RU2546246C2 - Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза. - Google Patents
Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза. Download PDFInfo
- Publication number
- RU2546246C2 RU2546246C2 RU2012111813/10A RU2012111813A RU2546246C2 RU 2546246 C2 RU2546246 C2 RU 2546246C2 RU 2012111813/10 A RU2012111813/10 A RU 2012111813/10A RU 2012111813 A RU2012111813 A RU 2012111813A RU 2546246 C2 RU2546246 C2 RU 2546246C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- seq
- borrelia
- type
- Prior art date
Links
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims abstract description 74
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims abstract description 31
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 claims abstract description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004571 lime Substances 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 38
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 38
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 22
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 17
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 16
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- -1 50 μM Chemical compound 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100431670 Rattus norvegicus Ybx3 gene Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 206010052057 Neuroborreliosis Diseases 0.000 description 10
- 201000004625 Acrodermatitis Diseases 0.000 description 9
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 description 8
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 description 8
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003399 Arthropod bite Diseases 0.000 description 3
- 206010061591 Borrelia infection Diseases 0.000 description 3
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 208000004374 Tick Bites Diseases 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010062488 Erythema migrans Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 2
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-2-oxochromen-7-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=C(OP(O)(O)=O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 241000833568 Borrelia afzelii PKo Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011312 Vector Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000013210 hematogenous Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретения относятся к химерным белкам, нуклеиновой кислоте, кодирующей такой белок, экспрессирующей кассете, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего экспрессирующую кассету, способу диагностики и набора для диагностики. Охарактеризованный химерный белок боррелии включает по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, соответствующего определенному штамму, и по меньшей мере одну последовательность области IR6 белка VlsE боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, причем боррелии выбраны из Borrelia stricto-sensu, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. Представленные изобретения позволяют производить диагностику Лайм-боррелиоза с повышенной специфичностью и чувствительностью. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 табл., 7 пр.
Description
Лайм-боррелиоз (LB) представляет собой неконтагиозное инфекционное заболевание, вызываемое спирохетой, называемой Borrelia burgdorferi, и передаваемое человеку при укусе клеща семейства иксодовых клещей. LB при отсутствии лечения вызывает различные патологические нарушения (дерматологического, артритического, сердечного, неврологического и иногда офтальмологического характера). Он представляет собой трансмиссионное инфекционное заболевание, наиболее часто встречающееся в США и в некоторых странах северного полушария с умеренным климатом.
В эту инфекцию вовлечены несколько видов боррелий, в настоящее время обозначаемых как группа burgdorferi или Borrelia burgdorferi sensu lato (включающая Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii и B. afzelii). Эти виды являются патогенными для человека.
В США вовлеченный инфекционный вид представляет собой Borrelia burgdorferi sensu stricto. В Европе к этому виду добавляются B. garinii и B. afzelii. В Азии вовлеченные виды представляют собой B. garinii и B. afzelii.
В США заявляют приблизительно о 10000 случаев. В Европе частота появления составляет менее 5 случаев на 100000.
Лайм-боррелиоз эволюционирует, проходя три различные стадии от ранней стадии инфицирования до поздней. Ранняя стадия (стадия I) может быть бессимптомной или выражаться псевдогриппозной картиной. В 50-80% случаев через несколько дней после укуса клеща на коже отмечается появление воспаленной сыпи очень специфического внешнего вида, называемой мигрирующей эритемой (EM). При отсутствии лечения гематогенная диссеминация боррелий проявляется спустя несколько недель во внезапном возникновении воспалительных артритов, неврологических (нейроборрелиоз) и менингеальных поражений, проявлений на коже и в деятельности сердца (стадия II). Через несколько месяцев или лет болезнь переходит в атрофическую хроническую форму, энцефалопатию, энцефаломиелит и хронический артрит (стадия III).
Для каждого вида Borrelia burgdorferi существует особый органический тропизм. Если первая стадия мигрирующей эритемы неясно связана с тремя видами, то переход в неврологическую форму предпочтительно связан с видом B. garinii, артриты чаще связаны с B. burgdorferi sensu stricto, атрофический хронический акродерматит специфичен для B. afzelii.
Сходство клинических симптомов между лайм-боррелиозом и другими не связанными с ним болезнями, а также вариабельность проявлений затрудняет клиническую диагностику. Если доказательства анамнеза отсутствуют (укус клеща или EM), то диагностика боррелиоза на основании клинических наблюдений может быть особенно затрудненной. Ранняя стадия болезни может быть бессимптомной до момента, когда она достигнет очень далеко зашедших клинических стадий.
Именно поэтому диагностика LB основана как на клинических признаках, так и на обнаружении в сыворотке антител, специфических для патогенных Borrelia burgdorferi, чаще всего способом ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ферментный иммуносорбентный тест)) или EIA, IFA.
В Европе оценка серологического ответа осложнена в силу существования трех патогенных видов и межвидовой вариабельности в отношении главных иммунодоминантных антигенов. Антигены, используемые в настоящее время в стандартной программе обнаружения IgG и IgM LB, представляют собой обработанные ультразвуком клеточные образцы Borrelia burgdorferi sensu lato. Результаты серологических исследований с данными антигенами в высокой степени вариативны в отношении специфичности и чувствительности. Таким образом, по причине недостаточной специфичности, вовлекающей перекрестную реактивность с антителами, связанными с патогенными бактериями, в частности, с Treponema pallidum (этиологический агент сифилиса), спирохетами, риккетсиями, эрлихиями или Helicobacter pylori, диагностика образцов с положительным результатом в испытаниях ELISA должна быть подтверждена иммуноблоттингом. Чувствительность также представляет собой основной фактор. На практике, Borrelia burgdorferi sensu lato экспрессирует различные поверхностные белки вследствие адаптации к различным микросредам, так что генетическое различие и дифференциальная экспрессия генов Borrelia burgdorferi у больных имеют существенное значение для разработки серологических тестов LB.
Таким образом, было необходимо разработать набор, который смягчает указанные ранее недостатки и в большей степени соответствует требуемым критериям специфичности и чувствительности.
Белок VlsE (surface expressed lipoprotein with Extensive antigenic Variation (экспрессируемый поверхностью липопротеин с расширенной антигенной вариативностью)), главным образом, экспрессируется in vivo транзиторным образом и вскоре после инфицирования хозяина. Он является очень иммуногенным у инфицированного хозяина и вызывает продуцирование IgG и IgM. Локус Vls находится в линейной плазмиде длиной 28 т.п.о. (Ip28-1), имеющейся у трех геновидов боррелий, ответственных за лайм-боррелиоз, и состоит из молчащих кассет и экспрессирующего сайта (VlsE). In vivo нерегулярные рекомбинации между экспрессирующими и молчащими кассетами внезапно возникают в ходе инфицирования и лежат в основе антигенной вариабельности VlsE. Белок VlsE состоит из шести вариабельных областей VR1-VR6, расположенных на поверхности белка VlsE и отделенных промежутками от константных областей IR1-IR6.
Известно, что белки VlsE обладают значительной межвидовой и внутривидовой гетерогенностью. В 2004 году Göttner и соавт. [1] описали степень идентичности приблизительно от 47 до 58% на уровне белка VlsE, происходящего от четырех штаммов.
