BR102018073888A2 - Proteína recombinante, sequência de dna sintético, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, método para produzir uma proteína recombinante, método e kit para detecção de escherichia coli enterotoxigênica (etec) em uma amostra biológica, e, uso de uma proteína recombinante - Google Patents

Abstract

proteína recombinante, sequência de dna sintético, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, método para produzir uma proteína recombinante, método e kit para detecção de escherichia coli enterotoxigênica (etec) em uma amostra biológica, e, uso de uma proteína recombinante. a presente invenção refere-se a método e kit úteis para detecção específica de escherichia coli enterotoxigênica (etec). a invenção também se refere à proteína recombinante com atividade imunogênica, sequência de dna sintético, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produção da dita proteína recombinante, bem como ao uso da dita proteína. o método desenvolvido é uma nova ferramenta de diagnóstico para detecção de etec que associa técnicas imunológicas à nanotecnologia, propiciando maior sensibilidade, especificidade e rapidez em relação aos testes encontrados na arte.

Description

PROTEÍNA RECOMBINANTE, SEQUÊNCIA DE DNA SINTÉTICO, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE, MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROTOXIGÊNICA (ETEC) EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, E, USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE Campo da invenção

[001] A invenção refere-se de forma geral a método e kit úteis para realizar detecção imunológica de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC). A invenção também se refere a uma proteína recombinante com atividade imunogênica, sequência de DNA sintético, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produção da dita proteína recombinante, bem como ao uso da dita proteína.

Antecedentes da Invenção

[002] A diarreia é uma doença classificada como uma importante causa de morbidade e mortalidade observada em diversas regiões do mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde (2013), as doenças diarreicas totalizam a segunda principal causa de morte em crianças menores de cinco anos de idade, perdendo apenas para a pneumonia. A cada ano a diarreia mata cerca de 760.000 crianças nessa faixa etária. No mundo, há cerca de 1,7 bilhão de casos de doença diarreica registrados todos os anos (WHO, 2013; KUMAR et al., 2016).

[003] Existem diversas condições que podem favorecer a disseminação dessa doença. As principais vias de veiculação dos agentes causais da diarreia são a água e os alimentos contaminados. Também podem contribuir com o aumento da incidência da doença, as precárias condições de higiene doméstica e pessoal, ausência de tratamento adequado do lixo e dejetos, fornecimento inadequado de água, difícil acesso à rede de saúde pela população socialmente menos favorecida, baixo nível educacional, interrupção da amamentação de recém-nascidos e pescados provenientes de águas poluídas (GUERRANT et al., 2002; WALKER et al., 2010; WHO, 2013). Outro fator relevante são os impactos diretos na economia e sociedade, gerando custos com hospitalizações, serviços médicos e ambulatoriais, medicamentos e perdas de dias de trabalho ou escola dos pacientes com diarreia (VRANJAC, 2004).

[004] No Brasil as populações carentes e principalmente residentes das regiões menos desenvolvidas do país, apresentam características semelhantes da doença em relação a outros países de baixa e média renda. Já em crianças pertencentes a famílias de condições socioeconômicas elevadas, tanto a etiologia quanto o curso clínico da doença são semelhantes ao descrito em países desenvolvidos. Estudos prospectivos têm mostrado que, onde as condições higiênicas em que vivem as populações são desfavoráveis, a incidência de diarreia aguda é alta em crianças. (GUERRANT et al., 2002; ORLANDI et al., 2001; ZAMBONI et al., 2004).

[005] A diarreia pode ser definida quando ocorre a passagem de três ou mais fezes moles ou líquidas por dia. Isso ocorre devido a alterações nos mecanismos de secreção, osmose ou processos inflamatórios e de infecção das células intestinais (WHO, 2013; CANANI et al., 2015). Existem também as doenças diarreicas classificadas como congênitas, estas se caracterizam por enteropatias raras apresentando uma etiologia heterogênea, com um início precoce dos sintomas típicos (PEZZELLA et al., 2013; CANANI et al., 2015).

[006] A lista de enteropatógenos que causam diarreia é extensa e inclui bactérias, parasitas e vírus. Entre os agentes patogênicos bacterianos, a Escherichia coli estabelece um importante papel como agente causador, sendo diagnosticada em mais de 49% dos pacientes hospitalizados por diarreia em países em desenvolvimento (TANIUCHI et al., 2012; WALKER et al., 2010).

[007] A Escherichia coli é uma bactéria anaeróbia facultativa não patogênica, pertencente à família Enterobacteriaceae que predomina o trato gastrointestinal humano, estabelecendo sua colonização nas primeiras horas de vida. Geralmente essas bactérias permanecem confinadas ao lúmen intestinal sem oferecer riscos ao hospedeiro, no entanto, em hospedeiros debilitados ou imunossuprimidos, ou quando as barreiras gastrointestinais são violadas, algumas cepas de E. coli desenvolvem a capacidade de provocar doenças gastrointestinais, do trato urinário e do sistema nervoso central (NGUYEN et al., 2005; NATARO e KAPER, 1998).

