membran einer Wirtszelle anzuheften und mit ihr zu fusionieren. Es umfasst eine S1-Domäne, die das Anheften katalysiert und eine S2-Domäne, die die Fusion mit der Wirtszelle katalysiert. Die S1-Domäne umfasst die Rezeptorbindungsdomäne (RBD), die Bindestelle für den Rezeptor Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) auf menschlichen Wirtszellen. Daher ist die RBD die Bindestelle von neutralisierenden Antikörpern, die die Interaktion zwischen dem Virus und seinen Wirtszellen blockieren und damit Immunität verleihen.
  • Im Gegensatz zu der Gruppe von Coronaviren, die SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 umfasst und die mit einer hohen Mortalität und schwerer Krankheit assoziiert sind, gibt es eine weitere Gruppe von Coronaviren, die normalerweise mit einer milden und schnell vorübergehenden Krankheit assoziiert sind, und sie umfasst die Coronaviren 229E, NL63, OC43 und HKU1.
  • Aufgrund der hohen Übertragbarkeit sind zuverlässige Verfahren zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion und der Immunität gegen SARS-CoV-2 von höchster Bedeutung. In der Vergangenheit wurde eine Kombination von serologischen Verfahren und RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction) verwendet, um Infektionen mit Coronaviren nachzuweisen und zu bestätigen.
  • RT-PCR-Verfahren basieren auf dem Nachweis von den Nukleinsäuren des interessierenden Coronavirus, genauer der RNA. Sie sind schnell und mit Hilfe von Proben aus Rachen- oder Nasen-/Rachen-Abstrichen können sie während der ersten Woche der Krankheit für den Nachweis von SARS-CoV-1 verwendet werden. Ihre Nützlichkeit hängt jedoch sehr davon ab, wie lange die Nukleinsäure in Proben nachweisbar ist, was sich von Virus zu Virus unterscheidet. Insbesondere mangelt es einem negativen Ergebnis von einem diagnostischen Test, der mit einer Probe durchgeführt wurde, die nach der Frühphase der Krankheit erhalten wurde, an Aussagekraft. Daher sollten mehrere Proben überprüft werden, eine aus der ersten Woche der Infektion und eine Folgeprobe, die drei bis vier Wochen später erhalten wurde. Darüber hinaus wird eine Probe aus dem oberen Teil der Atemwege des Patienten benötigt. Eine nicht fachmännische Gewinnung einer solchen Probe kann ebenfalls zu falsch-negativen Ergebnissen führen.
  • Corman et al. veröffentlichten einen RT-PCR-basierten Test für den Nachweis von SARS-CoV-2 (Corman, V. M., Landt, O., Kaiser, M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):2000045. doi: 10.2807/1560-7917. ES.2020.-25.3.2000045).
  • Daher werden auch serologische Tests häufig verwendet. Das besondere Kennzeichen dieser Tests besteht in dem Nachweis von Antikörpern, die spezifisch mit einem bestimmten Virus wie SARS-CoV-2 assoziiert sind. Wenn die Anwesenheit eines solchen Antikörpers in Patientenserum nachgewiesen wird, zeigt dies an, dass der Patient infiziert sein oder infiziert gewesen sein. Im Gegensatz dazu legt die Abwesenheit des Antikörpers nahe, dass der Patient zuvor nicht infiziert war. Jedoch kann ein negatives Ergebnis auch in einer sehr frühen Phase der Krankheit erhalten werden, d. h. bevor der Körper des Patienten in der Lage war, spezifische Antikörper herzustellen. Eine weitere serologische Überwachung, unter Berücksichtigung, ob ein nachgewiesener Antikörper zu einer bestimmten Immunglobulin-Klasse gehört, kann dazu beitragen, den Verlauf der Krankheit zu überwachen und eine akute von einer vorherigen Infektion oder Impfung zu unterscheiden. Z. B. legt eine geringe Konzentration von IgG, die über Monate oder Jahre persistiert, nahe, dass eine Infektion in der Vergangenheit vorlag oder dass eine Impfung vorliegt.
  • Wenn ein Test erstmalig entwickelt und validiert wird, kann der Zeitpunkt, zu dem ein Antikörper nach einer Infektion mit einem neuen Virus erstmalig produziert wird und nachweisbar ist, nicht vorhergesagt werden, weil er von einer Vielzahl von Faktoren abhängig ist, darunter dem Virus selbst, dem Ausmaß seiner Immunogenizität, dem Patienten und seinem Immunsystem, das z. B. supprimiert oder überstimuliert sein kann, der Immunglobulin-Klasse des interessierenden Antikörpers und dem Zielantigen, das für die Entwicklung des diagnostischen Tests ausgewählt wurde.
  • Zudem sind die Spezifität und Sensitivität solcher Tests entscheidend. Z. B. kann eine Gruppe von Viren, z. B. Flaviviren, Antigene mit einem Epitop mit konservierter Aminosäuresequenz gemein haben. Der Nachweis eines Antikörpers gegen ein solches Epitop zeigt dann nicht an, welche Art von Virus nachgewiesen wurde. Z. B. wäre es unmöglich, zwischen dem Langat-Flavivirus, das mit keiner bekannten Krankheit bei Menschen assoziiert ist, und dem Dengue-Flavivirus zu unterscheiden, das schwere Dengue, eine lebensbedrohliche Krankheit auslösen kann. Was die Sensitivität angeht, kann die Konzentration eines Antikörpers, der als Indikator der Infektion in Betracht gezogen wird, zu niedrig für einen Nachweis im Routine-Diagnostikbetrieb sein.
  • Daher besteht ein der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegendes Problem darin, einen Test und Reagenzien zum frühen serologischen Nachweis von SARS-CoV-2 bereitzustellen.
  • Ein weiteres der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegendes Problem besteht darin, einen Test bereitzustellen, der verwendet werden kann, um Infektionen mit bekannten Coronaviren zu unterscheiden.
  • Ein weiteres der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegendes Problem besteht darin, einen Test mit hoher optimierter Zuverlässigkeit bereitzustellen, insbesondere mit Hinblick auf Sensitivität und/oder Spezifität, bevorzugt Sensitivität, über einen langen Zeitraum.
  • WO14045254 offenbart Tests zum Diagnostizieren einer MERS-Infektion.
  • US2005/0112559 offenbart SARS-CoV betreffende Verfahren und Agenzien. Das Nukleokapsid-Protein wird als Hauptantigen für die Diagnostik betrachtet.
  • WO2005/118813 offenbart eine Variante des SARS-CoV-verwandten S-Proteins und den Nachweis seiner Anwesenheit oder der Anwesenheit von dagegen bindenden Antikörpern in Proben.
  • US2006/0188519 offenbart Peptide für die Diagnose einer SARS-CoV-Infektion.
  • Hsueh et al., berichteten, dass Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG bereits vier Tage nach Ausbruch einer SARS-Infektion nachgewiesen werden konnten, zum gleichen Zeitpunkt oder einen Tag früher als Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgM und IgA (Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066).
  • Die Probleme werden durch den Gegenstand der unabhängigen und abhängigen Ansprüche gelöst.
  • In einem ersten Aspekt wird das Problem durch ein Verfahren zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion gelöst, umfassend den Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgM, IgG und/oder IgA, bevorzugter ein Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA, in einer Probe von einem Subjekt.
  • In einem zweiten Aspekt wird das Problem gelöst durch ein Verfahren zur Differentialdiagnose einer Coronavirusinfektion, bevorzugt zum Unterscheiden einer SARS-CoV; bevorzugt SARS-CoV-2-; MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion, umfassend den Schritt Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 in einer Probe von einem Subjekt, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgA und/oder IgG, bevorzugter eines Antikörpers der Immunglobulin-Klasse IgA.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgG und/oder IgM gegen SEQ ID NO1 zusätzlich zu der eines Antikörpers der Immunglobulin-Klasse A gegen SEQ ID NO1 nachgewiesen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine Blutprobe, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum, Kapillarblut oder Plasma. Das Kapillarblut liegt bevorzugt in Form eines Dried Blot Spot vor, der, von dem Patienten zubereitet und zum Labor geschickt werden kann, gefolgt von der Extraktion des Blutes.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper unter Verwendung eines markierten sekundären Antikörpers nachgewiesen, der bevorzugt an Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG oder IgM bindet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper, bevorzugt ein Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG oder IgM, unter Verwendung eines Verfahrens nachgewiesen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Kolorimetrie, Immunfluoreszenz, Nachweis von enzymatischer Aktivität, Chemilumineszenz und Radioaktivität umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Infektion in einer frühen Phase nachgewiesen.
  • In einem dritten Aspekt wird das Problem durch die Verwendung eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klasse IgA, zum Diagnostizieren einer SARS-CoV-2-Infektion oder zur Differenzialdiagnose einer Coronavirus-Infektion gelöst, bevorzugt zum Unterscheiden einer SARS-CoV-2-, MERS-, NL63-, 229E-, OC43- und HKU1-Infektion.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform liegt eine Verwendung zur frühen Diagnose der Infektion einer SARS-CoV-2-Infektion vor.
  • In einem vierten Aspekt wird das Problem durch ein Kit gelöst, das ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, bevorzugt beschichtet auf einem diagnostisch nützlichen Träger, und ein oder mehr als einen Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfasst, die einen Antikörper gegen SEQ ID NO1, einen Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und/oder IgM, bevorzugt einen sekundären Antikörper, der spezifisch gegen Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und/oder IgM bindet, bevorzugt umfassend eine nachweisbare Markierung, und einen Verdünnungspuffer.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der diagnostisch nützliche Träger aus der Gruppe ausgewählt, die einen Bead, bevorzugt einen magnetischen Bead, einen Teststreifen, eine Mikrotiterplatte, eine Membran, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Westernblot, Lineblot und Dotblot, eine Lateral-Flow-Vorrichtung, eine Glasoberfläche, einen Mikroskopieträger, einen Mikroarray, eine Chromatographiesäule und einen Biochip umfasst und bevorzugt eine Mikrotiterplatte ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit zwei oder mehr als zwei, bevorzugt drei oder mehr als drei Kalibratoren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Kalibrator ein rekombinanter Antikörper, der gegen SEQ ID NO1 bindet, und der bevorzugt von einem sekundären Antikörper erkannt wird, der an Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA, IgG und/oder IgM bindet.
  • In einem sechsten Aspekt wird das Problem gelöst durch die Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon oder eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und/oder IgM, zur Herstellung eines diagnostischen Kits.
  • In einem siebten Aspekt wird das Problem durch eine Verwendung eines rekombinanten Antikörpers gelöst, der gegen SEQ ID NO1 bindet, der bevorzugt von einem sekundären Antikörper erkannt wird, welcher gegen Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und/oder IgM bindet, als Kalibrator zur Frühdiagnose einer SARS-CoV-2-Infektion.
  • Verschiedene Antigene und Antikörper wurden als Grundlage für den immunologischen Nachweis von Coronaviren verwendet, darunter das ganze Virus oder jedes der Strukturproteine oder Fragmente davon, genauso wie Antikörper, die gegen all diese Antigene binden.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass Antikörper gegen SEQ ID NO1, der S1-Domäne des S-Proteins, während einer Frühphase der Infektion nachgewiesen werden können. Sie können nachgewiesen werden, um die Anwesenheit einer Infektion in einer Frühphase der Infektion zu bestimmen, vor oder wenigstens kurz bevor PCR-basierte Tests beginnen, für viele Patienten falsch-negative Ergebnisse ergeben.
  • Weiterhin basiert die vorliegende Erfindung auf der überraschenden Erkenntnis, dass Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA in vielen Patienten früher als andere Antikörper wie Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG nachgewiesen werden können, auch in einer Subpopulation von Patienten, denen es an nachweisbaren Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgM fehlt.
  • Weiterhin basiert die Erfindung auf der überraschenden Erkenntnis, dass Antikörper gegen SEQ ID NO1 länger persistieren und über einen längeren Zeitraum als Antikörper gegen das SARS-CoV-2-N-Protein nachweisbar sind.
  • Weiterhin besteht eine überraschend geringe Kreuzreaktivität mit einer Reihe von Antikörpern in Proben von Patienten, die mit anderen Coronaviren als SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 infiziert sind, was die überraschende Spezifität des Nachweises von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 erklärt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Begriff „Diagnose“, wie hierin verwendet, in seinem breitestmöglichen Sinn zu verwenden und kann jede Art von Vorgehensweise bedeuten, die darauf abzielt, Informationen zu erlangen, die für die Einschätzung, ob ein Patient in der Vergangenheit, zur Zeit der Diagnose oder in der Zukunft, an einer bestimmten Krankheit oder Störung leidet oder leiden wird oder wahrscheinlich oder mit höherer Wahrscheinlichkeit als ein durchschnittliches Subjekt oder Vergleichssubjekt daran leidet oder leiden wird, wobei das Vergleichssubjekt vorzugsweise ähnliche Symptome aufweist, oder hilfreich ist, um herauszufinden, wie die Krankheit fortschreitet oder in der Zukunft wahrscheinlich fortschreiten wird, oder um das Ansprechen eines Patienten oder von Patienten im Allgemeinen mit Hinblick auf eine bestimmte Behandlung, bevorzugt eine Impfung, zu evaluieren, oder um herauszufinden, ob eine Probe von einem solchen Patienten stammt. Solche Informationen können für eine klinische Diagnose verwendet werden, aber können auch von einem Experimental- und/oder Forschungslabor zum Zweck von allgemeiner Forschung erhalten werden, z. B. um den Anteil an Subjekten, die an der Krankheit leiden, in einer Patientenkohorte oder in einer Population als Teil epidemiologischer Studien zu bestimmen. In anderen Worten umfasst der Begriff „Diagnose“ nicht nur das Diagnostizieren, sondern auch das Prognostizieren und/oder das Überwachen des Verlaufs einer Krankheit oder Störung, umfassend das Überwachen der Reaktion von einem oder mehr als einem Patienten auf die Verabreichung eines Wirkstoffes oder eines Wirkstoffkandidaten, z. B. um dessen Wirksamkeit zu bestimmen. Während das Ergebnis einem spezifischen Patienten für klinische diagnostische Anwendungen zugeordnet und einem Arzt oder einer Einrichtung mitgeteilt werden kann, die den Patienten behandelt, ist dies für andere Anwendungen nicht notwendigerweise der Fall, z. B. bei der Diagnostik für Forschungszwecke, wo es ausreichend sein kann, die Ergebnisse einer Probe von einem anonymisierten Patienten zuzuordnen. Bevorzugt ist die Krankheit eine SARS-Infektion umfassend SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2, bevorzugter eine SARS-CoV-2-Infektion.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verfahren und Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung für Interaktionsstudien verwendet werden, umfassend das Bestimmen, ob ein Wirkstoffkandidat oder eine andere Verbindung, umfassend einen Impfstoffkandidaten oder eine Verbindung aus einem Körper wie ein blockierender Antikörper vorhanden ist und das Binden eines Antikörpers an SARS-CoV-2 stören oder irgendeinen nachfolgenden Prozess beeinflussen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform können sie für das Überwachen der Immunantwort verwendet werden, bevorzugter das Erscheinen und/oder die Konzentration von Antikörpern gegen ein Polypeptid umfassend, bevorzugt bestehend aus SEQ ID NO1, nach der Verabreichung einer immunogenen Zusammensetzung umfassend SEQ ID NO1 oder eine immunogene Variante davon, z. B. an ein Säugetier, bei dem es sich um ein anderes Säugetier als einen Menschen handeln kann, wie beispielsweise ein Versuchstier.
  • Das Subjekt leidet wahrscheinlich oder wahrscheinlicher an einer SARS-CoV-2-Infektion, wenn ein Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA und/oder IgG und/oder IgM gegen SEQ ID NO1 in einer Probe von dem Subjekt nachgewiesen werden kann. Der Fachmann ist mit der Interpretation von Ergebnissen, die die Anwesenheit von Antikörpern widerspiegeln, vertraut (z. B. Doerr, H. W., and Gerlich, W., Medizinische Virologie: Grundlagen, Diagnostik, Prävention und Therapie, Thieme 2010, z. B. Abb. 9.7). Kurz gesagt kann der erste Nachweis von spezifischen Antikörpern für die anfängliche Diagnose von Infektionen verwendet werden. Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgM sind gewöhnlich die ersten nachweisbaren Antikörper, gefolgt von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgG. Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA sind außer in spezifischen Fällen wie bei Enteroviren normalerweise nicht diagnostisch relevant (Gressner/Arndt, Lexikon der Medizinischen Labordiagnostik, 2. Auflage, Springer, 2013, Seite 1387). Wenn sie auftreten, kann dies nach dem Auftreten von IgG-Antikörpern geschehen, und ihre Konzentration wird geringer als die von Antikörpern der Immunglobulin-Klassen IgM und IgG sein. Eine geringe Konzentration von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgG in Abwesenheit von Antikörpern der Immunglobulin-Klassen IgM und IgA zeigt eine frühere Infektion an. Eine zunehmende Konzentration oder eine hohe Konzentration in einer Frühphase der Krankheit von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgG kann eine erneute Infektion anzeigen. Eine geringe Konzentration von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgG, die über eine lange Zeit persistiert, kann eine frühere Immunisierung anzeigen, die aber keine akute Krankheit darstellt, insbesondere in Abwesenheit von Antikörpern der Immunglobulin-Klassen IgM und/oder IgA. Wenn ein Patient mit einem Impfstoff oder Impfstoffkandidaten umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon geimpft wurde, kann der Nachweis eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 oder eine zunehmende Konzentration eines solchen Antikörpers eine erfolgreiche Immunisierung anzeigen.
  • Die Probe stammt bevorzugt von einem Säugetier, bevorzugter von einem Menschen.
  • Daher impliziert der Begriff „Diagnose“ bevorzugterweise nicht, dass die diagnostischen Verfahren oder Agenzien gemäß der vorliegenden Erfindung definitiv und ausreichend sind, um die endgültige Diagnose auf Basis eines einzelnen Tests, geschweige denn Parameters, zu stellen, aber bedeutet einen Beitrag zu einer Vorgehensweise, die als „Differenzialdiagnose“ bezeichnet wird, das heißt eine systematische diagnostische Vorgehensweise, bei der die Wahrscheinlichkeit einer Reihe von möglichen Krankheiten auf der Basis einer Reihe von diagnostischen Parametern in Betracht gezogen wird. Erfindungsgemäß kann unterschieden werden, ob ein Patient, bevorzugt einer, der bereits unter Verdacht steht, unter einer Coronavirusinfektion zu leiden, unter einer SARS-, bevorzugt SARS-CoV-1- und/oder SARS-CoV-2-Infektion, oder unter einer anderen Coronavirusinfektion leidet, bevorzugt mit einem Coronavirus aus der Gruppe umfassend MERS, NL63, 229E, OC43 und HKU1. Z. B. könnte ein Patient anfänglich aufgrund einer möglichen Exponierung in einer Risikoumgebung und/oder basierend auf üblichen Symptomen wie beispielsweise Fieber, Husten oder Kurzatmigkeit unter dem Verdacht stehen, an einer Coronavirusinfektion zu leiden. Eine PCR und/oder ein Immuntest kann anschließend durchgeführt werden. Wenn die PCR negativ ist, z. B. weil die Probe später als eine Woche nach der Infektion abgenommen wurde, kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 nachzuweisen. Zusätzlich kann die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen ein Antigen von einem anderen Coronavirus nachgewiesen werden, bevorzugt aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-1, MERS, NL63, 229E, OC43 und HKU1, bevorzugt MERS, NL63, 229E, OC43 und HKU1. Antikörper, bevorzugt Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA, IgG und/oder IgM gegen Homologe von SEQ ID NO1 von SARS-CoV-2 können nachgewiesen werden. Basierend auf spezifischen klinischen Symptomen wie Kopfschmerzen und Körperschmerzen, die eher charakteristisch für SARS-CoV-1 sind, oder dem Verlust des Geschmacks- oder Geruchsinnes oder angeschwollenem Rachen, die eher charakteristisch für SARS-CoV-2 sind, kann die Diagnose möglicherweise endgültig gestellt werden. Eine Unterscheidung zwischen SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 ist möglich basierend auf der unterschiedlichen zeitaufgelösten Immunglobulin-Klassen-Signatur, insbesondere dem späteren Erscheinen von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA in SARS-CoV-1 (Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066). Die Antikörper-Konzentrationen können überwacht werden, z. B. über mehrere Wochen, z. B. um das Verschwinden oder Auftreten eines interessierenden Antikörpers nachzuweisen, was zum Unterscheiden einer primären und einer sekundären Infektion oder zum Erkennen einer Infektion mit mehr als einem Coronavirus beitragen kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „SARS-CoV-2“, wie hierin verwendet, ein Virus, das durch das Genom charakterisiert ist, wie es in der Datenbank GenBank unter der Zugangsnummer MN908947 oder SEQ ID NO13 charakterisiert ist, bevorzugt wie in SEQ ID NO13 gezeigt, sowie Derivative davon, die wenigstens 80, bevorzugt 85, bevorzugt 88, bevorzugt 90, bevorzugt 91, bevorzugt 92, bevorzugt 93, bevorzugt 94, bevorzugt 95, bevorzugt 96, bevorzugt 97, bevorzugt 98, bevorzugt 99, bevorzugt 99.5, bevorzugt 99.8, bevorzugt 99.9 oder 99.99 Prozent Sequenzidentität über die gesamte Nukleotidsequenz des Genoms aufweisen. Alle Datenbankeinträge, die hierin verwendet werden, entsprechen der Version, die zum frühesten Prioritätstag oder zum Anmeldetag der Anmeldung im Internet zugänglich waren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Diagnose“, dass das Verfahren oder Produkt oder die Verwendung verwendet werden kann, um die Diagnose einer Krankheit oder das Identifizieren eines Subjektes mit einem Risiko an der Krankheit zu leiden, unterstützen kann. Der Begriff „Diagnose“ kann auch ein Verfahren oder ein Agens bedeuten, das verwendet wird, um das vielversprechendste Behandlungsregime für einen Patienten zu wählen. In anderen Worten kann das Verfahren oder das Agens das Auswählen eines Behandlungsregimes für ein Subjekt betreffen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Schritt Bereitstellen des diagnostisch nützlichen Trägers und einer Probe von einem Patienten, der unter Verdacht steht, infiziert zu sein, bevorzugt einem Säugetier-Patienten, bevorzugter einem menschlichen Patienten. Der Träger ist mit dem Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder einer Variante davon beschichtet. Der Träger kann anschließend mit der Probe und unter Bedingung kontaktiert werden, die das Binden irgendwelcher Antikörper an das Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon umfassen. Die Probe kann anschließend entfernt werden, und der Träger mit dem Polypeptid kann gewaschen werden, um irgendwelche Reste der Probe zu entfernen. Ein sekundärer Antikörper oder ähnliches Reagenz oder Mittel, das an den Antikörper bindet und eine nachweisbare Markierung trägt, kann anschließend mit dem Träger unter Bedingungen kontaktiert werden, die die Bildung eines Komplexes zwischen irgendeinem gebundenem Antikörper und dem sekundären Antikörper gestatten. Der Träger kann anschließend gewaschen werden, um nicht gebundenen sekundären Antikörper zu entfernen. Schließlich kann die Anwesenheit des Antikörpers nachgewiesen werden, indem überprüft wird, ob der sekundäre Antikörper nachgewiesen werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „SARS-CoV-2-Infektion“ oder ähnliche Begriffe, wie hierin verwendet, eine Infektion eines Subjektes, bevorzugt eines Menschen, mit SARS-CoV-2, d.h. die Anwesenheit des Virus, wenigstens zeitweilig, im Körper des Subjektes, bevorzugter mit nachweisbaren Konzentrationen des Virus selbst und/oder von einem oder mehr als einem Biomarker aus der Gruppe umfassend ein SARS-CoV-2-Polypeptid aus der Gruppe umfassend die Strukturproteine, insbesondere S- und N-Protein, bevorzugter S1-Protein, und Antikörper, die an sie binden, oder eine Nukleinsäure, die letztere nachweisbar durch PCR. Das Subjekt kann klinische Symptome aufweisen, bevorzugt ein oder mehr als ein, bevorzugter alle Symptome aus der Gruppe umfassend Fieber, Müdigkeit, trockener Husten, Nasenverstopfung, triefende Nase und angeschwollener Rachen. Schwerere Symptome umfassen Atembeschwerden, Brustschmerzen oder Druck auf der Brust und plötzliche Verwirrung. Die Krankheit kann zu Komplikationen wie Lungenentzündung, akutem respiratorischen Distress-Syndrom, Sepsis, septischem Schock und Nierenversagen führen. Jedoch haben viele infizierte Subjekte milde Symptome und sind sich ihrer Infektion möglicherweise nicht einmal bewusst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren mehr als einmal verwendet, um Proben des gleichen Patienten zu untersuchen, bevorzugt an verschiedenen Tagen. Z. B. kann die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern täglich über eine oder zwei Wochen untersucht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Proben an unterschiedlichen Tagen untersucht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben über einen Zeitraum von wenigstens 2, 3, 4, 6, 8, 12, oder 16 Wochen abgenommen.
  • Die Verfahren und Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit und Nützlichkeit eines antiviralen Wirkstoffes oder Impfstoffes oder Impfstoffkandidaten zu untersuchen. Ein Impfstoff kann nützlich sein, wenn die Anwesenheit, bevorzugt das Zunehmen der Konzentration eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 nachgewiesen wird. Ein antiviraler Wirkstoff kann nützlich sein, wenn die Abwesenheit oder ein Abfall der Konzentration von Antikörpern gegen SEQ ID NO1, bevorzugt der Immunglobulin-Klassen IgA, IgM oder IgG anzeigt, dass der Patient nicht länger unter einer akuten Infektion leidet oder dabei ist, sich von einer akuten Infektion zu erholen.
  • Das Verfahren und die Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um zu screenen, ob gespendetes Blut mit einem Coronavirus kontaminiert ist oder ob ein Blutspender Antikörper gegen SARS-CoV-2 produziert, bevorzugt SEQ ID NO1, die aus seinem gespendeten Blut entnommen werden können, z. B. für therapeutische Verwendungen. Nach dem Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern der Immunglobulin-Klassen IgG, IgM und/oder IgA, bevorzugt IgG und IgA, noch bevorzugter IgA, gegen SEQ ID NO1, kann ein Antikörper gegen SARS-CoV-2, bevorzugt SEQ ID NO1, aus dem aufgereinigten Blut des Blutspenders aufgereinigt werden, z. B. durch Affinitätschromatographie, durch Kontaktieren des Trägers gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem gespendeten Blut unter Bedingungen, die mit der Bildung eines Komplexes umfassend den Antikörper gegen SEQ ID NO1 und dem Träger kompatibel sind, dem Entfernen von verbliebenem gespendeten Blut und dem Abtrennen des Antikörpers von dem Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform ist gespendetes Blut aus der Gruppe umfassend rote Blutzellen, Plasma, Blutplättchen und Vollblut ausgewählt, und kann ein Antigerinnungsreagenz umfassen. Zudem kann eine Verbindung anwesend sein, die aus der Gruppe umfassend Citrat, Phosphat, Dextrose und Adenin ausgewählt ist, bevorzugt alle dieser Verbindungen.
  • Ein nachzuweisender Antikörper bindet bevorzugt spezifisch an sein Target, noch bevorzugter SEQ ID NO1. Spezifische Bindung bedeutet bevorzugter Weise, dass die Bindungsreaktion stärker als eine Bindungsreaktion ist, die durch eine Dissziationskonstante von 1 × 10-5 M, bevorzugter 1 × 10-7 M, bevorzugter 1 × 10-8 M, bevorzugter 1 × 10-9 M, bevorzugter 1 × 10-10 M, bevorzugter 1 × 10-11 M, bevorzugter 1 × 10-12 M, charakterisiert ist wie durch Surface Plasmon Resonance unter Verwendung von Biacore-Ausrüstung bei 25 °C in PBS-Puffer bei pH 7 bestimmt wird.
  • Die Lehre der vorliegenden Erfindung kann nicht nur unter Verwendung von Polypeptiden ausgeführt werden, die die genauen Sequenzen aufweisen, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, wie beispielsweise SEQ ID NO1, beispielsweise durch Funktion, Name, Sequenz oder Zugangsnummer, oder implizit, sondern auch unter Verwendung von Varianten solcher Polypeptide.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet, wenigstens ein Fragment der Volllängen-Sequenz, auf die Bezug genommen wird, oder ein Polypeptid umfassend ein solches Fragment, spezifischer eine oder mehr als eine Aminosäure- oder Nukleinsäure-Sequenz, die relativ zur Volllängen-Sequenz an einem oder beiden Enden um eine oder mehr als eine Aminosäure verkürzt ist. Ein solches Fragment umfasst oder kodiert für ein Peptid, das wenigstens 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 oder 600 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Original-Sequenz umfasst, oder für eine Variante davon. Z. B. ist SEQ ID NO12 ein beispielhaftes Fragment, das verwendet werden kann.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Variante“ nicht nur wenigstens ein Fragment, sondern auch ein Polypeptid oder Fragment davon, das Aminosäuresequenzen umfasst, bevorzugt ein Fragment umfassend wenigstens 25, bevorzugter 50, bevorzugter 200 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die wenigstens zu 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch zur Aminosäuresequenz sind, auf die Bezug genommen wird, oder zu dem Fragment davon, wobei andere Aminosäuren als die für die biologische Aktivität, z. B. die Fähigkeit, spezifisch an einen interessierenden Antikörper zu binden, oder die Faltung oder Struktur des Polypeptides essenziellen Aminosäure deletiert oder substituiert sind und/oder eine oder mehr als eine solche essenzielle Aminosäure konservativ ersetzt ist und/oder Aminosäuren hinzugefügt oder deletiert sind, so dass die biologische Aktivität des Polypeptides wenigstens teilweise erhalten bleibt. Der Stand der Technik umfasst zahlreiche Verfahren, die verwendet werden können, um ein Alignment von zwei gegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzen zu erstellen und um das Ausmaß der Identität zu berechnen, siehe z. B. Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3rd edition. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die ClustalW-Software (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) wird verwendet, wobei die Grundeinstellungen angewandt werden.