Для смягчения указанных ранее проблем чувствительности и специфичности заявителями получен химерный белок боррелии, включающий по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, соответствующего определенному штамму, и по меньшей мере одну последовательность области IR6 белка VlsE боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, причем указанный химерный белок включает (или в основном состоит из, или также состоит из):
- последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, состоящую из пяти вариабельных областей VR1, VR2, VR3, VR4 и VR5 и шести константных областей IR1, IR2, IR3, IR4, IR5 и IR6, причем по меньшей мере одна указанная последовательность внеклеточного домена выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5 или вариант одной из указанных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 50% (предпочтительно по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% и преимущественно по меньшей мере 80% или по меньшей мере 85%) относительно последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно, при условии, что этот вариант способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями;
- по меньшей мере одна последовательность области IR6 боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO: 6, 7 и 8 или вариант одной из указанных последовательностей SEQ ID NO: 6, 7 и 8, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно последовательностей SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно, при условии, что вариант этой последовательности способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями.
Описанный ранее химерный белок может включать, кроме того, вариабельную последовательность VR6 вида боррелии, причем эта последовательность идентифицирована в SEQ ID NO: 9 в перечне последовательностей.
Предпочтительный химерный белок включает (или в основном состоит из, или состоит из):
- последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант последовательности SEQ ID NO: 1, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 50% (предпочтительно по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% и преимущественно по меньшей мере 80% или по меньшей мере 85%) относительно SEQ ID NO: 1;
- последовательность SEQ ID NO: 6 или вариант последовательности SEQ ID NO: 6, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно SEQ ID NO: 6;
- последовательность SEQ ID NO: 7 или вариант последовательности SEQ ID NO: 7, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно SEQ ID NO: 7;
- последовательность SEQ ID NO: 8 или вариант последовательности SEQ ID NO: 8, причем этот вариант имеет степень идентичности по меньшей мере 80% (предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90%) относительно SEQ ID NO: 8;
- и при необходимости вариабельную последовательность VR6, идентифицированную в SEQ ID NO: 9.
Таким образом, один из химерных белков по настоящему изобретению включает (или в основном состоит из, или состоит из) последовательность SEQ ID NO: 1, последовательность SEQ ID NO: 6, последовательность SEQ ID NO: 7 и последовательность SEQ ID NO: 8, кроме того, при необходимости последовательность SEQ ID NO: 9.
Предпочтительные химерные белки по настоящему изобретению идентифицируются, в частности, как белки, включающие (или содержащие в основном, или содержащие) последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 23; причем наиболее предпочтительный белок представляет собой белок, включающий или содержащий последовательность, идентифицированную в SEQ ID NO: 20 в перечне последовательностей.
SEQ ID NO: 1 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pBi), укороченного в его сигнальной последовательности (aa 1-19) и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. garinii (штамм pBi).
SEQ ID NO: 2 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pBr), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. garinii (штамм pBr).
SEQ ID NO: 3 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pLi), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. garinii (штамм pLi).
SEQ ID NO: 4 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. afzelii (штамм pKo), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. afzelii (штамм pKo).
SEQ ID NO: 5 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6, то есть этот внеклеточный домен включает области IR1, VR1, IR2, VR2, IR3, VR3, IR4, VR4, IR5, VR5 и IR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31).
SEQ ID NO: 6 соответствует последовательности домена IR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31).
SEQ ID NO: 7 соответствует последовательности домена IR6 B. afzelii (штамм ACA-1).
SEQ ID NO: 8 соответствует последовательности домена IR6 B. garinii (штамм Ip90).
SEQ ID NO: 9 соответствует последовательности вариабельной области VR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31). Эта последовательность может быть введена в конструкцию в качестве плеча спейсера между доменами IR6.
Последовательность по меньшей мере из 6 гистидиновых остатков (полигистидиновая цепочка, идентифицированная в SEQ ID NO: 10, кодируемая любой из нуклеиновых последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 11, 12 и 13, может быть присоединена на уровне N-концевого или C-концевого участка белка с целью обеспечения его очистки на металлохелатной смоле, а также могут быть присоединены добавочные аминокислоты, представленные в SEQ ID NO: 14 и кодируемые последовательностью SEQ ID NO: 15 в начале полигистидиновой цепочки. В этой конфигурации белок включает или состоит из последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 21. Альтернативным образом, последовательность из 8 гистидиновых остатков, представленная в SEQ ID NO: 16 и кодируемая последовательностью SEQ ID NO: 17, может быть введена в N-концевом участке белка вместо последовательности из 6 гистидиновых остатков, что позволяет стабилизировать адгезию рекомбинантного белка на металлохелатной смоле и улучшить условия очистки, а также могут быть введены добавочные аминокислоты, представленные в SEQ ID NO: 18 и кодируемые последовательностью SEQ ID NO: 19. В этой конфигурации белок включает или состоит из последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 23.
Предпочтительные белки по настоящему изобретению представляют собой белки, идентифицированные как SEQ ID NO: 21 и 23 и соответственно кодируемые последовательностями SEQ ID NO: 22 и 24.
Настоящее изобретение относится также к последовательностям ДНК, кодирующим ранее определенные белки, в частности, к последовательностям, идентифицированным как SEQ ID NO: 22 и 24.
Настоящее изобретение относится также к экспрессирующей кассете, являющейся функциональной в клетке, производной от прокариотического (пример: Escherichia coli) или эукариотического организма, такого, как дрожжи (пример: Pichia, Schizosaccharomyces), и обеспечивающей экспрессию ранее описанной нуклеиновой кислоты (ДНК), когда она находится под контролем элементов, разрешающей ее экспрессию, а также к вектору, включающему такую кассету.
Белок по настоящему изобретению является предпочтительно приемлемым для диагностики инфицирования боррелиями. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro лайм-боррелиоза в биологическом образце (например, в образце сыворотки, крови, плазмы и т.д.), согласно которому биологический образец приводят в контакт по меньшей мере с одним ранее определенным белком и выявляют возможное образование иммунологического комплекса между указанным белком и антителами биологического образца (IgG и/или IgM), например, посредством прибавления по меньшей мере одного антииммуноглобулина человека, меченого любым приемлемым маркером. Под маркером понимают индикатор, способный генерировать сигнал. В неограничительный перечень таких индикаторов входят ферменты, производящие сигнал, детектируемый, например, колориметрией, по флуоресценции или люминесценции, такие, как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; хромофоры, такие, как флуоресцентные, люминесцирующие или окрашивающие соединения; группировки, обладающие электронной плотностью, детектируемой электронной микроскопией или по их электрическим свойствам, таким, как проводимость, способами амперометрии или вольтамперометрии или по измерению сопротивления; группировки, детектируемые оптическими способами, такими, как дифракция, резонанс поверхностного плазмона, изменение краевого угла, или физическими способами, такими как спектроскопия атомных взаимодействий, туннельный эффект, и т.д.; радиоактивные молекулы, содержащие 32P, 35S или 125I. Белок предпочтительно иммобилизуют на твердой подложке, которая может представлять собой конус прибора Vidas®, лунки планшета для микротитрования, отдельные частицы, гель и т.д.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец, кроме того, приводят в контакт по меньшей мере с одним слитым химерным белком, выбранным из описанных далее белков, таких как:
(a) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 25 и последовательность SEQ ID NO: 26 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 25, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 26;
(b) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 27 и последовательность SEQ ID NO: 28 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 27, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 28;
(c) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, выбранную из таких последовательностей, как:
(i) последовательность SEQ ID NO: 29 и последовательность SEQ ID NO: 31 или последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 29, и последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 31;
(ii) последовательность SEQ ID NO: 30 и последовательность SEQ ID NO: 31 или последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 30, и последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 31;
(iii) последовательность SEQ ID NO: 29, последовательность SEQ ID NO: 30 и последовательность SEQ ID NO: 31 или последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 29, последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 30, и последовательность, имеющая степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 31;
(d) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 32, 34, 36, или последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 33, 35, 37 и 38, описанных более подробно далее.