[008] As cepas de E. coli diarreiogênicas podem ser divididas em seis categorias principais com base em distintas características epidemiológicas e clínicas, determinantes de virulência específicos que afetam uma ampla variedade de processos celulares e associação com certos sorotipos. As categorias são: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enteroinvasora (EIEC) e E. coli difusamente aderente (DAEC) (KAPER et al., 2004; NGUYEN et al., 2005; TANIUCHI et al., 2012).

[009] A cepa de Escherichia coli enterotoxigênica foi inicialmente reconhecida como agente causador de doença diarreica em leitões recémnascidos. Os primeiros mecanismos de patogênese também foram elucidados nesses animais infectados por ETEC (NATARO e KAPER, 1998). DuPont e colaboradores (1971) foi um dos primeiros pesquisadores a demonstrar a capacidade de ETEC infectar e causar diarreia em seres humanos. ETEC é considerada como um dos agentes causadores mais frequentes da diarreia infantil e da diarreia dos viajantes em países de baixa e média renda. Além disso, essa bactéria é relacionada com o desenvolvimento de desnutrição em crianças (DUBREUIL, 2014). De acordo com a Organização Mundial de Saúde, esse patógeno provoca por ano a morte de aproximadamente 400.000 crianças com menos de 5 anos de idade (QADRI et al., 2005; MENTZER et al., 2014).

[0010] Esse enteropatógeno é contraído por meio do consumo ou utilização de água ou alimentos contaminados e colonizam a superfície da mucosa do intestino delgado, sintetizando enterotoxinas (LT/ST) que provocam diarreia (GAASTRA E SVENNERHOLM, 1996). A doença possui um início tipicamente abrupto, com um curto período de incubação entre 14 à 50 horas. A dose infectante avaliada em voluntários foi de aproximadamente 108 a 1010 unidades formadoras de colônias. Os aspectos clínicos mais comuns são diarreia aquosa, geralmente sem sangue, muco e pus. Os sinais de febre e vômitos estão presentes numa minoria de pacientes. Além disso, a diarreia pode ser leve, breve e auto-limitada ou pode resultar em graves evacuações, semelhante à observada na infecção por Vibrio cholerae (DUPONT et al., 1971; DUBREUIL, 2014).

[0011] Estudos referentes à epidemiologia desse patógeno demonstrou que em diversas áreas do mundo, incluindo principalmente países em desenvolvimento, ETEC é responsável por mais de 20% de todas as doenças diarreicas graves. Estima-se que mais de 10 milhões de turistas todos os anos sofram de diarreia provocada por ETEC (DUBREUIL, 2014; QADRI et al., 2005; WHO, 2013). O padrão epidemiológico da doença diarreica provocada por ETEC é determinada basicamente pela compreensão da prevalência das toxinas (LT e ST) e pelos fatores de colonização (CF) utilizados por ETEC. Isidean e colaboradores (2011) fizeram uma revisão sistemática da epidemiologia de ETEC com o foco nesses dois fatores. Os autores coletaram dados de 17.205 isolados de ETEC que foram abstraídos de 136 estudos. Aproximadamente metade dos estudos (49%) envolveu apenas populações endêmicas, e 17% envolveram apenas viajantes. Na análise global, 60% dos isolados de ETEC expressaram a toxina LT, sendo 27% isoladamente e 33% expressaram LT em combinação com a toxina ST. Os resultados sobre a prevalência dos fatores de colonização demonstraram que 17% das cepas de ETEC expressaram o fator CFA/I, 9% o CFA/II e 18% o CFA/IV. Segundo os autores a heterogeneidade ao longo do tempo, a população, a região, confundidos pela variabilidade dos fatores de colonização e metodologias de detecção das toxinas de ETEC, ofuscam as estimativas racionais para os requisitos de legitimidade em alguns estudos.

[0012] No Brasil, alguns estudos sobre a prevalência de ETEC também foram realizados. Orlandi e colaboradores (2006) realizaram um estudo sobre a etiologia das infecções diarreicas em crianças de Porto VelhoRO. Foram analisadas 470 crianças com menos de 72 meses de idade que apresentavam diarreia aguda. Destas, foram constatados 21 casos de diarreia provocada por ETEC. Nunes e colaboradores (2011) também conduziram um estudo que envolveu 250 crianças com diarreia, com idade entre 1 e 5 anos, de famílias de baixa renda em Teresina-PI. Nesse estudo foram isolados 9,2% de ETEC. Outro estudo envolveu uma análise sobre a etiologia da diarreia infantil no Nordeste do Brasil. Moreno e colaboradores (2010) analisaram 2.344 cepas de E. coli isoladas de 290 crianças com diarreia. Os autores verificaram que 10% desses isolados eram de ETEC.