  • SARS-CoV-2 betreffende Veröffentlichungen zu spezifischen Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise Beal et al. können dem Fachmann dabei helfen, geeignete Varianten zu gestalten (Beal, J., Mitechell, T., Wyschogrod, W., Manthey, J, and Clore, A. (2020) Highly Distinguished Amino Acid Sequences of 2019-nCoV (Wuhan Coronavirus) doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.31.929497 ), genauso wie Veröffentlichungen, die SARS-CoV betreffen, z. B. Hua, R., Zhou, Y., Wang, Y., Hua, Y and Tong, T. (2004). Identification of two antigenic epitopes on SARS-CoV spike protein, BBR 319, 929-935, wobei homologe Epitope aufgefunden werden können und SARS-CoV-2-Epitope auf Basis ihrer Homologie identifiziert werden können. Beispielsweise können mögliche Epitope von SEQ ID NO5 abgeleitet werden. Dahlke et al. zeigen ein Epitop-Mapping basierend auf einem Mikroarray umfassend überlappende Peptide mit einer Länge von 15 Aminosäuren, die vom S1-Polypeptid abgeleitet sind (Dahlke, C., Heidepriem, J., Kobbe, R., Santer R., Koch, T., Fathi, A., Ly, M. L, Schmiedel, S., Seeberger, P. H., ID-UKE COVID-19 study group, Addo, M. M., and Loeffler, F. F. (2020) https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20059733doi). Genauer wurden Peptide umfassend die Aminosäuresequenzen SSVLHSTQDLFLPFF (SEQ ID NO14, wobei es sich um 30-44 von SEQ ID NO1 handelt), TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPV (SEQ ID NO15, wobei es sich um 48-68 handelt), NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEG (SEQ ID NO16, wobei es sich um 110-166 handelt), DLPQGFSALEPLVDL (SEQ ID NO17, wobei es sich um 200-214 handelt), LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY (SEQ ID NO18, wobei es sich um 226-250 handelt), QPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDP (SEQ ID NO19, wobei es sich um 256-277 handelt), NATRFASVYAWNRKR (SEQ ID NO20, wobei es sich um 328-342 handelt), TGKIADYNYKLPDDF (SEQ ID NO21, wobei es sich um 399-414 handelt), YNYLYRLFRKSNLKP (SEQ ID NO22, wobei es sich um 434-448), FGRDIADTTDAVRDPQTLEILDI (SEQ ID NO23, wobei es sich um 550-572 handelt), SNQVAVLYQDVNCTE (SEQ ID NO24, wobei es sich um 590-604 handelt), AGCLIGAEHVNNSYECDIP (SEQ ID NO25, wobei es sich um 632-650 handelt) des S1-Proteins als IgA-reaktive Epitope identifiziert wurden. Peptide umfassend die Aminosäuresequenzen YNSASFSTFKCYGVS (SEQ ID NO26, wobei es sich um 354-368 handelt), STGSNVFQTRAGCLI (SEQ ID NO27, wobei es sich um 622-636 handelt) des S1-Proteins wurden als IgG-reaktive Epitope identifiziert. Peptide umfassend die Aminosäuresequenzen SSVLHSTQDLFLPFF (SEQ ID NO28, wobei es sich um 30-44 handelt) and LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA AAY (SEQ ID NO29, wobei es sich um 226-250 handelt) des S1-Proteins wurden als IgM-reaktive Epitope identifiziert. Darüber hinaus haben die Erfinder gezeigt, dass Peptide mit den Sequenzen RTQLPPAYTNS (SEQ ID NO34), LTPGDSSSGWTAG (SEQ ID NO35), YQAGSTPCNGV (SEQ ID NO36) und YGFQPTNGVGYQ (SEQ ID NO37) mit Antikörpern von SARS-CoV-2-Patienten reaktiv sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Varianten zusätzliche chemische Modifikationen umfassen, z. B. Markierungen wie Isotopen-Markierungen oder nachweisbare Markierungen oder kovalente Markierungen wie Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Decarboxylierung, Citrullinierung, Hydroxylierung und dergleichen. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit Verfahren zur Modifikation von Polypeptiden vertraut. Darüber hinaus können auch Varianten durch Fusion mit anderen bekannten Polypeptiden oder Varianten davon, z. B. künstlichen Linkern, Affinitäts-Tags, anderen Antigenen und dergleichen erzeugt werden. Z. B. ist SEQ ID NO3 ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine medizinische oder diagnostische Vorrichtung wie der diagnostisch nützliche Träger durch Exprimieren einer rekombinanten Variante von SEQ ID NO1 umfassend ein Affinitäts-Tag, optional mit einem künstlichen Linker, der eine Protease-Spaltstelle umfassen kann, in einer Zelle wie einer eukaryontischen oder prokaryontischen Zelle, durch Kontaktieren der exprimierten Variante mit einem Liganden, der spezifisch an das Affinitäts-Tag bindet, wobei der Ligand an einer Festphase immobilisiert ist, durch Waschen der Festphase derart, dass nicht spezifisch gebundenes Material aus der Zelle entfernt wird, und durch Eluieren der exprimierten Variante von der Festphase, bevorzugt durch Hinzufügen eines Überschusses von nicht immobilisiertem Ligand hergestellt werden. Die Variante kann anschließend auf der Vorrichtung immobilisiert werden. Optional kann der Affinitäts-Tag durch Kontaktieren der Variante mit einer Protease entfernt werden, bevorzugt einer Protease, die die Protease-Spaltstelle erkennt, vor der Immobilisierung. Der Affinitäts-Tag kann aus der Gruppe von Tags ausgewählt werden, die 18A, ACP, Aldehyd, Avi, BCCP, Calmodulin, Chitin-bindendes Protein, E-Tag, ELK16, FLAG, Flash, Polyglutamat, Polyaspartat, GST, GFP, HA, Isope, Maltose-bindendes Protein, myc, nus, NE, ProtA, ProtC, Tho1d4, S-Tag, SnoopTag, SpyTag, SofTag, Streptavidin, Strep-tag II, T7-Epitop-Tag, TAP, TC, Thioredoxin, Ty, V5, VSV und Xpress-Tag umfasst. Nützliche Proteasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf TEV, Thrombin, Faktor Xa oder Enteropeptidase. Geeignete Linker sind Teil von Vektoren, z. B. aus der pET-Vektor-Serie (Novagen).
  • Die Variante des Polypeptides hat biologische Aktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einer derartigen biologischen Aktivität um die Fähigkeit, an den entsprechenden Antikörper zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst sie ein Epitop, das die Fähigkeit hat, an einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 zu binden, oder die Variante hat selbst die Fähigkeit, an einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 zu binden, bevorzugt einen Antikörper der Immungobulin-Klassen IgA, IgG oder IgM gegen SEQ ID NO1, bevorzugt aus einer Probe von einem Patienten, der unter SARS-CoV-2 leidet, wobei bevorzugter das Epitop eine Sequenz umfassend wenigstens 5, 6, 7, 8 oder 10 Aminosäurereste umfasst. Bevorzugter bindet es nicht spezifisch an Homologe von SEQ ID NO1 von anderen Coronaviren, bevorzugt aus der Gruppe umfassend MERS (SEQ ID NO6), NL63 (SEQ ID NO10), 229E (SEQ ID NO7), OC43 (SEQ ID NO8) und HKU1 (SEQ ID NO9), bevorzugter aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-1 (SEQ ID NO11), MERS, NL63, 229E, OC43 und HKU1, wobei spezifisches Binden bevorzugt definiert und bestimmt wird, wie oben ausgeführt, unter Verwendung von Biacore-Ausrüstung.
  • Der Fachmann ist mit der Herstellung diagnostisch nützlicher Reagenzien basierend auf geeigneten Aminosäuresequenzen vertraut und in der Lage, sowohl lineare Peptide, z. B. durch chemische Synthese, und Polypeptide bereitzustellen, z. B. durch rekombinante Expression. Insbesondere ist dem Fachmann bewusst, dass sowohl Konformations- als auch sequenzielle Epitope existieren, und dass eine geeignete Strategie zur Expression und Aufreinigung gewählt werden muss, um ein diagnostisch nützliches Polypeptid zu erhalten, das verwendet werden kann, um einen Antikörper wie den Antikörper gegen SEQ ID NO1 nachzuweisen (z. B. Reischl, U., Molecular Diagnosis of Infectious diseases, Humana Press, 1998, z. B. Kapitel 12, 15, 16, 18 und 19). Der Fachmann ist auch mit Vorgehensweisen zum Evaluieren der Nützlichkeit von rekombinanten Proteinen für Testsysteme vertraut (z. B. Reischl, U., Molecular Diaignosis of Infectious diseases, Humana Press, 1998, z. B. Kapitel 21-26).
  • Der Nachweis des Antikörpers oder Komplexes für die Prognose, Diagnose, Verfahren oder das Kit gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung eines Verfahrens ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immundiffusionstechniken, immunelektrophoretische Techniken, Lichtstreuungs-Immuntests, Agglutinationstechniken, Immuntests mit Markierung wie beispielsweise aus der Gruppe umfassend radiomarkierte Immuntests, Enzym-Immuntests wie beispielsweise kolorimetrische Tests, Chemilumineszenz-Immuntests und Immunfluoreszenz-Techniken. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex nachgewiesen unter Verwendung eines Verfahrens ausgewählt aus der Gruppe umfassend Immundiffusionstechniken, immunelektrophoretische Techniken, Lichtstreuungs-Immuntests, Agglutinationstechniken, markierte Immuntests aus der Gruppe umfassend radiomarkierte Immuntests, Chemilumineszenz-Immuntests und Immunfluoreszenz-Techniken. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit diesem Verfahren vertraut, und sie sind auch im Stand der Technik beschrieben, z. B. in Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, insbesondere in Kapitel 14. Bevorzugt ist das Testformat ein ELISA, und eine Mikrotiterplatte umfassend Wells wird als diagnostisch nützlicher Träger verwendet.
  • Bevorzugt ist ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon auf einer Festphase des Trägers immobilisiert. Es kann direkt auf der Festphase immobilisiert sein, wenn es mit der Probe kontaktiert wird, aber ein kompetitiver Test, ein capture bridge-Test, ein immunometrischer Test, ein klassenspezifischer sekundärer Antikörper auf der Festphase, ein class capture-Test, direkt oder indirekt, kann ebenfalls verwendet werden. Das Prinzip von jedem dieser Formate ist in The Immunassay Handbook, 3rd edition, edited by David Wild, Elsevier, 2005, ausführlich beschrieben. Bevorzugter ist die Festphase ein Teststreifen oder ein Well von einer Mikrotiterplatte für ELISA, bevorzugt ein Well einer Mikrotiterplatte für ELISA.
  • Jedes Polypeptid, z. B. ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder ein sekundärer Antikörper, kann in jeder Form und in jedem Reinheitsgrad bereitgestellt werden, von Geweben, Flüssigkeiten und Zellen umfassend das Polypeptid in einer endogenen Form, bevorzugt Zellen, die das Polypeptid exprimieren, kruden oder angereicherte Lysaten solcher Zellen, bis zu aufgereinigtem und/oder isoliertem Polypeptid, das im Wesentlichen rein sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein natives Polypeptid, wobei der Begriff „natives Polypeptid“, wie hierin verwendet, ein gefaltetes Polypeptid bedeutet, bevorzugter ein gefaltetes Polypeptid aufgereinigt aus Zellen, noch bevorzugter aus prokaryontischen oder eukaryontischen, bevorzugt Säugetier-Zellen. Es kann eine glykosylierte Form des Polypeptides verwendet werden. Sekundäre Antikörper sind bevorzugt rein, z. B. nach Reinigung basierend auf Protein A oder Protein G als Affinitätsligand. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jegliches Polypeptid, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet oder bereitgestellt wird, in einem gefalteten Zustand verwendet oder bereitgestellt, in Abwesenheit signifikanter Konzentrationen von denaturierenden Reagenzien, wie Thiol enthaltenen Verbindungen wie beispielsweise DTT.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgA, IgM und/oder IgG gegen SEQ ID NO1 nachgewiesen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird lediglich die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgA nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform wird lediglich die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgM detektiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird lediglich die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgG nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgA und die Anwesenheit oder Abwesenheit von IgG nachgewiesen. Bevorzugter wird ein sekundärer Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA und ein sekundärer Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG verwendet oder bereitgestellt, um dies zu tun.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers, z. B. der Immunglobulin-Klassen IgA, IgM und IgG, gegen SEQ ID NO1, unter Verwendung eines Polypeptides umfassend SEQ ID NO1 oder einer Variante davon, nachgewiesen, aber das Polypeptid kann zusätzliche Sequenzen umfassen, bevorzugt künstliche Sequenzen oder z.B. Linker und/oder Affinitäts-Tags. Solche zusätzlichen Sequenzen sind jedoch derart ausgewählt, dass die Fähigkeit von SEQ ID NO1 oder einer Variante davon an den nachzuweisenden Antikörper spezifisch zu binden, oder die diagnostische Zuverlässigkeit, insbesondere Sensitivität und/oder Spezifität, nicht signifikant verändert wird. Z. B. sollte eine Domäne, die an SEQ ID NO1 oder ein Fragment davon bindet, nicht fusioniert oder anwesend sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Produkte, Verfahren und Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung derart konfiguriert, dass die Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 von der Anwesenheit eines Antikörpers gegen ein anderes SARS-CoV-2 Antigen oder eines oder eines weiteren Antigens, bevorzugt aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-2 N-Protein, bevorzugter aus der Gruppe umfassend SARS-CoV 2-N-Protein, SARS-CoV 2-M-Protein und SARS-CoV-2 E-Protein, am bevorzugtesten aus der Gruppe umfassend SARS-CoV-2 N-Protein, SARS-CoV-2 M-Protein und SARS-CoV-2 E-Protein und SARS-CoV-2 S-Protein-Epitope, soweit nicht in SEQ ID NO1 vorhanden, unterschieden werden kann. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon von solchen anderen SARS-CoV-2-Antigenen oder anderen Coronavirus-Antigenen räumlich getrennt, wenn es verwendet wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 nachzuweisen. Z. B. kann das Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon rein und/oder isoliert auf einem Träger vorliegen. Z. B. kann es auf einem Blot oder Mikrotiter-Well oder Bead räumlich getrennt von anderen Antigenen vorliegen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Abwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 nachgewiesen, unter Verwendung eines isolierten, reinen und/oder rekombinanten Polypeptides umfassend SEQ ID NO1 oder einer Variante davon.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen SARS-CoV-2 N-Protein, definiert durch SEQ ID NO30, zusätzlich bestimmt, bevorzugt ein Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und/oder IgM, bevorzugter IgG oder IgM, am bevorzugtesten IgG. Der erfindungsgemäße Träger kann zu diesem Zweck ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO30 oder eine Variante davon umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen die Rezeptorbindungsdomäne, definiert durch SEQ ID NO31, nachgewiesen. Der erfindungsgemäße Träger kann zu diesem Zweck ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO31 oder eine Variante davon umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gegen die S2-Domäne, definiert durch SEQ ID NO32, von SARS-CoV-2-Spike Protein nachgewiesen. Der erfindungsgemäße Träger kann zu diesem Zweck ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO32 oder eine Variante davon umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein sekundärer Antikörper ein Antikörper, der gegen alle Antikörper von einer Antikörper- oder Immunglobulin-Klasse bindet, bevorzugt einer menschlichen Antikörperklasse, bevorzugt einer der Immunglobulin-Klassen IgA und/oder IgG und/oder IgM, bevorzugt IgA-Antikörper. Sekundäre Antikörper erkennen typischerweise die konstante Domäne einer solchen Klasse oder haben polyvalente Bindungsstellen gegen verschiedene Epitope über die Sequenz oder dreidimensionale Struktur, die den Antikörpern der Immunglobulin-Klasse gemein sind. Sekundäre Antikörper stammen typischerweise aus einem Säugetier, bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, oder von einem Vogel, bevorzugt aus Huhn, Kaninchen, Maus, Ratte, Pferd, Schwein, Esel, Ziege, Kuh oder Primat. Eine Vielzahl von ihnen ist im Handel erhältlich.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die SARS-CoV-2-Infektion in einer frühen Phase mit erhöhter Sensitivität nachgewiesen werden, bevorzugt 5 oder weniger Tage nach dem Beginn der Krankheitssymptome.
  • Erfindungsgemäß wird ein diagnostisch nützlicher Träger bereitgestellt, der bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt ist, die einen Glasträger, bevorzugt zur Mikroskopie, ein Biochip, ein Mikroarray, eine Mikrotiterplatte, eine Lateral-Flow-Vorrichtung, ein Teststreifen, eine Membran, bevorzugt einen Lineblot, eine Chromatographie-Säule und einen Bead umfasst, bevorzugt eine Mikrotiterplatte.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem diagnostisch nützlichen Träger um einen Lineblot (Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65; WO2013041540 ). In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Lineblot“, wie hierin verwendet, ein Teststreifen, bevorzugter membranbasiert, der mit einem oder mehr als einem Mittel zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers beschichtet wurde, von denen jedes bevorzugt ein Polypeptid ist. Wenn zwei oder mehr Mittel verwendet werden, liegen sie bevorzugt räumlich getrennt auf dem Träger vor. Bevorzugt beträgt die Breite solcher Banden wenigstens 30, bevorzugter 40, 50, 60, 70 oder 80 % der Breite des Teststreifens. Der Lineblot kann eine oder mehr als eine Kontrollbande zum Bestätigen umfassen, dass er mit einer Probe ausreichend lang und unter geeigneten Bedingungen kontaktiert wurde, insbesondere in Anwesenheit von menschlichem Serum bzw. mit einem sekundären Antikörper.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem diagnostisch nützlichen Träger um einen Bead. Verschiedene Beads für zahlreiche Anwendungen sind im Handel erhältlich, hauptsächlich basierend auf Kohlenhydrat, z. B. Sepharose oder Agarose, oder Plastik. Sie umfassen aktive oder aktivierbare chemische Gruppen wie eine Carboxyl- oder Tosyl- oder Estergruppe, die für die Immobilisierung eines Mittels zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers verwendet werden können. Bevorzugt haben die Beads einen durchschnittlichen Durchmesser von 0.1 µm bis 10 µm, von 0.5 µm bis 8 µm, von 0.75 µm bis 7 µm oder von 1 µm bis 6 µm. Die Beads können mit dem Mittel zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers direkt oder über Affinitätsliganden beschichtet werden, z. B. Biotin oder Glutathion und Streptavidin und GST. Z. B. kann der Bead mit Biotin oder Glutathion beschichtet sein und das Antigen kann mit Streptavidin bzw. Glutathion-S-Transferase oder einer Variante davon fusioniert sein. Bevorzugt wird der Bead in Form einer wässrigen Lösung bereitgestellt, die einen Beadgehalt von 10 bis 90 %, bevorzugt von 20 bis 80 %, bevorzugt von 30 bis 70 %, bevorzugter von 40 bis 60 % (w/w) aufweist.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Beads magnetische Beads, die leicht mit Hilfe eines Magneten an einer Oberfläche konzentriert werden können. Zu diesem Zweck enthalten im Handel erhältliche magnetische Beads gewöhnlich ein magnetisches Mineral, z. B. Eisenoxid. Eine Vielzahl von geeigneten magnetischen Beads ist im Handel erhältlich. Ein Bead kann mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein magnetischer Bead in einem Puffer durch Anlegen eines magnetischen Feldes, um die Beads zu konzentrieren und zu immobilisieren, verwendet und gewaschen oder inkubiert, gefolgt vom Entfernen des vorhandenen Puffers und Hinzugabe von neuem Puffer. Das magnetische Feld kann dann abgestellt werden, um das Suspendieren der Beads in dem neuen Puffer effizienter zu gestalten. Ein Puffer kann jegliche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Lösung sein, umfassend eine verdünnte Patientenprobe, einen Inkubationspuffer oder einen Puffer umfassend einen sekundären Antikörper.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper unter Verwendung einer chemilumineszenzfähigen Markierung nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein chemilumineszenzfähiges Enzym, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Luciferase, Peroxidase, alkalische Phosphatase und β-Galactosidase oder eine Variante davon, das oder die ein chemilumineszenzfähiges Substrat umsetzen kann, ohne dabei selbst verbraucht zu werden (Kricka, L. J. (2003). Clinical applications of chemiluminescence. Analytica chimica acta, 500(1): 279-286). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die chemilumineszenzfähige Markierung eine kleine organische Verbindung, die keine enzymatische Aktivität mit Hinblick auf das Katalysieren einer Chemilumineszenz-Reaktion aufweist, die ein Chemilumineszenz-Signal aussendet und abgebaut wird, wenn sie mit einer Chemilumineszenz-Substratlösung kontaktiert wird, die anorganische und/oder nicht-enzymatische organische Verbindungen enthält, welche für das Aussenden des Signals erforderlich sind. Bevorzugt ist die kleine organische Verbindung ohne enzymatische Aktivität aus der Gruppe ausgewählt, die Acridinium-Ester (Weeks, I., Beheshti, I., McCapra, F., Campbell, A. K., Woodhead, J. S. (1983) Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay. Clin Chem 29: 1474-1479) und Luminol oder ein chemilumineszenzfähiges Derivat davon, wie beispielsweise Isoluminol, umfasst. Solche kleinen organischen Verbindungen können an einen sekundären Antikörper gekoppelt sein. Im Falle von Luminol umfasst die Substratlösung H2O2 bei hohem pH-Wert. Im Falle eines Acridinium-Esters wird häufig eine Mischung aus H2O2 und Natriumhydroxid verwendet. Die kleine organische Verbindung wird beim Aussenden des Chemilumineszenz-Signals verbraucht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Chemilumineszenz der chemilumineszenzfähigen Markierung 1 bis 60 Sekunden, bevorzugt 2 bis 20 Sekunden, noch bevorzugter 3 bis 15 Sekunden lang nach dem Auslösen der Chemilumineszenz-Nachweisreaktion nachgewiesen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Chemilumineszenz der chemilumineszenzfähigen Markierung wenigstens 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 oder 3 Sekunden, bevorzugt 3 bis 15, bevorzugter 5 bis 10 Sekunden lang nachgewiesen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger eine Mikrotiterplatte umfassend wenigstens 8 Wells, die für einen ELISA verwendet werden können. Wenigstens eines der Wells ist mit dem Mittel zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers, entweder direkt oder indirekt, bevorzugt einem Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, beschichtet. Wenigstens 3, bevorzugt 4, noch bevorzugter 5 Kalibratoren, mit definierten Konzentrationen, können verwendet werden, um eine Kalibrationskurve für eine semiquantitative Analyse aufzustellen. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt wird, können die Kalibratoren parallel zu den Proben prozessiert und entwickelt werden. Ein sekundärer Antikörper umfassend eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine enzymatisch aktive Markierung, kann bereitgestellt werden, z. B. eine Markierung mit Meerettich-Peroxidase-Aktivität oder alkalischer Phosphatase-Aktivität oder einem Enzym, das chemilumineszenzfähig ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein Mikroarray. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Microarray“, wie hierin verwendet, ein Chip, der mit einer Vielzahl von räumlich getrennten Antigenen beschichtet ist, bevorzugt wenigstens 20, bevorzugt 30, 40, 50, 80 oder 100. Bevorzugt ist jedes Antigen ein Peptid umfassend oder bestehend aus 5 bis 25, bevorzugt 7 bis 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren des Antigens, bevorzugt SEQ ID NO1. Bevorzugt wird eine Bibliothek verwendet, mit überlappenden Peptiden, die ein Fragment oder die volle Sequenz von SEQ ID NO1 umfassen, bevorzugter umfassend die RBD. Die Peptide sind typischerweise chemisch synthetisiert und können eine Blocking Group umfassen. Ein sekundärer Antikörper umfassend eine Markierung, bevorzugt eine Fluoreszenzmarkierung, kann zum Nachweis verwendet werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Glasträger verwendet, der auf einem oder ein Teil eines Trägers für eine mikroskopische Immunfluoreszenzanalyse ist. Eine Zelle, bevorzugt eine eukaryontische Zelle wie eine HEK293-Zelle befindet sich auf dem Träger. Sie kann mit einem Deckmedium bedeckt sein. Verschiedene Zusammensetzungen und Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in „Mountants and Antifades", published by Wright Cell Imaging Facility, Toronto Western Research Institute University Health Network (https://de.scribd.com/document/47879592/Mountants-Antifades), Krenek et al. (1989) Comparison of antifading agents used in immunofluorescence, J. Immunol. Meth 117, 91-97 and Nairn et al. (1969) Microphotometry in Immunofluorescence, Clin. Exp. Immunol. 4, 697-705. Die Zelle exprimiert, bevorzugt überexprimiert ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon. Der Träger kann eine zum Schein transfizierte Zelle umfassen, die mit dem gleichen Vektor wie die Zelle, die ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon überexprimiert, transfiziert ist, aber ohne die Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert. Eine solche zum Schein transfizierte Zelle kann als Negativ-Kontrolle dienen. Eine weitere Zelle kann ein weiteres Coronavirus umfassen, bevorzugt SARS, bevorzugter SARS-CoV-2-Antigen, z. B. N-Protein, S2-Protein oder RBD, um einen Antikörper nachzuweisen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein bereitgestelltes Polypeptid, bevorzugt das Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, ein rekombinantes Protein sein, wobei der Begriff „rekombinant“, wie hierin verwendet, ein Polypeptid bedeutet, das bei irgendeiner Stufe des Produktionsprozesses unter Verwendung von gentechnischen Methoden hergestellt wurde, z. B. durch Fusionieren einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, an einen starken Promoter zur Überexpression in Zellen oder Geweben oder durch Verändern der Sequenz des Polypeptides selbst. Der Fachmann ist mit Verfahren zum gentechnischen Verändern von Nukleinsäuren und Polypeptiden, für die sie kodieren, vertraut (z. B. beschrieben in Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH or in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) und zum Herstellen und Aufreinigen von nativen oder rekombinanten Polypeptiden (z. B. Handbücher „Strategies for Protein Purification", „Antibody Purification", published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R. , Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein isoliertes Polypeptid, wobei der Begriff „isoliert“ bedeutet, dass das Polypeptid im Vergleich zu seinem Zustand bei der Produktion unter Verwendung eines biotechnologischen oder synthetischen Ansatzes angereichert ist und bevorzugt rein ist, das heißt wenigstens 60, 70, 80, 90, 95 oder 99 Prozent des Polypeptides in der jeweiligen Flüssigkeit besteht aus dem Polypeptid, wie beurteilt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Coomassie-Blue-Färbung und Betrachtung mit dem Auge. Bevorzugt ist jedes Polypeptid auf einem Träger, der als Mittel zum Einfangen eines Antikörpers verwendet wird, rein.
  • Ein sekundärer Antikörper umfassend eine nachweisbare Markierung kann verwendet werden, um Antikörper gegen SEQ ID NO1 der Immunglobulin-Klassen IgA und/oder IgG und/oder IgM, bevorzugt IgA nachzuweisen, bevorzugter gegen SEQ ID NO1 und gegen ein weiteres Coronavirus-Antigen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung ausgewählt aus der Gruppe umfassend eine fluoreszenzfähige, eine radioaktive oder eine enzymatisch aktive Markierung, bevorzugt eine, die eine kolorimetrische Reaktion katalysiert. FITC oder eine anderes Fluorescein-Derivat können als fluoreszenzfähige Markierung verwendet werden. Ein Protein mit Peroxidase-Aktivität kann als enzymatisch aktive Markierung verwendet werden. Bevorzugt erkennt der sekundäre Antikörper Säugetier-, bevorzugter menschliche Antikörper. Bevorzugt ist der sekundäre Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Wenn mehr als ein Antikörper aus mehr als einer Immunglobulin-Klasse nachgewiesen wird, können zwei sekundäre Antikörper verwendet werden, bevorzugt einer, der einen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA und einer, der einen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG bindet. Die beiden sekundären Antikörper können in einer Mischung oder getrennt vorliegen, bevorzugt getrennt, um den getrennten Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene Immunglobulin-Klassen, wie beispielsweise IgA-, IgM- und IgG-Antikörper, bevorzugt IgG- und IgA-, nachzuweisen, um z. B. Informationen zum Verlauf der Krankheit zu erhalten, basierend auf der Tatsache, dass Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA in vielen Patienten früher als Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG auftreten. Alternativ kann ein sekundärer Antikörper verwendet werden, der an Antikörper aus mehr als einer Immunglobulin-Klasse bindet, z. B. aus der Gruppe umfassend IgG, IgA und IgM, bevorzugt ein sekundärer Antikörper, der gegen Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgG und IgA bindet. Ein sekundärer Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der sekundäre Antikörper aus einem Säugetier, bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, aber bindet an menschliche Antikörper einer bestimmten Immunglobulin-Klasse, bevorzugt IgA, IgG und/oder IgM. Eine Vielzahl von sekundären Antikörpern, optional mit Markierungen wie einer fluoreszenzfähigen Markierung, ist im Handel erhältlich.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, das ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon umfasst, bevorzugt beschichtet auf einem diagnostisch nützlichen Träger, bevorzugter einer Mikrotiterplatte, und weiter ein oder mehr als ein Reagenz umfasst, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen Kalibrator, eine Positiv-Kontrolle, eine Negativ-Kontrolle, einen Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, bevorzugt eines Antikörpers der Immunglobulin-Klassen IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugt ein sekundärer Antikörper, der spezifisch an Antikörper bindet, bevorzugter Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgM und/oder IgG, wobei der sekundäre Antikörper eine nachweisbare Markierung umfassen kann, einen Probenpuffer, eine Nachweislösung, bevorzugt eine Chromogen-/Substrat-Lösung, eine Stop-Lösung und eine Schutzfolie.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Kalibrator ein Reagenz, das an ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon bindet, und bevorzugt von sekundären Antikörpern erkannt wird, die Antikörper der Immungobulin-Klassen IgA, IgM und/oder IgG erkennen. Der Kalibrator kann ein Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO1 sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Positiv-Kontrolle eine Lösung, die eine Verbindung wie einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 umfasst, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und IgM, bevorzugter IgA, aus der Probe eines Patienten, der an SARS-CoV-2 leidet, und zwar eine Menge, die unter Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zu einem positiven Ergebnis führt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine Positiv-Kontrolle ein Reagenz, das alle Antikörper aus der nachzuweisenden Immungobulin-Klasse einfängt, z. B. ein sekundärer Antikörper, bevorzugt ein Antikörper gegen menschliche Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG oder IgM. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Negativ-Kontrolle ein Reagenz, in dem eine solche Verbindung abwesend ist, und sie könnte Serum von einer gesunden Person umfassen, oder ein Reagenz, das nicht an die Immunglobulin-Klasse des nachzuweisenden Antikörpers bindet, aber bevorzugter an Antikörper einer anderen Immunglobulin-Klasse bindet, die nicht nachzuweisen ist, wie beispielsweise IgG, IgA oder IgM.
  • Ein Waschpuffer kann verwendet werden, um die Mikrotiterplatte nach der Inkubation zu waschen, um unspezifische Antikörper zu entfernen, und könnte PBS sein. Das Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers könnte ein sekundärer Antikörper sein, der an Antikörper der nachzuweisenden Immunglobulin-Klasse bindet, bevorzugt menschliche Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgM und/oder IgG, und markiert ist, bevorzugt mit einem Enzym, bevorzugter mit einem Enzym, das Peroxidase-Aktivität aufweist. Der Probenpuffer kann verwendet werden, um Patientenprobe zu verdünnen, und es kann sich dabei um PBS handeln.
  • Die Nachweis-Lösung kann ein Signal in Anwesenheit des markierten sekundären Antikörpers erzeugen und ist bevorzugt eine farbentwickelnde Lösung und bevorzugter 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/H2O2. Die Stop-Lösung kann einer Reaktion hinzugefügt werden, um die Reaktion der Nachweislösung zum Erliegen zu bringen, und kann eine starke Säure umfassen, z. B. 0,5 M Schwefelsäure. Die Schutzfolie kann auf der Mikrotiterplatte oder auf einer Inkubationswanne platziert werden, um Verdunstung zu verhindern.
  • Jegliches gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Reagenz kann ein Konservierungsmittel enthalten, z. B. Azid.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst eine Reihe von neuen Nukleinsäure- und Polypeptid-Sequenzen,genauer 
SEQ ID NO1 (SARS-CoV-2 S1-Domäne aus S-Protein)

 VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTK
 RFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFL
 GVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYF
 KIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY
 YVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVR
 FPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL
 CFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL
 YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL
 SFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDA
 VRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST
 GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR

 SEQ ID NO2 (SARS-CoV-2 S1-Domäne aus S-Protein, C-terminal mit His-Tag versehen,
 wie für das Beispiel in Zellen exprimiert)
 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV
 TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATN
 VVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGN
 FKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLT
 PGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGI
 YQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASF
 STFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAW
 NSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGF
 QPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKK
 FLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVP
 VAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRR
 ARLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO3 (SARS-CoV-2 S1-Domäne aus S-Protein, C-terminal mit His-Tag versehen,
 wie nach Abspaltung des Signal-Peptides, verwendet in den Beispielen)
 VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTK
 RFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFL
 GVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYF
 KIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY
 YVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVR
 FPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL
 CFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL
 YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL
 SFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDA
 VRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST
 GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO4 (SARS-CoV-2 S1-Domäne aus S-Protein, Nukleotid-Sequenz, die für SEQ
 ID NO2 kodiert)
 ATGTTCGTATTCCTTGTTCTGCTGCCTTTGGTTAGCAGTCAGTGTGTCAACCTGACAACT
 CGCACGCAACTGCCGCCAGCTTACACCAACTCTTTCACAAGAGGCGTCTACTACCCGG
 ACAAAGTGTTTCGCTCATCAGTGCTGCACTCTACACAAGATTTGTTTCTGCCATTCTTCT
 CTAACGTAACCTGGTTTCACGCGATTCATGTGTCTGGGACAAATGGGACCAAGCGCTTC
 GACAACCCCGTGCTGCCATTCAATGACGGGGTGTATTTTGCCTCCACCGAGAAATCCAA
 TATCATCCGAGGATGGATTTTCGGTACTACGCTGGACTCTAAAACGCAGTCTCTCTTGAT
 CGTTAATAACGCCACAAATGTTGTCATTAAGGTGTGCGAGTTTCAGTTCTGTAATGATCC
 CTTTCTGGGTGTGTATTACCACAAGAATAACAAGTCATGGATGGAAAGCGAGTTTCGCG
 TGTACTCAAGTGCCAATAACTGCACATTCGAGTATGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGATC
 TCGAAGGCAAACAGGGGAACTTCAAGAATCTGCGCGAGTTCGTGTTTAAGAACATCGAC
 GGTTATTTCAAGATCTACAGCAAACATACACCCATTAACCTGGTCAGGGATCTCCCTCAG
 GGATTCTCCGCCCTGGAACCCTTGGTGGACTTGCCCATTGGGATTAACATCACTAGATT
 CCAGACCCTGCTGGCCCTTCACCGTTCCTATCTTACTCCTGGCGACAGTAGCAGTGGAT
 GGACCGCAGGAGCAGCCGCTTACTATGTAGGCTATCTGCAGCCACGGACCTTCCTCCT
 CAAGTACAATGAAAATGGTACCATAACTGATGCTGTGGACTGCGCTCTGGATCCACTCT
 CCGAAACTAAATGCACCCTTAAAAGCTTCACGGTCGAAAAGGGAATCTACCAGACAAGT
 AACTTTCGGGTACAACCCACTGAGTCCATCGTGCGGTTTCCTAACATCACAAATCTCTG
 CCCCTTTGGTGAAGTGTTTAACGCCACTAGGTTCGCTTCTGTTTATGCGTGGAATCGGA
 AGAGGATTTCCAATTGCGTGGCAGACTACTCTGTCCTGTATAATAGCGCTAGCTTCAGC
 ACCTTCAAATGTTACGGGGTAAGCCCAACTAAACTGAACGACCTCTGTTTTACCAACGT
 GTATGCCGATAGCTTTGTCATACGAGGAGATGAGGTTCGTCAGATTGCTCCTGGCCAAA
 CGGGGAAAATCGCAGACTACAACTACAAGCTTCCCGACGACTTCACAGGATGCGTGAT
 CGCGTGGAACTCAAATAATCTGGATAGCAAGGTTGGTGGCAATTATAACTACCTGTATC
 GACTGTTCAGGAAAAGCAACCTCAAACCCTTTGAGCGCGACATCAGCACCGAGATATAC
 CAAGCCGGTTCAACACCTTGCAATGGGGTGGAAGGGTTTAACTGCTATTTCCCACTTCA
 GAGCTATGGGTTTCAGCCAACCAATGGAGTCGGCTACCAGCCCTATCGGGTGGTAGTC
 CTGTCCTTTGAGCTGTTGCATGCGCCTGCCACAGTCTGTGGCCCTAAGAAGAGTACGAA
 TCTGGTGAAGAACAAGTGCGTCAACTTCAATTTTAACGGCTTGACTGGAACAGGAGTTC
 TGACCGAGTCCAACAAGAAATTCCTTCCTTTTCAGCAGTTTGGAAGGGATATAGCCGAC
 ACTACCGATGCCGTTCGGGATCCACAGACACTGGAGATTCTGGACATTACTCCGTGCTC
 ATTTGGCGGTGTATCTGTCATCACACCTGGGACCAATACCTCAAATCAGGTGGCTGTGC
 TCTACCAGGATGTGAATTGTACCGAAGTTCCAGTGGCAATTCATGCCGATCAACTGACT
 CCCACCTGGAGAGTGTACAGTACTGGCAGTAACGTGTTTCAGACAAGAGCTGGCTGTCT
 CATAGGCGCAGAACACGTCAACAACAGCTATGAGTGTGACATTCCGATCGGCGCAGGC
 ATCTGTGCATCCTACCAGACGCAAACCAACTCTCCCAGAAGAGCCAGGCTCGAGCACC
 ACCATCACCATCACCATCACTAA