Каждый из белков, идентифицированных ранее, включает по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка DbpA вида боррелии, выбранного из B. afzelii (SEQ ID NO: 25), B. burgdorferi sensu stricto (SEQ ID NO: 27) и B. garinii (группа III: SEQ ID NO: 29) (группа IV: SEQ ID NO: 30) или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно указанных последовательностей, и по меньшей мере одну последовательность белка OspC B. afzelii (SEQ ID NO: 26), B. burgdorferi sensu stricto (SEQ ID NO: 28) и B. garinii (SEQ ID NO: 31) или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно указанных последовательностей. Предпочтительно одна или несколько последовательностей DbpA находятся на N-концевом участке рекомбинантного белка, а последовательность OspC находится на C-концевом участке рекомбинантного белка.
Соответственно описанному ранее последовательность по меньшей мере из 6 гистидиновых остатков может быть присоединена на уровне N-концевого или C-концевого участка белка с целью обеспечения его очистки на металлохелатной смоле. Последовательность из 6 гистидиновых остатков, идентифицированная в SEQ ID NO: 10, находится предпочтительно на N-концевом участке конструкции. Добавочные аминокислоты могут находиться в начале цепочки поли-His в результате инсерции в последовательность ДНК, кодирующей малую последовательность, которая позволяет облегчать клонирование требуемой последовательности в экспрессирующей плазмиде, например, звено "MRGS" (SEQ ID NO: 14), кодируемое последовательностью ATGAGGGGATCC (SEQ ID NO: 15).
Область связывания может быть введена между каждой из последовательностей DbpA и OspC, образующих химерный рекомбинантный белок. Область такого типа соответствует области гибкого спейсера, обеспечивающей лучшую доступность потенциальных антител к каждому из доменов. Она, в общем случае, содержит много аминокислотных остатков Gly и Ser, представляющих собой аминокислоты, охарактеризованные как аминокислоты, придающие гибкость в третичной структуре белка. Также возможно вводить в требуемую кодирующую последовательность плечо ДНК (или линкер) для облегчения связи между последовательностями, кодирующими два требуемых белка. Например, это может быть звено "GSGG" (SEQ ID NO: 46), кодируемое последовательностью GGTTCCGGGGGT (SEQ ID NO: 47) и действующее в качестве плеча связывания между белками DbpA группы IV и OspC B. garinii.
Примеры таких белков представлены последовательностями SEQ ID NO: 33, 35, 37 и 38 в перечне последовательностей.
Белки, описанные ранее и идентифицированные как SEQ ID NO: 32-38 в перечне последовательностей, соответственно кодируются соответствующими последовательностями ДНК, идентифицированными в SEQ ID NO: 39-45.
Настоящее изобретение относится также к набору для диагностики in vitro лайм-боррелиоза, содержащему по меньшей мере один химерный белок VlsE, описанный ранее, и при необходимости по меньшей мере один слитый химерный белок DbpA/OspC, определенный ранее, и предпочтительно содержащему по меньшей мере один вид антииммуноглобулина человека, меченного любым приемлемым маркером, соответствующим приведенным ранее определениям.
Примеры
Пример 1. Получение плазмидных конструкций, кодирующих химерные рекомбинантные белки VlsE
Последовательности ДНК, кодирующие различные последовательности белка, идентифицированы в таблице 1.
Таблица 1 Происхождение последовательностей |
|||
Виды B. Burgdorferi *Изолят; **аминокислоты (aa); ***№ позиции в GenBank |
|||
Белок | B. sensu stricto | B. afzelii | B. garinii |
VlsE | - | - | *PBi; **aa 20-293; ***AJ630106 (GenScript Corp) |
IR6 | *B31; **aa 274-305; ***U76405 (GeneArt GmbH) | *ACA-1; **aa 172-188; ***U76405 (GeneArt GmbH) | *Ip90; **aa 167-191; ***AAN87834 (GeneArt GmbH) |
Последовательности были оптимизированы в отношении их экспрессии в E. Coli с использованием набора GeneOptimizer™ и синтезированы соответственно методике GenScript corporation (Скотч-Плейнс, NJ, США) или GeneArt GmbH (Регенсбург, Германия).
Дополнительные изменения ДНК, делеции или ассоциации различных последовательностей реализовывали способом ПЦР (PCR), применяемым в генной инженерии, с использованием методик ПЦР, хорошо известных специалистам в данной области техники и описанных, например, в Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Последовательности ДНК были связаны в экспрессионный вектор pMR [2] или pET-3d (Novagen®). Соответствующие плазмидные конструкции и белки, указанные в примере (bLYM110, bLYM125), описаны в таблице 2.
Таблица 2 Соответствующие плазмидные конструкции и белки |
||||
Характеристики рекомбинантных белков | Характеристики плазмидных конструкций | |||
Название | N-концевая метка | Последовательность B. burgdorferi | Родительский вектор | Сайт инсерции в векторе последовательности вставки |
bLYM110 SEQ ID NO: 21 | 6 × His | VlsE garinii pBi aa 20-293 + 3 IR6 [sensu stricto B21 aa 274-305 + afzelii ACA-1 aa 172-188 + garinii Ip90 aa 167-191] | pMR78 | 5'BamHI/3'HindIII |
bLYM125 SEQ ID NO: 23 | 8 × His | pET-3d | 5'NcoI/3'BamHI |
Пример 2. Экспрессия рекомбинантных белков примера 1 и очистка
Для трансформации бактерии E. coli (штамм BL21) согласно традиционной методике, известной специалистам в данной области техники, использовали плазмидную конструкцию, описанную в примере 1. Трансформированные бактерии селекционировали по их резистентности к ампициллину, приданной вектором pMR или pET.
Затем осуществляли селекцию клона рекомбинантной бактерии для посева прекультуры в 40 мл среды 2xYT (триптон, 16 г/л; экстракт дрожжей, 10 г/л; NaCl, 5 г/л, pH=7,0), содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение 15-18 часов при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин данную прекультуру использовали для осуществления посева в 1 л среды 2xYT, содержавшей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Данную культуру инкубировали при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин до достижения оптической плотности DO при 600 нм значения 1,0/1,2. Культуру выдерживали в течение 3 часов 30 мин или 4 часов при 30°C после прибавления 0,4 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) и собирали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин. Осадок клеток хранили при -60°C. Для очистки влажную биомассу ресуспендировали в лизирующем буферном растворе, содержавшем ингибиторы протеаз без ЭДТА (Roche) и бензоназонуклеазу (Novagen®), и осуществляли разрушение клеток при 1,6 кбар в деструкторе клеток (Constant System Ltd, Давентри, Великобритания). Затем лизат центрофугировали при 10000 об/мин в течение 45 минут при 2-8°C. После фильтрования через фильтр пористостью 0,22 мкм надосадочную жидкость вводили в колонку Ni-NTA (Quiagen®), кондиционированную лизирующим буферным раствором. Затем смолу промывали тем же самым буферным раствором до достижения A280 нм значения базовой линии. Элюирование осуществляли элюирующим буферным раствором, а очищенный белок подвергали диализу на кассете Pierce для диализа Slide-A-Lyser® с отсечкой 10000 или 20000 а.е.м. против диализного буферного раствора. Условия очистки на геле Ni-NTA описаны в таблице 3.