 SEQ ID NO5 (mögliches SARS-CoV-2 S1-Epitop)
 NLKPFERDISTE

 SEQ ID NO6 (S1[MERS_CoV])
 YVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKTWPRPIDVSKADGIIYPQGRTYSNITITYQGLFPYQGD
 HGDMYVYSAGHATGTTPQKLFVANYSQDVKQFANGFVVRIGAAANSTGTVIISPSTSATIRKI
 YPAFMLGSSVGNFSDGKMGRFFNHTLVLLPDGCGTLLRAFYCILEPRSGNHCPAGNSYTSF
 ATYHTPATDCSDGNYNRNASLNSFKEYFNLRNCTFMYTYNITEDEILEWFGITQTAQGVHLF
 SSRYVDLYGGNMFQFATLPVYDTIKYYSIIPHSIRSIQSDRKAWAAFYVYKLQPLTFLLDFSVD
 GYIRRAIDCGFNDLSQLHCSYESFDVESGVYSVSSFEAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSG
 TPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKS
 DLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRLLSDDRTEVPQLV
 NANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYG
 TDTNSVCPKLEFANDTKIASQLGNCVEYSLYGVSGRGVFQNCTAVGVRQQRFVYDAYQNL
 VGYYSDDGNYYCLRACVSVPVSVIYDKETKTHATLFGSVACEHISSTMSQYSRSTRSMLKR
 RDSTYGPLQTPVGCVLGLVNSSLFVEDCKLPLGQSLCALPDTPSTLTPRSVR

 SEQ ID NO7 (S1[HCoV-229E])
 CQTTNGLNTSYSVCNGCVGYSENVFAVESGGYIPSDFAFNNWFLLTNTSSVVDGVVRSFQ
 PLLLNCLWSVSGLRFTTGFVYFNGTGRGDCKGFSSDVLSDVIRYNLNFEENLRRGTILFKTS
 YGVVVFYCTNNTLVSGDAHIPFGTVLGNFYCFVNTTIGNETTSAFVGALPKTVREFVISRTGH
 FYINGYRYFTLGNVEAVNFNVTTAETTDFCTVALASYADVLVNVSQTSIANIIYCNSVINRLRC
 DQLSFDVPDGFYSTSPIQSVELPVSIVSLPVYHKHTFIVLYVDFKPQSGGGKCFNCYPAGVNI
 TLANFNETKGPLCVDTSHFTTKYVAVYANVGRWSASINTGNCPFSFGKVNNFVKFGSVCFS
 LKDIPGGCAMPIVANWAYSKYYTIGSLYVSWSDGDGITGVPQPVEGVSSFMNVTLDKCTKY
 NIYDVSGVGVIRVSNDTFLNGITYTSTSGNLLGFKDVTKGTIYSITPCNPPDQLVVYQQAVVG
 AMLSENFTSYGFSNVVELPKFFYA
SEQ ID NO8 (S1 [HCoV-OC43])
 AVIGDLKCTSDNINDKDTGPPPISTDTVDVTNGLGTYYVLDRVYLNTTLFLNGYYPTSGSTYR
 NMALKGSVLLSRLWFKPPFLSDFINGIFAKVKNTKVIKDRVMYSEFPAITIGSTFVNTSYSVVV
 QPRTINSTQDGDNKLQGLLEVSVCQYNMCEYPQTICHPNLGNHRKELWHLDTGVVSCLYK
 RNFTYDVNADYLYFHFYQEGGTFYAYFTDTGVVTKFLFNVYLGMALSHYYVMPLTCNSKLT
 LEYWVTPLTSRQYLLAFNQDGIIFNAEDCMSDFMSEIKCKTQSIAPPTGVYELNGYTVQPIAD
 VYRRKPNLPNCNIEAWLNDKSVPSPLNWERKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKI
 YGMCFSSITIDKFAIPNGRKVDLQLGNLGYLQSFNYRIDTTATSCQLYYNLPAANVSVSRFNP
 STWNKRFGFIEDSVFKPRPAGVLTNHDVVYAQHCFKAPKNFCPCKLNGSCVGSGPGKNNG
 IGTCPAGTNYLTCDNLCTPDPITFTGTYKCPQTKSLVGIGEHCSGLAVKSDYCGGNSCTCRP
 QAFLGWSADSCLQGDKCNIFANFILHDVNSGLTCSTDLQKANTDIILGVCVNYDLYGILGQGI
 FVEVNATYYNSWQNLLYDSNGNLYGFRDYIINRTFMIRSCYSGRVSAAFHANSSEPALLFRN
 IKCNYVFNNSLTRQLQPINYFDSYLGCVVNAYNSTAISVQTCDLTVGSGYCVDYSKNRRSRG

 SEQ ID NO9 (S1[HCoV-HKU1])
 AVIGDFNCTNSFINDYNKTIPRISEDVVDVSLGLGTYYVLNRVYLNTTLLFTGYFPKSGANFR
 DLALKGSIYLSTLVVYKPPFLSDFNNGIFSKVKNTKLYVNNTLYSEFSTIVIGSVFVNTSYTIVVQ
 PHNGILEITACQYTMCEYPHTVCKSKGSIRNESWHIDSSEPLCLFKKNFTYNVSADWLYFHF
 YQERGVFYAYYADVGMPTTFLFSLYLGTILSHYYVMPLTCNAISSNTDNETLEYWVTPLSRR
 QYLLNFDEHGVITNAVDCSSSFLSEIQCKTQSFAPNTGVYDLSGFTVKPVATVYRRIPNLPDC
 DIDNWLNNVSVPSPLNWERRIFSNCNFNLSTLLRLVHVDSFSCNNLDKSKIFGSCFNSITVDK
 FAIPNRRRDDLQLGSSGFLQSSNYKIDISSSSCQLYYSLPLVNVTINNFNPSSWNRRYGFGS
 FNLSSYDVVYSDHCFSVNSDFCPCADPSVVNSCAKSKPPSAICPAGTKYRHCDLDTTLYVK
 NWCRCSCLPDPISTYSPNTCPQKKVVVGIGEHCPGLGINEEKCGTQLNHSSCFCSPDAFLG
 WSFDSCISNNRCNIFSNFIFNGINSGTTCSNOLLYSNTEISTGVCVNYDLYGITGQGIFKEVSA
 AYYNNWQNLLYDSNGNIIGFKDFLTNKTYTILPCYSGRVSAAFYQNSSSPALLYRNLKCSYV
 LNNISFISQPFYFDSYLGCVLNAVNLTSYSVSSCDLRMGSGFCIDYALPSSRRKRR

 SEQ ID N010 (S1[HCoV-NL63])
 FFTCNSNANLSMLQLGVPDNSSTIVTGLLPTHWFCANQSTSVYSANGFFYIDVGNHRSAFAL
 HTGYYDANQYYIYVTNEIGLNASVTLKICKFSRNTTFDFLSNASSSFDCIVNLLFTEQLGAPLG
 ITISGETVRLHLYNVTRTFYVPAAYKLTKLSVKCYFNYSCVFSVVNATVTVNVTTHNGRVVNY
 TVCDDCNGYTDNIFSVQQDGRIPNGFPFNNWFLLTNGSTLVDGVSRLYQPLRLTCLWPVPG
 LKSSTGFVYFNATGSDVNCNGYQHNSVVDVMRYNLNFSANSLDNLKSGVIVFKTLQYDVLF
 YCSNSSSGVLDTTIPFGPSSQPYYCFINSTINTTHVSTFVGILPPTVREIVVARTGQFYINGFK
 YFDLGFI EA VNFNVTT ASA TDFWTV AFA TFVDVL VNVSA TNIQNLL YCDSPFEKLQCEHLQF
 GLQDGFYSANFLDDNVLPETYVALPIYYQHTDINFTATASFGGSCYVCKPHQVNISLNGNTS
 VCVRTSHFSIRYIYNRVKSGSPGDSSWHIYLKSGTCPFSFSKLNNFQKFKTICFSTVEVPGSC
 NFPLEATWHYTSYTIVGALYVTWSEGNSITGVPYPVSGIREFSNLVLNNCTKYNIYDYVGTGII
 RSSNQSLAGGITYVSNSGNLLGFKNVSTGNIFIVTPCNQPDQVAVYQQSIIGAMTAVNESRY
 GLQNLLQLPNFYYV

 SEQ ID NO11 (S1[SARS_CoV])
 SGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTIN
 HTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNP
 FFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYK
 GYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTF
 MLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPF
 GEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSF
 VVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKL
 RPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLN DYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATV
 CGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILD
 ISPCSFGGVSVITPGTNASSEV A VL YQDVNCTDVST AI HADQL TPA WRIYSTGN NVFQTQAG
 CLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRL

 SEQ ID NO12 (Fragment von SEQ ID NO1)
 NSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGV
 YFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWM
 ESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRD
 LPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLK
 YNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVF
 NATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRG
 DEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFE
 RDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCG
 PKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITP
 CSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLI
 GAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQT

 SEQ ID NO13 (Genom von SARS-CoV-2-Isolat Wuhan-Hu-1, identisch mit Genbank- Eintrag
 MN908947 zum Prioritätstag):
 ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCT
 GTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACT
 CACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATC
 TTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTT
 TCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGAGAA
 AACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTACAGGTTCGCGACGTGCTCGTACGTGGCT
 TTGGAGACTCCGTGGAGGAGGTCTTATCAGAGGCACGTCAACATCTTAAAGATGGCACT
 TGTGGCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGAACAGCCCTATGTGTTC 
 ATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGC
 AGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTC
 ATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAA
 GGAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGC
 TTGGCACTGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTAAACATAGCAGTGGTG
 TTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTAACGGAGGGGCATACACTCGCTATGTCGATAAC
 AACTTCTGTGGCCCTGATGGCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAGCACGTGC
 TGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTG
 TATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAG
 AGCTATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCAAT
 GGGGAATGTCCAAATTTTGTATTTCCCTTAAATTCCATAATCAAGACTATTCAACCAAGG
 GTTGAAAAGAAAAAGCTTGATGGCTTTATGGGTAGAATTCGATCTGTCTATCCAGTTGCG
 TCACCAAATGAATGCAACCAAATGTGCCTTTCAACTCTCATGAAGTGTGATCATTGTGGT
 GAAACTTCATGGCAGACGGGCGATTTTGTTAAAGCCACTTGCGAATTTTGTGGCACTGA
 GAATTTGACTAAAGAAGGTGCCACTACTTGTGGTTACTTACCCCAAAATGCTGTTGTTAA
 AATTTATTGTCCAGCATGTCACAATTCAGAAGTAGGACCTGAGCATAGTCTTGCCGAATA
 CCATAATGAATCTGGCTTGAAAACCATTCTTCGTAAGGGTGGTCGCACTATTGCCTTTGG
 AGGCTGTGTGTTCTCTTATGTTGGTTGCCATAACAAGTGTGCCTATTGGGTTCCACGTG
 CTAGCGCTAACATAGGTTGTAACCATACAGGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCGAAGGTCTT
 AATGACAACCTTCTTGAAATACTCCAAAAAGAGAAAGTCAACATCAATATTGTTGGTGAC
 TTTAAACTTAATGAAGAGATCGCCATTATTTTGGCATCTTTTTCTGCTTCCACAAGTGCTT
 TTGTGGAAACTGTGAAAGGTTTGGATTATAAAGCATTCAAACAAATTGTTGAATCCTGTG
 GTAATTTTAAAGTTACAAAAGGAAAAGCTAAAAAAGGTGCCTGGAATATTGGTGAACAGA
 AATCAATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTGCATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTACGATCAA
 TTTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCAAAATTCTGTGCGTGTTTTACAGAAGGCCGCTA
 TAACAATACTAGATGGAATTTCACAGTATTCACTGAGACTCATTGATGCTATGATGTTCA
 CATCTGATTTGGCTACTAACAATCTAGTTGTAATGGCCTACATTACAGGTGGTGTTGTTC
 AGTTGACTTCGCAGTGGCTAACTAACATCTTTGGCACTGTTTATGAAAAACTCAAACCCG
 TCCTTGATTGGCTTGAAGAGAAGTTTAAGGAAGGTGTAGAGTTTCTTAGAGACGGTTGG
 GAAATTGTTAAATTTATCTCAACCTGTGCTTGTGAAATTGTCGGTGGACAAATTGTCACC
 TGTGCAAAGGAAATTAAGGAGAGTGTTCAGACATTCTTTAAGCTTGTAAATAAATTTTTG
 GCTTTGTGTGCTGACTCTATCATTATTGGTGGAGCTAAACTTAAAGCCTTGAATTTAGGT
 GAAACATTTGTCACGCACTCAAAGGGATTGTACAGAAAGTGTGTTAAATCCAGAGAAGA
 AACTGGCCTACTCATGCCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATCTTCTTAGAGGGAGAAAC
 ACTTCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGAAGTTGTCTTGAAAACTGGTGATTTACAACCATT
 AGAACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGAAGCTCCATTGGTTGGTACACCAGTTTGTATTAA
 CGGGCTTATGTTGCTCGAAATCAAAGACACAGAAAAGTACTGTGCCCTTGCACCTAATA
 TGATGGTAACAAACAATACCTTCACACTCAAAGGCGGTGCACCAACAAAGGTTACTTTTG
 GTGATGACACTGTGATAGAAGTGCAAGGTTACAAGAGTGTGAATATCACTTTTGAACTTG 
 ATGAAAGGATTGATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTTGAACTCGGTA
 CAGAAGTAAATGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCA
 GTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATAC
 TACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTAAATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACC
 CTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACT
 CAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACT
 TCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCA
 ACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAA
 TTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAG
 TGAATAGTTTTAGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACAT
 TGTGGAAGAAGCTAAAAAGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCT
 TAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGGCTACTAACAATGCCATGCAAG
 TTGAATCTGATGATTACATAGCTACTAATGGACCACTTAAAGTGGGTGGTAGTTGTGTTT
 TAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAG
 GTGAAGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTTAATCAGCACGAAGTTCTACT
 TGCACCATTATTATCAGCTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTATACATTCTTTAAGAGTTTGT
 GTAGATACTGTTCGCACAAATGTCTACTTAGCTGTCTTTGATAAAAATCTCTATGACAAAC
 TTGTTTCAAGCTTTTTGGAAATGAAGAGTGAAAAGCAAGTTGAACAAAAGATCGCTGAGA
 TTCCTAAAGAGGAAGTTAAGCCATTTATAACTGAAAGTAAACCTTCAGTTGAACAGAGAA
 AACAAGATGATAAGAAAATCAAAGCTTGTGTTGAAGAAGTTACAACAACTCTGGAAGAAA
 CTAAGTTCCTCACAGAAAACTTGTTACTTTATATTGACATTAATGGCAATCTTCATCCAGA
 TTCTGCCACTCTTGTTAGTGACATTGACATCACTTTCTTAAAGAAAGATGCTCCATATATA
 GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCT
 GGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGAAAGCTTTGAGAAAAGTGCCAACAGACAATTATAT
 AACCACTTACCCGGGTCAGGGTTTAAATGGTTACACTGTAGAGGAGGCAAAGACAGTGC
 TTAAAAAGTGTAAAAGTGCCTTTTACATTCTACCATCTATTATCTCTAATGAGAAGCAAGA
 AATTCTTGGAACTGTTTCTTGGAATTTGCGAGAAATGCTTGCACATGCAGAAGAAACACG
 CAAATTAATGCCTGTCTGTGTGGAAACTAAAGCCATAGTTTCAACTATACAGCGTAAATA
 TAAGGGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGTGCTAGATTTTACTTTTACAC
 CAGTAAAACAACTGTAGCGTCACTTATCAACACACTTAACGATCTAAATGAAACTCTTGT
 TACAATGCCACTTGGCTATGTAACACATGGCTTAAATTTGGAAGAAGCTGCTCGGTATAT
 GAGATCTCTCAAAGTGCCAGCTACAGTTTCTGTTTCTTCACCTGATGCTGTTACAGCGTA
 TAATGGTTATCTTACTTCTTCTTCTAAAACACCTGAAGAACATTTTATTGAAACCATCTCA
 CTTGCTGGTTCCTATAAAGATTGGTCCTATTCTGGACAATCTACACAACTAGGTATAGAA
 TTTCTTAAGAGAGGTGATAAAAGTGTATATTACACTAGTAATCCTACCACATTCCACCTA
 GATGGTGAAGTTATCACCTTTGACAATCTTAAGACACTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGG
 ACTATTAAGGTGTTTACAACAGTAGACAACATTAACCTCCACACGCAAGTTGTGGACATG
 TCAATGACATATGGACAACAGTTTGGTCCAACTTATTTGGATGGAGCTGATGTTACTAAA
 ATAAAACCTCATAATTCACATGAAGGTAAAACATTTTATGTTTTACCTAATGATGACACTC 
 TACGTGTTGAGGCTTTTGAGTACTACCACACAACTGATCCTAGTTTTCTGGGTAGGTACA
 TGTCAGCATTAAATCACACTAAAAAGTGGAAATACCCACAAGTTAATGGTTTAACTTCTAT
 TAAATGGGCAGATAACAACTGTTATCTTGCCACTGCATTGTTAACACTCCAACAAATAGA
 GTTGAAGTTTAATCCACCTGCTCTACAAGATGCTTATTACAGAGCAAGGGCTGGTGAAG
 CTGCTAACTTTTGTGCACTTATCTTAGCCTACTGTAATAAGACAGTAGGTGAGTTAGGTG
 ATGTTAGAGAAACAATGAGTTACTTGTTTCAACATGCCAATTTAGATTCTTGCAAAAGAGT
 CTTGAACGTGGTGTGTAAAACTTGTGGACAACAGCAGACAACCCTTAAGGGTGTAGAAG
 CTGTTATGTACATGGGCACACTTTCTTATGAACAATTTAAGAAAGGTGTTCAGATACCTT
 GTACGTGTGGTAAACAAGCTACAAAATATCTAGTACAACAGGAGTCACCTTTTGTTATGA
 TGTCAGCACCACCTGCTCAGTATGAACTTAAGCATGGTACATTTACTTGTGCTAGTGAGT
 ACACTGGTAATTACCAGTGTGGTCACTATAAACATATAACTTCTAAAGAAACTTTGTATTG
 CATAGACGGTGCTTTACTTACAAAGTCCTCAGAATACAAAGGTCCTATTACGGATGTTTT
 CTACAAAGAAAACAGTTACACAACAACCATAAAACCAGTTACTTATAAATTGGATGGTGT
 TGTTTGTACAGAAATTGACCCTAAGTTGGACAATTATTATAAGAAAGACAATTCTTATTTC
 ACAGAGCAACCAATTGATCTTGTACCAAACCAACCATATCCAAACGCAAGCTTCGATAAT
 TTTAAGTTTGTATGTGATAATATCAAATTTGCTGATGATTTAAACCAGTTAACTGGTTATA
 AGAAACCTGCTTCAAGAGAGCTTAAAGTTACATTTTTCCCTGACTTAAATGGTGATGTGG
 TGGCTATTGATTATAAACACTACACACCCTCTTTTAAGAAAGGAGCTAAATTGTTACATAA
 ACCTATTGTTTGGCATGTTAACAATGCAACTAATAAAGCCACGTATAAACCAAATACCTG
 GTGTATACGTTGTCTTTGGAGCACAAAACCAGTTGAAACATCAAATTCGTTTGATGTACT
 GAAGTCAGAGGACGCGCAGGGAATGGATAATCTTGCCTGCGAAGATCTAAAACCAGTC
 TCTGAAGAAGTAGTGGAAAATCCTACCATACAGAAAGACGTTCTTGAGTGTAATGTGAAA
 ACTACCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACCAGCAAATAATAGTTTAAAAATTACA
 GAAGAGGTTGGCCACACAGATCTAATGGCTGCTTATGTAGACAATTCTAGTCTTACTATT
 AAGAAACCTAATGAATTATCTAGAGTATTAGGTTTGAAAACCCTTGCTACTCATGGTTTA
 GCTGCTGTTAATAGTGTCCCTTGGGATACTATAGCTAATTATGCTAAGCCTTTTCTTAAC
 AAAGTTGTTAGTACAACTACTAACATAGTTACACGGTGTTTAAACCGTGTTTGTACTAATT
 ATATGCCTTATTTCTTTACTTTATTGCTACAATTGTGTACTTTTACTAGAAGTACAAATTCT
 AGAATTAAAGCATCTATGCCGACTACTATAGCAAAGAATACTGTTAAGAGTGTCGGTAAA
 TTTTGTCTAGAGGCTTCATTTAATTATTTGAAGTCACCTAATTTTTCTAAACTGATAAATAT
 TATAATTTGGTTTTTACTATTAAGTGTTTGCCTAGGTTCTTTAATCTACTCAACCGCTGCT
 TTAGGTGTTTTAATGTCTAATTTAGGCATGCCTTCTTACTGTACTGGTTACAGAGAAGGC
 TATTTGAACTCTACTAATGTCACTATTGCAACCTACTGTACTGGTTCTATACCTTGTAGTG
 TTTGTCTTAGTGGTTTAGATTCTTTAGACACCTATCCTTCTTTAGAAACTATACAAATTAC
 CATTTCATCTTTTAAATGGGATTTAACTGCTTTTGGCTTAGTTGCAGAGTGGTTTTTGGCA
 TATATTCTTTTCACTAGGTTTTTCTATGTACTTGGATTGGCTGCAATCATGCAATTGTTTTT
 CAGCTATTTTGCAGTACATTTTATTAGTAATTCTTGGCTTATGTGGTTAATAATTAATCTTG
 TACAAATGGCCCCGATTTCAGCTATGGTTAGAATGTACATCTTCTTTGCATCATTTTATTA
 TGTATGGAAAAGTTATGTGCATGTTGTAGACGGTTGTAATTCATCAACTTGTATGATGTG 
 TTACAAACGTAATAGAGCAACAAGAGTCGAATGTACAACTATTGTTAATGGTGTTAGAAG
 GTCCTTTTATGTCTATGCTAATGGAGGTAAAGGCTTTTGCAAACTACACAATTGGAATTG
 TGTTAATTGTGATACATTCTGTGCTGGTAGTACATTTATTAGTGATGAAGTTGCGAGAGA
 CTTGTCACTACAGTTTAAAAGACCAATAAATCCTACTGACCAGTCTTCTTACATCGTTGAT
 AGTGTTACAGTGAAGAATGGTTCCATCCATCTTTACTTTGATAAAGCTGGTCAAAAGACT
 TATGAAAGACATTCTCTCTCTCATTTTGTTAACTTAGACAACCTGAGAGCTAATAACACTA
 AAGGTTCATTGCCTATTAATGTTATAGTTTTTGATGGTAAATCAAAATGTGAAGAATCATC
 TGCAAAATCAGCGTCTGTTTACTACAGTCAGCTTATGTGTCAACCTATACTGTTACTAGA
 TCAGGCATTAGTGTCTGATGTTGGTGATAGTGCGGAAGTTGCAGTTAAAATGTTTGATG
 CTTACGTTAATACGTTTTCATCAACTTTTAACGTACCAATGGAAAAACTCAAAACACTAGT
 TGCAACTGCAGAAGCTGAACTTGCAAAGAATGTGTCCTTAGACAATGTCTTATCTACTTT
 TATTTCAGCAGCTCGGCAAGGGTTTGTTGATTCAGATGTAGAAACTAAAGATGTTGTTGA
 ATGTCTTAAATTGTCACATCAATCTGACATAGAAGTTACTGGCGATAGTTGTAATAACTAT
 ATGCTCACCTATAACAAAGTTGAAAACATGACACCCCGTGACCTTGGTGCTTGTATTGAC
 TGTAGTGCGCGTCATATTAATGCGCAGGTAGCAAAAAGTCACAACATTGCTTTGATATG
 GAACGTTAAAGATTTCATGTCATTGTCTGAACAACTACGAAAACAAATACGTAGTGCTGC
 TAAAAAGAATAACTTACCTTTTAAGTTGACATGTGCAACTACTAGACAAGTTGTTAATGTT
 GTAACAACAAAGATAGCACTTAAGGGTGGTAAAATTGTTAATAATTGGTTGAAGCAGTTA
 ATTAAAGTTACACTTGTGTTCCTTTTTGTTGCTGCTATTTTCTATTTAATAACACCTGTTCA
 TGTCATGTCTAAACATACTGACTTTTCAAGTGAAATCATAGGATACAAGGCTATTGATGG
 TGGTGTCACTCGTGACATAGCATCTACAGATACTTGTTTTGCTAACAAACATGCTGATTT
 TGACACATGGTTTAGCCAGCGTGGTGGTAGTTATACTAATGACAAAGCTTGCCCATTGA
 TTGCTGCAGTCATAACAAGAGAAGTGGGTTTTGTCGTGCCTGGTTTGCCTGGCACGATA
 TTACGCACAACTAATGGTGACTTTTTGCATTTCTTACCTAGAGTTTTTAGTGCAGTTGGTA
 ACATCTGTTACACACCATCAAAACTTATAGAGTACACTGACTTTGCAACATCAGCTTGTG
 TTTTGGCTGCTGAATGTACAATTTTTAAAGATGCTTCTGGTAAGCCAGTACCATATTGTTA
 TGATACCAATGTACTAGAAGGTTCTGTTGCTTATGAAAGTTTACGCCCTGACACACGTTA
 TGTGCTCATGGATGGCTCTATTATTCAATTTCCTAACACCTACCTTGAAGGTTCTGTTAG
 AGTGGTAACAACTTTTGATTCTGAGTACTGTAGGCACGGCACTTGTGAAAGATCAGAAG
 CTGGTGTTTGTGTATCTACTAGTGGTAGATGGGTACTTAACAATGATTATTACAGATCTTT
 ACCAGGAGTTTTCTGTGGTGTAGATGCTGTAAATTTACTTACTAATATGTTTACACCACTA
 ATTCAACCTATTGGTGCTTTGGACATATCAGCATCTATAGTAGCTGGTGGTATTGTAGCT
 ATCGTAGTAACATGCCTTGCCTACTATTTTATGAGGTTTAGAAGAGCTTTTGGTGAATAC
 AGTCATGTAGTTGCCTTTAATACTTTACTATTCCTTATGTCATTCACTGTACTCTGTTTAA
 CACCAGTTTACTCATTCTTACCTGGTGTTTATTCTGTTATTTACTTGTACTTGACATTTTAT
 CTTACTAATGATGTTTCTTTTTTAGCACATATTCAGTGGATGGTTATGTTCACACCTTTAG
 TACCTTTCTGGATAACAATTGCTTATATCATTTGTATTTCCACAAAGCATTTCTATTGGTT
 CTTTAGTAATTACCTAAAGAGACGTGTAGTCTTTAATGGTGTTTCCTTTAGTACTTTTGAA
 GAAGCTGCGCTGTGCACCTTTTTGTTAAATAAAGAAATGTATCTAAAGTTGCGTAGTGAT 
 GTGCTATTACCTCTTACGCAATATAATAGATACTTAGCTCTTTATAATAAGTACAAGTATT
 TTAGTGGAGCAATGGATACAACTAGCTACAGAGAAGCTGCTTGTTGTCATCTCGCAAAG
 GCTCTCAATGACTTCAGTAACTCAGGTTCTGATGTTCTTTACCAACCACCACAAACCTCT
 ATCACCTCAGCTGTTTTGCAGAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTCCCATCTGGTAAAGTT
 GAGGGTTGTATGGTACAAGTAACTTGTGGTACAACTACACTTAACGGTCTTTGGCTTGAT
 GACGTAGTTTACTGTCCAAGACATGTGATCTGCACCTCTGAAGACATGCTTAACCCTAAT
 TATGAAGATTTACTCATTCGTAAGTCTAATCATAATTTCTTGGTACAGGCTGGTAATGTTC
 AACTCAGGGTTATTGGACATTCTATGCAAAATTGTGTACTTAAGCTTAAGGTTGATACAG
 CCAATCCTAAGACACCTAAGTATAAGTTTGTTCGCATTCAACCAGGACAGACTTTTTCAG
 TGTTAGCTTGTTACAATGGTTCACCATCTGGTGTTTACCAATGTGCTATGAGGCCCAATT
 TCACTATTAAGGGTTCATTCCTTAATGGTTCATGTGGTAGTGTTGGTTTTAACATAGATTA
 TGACTGTGTCTCTTTTTGTTACATGCACCATATGGAATTACCAACTGGAGTTCATGCTGG
 CACAGACTTAGAAGGTAACTTTTATGGACCTTTTGTTGACAGGCAAACAGCACAAGCAG
 CTGGTACGGACACAACTATTACAGTTAATGTTTTAGCTTGGTTGTACGCTGCTGTTATAA
 ATGGAGACAGGTGGTTTCTCAATCGATTTACCACAACTCTTAATGACTTTAACCTTGTGG
 CTATGAAGTACAATTATGAACCTCTAACACAAGACCATGTTGACATACTAGGACCTCTTT
 CTGCTCAAACTGGAATTGCCGTTTTAGATATGTGTGCTTCATTAAAAGAATTACTGCAAA
 ATGGTATGAATGGACGTACCATATTGGGTAGTGCTTTATTAGAAGATGAATTTACACCTT
 TTGATGTTGTTAGACAATGCTCAGGTGTTACTTTCCAAAGTGCAGTGAAAAGAACAATCA
 AGGGTACACACCACTGGTTGTTACTCACAATTTTGACTTCACTTTTAGTTTTAGTCCAGA
 GTACTCAATGGTCTTTGTTCTTTTTTTTGTATGAAAATGCCTTTTTACCTTTTGCTATGGG
 TATTATTGCTATGTCTGCTTTTGCAATGATGTTTGTCAAACATAAGCATGCATTTCTCTGT
 TTGTTTTTGTTACCTTCTCTTGCCACTGTAGCTTATTTTAATATGGTCTATATGCCTGCTA
 GTTGGGTGATGCGTATTATGACATGGTTGGATATGGTTGATACTAGTTTGTCTGGTTTTA
 AGCTAAAAGACTGTGTTATGTATGCATCAGCTGTAGTGTTACTAATCCTTATGACAGCAA
 GAACTGTGTATGATGATGGTGCTAGGAGAGTGTGGACACTTATGAATGTCTTGACACTC
 GTTTATAAAGTTTATTATGGTAATGCTTTAGATCAAGCCATTTCCATGTGGGCTCTTATAA
 TCTCTGTTACTTCTAACTACTCAGGTGTAGTTACAACTGTCATGTTTTTGGCCAGAGGTA
 TTGTTTTTATGTGTGTTGAGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTGGTAATACACTTCAGTG
 TATAATGCTAGTTTATTGTTTCTTAGGCTATTTTTGTACTTGTTACTTTGGCCTCTTTTGTT
 TACTCAACCGCTACTTTAGACTGACTCTTGGTGTTTATGATTACTTAGTTTCTACACAGGA
 GTTTAGATATATGAATTCACAGGGACTACTCCCACCCAAGAATAGCATAGATGCCTTCAA
 ACTCAACATTAAATTGTTGGGTGTTGGTGGCAAACCTTGTATCAAAGTAGCCACTGTACA
 GTCTAAAATGTCAGATGTAAAGTGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAGTTTTGCAACAACT
 CAGAGTAGAATCATCATCTAAATTGTGGGCTCAATGTGTCCAGTTACACAATGACATTCT
 CTTAGCTAAAGATACTACTGAAGCCTTTGAAAAAATGGTTTCACTACTTTCTGTTTTGCTT
 TCCATGCAGGGTGCTGTAGACATAAACAAGCTTTGTGAAGAAATGCTGGACAACAGGGC
 AACCTTACAAGCTATAGCCTCAGAGTTTAGTTCCCTTCCATCATATGCAGCTTTTGCTAC
 TGCTCAAGAAGCTTATGAGCAGGCTGTTGCTAATGGTGATTCTGAAGTTGTTCTTAAAAA 
 GTTGAAGAAGTCTTTGAATGTGGCTAAATCTGAATTTGACCGTGATGCAGCCATGCAAC
 GTAAGTTGGAAAAGATGGCTGATCAAGCTATGACCCAAATGTATAAACAGGCTAGATCT
 GAGGACAAGAGGGCAAAAGTTACTAGTGCTATGCAGACAATGCTTTTCACTATGCTTAG
 AAAGTTGGATAATGATGCACTCAACAACATTATCAACAATGCAAGAGATGGTTGTGTTCC
 CTTGAACATAATACCTCTTACAACAGCAGCCAAACTAATGGTTGTCATACCAGACTATAA
 CACATATAAAAATACGTGTGATGGTACAACATTTACTTATGCATCAGCATTGTGGGAAAT
 CCAACAGGTTGTAGATGCAGATAGTAAAATTGTTCAACTTAGTGAAATTAGTATGGACAA
 TTCACCTAATTTAGCATGGCCTCTTATTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGTCAA
 ATTACAGAATAATGAGCTTAGTCCTGTTGCACTACGACAGATGTCTTGTGCTGCCGGTA
 CTACACAAACTGCTTGCACTGATGACAATGCGTTAGCTTACTACAACACAACAAAGGGA
 GGTAGGTTTGTACTTGCACTGTTATCCGATTTACAGGATTTGAAATGGGCTAGATTCCCT
 AAGAGTGATGGAACTGGTACTATCTATACAGAACTGGAACCACCTTGTAGGTTTGTTACA
 GACACACCTAAAGGTCCTAAAGTGAAGTATTTATACTTTATTAAAGGATTAAACAACCTAA
 ATAGAGGTATGGTACTTGGTAGTTTAGCTGCCACAGTACGTCTACAAGCTGGTAATGCA
 ACAGAAGTGCCTGCCAATTCAACTGTATTATCTTTCTGTGCTTTTGCTGTAGATGCTGCT
 AAAGCTTACAAAGATTATCTAGCTAGTGGGGGACAACCAATCACTAATTGTGTTAAGATG
 TTGTGTACACACACTGGTACTGGTCAGGCAATAACAGTTACACCGGAAGCCAATATGGA
 TCAAGAATCCTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATC
 CAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTG
 CTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGG
 AAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGC
 ACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCAC
 AGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTG
 GTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACA
 ATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGA
 AACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATGACTTCTTTAAGTTT
 AGAATAGACGGTGACATGGTACCACATATATCACGTCAACGTCTTACTAAATACACAATG
 GCAGACCTCGTCTATGCTTTAAGGCATTTTGATGAAGGTAATTGTGACACATTAAAAGAA
 ATACTTGTCACATACAATTGTTGTGATGATGATTATTTCAATAAAAAGGACTGGTATGATT
 TTGTAGAAAACCCAGATATATTACGCGTATACGCCAACTTAGGTGAACGTGTACGCCAA
 GCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTGTGATGCCATGCGAAATGCTGGTATTGTTGGTGTA
 CTGACATTAGATAATCAAGATCTCAATGGTAACTGGTATGATTTCGGTGATTTCATACAA
 ACCACGCCAGGTAGTGGAGTTCCTGTTGTAGATTCTTATTATTCATTGTTAATGCCTATA
 TTAACCTTGACCAGGGCTTTAACTGCAGAGTCACATGTTGACACTGACTTAACAAAGCCT
 TACATTAAGTGGGATTTGTTAAAATATGACTTCACGGAAGAGAGGTTAAAACTCTTTGAC
 CGTTATTTTAAATATTGGGATCAGACATACCACCCAAATTGTGTTAACTGTTTGGATGAC
 AGATGCATTCTGCATTGTGCAAACTTTAATGTTTTATTCTCTACAGTGTTCCCACCTACAA
 GTTTTGGACCACTAGTGAGAAAAATATTTGTTGATGGTGTTCCATTTGTAGTTTCAACTG
 GATACCACTTCAGAGAGCTAGGTGTTGTACATAATCAGGATGTAAACTTACATAGCTCTA 
 GACTTAGTTTTAAGGAATTACTTGTGTATGCTGCTGACCCTGCTATGCACGCTGCTTCTG
 GTAATCTATTACTAGATAAACGCACTACGTGCTTTTCAGTAGCTGCACTTACTAACAATG
 TTGCTTTTCAAACTGTCAAACCCGGTAATTTTAACAAAGACTTCTATGACTTTGCTGTGTC
 TAAGGGTTTCTTTAAGGAAGGAAGTTCTGTTGAATTAAAACACTTCTTCTTTGCTCAGGA
 TGGTAATGCTGCTATCAGCGATTATGACTACTATCGTTATAATCTACCAACAATGTGTGA
 TATCAGACAACTACTATTTGTAGTTGAAGTTGTTGATAAGTACTTTGATTGTTACGATGGT
 GGCTGTATTAATGCTAACCAAGTCATCGTCAACAACCTAGACAAATCAGCTGGTTTTCCA
 TTTAATAAATGGGGTAAGGCTAGACTTTATTATGATTCAATGAGTTATGAGGATCAAGAT
 GCACTTTTCGCATATACAAAACGTAATGTCATCCCTACTATAACTCAAATGAATCTTAAGT
 ATGCCATTAGTGCAAAGAATAGAGCTCGCACCGTAGCTGGTGTCTCTATCTGTAGTACT
 ATGACCAATAGACAGTTTCATCAAAAATTATTGAAATCAATAGCCGCCACTAGAGGAGCT
 ACTGTAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGGTGGTTGGCACAACATGTTAAAAACTGTT
 TATAGTGATGTAGAAAACCCTCACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCC
 ATGCCTAACATGCTTAGAATTATGGCCTCACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGT
 TGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAA
 ATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC
 CACAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTTAAT
 GCACTTTTATCTACTGATGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTCCGCAATTTACAACAC
 AGACTTTATGAGTGTCTCTATAGAAATAGAGATGTTGACACAGACTTTGTGAATGAGTTT
 TACGCATATTTGCGTAAACATTTCTCAATGATGATACTCTCTGACGATGCTGTTGTGTGT
 TTCAATAGCACTTATGCATCTCAAGGTCTAGTGGCTAGCATAAAGAACTTTAAGTCAGTT
 CTTTATTATCAAAACAATGTTTTTATGTCTGAAGCAAAATGTTGGACTGAGACTGACCTTA
 CTAAAGGACCTCATGAATTTTGCTCTCAACATACAATGCTAGTTAAACAGGGTGATGATT
 ATGTGTACCTTCCTTACCCAGATCCATCAAGAATCCTAGGGGCCGGCTGTTTTGTAGAT
 GATATCGTAAAAACAGATGGTACACTTATGATTGAACGGTTCGTGTCTTTAGCTATAGAT
 GCTTACCCACTTACTAAACATCCTAATCAGGAGTATGCTGATGTCTTTCATTTGTACTTAC
 AATACATAAGAAAGCTACATGATGAGTTAACAGGACACATGTTAGACATGTATTCTGTTA
 TGCTTACTAATGATAACACTTCAAGGTATTGGGAACCTGAGTTTTATGAGGCTATGTACA
 CACCGCATACAGTCTTACAGGCTGTTGGGGCTTGTGTTCTTTGCAATTCACAGACTTCAT
 TAAGATGTGGTGCTTGCATACGTAGACCATTCTTATGTTGTAAATGCTGTTACGACCATG
 TCATATCAACATCACATAAATTAGTCTTGTCTGTTAATCCGTATGTTTGCAATGCTCCAGG
 TTGTGATGTCACAGATGTGACTCAACTTTACTTAGGAGGTATGAGCTATTATTGTAAATC
 ACATAAACCACCCATTAGTTTTCCATTGTGTGCTAATGGACAAGTTTTTGGTTTATATAAA
 AATACATGTGTTGGTAGCGATAATGTTACTGACTTTAATGCAATTGCAACATGTGACTGG
 ACAAATGCTGGTGATTACATTTTAGCTAACACCTGTACTGAAAGACTCAAGCTTTTTGCA
 GCAGAAACGCTCAAAGCTACTGAGGAGACATTTAAACTGTCTTATGGTATTGCTACTGTA
 CGTGAAGTGCTGTCTGACAGAGAATTACATCTTTCATGGGAAGTTGGTAAACCTAGACC
 ACCACTTAACCGAAATTATGTCTTTACTGGTTATCGTGTAACTAAAAACAGTAAAGTACAA
 ATAGGAGAGTACACCTTTGAAAAAGGTGACTATGGTGATGCTGTTGTTTACCGAGGTAC 
 AACAACTTACAAATTAAATGTTGGTGATTATTTTGTGCTGACATCACATACAGTAATGCCA
 TTAAGTGCACCTACACTAGTGCCACAAGAGCACTATGTTAGAATTACTGGCTTATACCCA
 ACACTCAATATCTCAGATGAGTTTTCTAGCAATGTTGCAAATTATCAAAAGGTTGGTATG
 CAAAAGTATTCTACACTCCAGGGACCACCTGGTACTGGTAAGAGTCATTTTGCTATTGG
 CCTAGCTCTCTACTACCCTTCTGCTCGCATAGTGTATACAGCTTGCTCTCATGCCGCTGT
 TGATGCACTATGTGAGAAGGCATTAAAATATTTGCCTATAGATAAATGTAGTAGAATTATA
 CCTGCACGTGCTCGTGTAGAGTGTTTTGATAAATTCAAAGTGAATTCAACATTAGAACAG
 TATGTCTTTTGTACTGTAAATGCATTGCCTGAGACGACAGCAGATATAGTTGTCTTTGAT
 GAAATTTCAATGGCCACAAATTATGATTTGAGTGTTGTCAATGCCAGATTACGTGCTAAG
 CACTATGTGTACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCACGCACATTGCTAACTAA
 GGGCACACTAGAACCAGAATATTTCAATTCAGTGTGTAGACTTATGAAAACTATAGGTCC
 AGACATGTTCCTCGGAACTTGTCGGCGTTGTCCTGCTGAAATTGTTGACACTGTGAGTG
 CTTTGGTTTATGATAATAAGCTTAAAGCACATAAAGACAAATCAGCTCAATGCTTTAAAAT
 GTTTTATAAGGGTGTTATCACGCATGATGTTTCATCTGCAATTAACAGGCCACAAATAGG
 CGTGGTAAGAGAATTCCTTACACGTAACCCTGCTTGGAGAAAAGCTGTCTTTATTTCACC
 TTATAATTCACAGAATGCTGTAGCCTCAAAGATTTTGGGACTACCAACTCAAACTGTTGA
 TTCATCACAGGGCTCAGAATATGACTATGTCATATTCACTCAAACCACTGAAACAGCTCA
 CTCTTGTAATGTAAACAGATTTAATGTTGCTATTACCAGAGCAAAAGTAGGCATACTTTG
 CATAATGTCTGATAGAGACCTTTATGACAAGTTGCAATTTACAAGTCTTGAAATTCCACG
 TAGGAATGTGGCAACTTTACAAGCTGAAAATGTAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAA
 GGTAATCACTGGGTTACATCCTACACAGGCACCTACACACCTCAGTGTTGACACTAAATT
 CAAAACTGAAGGTTTATGTGTTGACATACCTGGCATACCTAAGGACATGACCTATAGAAG
 ACTCATCTCTATGATGGGTTTTAAAATGAATTATCAAGTTAATGGTTACCCTAACATGTTT
 ATCACCCGCGAAGAAGCTATAAGACATGTACGTGCATGGATTGGCTTCGATGTCGAGG
 GGTGTCATGCTACTAGAGAAGCTGTTGGTACCAATTTACCTTTACAGCTAGGTTTTTCTA
 CAGGTGTTAACCTAGTTGCTGTACCTACAGGTTATGTTGATACACCTAATAATACAGATT
 TTTCCAGAGTTAGTGCTAAACCACCGCCTGGAGATCAATTTAAACACCTCATACCACTTA
 TGTACAAAGGACTTCCTTGGAATGTAGTGCGTATAAAGATTGTACAAATGTTAAGTGACA
 CACTTAAAAATCTCTCTGACAGAGTCGTATTTGTCTTATGGGCACATGGCTTTGAGTTGA
 CATCTATGAAGTATTTTGTGAAAATAGGACCTGAGCGCACCTGTTGTCTATGTGATAGAC
 GTGCCACATGCTTTTCCACTGCTTCAGACACTTATGCCTGTTGGCATCATTCTATTGGAT
 TTGATTACGTCTATAATCCGTTTATGATTGATGTTCAACAATGGGGTTTTACAGGTAACCT
 ACAAAGCAACCATGATCTGTATTGTCAAGTCCATGGTAATGCACATGTAGCTAGTTGTGA
 TGCAATCATGACTAGGTGTCTAGCTGTCCACGAGTGCTTTGTTAAGCGTGTTGACTGGA
 CTATTGAATATCCTATAATTGGTGATGAACTGAAGATTAATGCGGCTTGTAGAAAGGTTC
 AACACATGGTTGTTAAAGCTGCATTATTAGCAGACAAATTCCCAGTTCTTCACGACATTG
 GTAACCCTAAAGCTATTAAGTGTGTACCTCAAGCTGATGTAGAATGGAAGTTCTATGATG
 CACAGCCTTGTAGTGACAAAGCTTATAAAATAGAAGAATTATTCTATTCTTATGCCACACA
 TTCTGACAAATTCACAGATGGTGTATGCCTATTTTGGAATTGCAATGTCGATAGATATCC 
 TGCTAATTCCATTGTTTGTAGATTTGACACTAGAGTGCTATCTAACCTTAACTTGCCTGGT
 TGTGATGGTGGCAGTTTGTATGTAAATAAACATGCATTCCACACACCAGCTTTTGATAAA
 AGTGCTTTTGTTAATTTAAAACAATTACCATTTTTCTATTACTCTGACAGTCCATGTGAGT
 CTCATGGAAAACAAGTAGTGTCAGATATAGATTATGTACCACTAAAGTCTGCTACGTGTA
 TAACACGTTGCAATTTAGGTGGTGCTGTCTGTAGACATCATGCTAATGAGTACAGATTGT
 ATCTCGATGCTTATAACATGATGATCTCAGCTGGCTTTAGCTTGTGGGTTTACAAACAAT
 TTGATACTTATAACCTCTGGAACACTTTTACAAGACTTCAGAGTTTAGAAAATGTGGCTTT
 TAATGTTGTAAATAAGGGACACTTTGATGGACAACAGGGTGAAGTACCAGTTTCTATCAT
 TAATAACACTGTTTACACAAAAGTTGATGGTGTTGATGTAGAATTGTTTGAAAATAAAACA
 ACATTACCTGTTAATGTAGCATTTGAGCTTTGGGCTAAGCGCAACATTAAACCAGTACCA
 GAGGTGAAAATACTCAATAATTTGGGTGTGGACATTGCTGCTAATACTGTGATCTGGGA
 CTACAAAAGAGATGCTCCAGCACATATATCTACTATTGGTGTTTGTTCTATGACTGACAT
 AGCCAAGAAACCAACTGAAACGATTTGTGCACCACTCACTGTCTTTTTTGATGGTAGAGT
 TGATGGTCAAGTAGACTTATTTAGAAATGCCCGTAATGGTGTTCTTATTACAGAAGGTAG
 TGTTAAAGGTTTACAACCATCTGTAGGTCCCAAACAAGCTAGTCTTAATGGAGTCACATT
 AATTGGAGAAGCCGTAAAAACACAGTTCAATTATTATAAGAAAGTTGATGGTGTTGTCCA
 ACAATTACCTGAAACTTACTTTACTCAGAGTAGAAATTTACAAGAATTTAAACCCAGGAGT
 CAAATGGAAATTGATTTCTTAGAATTAGCTATGGATGAATTCATTGAACGGTATAAATTAG
 AAGGCTATGCCTTCGAACATATCGTTTATGGAGATTTTAGTCATAGTCAGTTAGGTGGTT
 TACATCTACTGATTGGACTAGCTAAACGTTTTAAGGAATCACCTTTTGAATTAGAAGATTT
 TATTCCTATGGACAGTACAGTTAAAAACTATTTCATAACAGATGCGCAAACAGGTTCATC
 TAAGTGTGTGTGTTCTGTTATTGATTTATTACTTGATGATTTTGTTGAAATAATAAAATCCC
 AAGATTTATCTGTAGTTTCTAAGGTTGTCAAAGTGACTATTGACTATACAGAAATTTCATT
 TATGCTTTGGTGTAAAGATGGCCATGTAGAAACATTTTACCCAAAATTACAATCTAGTCA
 AGCGTGGCAACCGGGTGTTGCTATGCCTAATCTTTACAAAATGCAAAGAATGCTATTAG
 AAAAGTGTGACCTTCAAAATTATGGTGATAGTGCAACATTACCTAAAGGCATAATGATGA
 ATGTCGCAAAATATACTCAACTGTGTCAATATTTAAACACATTAACATTAGCTGTACCCTA
 TAATATGAGAGTTATACATTTTGGTGCTGGTTCTGATAAAGGAGTTGCACCAGGTACAGC
 TGTTTTAAGACAGTGGTTGCCTACGGGTACGCTGCTTGTCGATTCAGATCTTAATGACTT
 TGTCTCTGATGCAGATTCAACTTTGATTGGTGATTGTGCAACTGTACATACAGCTAATAA
 ATGGGATCTCATTATTAGTGATATGTACGACCCTAAGACTAAAAATGTTACAAAAGAAAA
 TGACTCTAAAGAGGGTTTTTTCACTTACATTTGTGGGTTTATACAACAAAAGCTAGCTCTT
 GGAGGTTCCGTGGCTATAAAGATAACAGAACATTCTTGGAATGCTGATCTTTATAAGCTC
 ATGGGACACTTCGCATGGTGGACAGCCTTTGTTACTAATGTGAATGCGTCATCATCTGA
 AGCATTTTTAATTGGATGTAATTATCTTGGCAAACCACGCGAACAAATAGATGGTTATGT
 CATGCATGCAAATTACATATTTTGGAGGAATACAAATCCAATTCAGTTGTCTTCCTATTCT
 TTATTTGACATGAGTAAATTTCCCCTTAAATTAAGGGGTACTGCTGTTATGTCTTTAAAAG
 AAGGTCAAATCAATGATATGATTTTATCTCTTCTTAGTAAAGGTAGACTTATAATTAGAGA
 AAACAACAGAGTTGTTATTTCTAGTGATGTTCTTGTTAACAACTAAACGAACAATGTTTGT 
 TTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAA
 TTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCA
 GATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTG
 GTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCT
 ACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTG
 GATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACT
 AATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTA
 CCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAA
 TTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAA
 TTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTA
 AGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCAT
 TGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAG
 AAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTA
 TGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACA
 GATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTC
 ACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATT
 GTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGAT
 TTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTG
 TCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATT
 AAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTC
 AGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGAT
 GATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGT
 AATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATA
 TTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATT
 GTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATA
 CAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAA
 AAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGC
 ACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGAC
 ATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACA
 CCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTT
 GCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAA
 CTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGC
 TGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCA
 GGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGC
 TAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTC
 TAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCA
 GTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAA
 TGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTG
 GAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTT 
 ACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCC
 ATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGC
 AGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCT
 CATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAAT
 GATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGG
 TGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTAT
 TGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAG
 TGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCA
 AGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAA
 TTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCT
 GAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGAC
 TCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAAT
 GTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCT
 TATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCC
 TGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTT
 TCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTT
 TTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGT
 AATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAA
 GGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACAT
 CTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGT
 TGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTA
 TATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAAT
 GGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTC
 TTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCA
 AATTACATTACACATAAACGAACTTATGGATTTGTTTATGAGAATCTTCACAATTGGAACT
 GTAACTTTGAAGCAAGGTGAAATCAAGGATGCTACTCCTTCAGATTTTGTTCGCGCTACT
 GCAACGATACCGATACAAGCCTCACTCCCTTTCGGATGGCTTATTGTTGGCGTTGCACT
 TCTTGCTGTTTTTCAGAGCGCTTCCAAAATCATAACCCTCAAAAAGAGATGGCAACTAGC
 ACTCTCCAAGGGTGTTCACTTTGTTTGCAACTTGCTGTTGTTGTTTGTAACAGTTTACTCA
 CACCTTTTGCTCGTTGCTGCTGGCCTTGAAGCCCCTTTTCTCTATCTTTATGCTTTAGTC
 TACTTCTTGCAGAGTATAAACTTTGTAAGAATAATAATGAGGCTTTGGCTTTGCTGGAAA
 TGCCGTTCCAAAAACCCATTACTTTATGATGCCAACTATTTTCTTTGCTGGCATACTAATT
 GTTACGACTATTGTATACCTTACAATAGTGTAACTTCTTCAATTGTCATTACTTCAGGTGA
 TGGCACAACAAGTCCTATTTCTGAACATGACTACCAGATTGGTGGTTATACTGAAAAATG
 GGAATCTGGAGTAAAAGACTGTGTTGTATTACACAGTTACTTCACTTCAGACTATTACCA
 GCTGTACTCAACTCAATTGAGTACAGACACTGGTGTTGAACATGTTACCTTCTTCATCTA
 CAATAAAATTGTTGATGAGCCTGAAGAACATGTCCAAATTCACACAATCGACGGTTCATC
 CGGAGTTGTTAATCCAGTAATGGAACCAATTTATGATGAACCGACGACGACTACTAGCG
 TGCCTTTGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGA 
 CAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGT
 TACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGT
 GAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGA
 GTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATATTATATTAGTTTTTCTGTTTGGAACTTT
 AATTTTAGCCATGGCAGATTCCAACGGTACTATTACCGTTGAAGAGCTTAAAAAGCTCCT
 TGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTCCTTACATGGATTTGTCTTCTACAATTT
 GCCTATGCCAACAGGAATAGGTTTTTGTATATAATTAAGTTAATTTTCCTCTGGCTGTTAT
 GGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTTTACAGAATAAATTGGATCACCG
 GTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTTCATT
 GCTTCTTTCAGACTGTTTGCGCGTACGCGTTCCATGTGGTCATTCAATCCAGAAACTAAC
 ATTCTTCTCAACGTGCCACTCCATGGCACTATTCTGACCAGACCGCTTCTAGAAAGTGAA
 CTCGTAATCGGAGCTGTGATCCTTCGTGGACATCTTCGTATTGCTGGACACCATCTAGG
 ACGCTGTGACATCAAGGACCTGCCTAAAGAAATCACTGTTGCTACATCACGAACGCTTT
 CTTATTACAAATTGGGAGCTTCGCAGCGTGTAGCAGGTGACTCAGGTTTTGCTGCATAC
 AGTCGCTACAGGATTGGCAACTATAAATTAAACACAGACCATTCCAGTAGCAGTGACAAT
 ATTGCTTTGCTTGTACAGTAAGTGACAACAGATGTTTCATCTCGTTGACTTTCAGGTTAC
 TATAGCAGAGATATTACTAATTATTATGAGGACTTTTAAAGTTTCCATTTGGAATCTTGAT
 TACATCATAAACCTCATAATTAAAAATTTATCTAAGTCACTAACTGAGAATAAATATTCTCA
 ATTAGATGAAGAGCAACCAATGGAGATTGATTAAACGAACATGAAAATTATTCTTTTCTTG
 GCACTGATAACACTCGCTACTTGTGAGCTTTATCACTACCAAGAGTGTGTTAGAGGTACA
 ACAGTACTTTTAAAAGAACCTTGCTCTTCTGGAACATACGAGGGCAATTCACCATTTCAT
 CCTCTAGCTGATAACAAATTTGCACTGACTTGCTTTAGCACTCAATTTGCTTTTGCTTGTC
 CTGACGGCGTAAAACACGTCTATCAGTTACGTGCCAGATCAGTTTCACCTAAACTGTTCA
 TCAGACAAGAGGAAGTTCAAGAACTTTACTCTCCAATTTTTCTTATTGTTGCGGCAATAG
 TGTTTATAACACTTTGCTTCACACTCAAAAGAAAGACAGAATGATTGAACTTTCATTAATT
 GACTTCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTCTGCTATTCCTTGTTTTAATTATGCTTATTATCTT
 TTGGTTCTCACTTGAACTGCAAGATCATAATGAAACTTGTCACGCCTAAACGAACATGAA
 ATTTCTTGTTTTCTTAGGAATCATCACAACTGTAGCTGCATTTCACCAAGAATGTAGTTTA
 CAGTCATGTACTCAACATCAACCATATGTAGTTGATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTAT
 TCTAAATGGTATATTAGAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAATTGTGCGTG
 GATGAGGCTGGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATATCGGTAATTATACAGTTTCC
 TGTTTACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGTCTTGTAGTGCGTTGTT
 CGTTCTATGAAGACTTTTTAGAGTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAAC
 GAACAAACTAAAATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTAC
 GTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCG
 CGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGC
 TCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTA
 ACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATT
 CGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGG 
 AACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTG
 CAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAAC
 AATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGC
 AGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAAC
 AGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGG
 CAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGA
 GCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCT
 GCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAAC
 ACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAA
 CTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAG
 CGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACG
 TGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAA
 GTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAA
 AAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACA
 GCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACA
 ATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAACTCATGCAGACCACACAAGGCAGA
 TGGGCTATATAAACGTTTTCGCTTTTCCGTTTACGATATATAGTCTACTCTTGTGCAGAAT
 GAATTCTCGTAACTACATAGCACAAGTAGATGTAGTTAACTTTAATCTCACATAGCAATCT
 TTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCC
 ACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAA
 GAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCT
 TAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

 SEQ ID NO14, wobei es sich um 30-44 von SEQ ID NO1 handelt
 SSVLHSTQDLFLPFF

 SEQ ID NO15, wobei es sich um 48-68 von SEQ ID NO1 handelt
 TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPV

 SEQ ID NO16, wobei es sich um 110-166 von SEQ ID NO1 handelt
 NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEG

 SEQ ID NO17, wobei es sich um 200-214 von SEQ ID NO1 handelt
 DLPQGFSALEPLVDL
SEQ ID NO18, wobei es sich um 226-250 von SEQ ID NO1 handelt
 LLALH RSYLTPGDSSSGWTAGAAAY

 SEQ ID NO19, wobei es sich um 256-277 von SEQ ID NO1 handelt
 QPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDP,

 SEQ ID NO20, wobei es sich um 328-342 von SEQ ID NO1 handelt
 NATRFASVYAWNRKR

 SEQ ID NO21, wobei es sich um 399-414 von SEQ ID NO1 handelt
 TGKIADYNYKLPDDF

 SEQ ID NO22, wobei es sich um 434-448 von SEQ ID NO1 handelt
 YNYLYRLFRKSNLKP

 SEQ ID NO23, wobei es sich um 550-572 von SEQ ID NO1 handelt
 FGRDIADTTDAVRDPQTLEILDI

 SEQ ID NO24, wobei es sich um 590-604 von SEQ ID NO1 handelt
 SNQVAVLYQDVNCTE

 SEQ ID NO25, wobei es sich um 632-650 von SEQ ID NO1 handelt
 AGCLIGAEHVNNSYECDIP

 SEQ ID NO26, wobei es sich um 354-368 von SEQ ID NO1 handelt
 YNSASFSTFKCYGVS

 SEQ ID NO27, wobei es sich um 622-636 von SEQ ID NO1 handelt
 STGSNVFQTRAGCLI

 SEQ ID NO28, wobei es sich um 30-44 von SEQ ID NO1 handelt
 SSVLHSTQDLFLPFF

 SEQ ID NO29, wobei es sich um 226-250 von SEQ ID NO1 handelt
 LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA AAY
SEQ ID NO30: SARS-CoV-2-N-Protein
 MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQH
 GKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEA
 GLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQ
 ASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQ
 QQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKH
 WPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTF
 PPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA

 SEQ ID N031: RBD, ein Fragment der S1-Domäne von SARS-CoV-2-S-Protein
 RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCY
 GVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLD
 SKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGV
 GYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

 SEQ ID NO32: RBD, ein Fragment der S1-Domäne von SARS-CoV-2 S-Protein, mit
 C-terminalem His-Tag
 RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCY
 GVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLD
 SKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGV
 GYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFLEHHHHHHHH

 SEQ ID NO33: S2-Dömäne aus SARS-CoV-2 S-Protein, mit C-terminalem His-Tag
 SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECS
 NLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPS
 KRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSAL
 LAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSS
 TASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQS
 LQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLH
 VTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNC
 DVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVA
 KNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSC
 CKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

 SEQ ID NO34 (von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid, reaktiv mit SARS-CoV-2-
 Antikörpern)
 RTQLPPAYTNS

 SEQ ID NO35 (von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid, reaktiv mit SARS-CoV-2-
 Antikörpern)
 LTPGDSSSGWTAG