Таблица 3 Очистка рекомбинантных белков |
||
Белок | bLYM110 SEQ ID NO: 21 |
bLYM125 SEQ ID NO: 23 |
Буферный раствор для лизиса и промывки | Буферный раствор A1 | Буферный раствор A1 + мочевина, 2 M |
Элюирующий буферный раствор | Буферный раствор B2 | Буферный раствор B2, модифицированный 600 мМ имидазола |
Элюирование, стадия 1 | 86% буферного раствора A + 14% буферного раствора B (4CV) | 92% буферного раствора A + 8% буферного раствора B (4CV) |
Элюирование, стадия 2 | 100% буферного раствора B | 100% буферного раствора B |
Выход очистки, мг белка/г влажной биомассы | 0,5 | 0,8 |
Выход очистки, мг белка/л культуры | 8,7 | 17 |
1 Фосфат натрия, 50 мкМ, имидазол, 30 мкМ, NaCl, 500 мМ, Tween 20, 0,1%, глицерин, 5%, pH=7,8 | ||
2 Фосфат натрия, 50 мкМ, имидазол, 325 мМ, NaCl, 500 мМ, глицерин, 5%, pH=7,5 |
Образцы анализировали на геле NuPAGE® Novex®, 4-12%, в циркуляционном буферном растворе NuPAGE® MES-SDS согласно руководства изготовителя (Invitrogen™). Белки окрашивали бриллиантовым синим Кумасси или электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5%-м (масс./об.) раствором сухого молока в PBS и инкубировали с анти-пентагистидиновым антителом (Qiagen®) в PBS, содержавшим 0,05% Tween 20. Конъюгат антимышиного IgG козы, меченный пероксидазой хрена, (Jackson Immunoresearch laboratories) в PBS/Tween использовали в качестве вторичного антитела.
Определение концентрации белков осуществляли, используя набор Bradford Assay Kit (Pierce Coomassie Plus, Perbio Science) с BSA в качестве стандартного белка.
Пример 3. Обнаружение IgG и IgM человека с химерным рекомбинантным белком bLYM110 примера 2 способом линейного иммуноблоттинга
Рекомбинантный белок наносили на поливинилидендифторидную мембрану (PVDF, Immobilon, Millipore®, Бедфорд, Массачусетс, США) по приведенной далее методике.
Концентрацию белка в PBS с pH=7,2 устанавливали равной 1 мг/мл и разбавляли PBS с pH=7,2, дополненным 0,03% Tween 20 (разведение 1/200). Мембрану из PVDF смачивали метанолом, промывали в деминерализованной воде и накладывали на бумагу с влажным пятном. Пластмассовую линейку погружали в разбавленный раствор белков и фиксировали на мембране из PVDF. После нанесения белков и высушивания мембрану разрезали в вертикальном направлении на полоски. Перед применением полоски инкубировали с 5%-м раствором желатина в TBS с pH=7,5 в течение 1 часа при 37°C. Процедуры иммуноблоттинга осуществляли при комнатной температуре соответственно описанному Bretz A.G. и соавт. [3]. Полоски инкубировали в течение 2 часов с пробами сыворотки человека, разбавленными в соотношении 1/200 в TBS с 1% желатина, промывали и инкубировали с отличающимися от человеческого IgG или IgM, меченными щелочной фосфатазой (Sigma™, Сент-Луис, США) и разбавленными в соотношении 1/1000 в TBS с 1% желатина. После промывки полоски инкубировали с субстратом BCIP-NBT (KPL, Гейтерсбург, MD, США) в течение 30 минут, промывали в дистиллированной воде и сушили.
Группа проб испытуемых сывороток
Пробы сыворотки человека отбирали у типичных, клинически хорошо охарактеризованных больных LB, соответствующих различным стадиям LB (22 с мигрирующей эритемой [EM], 5 с кардитом, 20 с нейроборрелиозом [NB], 20 с артритом Лайма [LA], 20 с атрофическим хроническим акродерматитом [ACA] и 10 с доброкачественной лимфоцитомой кожи [LCB]). Антиборрелиозные IgG были найдены описанным ранее иммуноблоттингом при использовании лизатов целых клеток [4] в сыворотке больных LA, ACA и кардитом. EM, NB и LCB были идентифицированы клинически, но все соответствующие пробы сыворотки не были определены как положительные ни посредством иммуноблоттинга [4], ни посредством коммерческих наборов (VIDAS® Lyme (biomérieux®), Borrelia IgG (Diasorin®) и Borrelia IgM (r-biopharm®)). Напротив, во всех случаях NB, включенных в исследование, имелись антитела, обнаруживаемые в спинномозговой жидкости [LCR] (индекс находился в интервале от 2 до 27,1).
Группа отрицательного контроля включала 31 пробу сыворотки, при этом пробы ранее были определены в традиционных испытаниях как отрицательные в отношении присутствия антиборрелиозных антител. Кроме того, с рекомбинантным белком были испытаны 64 пробы сыворотки здоровых доноров крови, проживающих в регионе, эндемичном в отношении болезни Лайма (Монтей, Вале, Швейцария). Интенсивность реакции оценивали следующим образом: [+], [++], [+++], [-] или неоднозначные результаты. Неоднозначные результаты принимали за отрицательные.
Результаты представлены в приведенной далее таблице 4.
Таблица 4 | |||||||
IgG | |||||||
Стадия I | Стадия II | Стадия III | Доноры | ||||
EM (n=22) | NB (n=20) | Кардит (n=5) | LA (n=19) | ACA (n=20) | Лимфоцитома (n=10) | (n=64) | |
17 | 20 | 5 | 19 | 20 | 9 | 6 | |
77,3% | 100% | 100% | 100% | 100% | 90% | 9,4% | |
12[+++] | 11[+++] | 4[+++] | 13[+++] | 20[+++] | 3[+++] | 6[+] | |
4[++] | 7[++] | 1[++] | 4[++] | 2[++] | |||
1[+] | 2[+] | 2[+] | 4[+] | ||||
Итого положительных реакций на IgG: 93,7% | |||||||
IgM | |||||||
EM (n=22) | NB (n=20) | Кардит (n=5) | (n=64) | ||||
5 | 4 | 2 | 1 | ||||
22% | 20% | 40% | 1,5% |
1[++] | 2[++] | 1[++] | 1[+] | |
4[+] | 1[+] | 1[+] | ||
Итого положительных реакций на IgM: 23,4% |
Обнаружение IgG
Результаты показывают, что рекомбинантный белок bLYM110 представляет собой диагностический антиген, высоко чувствительный в отношении IgG на всех стадиях инфицирования. На стадии I инфицирования IgG были обнаружены в 17 случаях больных с EM из 22 (или 77,3% чувствительности). У пяти больных с EM, для которых найдены отрицательные результаты с рекомбинантным белком, такие же результаты определены штатным иммуноблоттингом и с коммерческими наборами. Семь проб сыворотки с EM, найденные положительными с рекомбинантным белком, не были обнаружены иммуноблоттингом, что представляет собой улучшение чувствительности с рекомбинантным белком на 31,8%. На первой стадии инфицирования в отсутствие характерного покраснения диагностика может быть затруднена, так как другие клинические проявления болезни Лайма не являются специфическими. Кроме того, традиционными испытаниями были обнаружены только несколько больных, имевших EM. Таким образом, белок по настоящему изобретению улучшил обнаружение IgG на стадии I инфицирования, обеспечив обнаружение их более чем у 77% больных, имевших EM.