 SEQ ID NO36 (von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid, reaktiv mit SARS-CoV-2-
 Antikörpern)
 YQAGSTPCNGV
SEQ ID NO37 (von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid, reaktiv mit SARS-CoV-2-
 Antikörpern)
 YGFQPTNGVGYQ
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele, Sequenzen und Figuren illustriert, aus denen weitere Merkmale, Ausführungsformen, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung entnommen werden können. Alle Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, können beim Ausführen oder Erproben der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit geeigneten Verfahren und Materialien, wie sie hierin beschrieben sind. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Bezugsquellen, die hierin erwähnt werden, werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.
    • 1 zeigt einen Zeitverlauf der Konzentrationen von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 (IgA, IgG) und gegen N-Protein (IgG, IgM), überwacht in zwei Patienten (1), wie in Beispiel 3 beschrieben.
    • 2 zeigt die Ergebnisse eines ELISA, bei dem die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA gegen S1 (Quadrate), der Immunglobulin-Klasse IgG gegen SEQ ID NO1 (Dreiecke) und der Immunglobulin-Klasse IgG gegen N-Protein (Kreise) bestimmt wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben ist.
    • 3 zeigt eine IFA unter Verwendung von Aceton-fixierten S1-exprimierenden oder mit Kontrollplasmid transfizierten HEK293-Zellen (A) inkubiert direkt mit anti-His-Tag-Antikörpern (1:200) oder Patientenserum 3 (PS3, 1:100) im ersten Schritt und anti-Maus-lgG-FITC oder anti-Human-lgG-FITC im zweiten Schritt, (B) inkubiert 30 Minuten lang mit PBS vor der zweischrittigen Inkubation mit PS3, wie beschrieben in A, oder (C) inkubiert 30 Minuten lang mit PBS, gefolgt von Inkubation mit PS3 (1:100) im ersten Schritt, anti-Human-lgG-Biotin (1:200) im zweiten Schritt und ExtrAvidin-FITC (1:2000) im dritten Schritt. S1-exprimierende Zellen waren mit einem pTriEx-Vektor unter Verwendung von Standardverfahren transfiziert worden, der SEQ ID NO2 exprimiert.
  • Beispiel 1: Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 unter Verwendung eines ELISA-Immunassays
  • Proben
  • Acht Proben von Patienten, die unter Verwendung von PCR wie beschrieben von Corman et al. (Corman et al. (2020) Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2) positiv auf SARS-CoV-2 getestet worden waren, und 6 bis 14 Tage nach der Infektion erhalten worden waren, und 14 Proben von Patienten, die zu einem früheren Zeitpunkt nach der Infektion erhalten worden waren, standen zur Verfügung.
  • Zusätzlich war eine Reihe von Proben verfügbar, die verschiedene Coronaviren betrafen, umfassend 18 Proben von Patienten infiziert mit MERS, drei Proben von Patienten infiziert mit SARS-CoV-1, vier Patienten mit NL63, drei Patienten mit 229E, sechs Patienten mit OC43 und drei Patienten mit HKU1.
  • Herstellung von Mikrotiterplatten beschichtet mit Antigen
  • SEQ ID NO2 wurde in HEK293T-Zellen exprimiert mittels Standard-Klonierung von SEQ ID NO4 in ein pTriEx-1-Plasmid mit einer künstlichen Signalsequenz und einem C-terminalen His-Tag, was zur Expression von SEQ ID NO2 führt, und nach Entfernung des Signalpeptides, zu SEQ ID NO3. Die transfizierten Zellen wurden bei 37 °C und 8,5 % CO2 in Dulbeccos-modifizierten Eagle-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 0.1 mg/ml Streptomycin drei bis 5 Tage lang kultiviert. Die Zellen wurden geerntet, in 20 mM Tris-HCL pH 7.4, 10 % (w/v) Saccharose, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
  • Um SEQ ID NO3 herzustellen, wurde der Überstand der Zellkultur auf 5 mmol/l Tris-Chlorid pH 8.0, 164 mmol/l Natriumchlorid, 50 mmol/l Magnesiumchlorid, 20 mmol/l Imidazol, 0,1 % Triton X-100 eingestellt, durch Zentrifugation 30 Minuten lang bei 17.600xg, 4 °C geklärt und an eine Nickel Rapid Run-Säule (Agarose Bead Technologies, Miami, FL, USA) aufgetragen, die mit 5 mmol/l Tris-Chlorid pH 8,0, 300 mmol/l Natriumchlorid, 20 mmol/l Imidazol eingestellt worden war und durch Erhöhung der Imidazol-Konzentration bis auf 150 mmol/l eluiert. Alle in SEQ ID NO3 enthaltenen Fraktionen wurden zusammen gegeben und mittels Ultrafiltration (VivaSpin, Sartorius, Göttingen, Germany) konzentiert. Die finale Präparation wurde bis zur weiteren Benutzung bei -80 °C gelagert.
  • Die finale Protein-Präparation von SEQ ID NO3 wurde mit oder ohne 16 mmol/l Dithiotreitol behandelt und 10 Minuten lang bei 70 °C oder bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von SDS-Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung. Die Proteinidentität wurde mittels Massenspektrometrie verifiziert.
  • Zur Verwendung für einen Mikrotiterplatten-ELISA wurde das gereinigte Protein in PBS bis zur Endkonzentration von ungefähr 1.5 µg/ml verdünnt und verwendet, um ELISA-Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Denmark) über Nacht zu beschichten.
  • Experimentelle Vorgehensweise
  • Die Proben wurden 1:101 in IgG-Probenpuffer verdünnt, auf Mikrotiterplatten aufgebracht und inkubiert, wie es für im Handel erhältliche EUROIMMUN-ELISA Test-Kits beschrieben ist, unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien (z. B. EI 2260-9601 G/A, wobei es sich um einen Puffer handelt, der im Wesentlichen physiologische Bedingungen mit Hinblick auf Salz-Konzentration und pH aufweist). Dabei wurde die Anleitung EI 2260-9601 G/A befolgt. Kurz gesagt: 60 Minuten bei 37 °C; drei Waschschritte unter Verwendung von Waschpuffer; Zugabe von 100 µl Peroxidase-markiertem anti-humanem IgG-Konjugat (Kaninchen) oder anti-humanem IgA-Konjugat (Kaninchen) pro Well; Inkubation 30 Minuten lang bei 37 °C; drei Waschschritte unter Verwendung von EUROIMMUN-Waschpuffer; Zugabe von 100 µl Chromogen-/Substrat-Lösung (TMB/H2O2) pro Well; Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur; Zugabe von 100 µl Stop-Lösung (0,5 M Schwefelsäure); Messung der optischen Dichte bei 450 nm gegen 630 nm als Referenz.
  • Die Kalibration wurde unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kalibratoren ausgeführt (Produkt Nummer EI 2606-9601 A, EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG). Ein Verhältnis wurde dadurch berechnet, dass die Extinktion der Kontrolle oder des Patientenserums durch die Extinktion des Kalibrators geteilt wurde. Ergebnisse unter 0,8 wurden als negative Ergebnisse betrachtet, Ergebnisse zwischen 0,8 und 1,1 als grenzwertig und Ergebnisse von mehr als 1,1 als positiv.
  • Ergebnisse
  • Die Primärdaten von 79 Patienten sind in Tabelle 1 gezeigt:
    Rohdaten Cut-Off OD Rohdaten Cut-Off OD
    0,100 0,200
    IgG (OD) Verdünnung 1: IgG (Verhältnis) IgA (OD) Verdünnung 1: IgA (Verhältnis)
    pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1
    - - grenzwertig: 0,8-1,0 - - grenzwertig: 0,8-1,0
    1 Kalibrator 1,911 300 19,1 3,055 600 15,3
    2 Kalibrator 1,593 600 15,9 2,204 1200 11,0
    3 Kalibrator 1,077 1200 10,8 1,068 2400 5,3
    4 Kalibrator 0,697 2400 7,0 0,529 4800 2,6
    5 Kalibrator 0,441 4800 4,4 0,314 9600 1,6
    6 Kalibrator 0,248 9600 2,5 0,155 19200 0,8
    7 Kalibrator 0,132 19200 1,3 0,078 38400 0,4
    8 Kalibrator 0,066 38400 0,7 0,051 76800 0,3
    9 SARS-CoV-2, späte Phase 0,157 1,6 1,402 7,0
    10 SARS-CoV-2, späte Phase 0,075 0,8 0,377 1,9
    11 SARS-COV-2, späte Phase 0,276 2,8 9,999 50,0
    12 SARS-COV-2, späte Phase 0,027 0,3 0,027 0,1
    13 SARS-COV-2, späte Phase 0,023 0,2 0,064 0,3
    14 SARS-COV-2, späte Phase 0,119 1,2 1,142 5,7
    15 SARS-COV-2, späte Phase 0,031 0,3 0,203 1,0
    16 SARS-COV-2, späte Phase 0,079 0.8 0,385 1,9
    17 SARS-COV-2, < Tag 6 0,021 0,2 0,055 0,3
    18 SARS-COV-2, < Taq 6 0,019 0,2 0,084 0,4
    19 SARS-COV-2, < Tag 6 0,021 0,2 0,225 1,1
    20 SARS-COV-2, < Taq 6 0,018 0,2 0,192 1,0
    21 SARS-COV-2, < Tag 6 0,033 0,3 0,599 3,0
    22 SARS-COV-2, < Tag 6 0,029 0,3 0,331 1,7
    23 SARS-COV-2, < Tag 6 0,013 0,1 0,030 0,2
    24 SARS-COV-2, < Tag 6 0,017 0,2 0,097 0,5
    25 SARS-COV-2, < Tag 6 0,027 0,3 0,214 1,1
    26 SARS-COV-2, < Tag 6 0,016 0,2 0,021 0,1
    27 SARS-COV-2, < Tag 6 0,014 0,1 0,073 0,4
    28 SARS-COV-2, < Tag 6 0,014 0,1 0,042 0,2
    29 SARS-COV-2, < Tag 6 0,015 0,2 0,030 0,2
    30 SARS-COV-2, < Tag 6 0,015 0,2 0,079 0,4
    31 MERS 1 0,013 0,1 0,042 0,2
    32 MERS 2 0,008 0,1 0,017 0,1
    33 MERS 3 0,011 0,1 0,038 0,2
    34 MERS 4 0,008 0,1 0,011 0,1
    35 MERS 5 0,008 0,1 0,027 0,1
    36 MERS 6 0,008 0,1 0,035 0,2
    37 MERS 7 0,009 0,1 0,013 0,1
    38 MERS 8 0,017 0,2 0,036 0,2
    39 MERS 9 0,010 0,1 0,024 0,1
    40 MERS 10 0,007 0,1 0,012 0,1
    41 MERS 11 0,020 0,2 0,026 0,1
    42 MERS 12 0,008 0,1 0,026 0,1
    43 MERS 13 0,015 0,2 0,021 0,1
    44 MERS 14 0,012 0,1 0,036 0,2
    45 MERS 15 0,024 0,2 0,066 0,3
    46 MERS 16 0,021 0,2 0,080 0,4
    47 MERS 17 0,008 0,1 0,039 0,2
    48 MERS 18 0,029 0,3 0,104 0,5
    49 SARS-1 0,214 2,1 0,285 1,4
    50 SARS-1 0,596 6,0 0,227 1,1
    51 SARS-1 0,128 1,3 0,260 1,3
    52 OC43 0,035 0,4 0,126 0,6
    53 OC43 0,029 0,3 0,098 0,5
    54 OC43 0,016 0,2 0,041 0,2
    55 OC43 0,011 0,1 0,048 0,2
    68 NL63 0,013 0,1 0,023 0,1
    69 NL63 0,027 0,3 0,039 0,2
    70 NL63 0,036 0,4 0,057 0,3
    71 NL63 0,019 0,2 0,030 0,2
    72 229E 0,041 0,4 0,045 0,2
    73 229E 0,022 0,2 0,024 0,1
    74 229E 0,030 0,3 0,034 0,2
    75 OC43 0,050 0,5 0,100 0,5
    76 OC43 0,079 0,8 0,201 1,0
    77 HKU1 0,023 0,2 0,054 0,3
    78 HKU1 0,019 0,2 0,055 0,3
    79 HKU1 0,010 0,1 0,029 0,1
  • Schlussfolgerungen
  • Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper gegen SEQ ID NO1 verwendet werden können, um eine SARS-CoV-2-Infektion in Proben von menschlichen Patienten zu diagnostizieren.
  • Ein Vergleich der Daten, die mit sekundären Antikörpern erhalten wurden, die Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgG bzw. IgA erkennen, zeigt, dass der Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA sensitiver ist, wenigstens in einer frühen Phase der Krankheit: 4/14 Patientproben, die in einer frühen Phase der Infektion abgenommen wurden, vor Ablauf von sechs Tagen nach Ausbruch der Krankheit, konnten korrekt als positiv identifiziert werden, wenn Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA nachgewiesen wurden, wohingegen der Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgG in den gleichen Proben negative Ergebnisse ergab.
  • Beide Tests zeigten Kreuzreaktivität mit Proben von SARS-CoV-1-Patienten, aber mit praktisch keiner der Proben von Patienten, die mit MERS, NL63, 229E, OC43 and HKU1 infiziert waren. Eine Unterscheidung zwischen SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 ist basierend auf der unterschiedlichen zeitaufgelösten Immunglobulin-Klassen-Signatur möglich, insbesondere des späteren Erscheinens von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA in SARS-CoV-1 (Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066).
  • Mehrere nachveröffentlichte Veröffentlichungen von unabhängigen Forschern bestätigten die Erkenntnisse der Erfinder. Jääskelainen et al. zogen die Schlussfolgerung, dass unter sechs im Handel verfügbaren serologischen Tests der EUROIMMUN-Assay basierend auf der dem Nachweis von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA gegen S1 die höchste Sensitivität aufwies (Jääskelainen, A. J., Kuivanen, S., Kekäläinen, E., Ahava, M.J., Loginov, R., Kallio-Kokko, H., Vapalahti, O., Jarva, H., Kurkela, and Lappalainen, M. (2020), J. Clin. Virology 129, 104512).
  • Beavis et al. bestätigten, dass die Sensitivität des IgA-basierten Tests gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Frühphase der Krankheit überlegen ist, wohingegen der IgGbasierte Assay zu späteren Phasen überlegen ist, genauer wenigstens vier Tage nach der Diagnose durch PCR (Beavis, K. G., Mathushek, S. M., Abeleda, A. P. F., Bethel, C., Hunt, C., Gillen, S., Moran, A., and Tesic, V. (2020) Evaluation of the EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA Assay for detection of IgA and IgG antibodies, J. Clin. Virology 129, 104468).
  • Insgesamt kann der Test gemäß der vorliegenden Erfindung für den frühen Nachweis diagnostisch relevanter Antikörper gegen SEQ ID NO1 verwendet werden. In einigen Patienten können richtig positive Ergebnisse vor Ablauf von sechs Tagen nach dem Ausbruch der Symptome erzielt werden. Daher trägt der Test dazu bei, die diagnostische Lücke zwischen der Zeit, in der PCR-basierte Tests verwendet werden können und der Zeit, in der Immuntests verwendet werden können, zu schließen oder wenigstens zu verkleinern.
  • Beispiel 2: Eine erweiterte ELISA-Studie mit dem Ziel, die diagnostische Zuverlässigkeit und Relevanz der Tests zum Nachweis von einem Antikörper gegen SEQ ID NO1 weiter zu charakterisieren
  • Um die Sensitivität zu bestimmen, wurde die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern der Immunglobulin-Klasse IgA in 166 Proben von 152 europäischen Patienten unter Verwendung von EUROIMMUN-Produkt Nr. EI 2606-9601 A nachgewiesen. Das Vorliegen einer SARS-CoV-2-Infektion war zuvor unter Verwendung der RT-PCR gemäß Corman VM, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 25(3): pii=2000045 (2020-01-23) basierend auf einer Probe aus einer frühen Phase der Infektion bestätigt worden.
  • Kurz gesagt basiert dieser Test auf einem ELISA unter Verwendung einer Mikrotiterplatte, die mit einem Antigen beschichtet ist, das aufgereinigtes SEQ ID NO1 umfasst. Nach einer Inkubation mit Proben und umfangreichen Waschschritten unter Verwendung von physiologischen Puffern wird ein sekundärer Antikörper gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA, der mit einer enzymatisch aktiven Markierung versehen ist, verwendet, um Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO1 spezifisch mit einer Markierung zu versehen, gefolgt von einer Inkubation mit einem chromogenen Substrat. Die Details können der Anleitung entnommen werden, die mit dem Produkt geliefert wird.
  • Die serologischen Charakterisierungen wurden mit Proben ausgeführt, die im Verlauf der Infektion abgenommen wurden.
  • Mit Proben, die bis zum Tag 10 nach Ausbruch der Symptome oder der direkten Detektion abgenommen worden waren, konnte eine Sensitivität von 60,2 % betreffend Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO1 bestimmt werden. Die Sensitivität betrug 98,6 %, wenn nach Tag 10 erhaltene Proben verwendet wurden.
  • Die Ergebnisse und Immunantworten sind jedoch hochgradig individuell. Z. B. kann eine Minderheit von Patienten keine IgA-, IgG- oder IgM-Antwort oder überhaupt keine der genannten Immunantworten zeigen.
  • Beispiel 3: Persistieren von diagnostisch relevanten Antikörpern über die Zeit bei SARS-CoV-2-Patienten, gezeigt mittels ELISA
  • Der Zeitverlauf von Konzentrationen von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 (IgA, IgG) und N-Protein (IgG, IgM) wurde in zwei Patienten überwacht (1). Beide stellten sich mit einem milden Verlauf der Krankheit vor, aber die Infektion war durch RT-PCR bestätigt worden. Es wurden typische spezifische Symptome wie beispielsweise der zeitweilige Verlust des Geruchsinns beobachtet. Die EUROIMMUN-Produkte EI 2606-A und -G und EI 2606-2-G und -M wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Das Prinzip und die wesentlichen Bestandteile der Tests sind wie in den Beispielen 1 und 2 dargestellt; jedoch wurden unterschiedliche Antigene (Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 und N-Protein) wie auch verschiedene sekundäre Antikörper (bindend an IgA, IgG oder IgM) verwendet, abhängig vom Target und der Immunglobulin-Klasse, die nachzuweisen war.
  • Aus der sehr frühen Phase der Krankheit standen keine Proben zur Verfügung. Der Verlauf der Krankheit wurde jedoch länger als vier Monate überwacht. Zunächst waren IgA und IgG gegen SEQ ID NO1 und IgG, aber kein IgM gegen N-Protein nachweisbar. In beiden Patienten war nach vier Monaten wenigstens IgA oder IgG gegen SEQ ID NO1 nachweisbar, wohingegen IgG gegen N-Protein schon zwei Monate nach der ersten positiven PCR abwesend oder nur noch schwach nachweisbar war.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper gegen SEQ ID NO1 wenigstens in einigen Patienten länger anzutreffen sind als Antikörper gegen N-Protein. Die Konzentration der IgA-Antikörper verringert sich schneller als die Konzentration der IgG-Antikörper, aber IgA-Antikörper können aufgrund ihres anfänglich höheren Signals auch beim Verschwinden noch dominant sein.
  • Das Überwachen eines anderen Zeitverlaufs mit einem dritten Patienten ist in 2 gezeigt. Im Wesentlichen wurden Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen S1 (Quadrate), Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG gegen SEQ ID NO1 (Dreiecke) und Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG gegen N-Protein (Kreise) unter Verwendung der EUROIMMUN-Produkte EI 2606-A und -G bzw. EI 2606-2 bestimmt.
  • Beispiel 4: ELISA-basiertes Überwachen verschiedener Antikörper über Zeit
  • Der Zeitverlauf der Konzentrationen von IgA- und IgG-Antikörpern gegen SED ID NO1 und IgG- und IgM-Antikörpern gegen N-Protein wurde unter Verwendung von ELISA-Kits EI 2606 A/G und EI 2606-2 G/M (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG) bestimmt. Es wurden je vier Proben von zwei Patienten untersucht, die an einer SARS-CoV-2-Infektion litten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt:
    Probe Tag nach erster positiver PCR EUROIMMUN GER
    EUROIMMUN ELISA
    SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 NCP
    EI 2606 A EI 2606 G EI 2606-2 G EI 2606-2 M
    C200412DA C200428DB verschiedene verschiedene
    IgA IgG IgG IgM
    Verhältnis Verhältnis Verhältnis Verhältnis
    pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1
    grenzwertig: 0,8-<1,1 grenzwertig: 0,8-<1,1 grenzwertig: 0,8-<1,1 grenzwertig: 0,8-<1,1
    Patient 1 16 5,3 1,9 1,5 0,1
    Patient 1 34 4,1 3,2 1,3 0,1
    Patient 1 63 1,6 3,3 1,0 0,1
    Patient 1 146 0,6 1,8 0,4 0,1
    Patient 2 16 11,0 5,7 1,3 0,1
    Patient 2 34 10,6 7,0 1,4 0,1
    Patient 2 63 6,3 6,0 1,3 0,2
    Patient 2 146 4,0 2,3 0,6 0,2
  • Bei beiden überwachten Patienten ist das IgA-Signal am stärksten und kann in einem Zeitfenster von wenigstens 47 Tagen nachgewiesen werden. IgG gegen SEQ ID NO1 kann über die gesamte Zeitspanne der Überwachung nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu sind IgG gegen N-Protein nur zu den ersten zwei (Patient 1) oder drei (Patient 2) Zeitpunkten nachweisbar, nur knapp über dem cut off-Wert. IgM gegen N-Protein ist zu keinem Zeitpunkt nachweisbar.
  • Es kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass Antikörper gegen SEQ ID NO1 deutlich länger persistieren als Antikörper gegen N-Protein, wobei IgG gegen SEQ ID NO1 über die gesamte Zeitspanne von 130 Tagen nachweisbar sind. Dies bestätigt die höhere Sensitivität des Tests gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 5: Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Immuntests (ChLIA)
  • Ein EUROIMMUN Random Access RA 10-Analyzer (YG 0710-0101) wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers und mit den Grundeinstellungen verwendet.
  • Tosylaktivierte magnetische Beads (M-280, Invitrogen) wurden unter Verwendung der Anleitung des Herstellers beschichtet. Kurz gesagt wurden die Beads in Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumphosphat pH 7,4) 10 Minuten lang bei 37 °C auf einem IKA-Roller 10 (geliefert von VWR) gewaschen, gefolgt von der magnetischen Konzentrierung der Beads und dem Entfernen von Überstand. Rekombinantes Polypeptid, aufgereinigt gemäß Beispiel 1, wurde im gleichen Puffer hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 1 M Ammoniumsulfat und Inkubation unter den gleichen Bedingungen 19 Stunden lang, gefolgt von zwei Waschschritten unter Verwendung von Waschpuffer (PBS pH 7,4 0,5% BSA 0,2 % Tween-20), Blockieren im gleichen Puffer 4 Stunden lang bei 37 °C und zwei weiteren Waschschritten. Die Beads wurden im gleichen Puffer wenigstens 16 Stunden lang bei 4 °C gelagert (PBS pH 7,4 0,1% BSA 0,2 % Tween-20).
  • Der Test wurde durch Vermischung von magnetischen Beads mit Probenpuffer (BSA/Tween-20 in Tris-HCI EDTA) durchgeführt. 20 µl Bead-Suspension (1 mg/ml) wurde mit 5 µl Probe in einem Gesamtvolumen von 200 µl in Probenpuffer kontaktiert. Nach der zehnminütigen Inkubation wurden die Beads dreimal in Probenpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 160 µl IgG-/IgA-/IgM-Konjugat (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostik AG, LK 0711-10010, im Wesentlichen ein sekundärer Antikörper markiert mit Acridiniumester) und Inkubation 10 Minuten lang bei 37 °C. Nach drei Waschschritten wurde alkalisches Wasserstoffperoxid schnell hinzugegeben und vermischt, um die Emission von Licht auszulösen, gefolgt von sofortigem Lumineszenz-Nachweis 10 Sekunden lang. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt:
    IgA ELISA IgG ELISA IgG ChLIA IgM ChLIA IgA ChLIA
    Verhältnis Verhältnis Verhältnis (nicht valide) Verhältnis (nicht valide) Verhältnis (nicht valide)
    pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1 pos: ≥ 1,1
    grenzwertig: 0,8-<1,1 grenzwertig: 0,8-<1,1 grenzwertig: 0,8-<1,1 grenzwertig: 0,8-<1,1 grenzwertig: 0,8-<1,1
    Patient 1 8,2/7,8/8,5 2,4/2,2/2,6 0,9 0,2 1,9
    2 14,1/12,9/ 11,2 6,9/6,0/5,7 3,2 0,5 3,7
    3 13,1 5,4 5,6 0,4 1,6
    4 0,3 0,3 0,1 0,1 0,2
    5 0,3 0,1 0,1 0 0,2
    6 0,3 0,0 0,1 0 0,3
    7 0,4 0,1 0,4 0,1 0,2
    8 0,5 0,5/0,76 0,3 0,1 0,5
  • Die Patienten 1 bis 3 litten unter einer SARS-CoV-2-Infektion, wohingegen die Patienten 4 bis 8 Negativ-Kontrollen waren.
  • Insgesamt konnten mit ELISA und ChLIA hochgradig konsistente Ergebnisse erzielt werden.
  • Beispiel 6: Indirekter Immunfluoreszenz-Test (IFA) mit HEK-S1-Zellen, die SEQ IQ NO2 exprimierten
  • Ein IFA wurde unter Verwendung von Glasträgern mit einer Biochip-Anordnung mit rekombinanten HEK293-Zellen durchgeführt, die SARS-CoV-2 S1-Protein exprimierten oder mit HEK293-Kontrollzellen, um zu zeigen, dass dieses Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen SEQ ID NO1 verwendet werden kann.
  • Jedes Biochip-Mosaik wurde mit 35 µl 1:100 PBS-verdünnten Serumproben bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, mit PBS-Tween gewaschen und 5 Minuten lang in PBS-Tween eingetaucht. Im zweiten Schritt wurde Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markierter Ziegen-Anti-humaner IgG (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck) zugefügt und es wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Träger wurden anschließend mit einer Spülung mit PBS-Tween gewaschen und anschließend 5 Minuten lang in PBS-Tween eingetaucht. Die Glasträger wurden in PBS-gepuffertes, DABCO enthaltendes Glyzerin (ungefähr 10 µl pro Feld) eingebettet und mittels Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Alternativ wurden die Träger vor Serum-Inkubation 30 Minuten lang mit PBS inkubiert, und gebundene menschliche IgGs wurden durch 30-minütige Inkubation mit anti-humanem IgG-Biotin (1:200, 109-065-098, Dianova), nachgewiesen, gefolgt von einem Waschschritt wie oben beschrieben und 30 Minuten Inkubation mit ExtrAvidin-FITC (1:2000, E2761, Sigma-Aldrich), gefolgt von einem weiteren Waschschritt. Die Proben wurden basierend auf der Fluoreszenz-Intensität der transfizierten Zellen im direkten Vergleich mit zur Kontrolle transfizierten Zelle und Kontrollproben als positiv oder negativ klassifiziert. Die Ergebnisse wurden von zwei unabhängige Beobachtern unter Verwendung eines EUROStar Il-Mikroskopes (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck, Deutschland) evaluiert. Die Reagenzien wurden von Merck, Darmstadt, Deutschland oder Sigma-Aldrich, Heidelberg, Deutschland erhalten, wenn es nicht anders angegeben wurde.
  • Ein S1-lgG-ELISA-positives Patientenserum (PS) zeigte eine positive Reaktion mit S1 (SEQ ID NO2), aber nicht mit einer zur Kontrolle transfizierten HEK-Zelle (2), wohingegen keine der 49 S1-lgG-ELISA-negativen Kontrollseren reagierten. Die Signal-Intensität des Patientenserums wurde verbessert durch Inkubieren der HEK-S1-Zellen mit PBS vor Serum-Inkubation und Nachweis von menschlichen IgG-Antikörpern und durch anti-Human-lgG-Biotin/ExtrAvidin-FITC. Insgesamt zeigten 15/24 S1-lgG-ELISA-positive Patientenseren eine positive Reaktion in HEK-S1-IFA mit Anti-Human-IgG-Biotin/ExtrAvidin-FITC.
  • Beispiel 7: Impfstudien
  • Ein gesundes Subjekt erhielt an Tag 1 eine Injektion von 12,86 µg rekombinantem S1-Protein in physiologischem PBS (SEQ ID NO3) in den Musculus Quadrizeps. Alum Adjuvans (Twinrix für Erwachsene, EMRA-MED Arzneimittel GmbH) wurde gemäß Anleitung des Herstellers verwendet. An den Tagen 9, 21 und 28 erhielt das Subjekt eine Injektion von weiteren 12,86 µg S1-Protein in physiologischem PBS-Puffer und 10 µl Imject Alaun Adjuvans in 500 µl Natriumchlorid-Lösung.
  • Blutproben wurden in den Tagen 10, 23 und 29 entnommen.
  • Die Anwesenheit von IgG- und IgA-Antikörpern gegen SARS-CoV-2 S1- und gegen N-Protein wurde in Serumproben des gesunden Subjekts unter Verwendung von serologischen Kits (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, EI 2606-9601 A, EI 2606-9601 G, EI 2606-9601-2 G) gemäß der Anleitung des Herstellers bestimmt.
  • Als Kontrollen wurden Proben von gesunden Blutspendern und von Patienten mit SARS-CoV-2-Infektionen verwendet. Tabelle 1: Antikörper gegen SARS-CoV-2-Antigene in einem Subjekt, das unter Verwendung von S1-Protein geimpft worden war
    Tag IgA (S1) (Cut off: <0,8) IgG (S1) (Cut off: <0,8) IgG (NCP) (Cut off: <0,8) IgM (NCP) (Cut off: <0,8)
    10 0,5 0,5 - -
    23 1,0 0,2 - -
    29 3,5 6,2 0,6 0,7
  • Von zwei Patienten, die unter einer SARS-CoV-2-Infektion litten (Positiv-Kontrollen), wurden Proben 17 und 19 Tage nach dem Ausbruch der Symptome (gewöhnlich 5-6 Tage nach der Infektion) erhalten. Die Antikörper-Konzentrationen sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Antikörper gegen SARS-CoV-2-Antigene in zwei Patienten, die an einer SARS-CoV-2-Infektion litten
    IgA (S1) (Cut off: <0,8) IgG (S1) (Cut off: <0,8) IgG (NCP) (Cut off: <0,8) IgM (NCP) (Cut off: <0,8)
    Patient 1 2,6 1,8 1,7 1,3
    Patient 2 1,3 6,3 3,5 11,4
  • In vier gesunden Subjekten, die keinen Impfstoff erhielten (Negativ-Kontrollen), wurden Proben erhalten. Die Antikörper-Konzentrationen sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Antikörper gegen SARS-CoV-2-Antigene in gesunden Subjekten
    IgA (S1) (Cut off: <0,8) IgG (S1) (Cut off: <0,8) IgG (NCP) (Cut off: <0,8) IgM (NCP) (Cut off: <0,8)
    Patient 1 0,0 0,1 0,0 0,5
    Patient 2 0,2 0,3 0,1 0,4
    Patient 3 0,1 0,1 0,1 0,2
    Patient 4 0,1 0,1 0,1 0,1
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass geimpfte und infizierte Subjekte oder Subjekte, die mit einem Vakzin behandelt wurden, das SEQ ID NO1 oder eine Variante davon nicht enthält, unter Verwendung eines Tests basierend auf dem Nachweis eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1 unterschieden werden können. Antikörper gegen das S1-Antigen im Impfstoff können in beiden nachgewiesen werden, aber Antikörper gegen das N-Protein nur in infizierten Patienten, aber nicht in geimpften Subjekten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    • <110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG
    • <120> Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion
    • <130> 20PU007DE6
    • <160> 37
    • <170> PatentIn version 3.5
    • <210> 1 <211> 670 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> SARS-CoV-2 S1 Spike-Protein
    • <400> 1
      Figure DE202020105117U1_0001
      Figure DE202020105117U1_0002
      Figure DE202020105117U1_0003
      Figure DE202020105117U1_0004
    • <210> 2 <211> 695 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
      Figure DE202020105117U1_0005
      Figure DE202020105117U1_0006
      Figure DE202020105117U1_0007
      Figure DE202020105117U1_0008
    • <210> 3 <211> 680
      Figure DE202020105117U1_0009
    • <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> SARS-CoV-2 Spike-Protein, C-terminal His-markiert, wie nach Abspaltung des Signalpeptids
    • <400> 3
      Figure DE202020105117U1_0010
      Figure DE202020105117U1_0011
      Figure DE202020105117U1_0012
      Figure DE202020105117U1_0013
    • <210> 4 <211> 2088 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> SARS-CoV-2 Spike-Protein, Nukleotidsequenz kodierend für SEQ ID NO2
    • <400> 4
      Figure DE202020105117U1_0014
    • <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Mögliches Epitop
    • <400> 5
      Figure DE202020105117U1_0015
    • <210> 6 <211> 734 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> S1 [MERS_CoV]
    • <400> 6
      Figure DE202020105117U1_0016
      Figure DE202020105117U1_0017
      Figure DE202020105117U1_0018
      Figure DE202020105117U1_0019
    • <210> 7 <211> 521 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> S1 [HCoV-229E]
    • <400> 7
      Figure DE202020105117U1_0020
      Figure DE202020105117U1_0021
      Figure DE202020105117U1_0022
      Figure DE202020105117U1_0023
    • <210> 8 <211> 745 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> S1 [HCoV-OC43]
    • <400> 8
      Figure DE202020105117U1_0024
      Figure DE202020105117U1_0025
      Figure DE202020105117U1_0026
      Figure DE202020105117U1_0027
    • <210> 9
    • <211> 744 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> S1 [HCoV-HKUl]
    • <400> 9
      Figure DE202020105117U1_0028
      Figure DE202020105117U1_0029
      Figure DE202020105117U1_0030
      Figure DE202020105117U1_0031
    • <210> 10 <211> 702 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> S1 [HCoV-NL63]
    • <400> 10
      Figure DE202020105117U1_0032
      Figure DE202020105117U1_0033
      Figure DE202020105117U1_0034
      Figure DE202020105117U1_0035
      Figure DE202020105117U1_0036
    • <210> 11 <211> 657 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> S1 [SARS_CoV]
    • <400> 11
      Figure DE202020105117U1_0037
      Figure DE202020105117U1_0038
      Figure DE202020105117U1_0039
      Figure DE202020105117U1_0040
    • <210> 12 <211> 649 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Fragment von SEQ ID NO1
    • <400> 12
      Figure DE202020105117U1_0041
      Figure DE202020105117U1_0042
      Figure DE202020105117U1_0043
      Figure DE202020105117U1_0044
    • <210> 13 <211> 29903 <212> DNA <213> schweres akutes respiratorisches Syndrom-Coronavirus-2
    • <400> 13
      Figure DE202020105117U1_0045
      Figure DE202020105117U1_0046
      Figure DE202020105117U1_0047
      Figure DE202020105117U1_0048
      Figure DE202020105117U1_0049
      Figure DE202020105117U1_0050
      Figure DE202020105117U1_0051
      Figure DE202020105117U1_0052
      Figure DE202020105117U1_0053
      Figure DE202020105117U1_0054
      Figure DE202020105117U1_0055
      Figure DE202020105117U1_0056
      Figure DE202020105117U1_0057
      Figure DE202020105117U1_0058
      Figure DE202020105117U1_0059
      Figure DE202020105117U1_0060
      Figure DE202020105117U1_0061
      Figure DE202020105117U1_0062
      Figure DE202020105117U1_0063
      Figure DE202020105117U1_0064
    • <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 30-44 von SEQ ID NO1
    • <400> 14
      Figure DE202020105117U1_0065
    • <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 48-68 von SEQ ID NO1
    • <400> 15
      Figure DE202020105117U1_0066
    • <210> 16 <211> 57 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 110-166 von SEQ ID NO1
    • <400> 16
      Figure DE202020105117U1_0067
    • <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 200-214 von SEQ ID NO1
    • <400> 17
      Figure DE202020105117U1_0068
    • <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 226-250 von SEQ ID NO1
    • <400> 18
      Figure DE202020105117U1_0069
    • <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
      Figure DE202020105117U1_0070
    • <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 328-342 von SEQ ID NO1
    • <400> 20
      Figure DE202020105117U1_0071
    • <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 399-414 von SEQ ID NO1
    • <400> 21
      Figure DE202020105117U1_0072
    • <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 434-448 von SEQ ID NO1
    • <400> 22
      Figure DE202020105117U1_0073
    • <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 550-572 von SEQ ID NO1
    • <400> 23
      Figure DE202020105117U1_0074
    • <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 590-604 von SEQ ID NO1
    • <400> 24
      Figure DE202020105117U1_0075
    • <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 632-650 von SEQ ID NO1
    • <400> 25
      Figure DE202020105117U1_0076
    • <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 354-368 von SEQ ID NO1
    • <400> 26
      Figure DE202020105117U1_0077
    • <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 622-636 von SEQ ID NO1
    • <400> 27
      Figure DE202020105117U1_0078
    • <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 30-44 von SEQ ID NO1
    • <400> 28
      Figure DE202020105117U1_0079
    • <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> Aminosäuren 226-250 von SEQ ID NO1
    • <400> 29
      Figure DE202020105117U1_0080
    • <210> 30 <211> 419 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> SARS-CoV-2 N Protein
    • <400> 30
      Figure DE202020105117U1_0081
      Figure DE202020105117U1_0082
      Figure DE202020105117U1_0083
    • <210> 31 <211> 223 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> RBD, ein Fragment der S1 Domäne aus dem SARS-CoV-2 S Protein
    • <400> 31
      Figure DE202020105117U1_0084
      Figure DE202020105117U1_0085
    • <210> 32 <211> 233 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> RBD, ein Fragment der S1 Domäne aus dem SARS-CoV-2 S Protein, mit C-terminaler His-Markierung
    • <400> 32
      Figure DE202020105117U1_0086
      Figure DE202020105117U1_0087
    • <210> 33 <211> 588 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> S2 Domäne aus dem SARS-CoV-2 S Protein, mit C-terminaler His-Markierung
    • <400> 33
      Figure DE202020105117U1_0088
      Figure DE202020105117U1_0089
      Figure DE202020105117U1_0090
      Figure DE202020105117U1_0091
    • <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2 Antikörpern
    • <400> 34
      Figure DE202020105117U1_0092
    • <210> 35 <211> 13 <212> PRT
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2 Antikörpern
    • <400> 35
      Figure DE202020105117U1_0093
    • <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2 Antikörpern
    • <400> 36
      Figure DE202020105117U1_0094
    • <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
    • <220> <223> von SEQ ID NO1 abgeleitetes Peptid reaktiv mit SARS-CoV-2 Antikörpern
    • <400> 37
      Figure DE202020105117U1_0095
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 14045254 [0015]
    • US 2005/0112559 [0016]
    • WO 2005/118813 [0017]
    • US 2006/0188519 [0018]
    • MN 908947 [0046]
    • WO 2013041540 [0075]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Corman, V. M., Landt, O., Kaiser, M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):2000045. doi: 10.2807/1560-7917. ES.2020.-25.3.2000045 [0008]
    • Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066 [0019, 0045, 0103]
    • Doerr, H. W., and Gerlich, W., Medizinische Virologie: Grundlagen, Diagnostik, Prävention und Therapie, Thieme 2010, z. B. Abb. 9.7 [0043]
    • Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3rd edition [0056]
    • Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948 [0056]
    • Beal, J., Mitechell, T., Wyschogrod, W., Manthey, J, and Clore, A. (2020) Highly Distinguished Amino Acid Sequences of 2019-nCoV (Wuhan Coronavirus) doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.31.929497 [0057]
    • Hua, R., Zhou, Y., Wang, Y., Hua, Y and Tong, T. (2004). Identification of two antigenic epitopes on SARS-CoV spike protein, BBR 319, 929-935 [0057]
    • Dahlke, C., Heidepriem, J., Kobbe, R., Santer R., Koch, T., Fathi, A., Ly, M. L, Schmiedel, S., Seeberger, P. H., ID-UKE COVID-19 study group, Addo, M. M., and Loeffler, F. F. (2020) https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20059733doi [0057]
    • Reischl, U., Molecular Diagnosis of Infectious diseases, Humana Press, 1998, z. B. Kapitel 12, 15, 16, 18 und 19 [0061]
    • Reischl, U., Molecular Diaignosis of Infectious diseases, Humana Press, 1998, z. B. Kapitel 21-26 [0061]
    • Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, insbesondere in Kapitel 14 [0062]
    • Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65 [0075]
    • Kricka, L. J. (2003). Clinical applications of chemiluminescence. Analytica chimica acta, 500(1): 279-286 [0079]
    • Weeks, I., Beheshti, I., McCapra, F., Campbell, A. K., Woodhead, J. S. (1983) Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay. Clin Chem 29: 1474-1479 [0079]
    • Mountants and Antifades“, published by Wright Cell Imaging Facility, Toronto Western Research Institute University Health Network (https://de.scribd.com/document/47879592/Mountants-Antifades) [0082]
    • Krenek et al. (1989) Comparison of antifading agents used in immunofluorescence, J. Immunol [0082]
    • Meth 117, 91-97 and Nairn et al. (1969) Microphotometry in Immunofluorescence, Clin. Exp. Immunol. 4, 697-705 [0082]
    • Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH or in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall [0083]
    • Handbücher „Strategies for Protein Purification“, „Antibody Purification“, published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R. , Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification [0083]
    • Corman et al. (2020) Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2 [0093]
    • Corman VM, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 25(3): pii=2000045 (2020-01-23) [0107]