Обнаружение IgM
Химерные антибелки IgM найдены в 23,4% проб сыворотки с LB. В сыворотке больных LB стадий I и II белок позволяет обнаруживать IgG чаще, чем IgM.
Пример 4. Получение плазмидных конструкций, кодирующих химерные рекомбинантные белки DpbA-OspC
Последовательности ДНК, кодирующие различные описанные последовательности DpbA и OspC, идентифицированы в таблице 5. Последовательности ДНК были оптимизированы в отношении облегчения экспрессии в E. Coli с использованием набора GeneOptimizer™ и синтезированы соответственно методике GenScript corporation (Скотч-Плейнс, NJ, США) или GeneArt GmbH (Регенсбург, Германия).
Таблица 5 Происхождение последовательностей |
|||
Виды B. Burgdorferi *Изолят; **аминокислоты (aa); ***№ позиции в GenBank |
|||
Белок | B. sensu stricto | B. afzelii | B. garinii |
DbpA | *B31; **aa 2-192; ***AF069269 | *PKo; **aa 2-150; ***AJ131967 | *40; **aa 2-187; ***AF441832; *PBi; **aa 2-176; ***AJ841673 |
OspC | *B31; **aa 26-210; ***X73622 | *PKo; **aa 2-212; ***X62162 | *PEi ; **aa 32-208; ***AJ749866 |
Каждый химерный рекомбинантный белок содержит по меньшей мере одну эпитопную область, соответствующую внеклеточному домену последовательности DbpA Borrelia burgdorferi sensu stricto или B. afzelii или B. garinii, и по меньшей мере одну эпитопную область, соответствующую внеклеточному домену последовательности OspC Borrelia burgdorferi sensu stricto или B. afzelii или B. garinii.
Ассоциации различных нуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательности DbpA и/или OspC, а также изменения нуклеотидных последовательностей, такие, как делеции, добавление последовательности связывания или добавление последовательности-линкера, осуществляли путем генной инженерии с использованием методик ПЦР, хорошо известных специалистам в данной области техники и описанных, например, в Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Последовательности ДНК, кодирующие требуемые химерные белки, были введены в экспрессионный вектор pMR [2] между сайтом рестрикции BamHI в положении 5' и сайтом EcoRI или HindIII в положении 3'. Соответствующие плазмидные конструкции и белки, указанные в примере (bLYM114, bLYM120 и bLYM121), описаны в таблице 6. MRGS в N-концевом участке рекомбинантных белков и соответствующая нуклеотидная последовательность ATG AGG GGA TCC были введены по методике клонирования, использованной для экспрессионного вектора pMR. В данной последовательности действительно необходим только кодон инициации ATG и, следовательно, аминокислота Met.
Последовательность поли-His (6 гистидиновых остатков) была введена на N-концевом участке каждого рекомбинантного белка. Данная последовательность обеспечивает очистку рекомбинантных белков на колонке для металлохелатной аффинной хроматографии. Она представляет собой область фиксации на геле Ni-NTA, которая в дальнейшем позволяет облегчать стадию очистки химерного рекомбинантного белка. Данный пептид HHHHHH (SEQ ID NO: 10) кодируется нуклеотидными последовательностями CATCATCATCATCATCAT (SEQ ID NO: 11) или CATCATCATCATCATCAC (SEQ ID NO: 12), или CATCATCACCACCATCAT (SEQ ID NO: 13), или любой другой последовательностью, кодирующей последовательность SEQ ID NO: 10.
Следует указать, что данная область особой фиксации, включающая гистидиновую последовательность, обеспечивает, в частности, ориентированную фиксацию рекомбинантного белка на подложке, образованной диоксидом кремния или оксидами металлов.
Таблица 6 Соответствующие плазмидные конструкции и белки |
|||||
Характеристики рекомбинантных белков | Характеристики плазмидных конструкций | ||||
Название | N-концевая метка | Последовательность B. burgdorferi | Название | Родительский вектор | Сайт инсерции в векторе последовательности вставки |
bLYM114 SEQ ID NO: 33 | 6 × His | B. afzelii штамм PKo DbpA aa 2-150 + OspC aa 2-212 |
pOL114 | pMR78* | 5'BamHI/3'EcoRI |
bLYM120 SEQ ID NO: 35 | 6 × His | B. sensu stricto штамм B31 DbpA aa 28-192 + OspC aa 26-210 |
pOL120 | pMR78* | 5'BamHI/3'HindIII |
bLYM121 SEQ ID NO: 38 | 6 × His | B. garinii DbpA III aa 25-187 штамм 40 + DbpA IV aa 24-176 штамм PBi + OspC aa 32-208 штамм PEi |
pOL121 | pMR78* | 5'BamHI/3'HindIII |
● [2] |
Пример 5. Экспрессия рекомбинантных белков bLYM114, bLYM120 и bLYM121 примера 4 и очистка
Для трансформации бактерии E. coli (штамм BL21) согласно традиционной методике, известной специалистам в данной области техники, была использована плазмидная конструкция, в которой в экспрессионный вектор (pMR) была вставлена последовательность SEQ ID NO: 40, 42 или 45. Трансформированные бактерии селекционировали по их резистентности к ампициллину, приданной вектором pMR.
Затем осуществляли селекцию клона рекомбинантной бактерии для посева прекультуры в 40 мл среды 2xYT (триптон, 16 г/л; экстракт дрожжей, 10 г/л; NaCl, 5 г/л, pH=7,0), содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение 15-18 часов при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин данную прекультуру использовали для осуществления посева в 1 л среды 2xYT, содержавшей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Данную культуру инкубировали при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин до достижения оптической плотности DO при 600 нм значения 1,0/1,2. Культуру выдерживали в течение 3 часов 30 мин или 4 часов при 30°C после прибавления 0,4 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) и собирали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин. Осадок клеток хранили при -60°C. Для очистки влажную биомассу размораживали и ресуспендировали в лизирующем буферном растворе, содержавшем ингибиторы протеаз без ЭДТА (Roche™) и бензоназонуклеазу (Novagen®), и осуществляли разрушение клеток при 1,6 кбар в деструкторе клеток (Constant System Ltd, Давентри, Великобритания). Затем лизат центрофугировали при 10000 об/мин в течение 45 мин при 2-8°C. Полученная надосадочная жидкость содержит растворимые белки. Надосадочную жидкость фильтровали через фильтр пористостью 0,45 мкм и очищали аффинной хроматографией на металлохелатной колонке (матрица "никель-нитрилуксусная кислота" (Ni-NTA, Qiagen)). С этой целью надосадочную жидкость вводили (1 мл/мин) при 18-25°C в колонку объемом 8 мл с гелем Ni-NTA, кондиционированную буферным раствором A (см. таблицу 7). Затем колонку промывали буферным раствором A до достижения на выходе из колонки DO280 нм=0. Элюирование рекомбинантного белка осуществляли подачей буферного раствор B, соответственно указаниям, приведенным в таблице 7, а очищенный белок подвергали диализу в кассете для диализа с отсечкой 10000 или 20000 а.е.м. (Slide-A-Lyser®, Pierce) против диализного буферного раствора. Условия очистки на геле Ni-NTA описаны в таблице 7.