    Claims (16)

    1. Diagnostisch nützlicher Träger umfassend ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 oder eine Variante davon, die an einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 aus einer Probe von einem Patienten binden kann, der an einer SARS-CoV-2-Infektion leidet, wobei das Polypeptid bevorzugt auf der Festphase des Trägers immobilisiert ist.
    2. Träger nach Anspruch 1, wobei die Variante eine Sequenzidentität von wenigstens 88, bevorzugt 90, 92, 94, 96, 97, 98 oder 99 % zu SEQ ID NO1 oder einem Fragment davon aufweist.
    3. Träger nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Variante wenigstens 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 oder 600 aufeinander abfolgende Aminosäuren der Sequenz von SEQ ID NO1 aufweist.
    4. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend einen Glasträger, bevorzugt für Mikroskopie, einen Biochip, eine Mikrotiterplatte, eine Lateral Flow-Vorrichtung, einen Teststreifen, eine Membran; bevorzugt Linienblot; eine Chromatographiesäule, einen Mikroarray und einen Bead, bevorzugt einen magnetischen Bead.
    5. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid rekombinant, isoliert und/oder aufgereinigt ist.
    6. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, erhältlich oder erhalten dadurch, dass der Träger gemäß Anspruch 1 mit einer Patientenprobe inkubiert wird, unter Bedingungen, die das Binden von einem Antikörper gegen SEQ ID NO1 gestatten, anschließend Entfernen der Probe, Waschen des Trägers, Kontaktieren des Trägers mit einem sekundären Antikörper, der menschliche Antikörper erkennt, unter Bedingungen, die die Bindung zwischen dem Antikörper gegen SEQ ID NO1 und einem sekundärem Antikörper gestatten.
    7. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend einen Komplex umfassend einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 und einen sekundären Antikörper, der an den Antikörper gegen SEQ ID NO1 bindet.
    8. Träger nach Anspruch 7, wobei der Komplex einen Antikörper gegen SEQ ID NO1 und einen sekundären Antikörper aufweist, wobei der Antikörper gegen SEQ ID NO1 ein Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA ist und der sekundäre Antikörper gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA bindet oder der Antikörper gegen SEQ ID NO1 ein Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG ist und der sekundäre Antikörper gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG bindet.
    9. Träger nach Anspruch 8, wobei der Träger einen Komplex umfassend einen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA gegen SEQ ID NO1 und einen sekundären Antikörper gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA und einen Komplex umfassend einen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG gegen SEQ ID NO1 und einen sekundären Antikörper gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgG aufweist.
    10. Kit umfassend den Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und wenigstens eine weitere Komponente aus der Gruppe umfassend einen Kalibrator, eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle, einen Waschpuffer, ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers gegen SEQ ID NO1, eine Verdünnungslösung, eine Nachweislösung, bevorzugt eine Substratlösung, eine Stopplösung und eine Schutzfolie.
    11. Kit nach Anspruch 10, wobei das Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines Antikörpers ein sekundärer Antikörper ist, der menschliche Antikörper erkennt, bevorzugt gegen Antikörper der Immunglobulin-Klasse IgA und/oder IgG und/oder IgM.
    12. Kit nach Anspruch 10, wobei der sekundäre Antikörper eine nachweisbare Markierung aufweist, bevorzugt aus der Gruppe umfassend eine fluoreszenzfähige, radioaktive, chemilumineszenzfähige oder enzymatisch aktive Markierung.
    13. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der nachzuweisende Antikörper ein Säugetier-, bevorzugt ein humaner Antikörper ist.
    14. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Kit einen Kalibrator enthält, der an ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO1 bindet, bevorzugt zwei oder mehr, noch bevorzugter drei oder mehr solcher Kalibratoren.
    15. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das Kit eine Positivkontrolle enthält, die einen Antikörper umfasst, der an SEQ ID NO1 bindet, bevorzugt aus der Gruppe umfassend Antikörper der Immunglobulin-Klassen IgA, IgG und IgM.
    16. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei der Kit einen ersten sekundären Antikörper gegen eine Immunglobulin-Klasse, bevorzugt IgA, enthält und einen zweiten sekundären Antikörper gegen eine andere Immunglobulin-Klasse, bevorzugt IgG.
    DE202020105117.2U 2020-02-20 2020-09-04 Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion Active DE202020105117U1 (de)

    Applications Claiming Priority (6)

    Application Number Priority Date Filing Date Title
    EP20158626.0A EP3715847A1 (de) 2020-02-20 2020-02-20 Verfahren und reagenzien zur diagnose von sars-cov-2
    EP20158626.0 2020-02-20
    EP20158821 2020-02-21
    EP20158821.7 2020-02-21
    DE202020104983.6 2020-08-28
    DE202020104983 2020-08-28

    Publications (1)

    Publication Number Publication Date
    DE202020105117U1 true DE202020105117U1 (de) 2020-10-07

    Family

    ID=72943794

    Family Applications (1)

    Application Number Title Priority Date Filing Date
    DE202020105117.2U Active DE202020105117U1 (de) 2020-02-20 2020-09-04 Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion

    Country Status (1)

    Country Link
    DE (1) DE202020105117U1 (de)

    Cited By (5)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    CN112505325A (zh) * 2021-01-22 2021-03-16 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种针对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条、检测卡及试剂盒
    CN112526139A (zh) * 2020-11-09 2021-03-19 杭州医学院 一种表征covid-19康复患者血浆中和抗体活性的间接elisa检测方法
    CN112964880A (zh) * 2021-02-07 2021-06-15 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒
    CN113092776A (zh) * 2021-03-24 2021-07-09 苏州携创生物技术有限公司 一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
    WO2022195070A1 (de) * 2021-03-19 2022-09-22 Universitätsmedizin Greifswald Risikobestimmung für eine prothrombotische thrombozytopenie

    Cited By (5)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    CN112526139A (zh) * 2020-11-09 2021-03-19 杭州医学院 一种表征covid-19康复患者血浆中和抗体活性的间接elisa检测方法
    CN112505325A (zh) * 2021-01-22 2021-03-16 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种针对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条、检测卡及试剂盒
    CN112964880A (zh) * 2021-02-07 2021-06-15 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒
    WO2022195070A1 (de) * 2021-03-19 2022-09-22 Universitätsmedizin Greifswald Risikobestimmung für eine prothrombotische thrombozytopenie
    CN113092776A (zh) * 2021-03-24 2021-07-09 苏州携创生物技术有限公司 一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒

    Similar Documents

    Publication Publication Date Title
    DE202021100842U1 (de) Methoden und Reagenzien zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion
    DE202020105116U1 (de) Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion
    DE202020105117U1 (de) Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion
    DE202020005492U1 (de) Nachweis von Antikörpern gegen Sarsr-Cov
    EP1297187B1 (de) Verfahren zum Nachweis von Influenza A/B-Viren in Speichel
    DE112017000924T5 (de) Ein Immuntest für die Diagnose von viralen Infektionen
    EP3855186A2 (de) Verfahren zur bestimmung der wirksamkeit eines impfstoffs
    JPS62501450A (ja) 抗体の検出のための競合的エリザ
    EP3505935B1 (de) Verfahren zur diagnose einer bornavirus-infektion
    US10408836B2 (en) Methods of detecting influenza virus
    EP3306316A1 (de) Rep-protein als proteinantigen zur verwendung in diagnostischen tests
    EP2649448A2 (de) Verfahren zum nachweis von anti-nmda-rezeptor autoantikörpern zum einsatz in diagnoseverfahren
    CN101701959A (zh) 新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条及应用
    PT2748612T (pt) Diagnósticos de vacina melhorados
    Hagebock et al. Serologic responses to the mallein test for glanders in solipeds
    van der Wal et al. Towards a peptide-based suspension array for the detection of pestivirus antibodies in swine
    CA3125206A1 (en) Specific monoclonal antibodies for the hepatitis pb2 of the influenza humana (flu), nucleic acid sequences; method and kit of inprol produced by flu
    DE102020125915B3 (de) Immundiagnostische mittel und verfahren für den nachweis und die differenzierung von coronavirus-infektionen
    KR20160075964A (ko) 돼지 콜레라 바이러스의 e2 단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 돼지 콜레라 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트
    EP0776906A2 (de) Peptide des Antigens Sm-D und ihre Verwendung, insbesondere für die Diagnostik des SLE
    Asano et al. Identification of antigenic peptides derived from B-cell epitopes of nucleocapsid protein of mouse hepatitis virus for serological diagnosis
    WO2021226229A1 (en) Variant sars-cov-2 proteins and uses thereof
    RU2546246C2 (ru) Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза.
    BR112017012511B1 (pt) Anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, método de diagnóstico in vitro e/ou ex vivo para a infecção por hmpv e kit de diagnóstico para a detecção de hmpv
    EP3761029B1 (de) Neuartiger test zur diagnose von nematodeninfektionen

    Legal Events

    Date Code Title Description
    R207 Utility model specification
    R197 New subsequently filed claims on ip dossier
    R150 Utility model maintained after payment of first maintenance fee after three years