Таблица 7 Очистка рекомбинантных белков |
|||
Белок | bLYM114 | bLYM120 | bLYM121 |
Буферный раствор для лизиса и промывки | Буферный раствор A1 | ||
Элюирующий буферный раствор | Буферный раствор B2 |
Элюирование, стадия 1 | 90% буферного раствора A + 10% буферного раствора B (4CV) | 92% буферного раствора A + 8% буферного раствора B (4CV) | 100% буферного раствора B |
Элюирование, стадия 2 | 100% буферного раствора B | 100% буферного раствора B | нет данных |
Выход очистки, мг белка/г влажной биомассы | 12 | 13 | 20 |
Выход очистки, мг белка/л культуры | 80 | 122 | 245 |
1 Фосфат натрия, 50 мкМ, имидазол, 30 мкМ, NaCl, 500 мМ, Tween 20, 0,1%, глицерин, 5%, pH=7,8 | |||
2 Фосфат натрия, 50 мкМ, имидазол, 325 мМ, NaCl, 500 мМ, глицерин, 5%, pH=7,5 |
Образцы анализировали на геле NuPAGE® Novex®, 4-12%, в буферном растворе NuPAGE® MES-SDS согласно руководства изготовителя (Invitrogen). Белки окрашивали бриллиантовым синим Кумасси или электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5%-м (масс./об.) раствором сухого молока в PBS и инкубировали с анти-пентагистидиновым антителом (Qiagen®) в PBS, содержавшим 0,05% Tween 20. Конъюгат антимышиного IgG козы, меченный пероксидазой хрена, (Jackson Immunoresearch laboratories) в PBS/Tween использовали в качестве вторичного антитела.
Определение концентрации белков осуществляли, используя набор Bradford (Pierce Coomassie Plus, Perbio Science) с BSA в качестве стандартного белка.
Пример 6. Обнаружение IgG и IgM человека с химерным рекомбинантным белком способом линейного иммуноблоттинга
Каждый рекомбинантный белок наносили на поливинилидендифторидную мембрану (PVDF, Immobilon, Millipore®, Бедфорд, Массачусетс, США) по приведенной далее методике. Концентрацию белка в PBS с pH=7,2 устанавливали равной 1 мг/мл и разбавляли PBS с pH=7,2, дополненным 0,03% Tween 20 (разведение 1/200). Мембрану из PVDF смачивали метанолом, промывали в деминерализованной воде и накладывали на бумагу с влажным пятном. Пластмассовую линейку погружали в разбавленный раствор белков и фиксировали на мембране из PVDF. После нанесения белков и высушивания мембрану разрезали в вертикальном направлении на полоски. Перед применением полоски инкубировали с 5%-м раствором желатина в TBS с pH=7,5 в течение 1 часа при 37°C. Процедуры иммуноблоттинга осуществляли при комнатной температуре соответственно описанному Bretz A.G. и соавт. [3]. Полоски инкубировали в течение 2 часов с пробами сыворотки человека, разбавленными в соотношении 1/200 в TBS с 1% желатина, промывали и инкубировали с антителом анти-IgG или анти-IgM человека, меченным щелочной фосфатазой (Sigma™, Сент-Луис, США) и разбавленным в соотношении 1/1000 в TBS с 1% желатина. После промывки полоски инкубировали с субстратом BCIP-NBT щелочной фосфатазы (KPL, Гейтерсбург, MD, США) в течение 30 мин, затем промывали в дистиллированной воде и сушили.
Группа проб испытуемых сывороток
Пробы сыворотки человека отбирали у типичных, клинически хорошо охарактеризованных больных LB, соответствующих различным стадиям LB (22 с мигрирующей эритемой [EM], 5 с кардитом, 20 с нейроборрелиозом [NB], 20 с артритом Лайма [LA], 20 с атрофическим хроническим акродерматитом [ACA] и 10 с доброкачественной лимфоцитомой кожи [LCB]). Антиборрелиозные IgG были найдены иммуноблоттингом при использовании лизатов целых клеток [4] в сыворотке больных LA, ACA и кардитом. EM, NB и LCB были идентифицированы клинически, но все соответствующие пробы сыворотки не были определены как положительные ни посредством иммуноблоттинга [4], ни посредством коммерческих наборов (VIDAS® Lyme (biomérieux), Borrelia IgG (Diasorin®) и Borrelia IgM (r-biopharm®)). Напротив, во всех случаях NB, включенных в исследование, имелись антитела, обнаруживаемые в спинномозговой жидкости [LCR] (индекс находился в интервале от 2 до 27,1 при определении с набором VIDAS® Lyme (biomérieux)). Присутствие IgM было определено только в клинических случаях стадий I и II, но не на хронических стадиях.
Группа отрицательного контроля включала 31 пробу сыворотки, при этом пробы ранее были определены в традиционных испытаниях как отрицательные в отношении присутствия антиборрелиозных антител. Кроме того, с рекомбинантным белком были испытаны 64 пробы сыворотки здоровых доноров крови, проживающих в регионе, эндемичном в отношении болезни Лайма (Монтей, Вале, Швейцария).
Интенсивность реакции оценивали следующим образом: [+], [++], [+++], [-] или неоднозначные результаты. Неоднозначные результаты принимали за отрицательные.
Результаты представлены в приведенной далее таблице 8.
Таблица 8 Реактивность при линейном иммуноблоттинге проб сыворотки больных лайм-боррелиозом с 3 химерными рекомбинантными белками |
|||||||||
Рекомбинантный белок | IgG | IgM | |||||||
Стадия I | Стадия II | Стадия III | Стадия I | Стадия II | |||||
EM (n=22) | NB (n=20) | Кардит (n=5) | LA (n=19) | ACA (n=20) | LCB (n=10) | EM (n=22) | NB (n=20) | Кардит (n=5) | |
bLYM114 | 5 | 10 | 0 | 7 | 12 | 2 | 7 | 7 | 2 |
bLYM120 | 6 | 7 | 0 | 8 | 6 | 0 | 11 | 7 | 2 |
bLYM121 | 2 | 10 | 5 | 9 | 8 | 0 | 7 | 7 | 2 |
Σ bLYM 114 + 120 + 121 | 9 | 13 | 5 | 18 | 17 | 2 | 11 | 7 | 2 |
Пробы сыворотки c положительным результатом, в % и по интенсивности реакции | 40,9% 1[+++] 4[++] 4[+] | 59,1% 8[+++] 2[++] 3[+] | 100% 4[+++] 1[+] | 94,7% 7[+++] 8[++] 3[+] | 85% 8[+++] 5[++] 4[+] | 20% 1[++] 1[+] | 50% 1[+++] 7[++] 5[+] | 35% 5[++] 2[+] | 40% 2[++] |
Итого положительных результатов, в % и по интенсивности реакции | 66,7% 28[+++] 20[++] 16[+] |
42,5% 1[+++] 14[++] 7[+] |
Специфичность равна 100% на основании 31 пробы сыворотки, отобранной у здоровых участников и определенной как лайм-отрицательные посредством стандартных коммерческих тестов.
Обнаружение IgG
Результаты показывают, что слитые химерные рекомбинантные белки представляют собой диагностический инструмент, чувствительный в отношении IgG и IgM на всех стадиях инфицирования. Они позволяют выявить комплементарное действие трех рекомбинантных белков, основанных на последовательностях Borrelia afzelii, B. sensu stricto и B. garinii соответственно, для обнаружения IgG. Комбинированное применение трех химерных рекомбинантных белков позволяет на стадии I инфицирования обнаруживать IgG в 9 случаях больных с EM из 22 (или 40,9% чувствительности).
Обнаружение IgM
Химерные антибелки IgM найдены в 11 случаях из 22 (или 50% чувствительности). Таким образом, в сыворотке больных LB стадии I такие химерные белки позволяют обнаруживать IgM чаще, чем IgG. В испытаниях, осуществленных для контроля посредством иммуноблоттинга [4] и коммерческого набора Borrelia IgM (r-biopharm®), обнаружено не большее число проб сыворотки с положительными результатами на IgM. Кроме того, 3 пробы сыворотки, которые посредством иммуноблоттинга и набора Borrelia IgM (r-biopharm®) определены как отрицательные, определены как положительные посредством трех химерных белков, указанных в примере (3/3), или посредством трех белков, указанных в примере (1/3). Комбинированное применение трех рекомбинантных белков позволяет улучшить на 13,6% чувствительность обнаружения IgM на стадии I инфицирования.
Пример 7. Оценка и валидация химерных рекомбинантных белков bLYM114, bLYM120, bLYM121 и bLYM125 посредством теста VIDAS
®
(bioMérieux)
Данную валидацию осуществляли посредством теста VIDAS®, применяя:
- 1) химерные рекомбинантные белки bLYM114, bLYM120 и bLYM121, полученные согласно примерам 4 и 5, для обнаружения IgM;
- 2) химерные рекомбинантные белки bLYM114, bLYM120, полученные согласно примерам 4 и 5, и химерный белок bLYM125, полученный согласно примерам 1 и 2, для обнаружения IgG.
Принцип теста VIDAS® состоит в следующем: конус образует твердую подложку, которая служит также системой подачи реактивов, содержащихся в полости конуса. Один или несколько рекомбинантных белков фиксируют на конусе. После стадии разбавления образец отбирают аспирацией и вводят за несколько приемов внутрь конуса. Данная процедура позволяет антиборрелиозным иммуноглобулинам образца связываться с рекомбинантными белками. Компоненты, оставшиеся несвязанными, удаляют промывкой. Антитело антииммуноглобулинов человека, конъюгированное с щелочной фосфатазой (PAL), инкубируют в конусе, в котором оно прикрепляется к антиборрелиозным иммуноглобулинам. На стадиях промывки удаляют конъюгат, оставшийся неприкрепленным. В ходе последней стадии обнаружения субстрат щелочной фосфатазы (PAL), представляющий собой 4-метилумбеллиферилфосфат, гидролизуют до 4-метилумбеллиферона, флуоресценцию которого измеряют при 450 нм. Интенсивность флуоресценции, измеренная посредством оптической системы Vidas®, пропорциональна содержанию антиборрелиозных иммуноглобулинов, присутствующих в образце. Результаты автоматически анализируются системой VIDAS® и выражаются в RFV (Relative Fluorescent Value (относительные единицы флуоресценции)).
Таким образом, посредством системы Vidas® были проанализированы 255 положительных проб сыворотки (пробы с неоднозначным результатом + пробы с положительным результатом) и 298 отрицательных проб сыворотки (пробы с неоднозначным результатом + пробы с отрицательным результатом).
Конусы Vidas® Lyme IgG сенсибилизировали 300 мкл раствора, содержавшего белки bLYM114, bLYM120 и bLYM1251 по настоящему изобретению с концентрацией каждого из них в общем сенсибилизирующем растворе, равной 1 мкг/мл.
На первой стадии пробы сыворотки инкубировали в течение 5,3 мин для образования комплексов "антигены-антитела". На второй стадии анти-IgG человека, меченные PAL, инкубировали в течение 5,3 мин.
Результаты выражали в виде индекса по отношению к порогу положительного значения, составляющего 135 RFV согласно методике.
- Из 255 испытанных положительных проб сыворотки 246 найдены положительными и 9 условно отрицательными, что соответствует чувствительности 96,5%.
- Из 298 испытанных отрицательных проб сыворотки 284 найдены отрицательными и 14 условно положительными, что соответствует специфичности 95,3%.
Список литературы
Claims (14)
1. Химерный белок боррелии для диагностики Лайм-боррелиоза, включающий по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, соответствующего определенному штамму, и по меньшей мере одну последовательность области IR6 белка VlsE боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, причем указанный химерный белок включает:
- последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, состоящую из пяти вариабельных областей VR1, VR2, VR3, VR4 и VR5 и шести константных областей IR1, IR2, IR3, IR4, IR5 и IR6, причем по меньшей мере одна указанная последовательность внеклеточного домена выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5;
- указанная по меньшей мере одна последовательность области IR6 боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO:6, 7 и 8,
причем боррелии выбраны из Borrelia stricto-sensu, Borrelia afzelii и Borrelia garinii.
- последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, состоящую из пяти вариабельных областей VR1, VR2, VR3, VR4 и VR5 и шести константных областей IR1, IR2, IR3, IR4, IR5 и IR6, причем по меньшей мере одна указанная последовательность внеклеточного домена выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5;
- указанная по меньшей мере одна последовательность области IR6 боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, выбрана из группы, в которую входят последовательности SEQ ID NO:6, 7 и 8,
причем боррелии выбраны из Borrelia stricto-sensu, Borrelia afzelii и Borrelia garinii.
2. Белок по п. 1, включающий вариабельную последовательность VR6 вида боррелии, идентифицированную в SEQ ID NO:9.
3. Белок по п. 1, включающий:
- последовательность SEQ ID NO:1;
- последовательность SEQ ID NO:6;
- последовательность SEQ ID NO:7;
- последовательность SEQ ID NO:8.
- последовательность SEQ ID NO:1;
- последовательность SEQ ID NO:6;
- последовательность SEQ ID NO:7;
- последовательность SEQ ID NO:8.
4. Белок по п. 3, дополнительно включающий последовательность SEQ ID NO:9.
5. Белок по любому из пп. 1-4, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:23.
6. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок, определенный в любом из пп. 1-5.
7. Экспрессирующая кассета, являющаяся функциональной в клетке, производной от прокариотического или эукариотического организма, обеспечивающая экспрессию нуклеиновой кислоты по п. 6 и находящаяся под контролем элементов, необходимых для ее экспрессии.
8. Вектор для экспрессии нуклеиновой кислоты по п. 6, включающий экспрессирующую кассету по п. 7.
9. Способ диагностики in vitro лайм-боррелиоза в биологическом образце, согласно которому биологический образец приводят в контакт по меньшей мере с одним белком по любому из пп. 1-5 и выявляют возможное образование иммунологического комплекса между указанным белком и антителами биологического образца.
10. Способ по п. 9, в котором антитела биологического образца представляют собой IgG и/или IgM.
11. Способ по п. 9, в котором образование иммунологического комплекса определяют посредством прибавления по меньшей мере одного антииммуноглобулина человека, меченного любым приемлемым маркером.
12. Способ по любому из пп. 9-11, в котором белок иммобилизуют на твердой подложке.
13. Набор для диагностики in vitro лайм-боррелиоза, включающий по меньшей мере один химерный белок боррелии, отличающийся тем, что белок представляет собой белок по любому из пп. 1-5.
14. Набор по п. 13, включающий по меньшей мере один антииммуноглобулин человека, меченный любым приемлемым маркером.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0904094A FR2949473B1 (fr) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Proteines utilisees pour le diagnostic d'une borreliose de lyme |
FR0904094 | 2009-08-28 | ||
PCT/FR2010/051787 WO2011023914A1 (fr) | 2009-08-28 | 2010-08-27 | Proteines utilisees pour le diagnostic d'une borreliose de lyme |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012111813A RU2012111813A (ru) | 2013-10-10 |
RU2546246C2 true RU2546246C2 (ru) | 2015-04-10 |
Family
ID=42041684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012111813/10A RU2546246C2 (ru) | 2009-08-28 | 2010-08-27 | Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза. |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8895257B2 (ru) |
EP (1) | EP2470908B1 (ru) |
ES (1) | ES2427407T3 (ru) |
FR (1) | FR2949473B1 (ru) |
PL (1) | PL2470908T3 (ru) |
RU (1) | RU2546246C2 (ru) |
WO (1) | WO2011023914A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013009739A2 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Uvic Industry Partnerships Inc. | Soluble treponema pallidum protein tp0453,tp0453-tp0326 fusion protein, and use in syphilis diagnosis |
KR20170056766A (ko) * | 2015-11-13 | 2017-05-24 | 에스케이하이닉스 주식회사 | 메모리 시스템 및 메모리 시스템의 동작 방법 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2102081C1 (ru) * | 1991-07-11 | 1998-01-20 | Иммуно АГ | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi |
US6475492B1 (en) * | 1999-04-28 | 2002-11-05 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Peptides and assays for the diagnosis of lyme disease |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5620862A (en) | 1993-11-24 | 1997-04-15 | University Of Connecticut | Methods for diagnosing early Lyme disease |
DE19632862B4 (de) | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
WO2000078800A2 (en) | 1999-06-18 | 2000-12-28 | Medimmune, Inc. | Combined decorin binding protein and outer surface protein compositions and methods of use |
WO2007133623A2 (en) * | 2006-05-10 | 2007-11-22 | Biopeptides Corporation | Peptide diagnostic agent for lyme disease |
-
2009
- 2009-08-28 FR FR0904094A patent/FR2949473B1/fr active Active
-
2010
- 2010-08-27 US US13/388,168 patent/US8895257B2/en active Active
- 2010-08-27 EP EP10763762.1A patent/EP2470908B1/fr active Active
- 2010-08-27 PL PL10763762T patent/PL2470908T3/pl unknown
- 2010-08-27 RU RU2012111813/10A patent/RU2546246C2/ru active
- 2010-08-27 WO PCT/FR2010/051787 patent/WO2011023914A1/fr active Application Filing
- 2010-08-27 ES ES10763762T patent/ES2427407T3/es active Active
-
2014
- 2014-10-15 US US14/514,937 patent/US9290548B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2102081C1 (ru) * | 1991-07-11 | 1998-01-20 | Иммуно АГ | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi |
US6475492B1 (en) * | 1999-04-28 | 2002-11-05 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Peptides and assays for the diagnosis of lyme disease |
EP1171605B1 (en) * | 1999-04-28 | 2006-12-13 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Peptides and assays for the diagnosis of lyme disease and compositions useful for the prevention thereof |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
M. B. LAWRENZ et al., Human Antibody Responses to VlsE Antigenic Variation Protein of Borrelia burgdorferi, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec. 1999, Vol. 37, No. 12, p. 3997–4004 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2949473B1 (fr) | 2013-08-09 |
EP2470908A1 (fr) | 2012-07-04 |
EP2470908B1 (fr) | 2013-06-19 |
ES2427407T3 (es) | 2013-10-30 |
PL2470908T3 (pl) | 2013-11-29 |
US20120156694A1 (en) | 2012-06-21 |
US9290548B2 (en) | 2016-03-22 |
WO2011023914A1 (fr) | 2011-03-03 |
FR2949473A1 (fr) | 2011-03-04 |
US20150037881A1 (en) | 2015-02-05 |
US8895257B2 (en) | 2014-11-25 |
RU2012111813A (ru) | 2013-10-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102570713B1 (ko) | SARS-CoV-2 감염의 진단을 위한 방법 및 시약 | |
KR102503883B1 (ko) | 라임 질환 항체의 검출을 위한 펩타이드 및 방법 | |
JP6325553B2 (ja) | エールリヒア抗体の検出のためのペプチド、デバイス、および方法 | |
JP2013511530A (ja) | ライム病抗体の検出のためのペプチドおよび方法 | |
US20180238874A1 (en) | Proteins used for the diagnosis of lyme borreliosis | |
JP5442641B2 (ja) | 全インフルエンザ菌の測定方法 | |
CN110914685A (zh) | Rep蛋白作为蛋白质抗原用于诊断试验 | |
JP2011518338A (ja) | ボレリア・ブルグドルフェリ(borreliaburgdorferi)の細胞エンベロープタンパク質のアレイ | |
CN107304231B (zh) | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用 | |
KR20160043984A (ko) | 에이치. 필로리 감염의 검출 방법 | |
RU2546246C2 (ru) | Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза. | |
JP2017531657A (ja) | 組換えボレリアタンパク質およびその使用のための方法 | |
WO1998029132A9 (en) | Early detection of mycobacterial disease | |
KR20190121820A (ko) | 신규한 펩타이드 및 진단에 있어서의 이의 용도 | |
JP2001516458A (ja) | 診断試薬としての組換えP37/FlaA | |
WO2020158811A1 (ja) | ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法、および同定用キット | |
JP6979200B2 (ja) | レプトスピラ症の診断に用いるレプトスピラ抗原検出用抗体 | |
JP2012239438A (ja) | バルトネラ・ヘンセラエ抗原の調製方法、および該方法により得られるバルトネラ・ヘンセラエ調製抗原 | |
KR102013954B1 (ko) | 서울바이러스와 푸말라바이러스 유래의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 한탄바이러스 유래의 재조합 당단백질을 포함하는 신증후군출혈열 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트 | |
CN112180096A (zh) | 用于诊断线虫感染的新测定法 | |
WO2012052719A1 (en) | Detection and/or diagnosis of mite infections in sheep | |
BR102018073888A2 (pt) | Proteína recombinante, sequência de dna sintético, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, método para produzir uma proteína recombinante, método e kit para detecção de escherichia coli enterotoxigênica (etec) em uma amostra biológica, e, uso de uma proteína recombinante | |
JP2016216413A (ja) | バルトネラ科に属する菌体由来の抗原を調製するための方法 | |
JP2007300817A (ja) | 細菌の検出方法、検出用試薬及び検出用キット。 | |
JP2012068034A (ja) | ヘリコバクター・へパティカスの検出方法、及び検出キット、並びにヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様dna結合たんぱく質の精製方法 |