[0013] A patogênese de ETEC se inicia com a colonização da superfície da mucosa do intestino delgado mediada por fatores de colonização (CFs), que podem ser de caráter não-fimbrial, fimbrial, helicoidal ou fibrilar (CROXEN E FINLAY., 2010; TURNER et al.,2006). A fixação mais íntima pode ser facilitada por duas proteínas de membrana externa denominadas de Tia e TibA (TURNER et al.,2006). Um grande número de fatores de colonização foi identificado, no entanto, estudos epidemiológicos indicam que aproximadamente 75% das cepas de ETEC isoladas de seres humanos expressam os fatores CFA/I, CFA/II e CFA/IV (Figura 1) (KAPER, 2004; WOLF, 1997).

[0014] A diarreia provocada por ETEC tem sido atribuída pela secreção das enterotoxinas termolábeis (LT) e enterotoxinas termoestáveis ao calor (ST) (ROY et al., 2010). As LTs de E. coli são toxinas oligoméricas que estão intimamente relacionadas, em estrutura e função, à enterotoxina da cólera (CT) expressa por Vibrio cholerae (NATARO e KAPER, 1998). As enterotoxinas termolábeis apresentam heterogeneidade, constituindo-se de duas classes: LT-I e LT-II. A LT-I é isolada tanto de amostras de origem humana como de animal, sendo formada por uma subunidade A e cinco subunidades B, apresentando um peso molecular de 86 KDa (DORSEY et al., 2006). A enterotoxina LT-II possui grande homologia com a LT-I em nível de subunidade A, mas é produzida por amostras de ETEC de origem animal.

[0015] As subunidades B fazem a ligação da holotoxina (LT) nos gangliosidios GM1 ou GD1 que estão presentes na superfície das células intestinais. A subunidade A é responsável pela atividade enzimática da toxina. A subunidade possui atividade de ADP-ribosil-transferase e transfere uma porção de ADP-ribosil de NAD, para a subunidade alfa da proteína estimuladora G. Isso resulta na ativação da enzima adenilato ciclase. A ativação permanente da enzima aumenta os níveis de AMP cíclico intracelular. Com o aumento de AMPc, ocorre a ativação das quinases dependentes e também a ativação do canal principal de cloreto das células epiteliais, o regulador da condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) (KAPER et al., 2004; SPANGLER, 1992).

[0016] A fosforilação desse canal resulta no efluxo de íons Cl-, acúmulo de líquidos e diarreia aquosa (Figura 2) (KAPER, 2004; SEARS E KAPER, 1996; SPANGLER, 1992). As enterotoxinas termoestáveis (STs) incluem duas classes independentes de toxinas (STa e STb) que diferem em estrutura e mecanismo de ação. A classe STa apresenta peso molecular de 2 KDa, é solúvel em água e em solventes orgânicos, sendo a classe associada a doenças humanas. STa liga-se a receptores da enzima guanilato ciclase e estimula a sua atividade. Com a ativação da enzima, ocorre um aumento dos níveis intracelulares de GMP cíclico, que ativa o canal CFTR, o que resulta na absorção deficiente de Na+ (sódio) provocando o efluxo de água para o lúmen intestinal (Figura 2) (KAPER et al., 2004).

[0017] Os estudos empreendidos como uma investigação inicial de respostas imunes que se desenvolveram com a exposição repetida a ETEC, demonstraram que os antígenos são reconhecidos durante a infecção experimental em camundongos ou em infecções naturais em humanos. Estes antígenos são compostos por uma variedade de proteínas de virulência que foram descobertas no decurso das mais recentes investigações moleculares com a linhagem H10407 de ETEC. Dentre esses antígenos incluem, flagelina, TibA, ClyA, proteínas autotransportadoras EatA e a exoproteína descrita como EtpA, objeto de estudo do presente trabalho (CROXEN E FINLAY., 2010; ROY et al., 2009; PATEL et al., 2004).

[0018] A adesão ao epitélio intestinal por ETEC é um processo muito complexo, que pode envolver várias estruturas, incluindo os flagelos. O papel dos flagelos na patogênese desse patógeno ainda não foi suficientemente explorado (GIRON, 2002; WOLF, 1997). Os flagelos são estruturas cilíndricas complexas montadas a partir de aproximadamente 20.000 flagelinas (FliC - subunidade proteica). Essas moléculas viajam para baixo do cilindro flagelar nascente até a ponta distal, onde elas são dirigidas por proteínas cap (FliD) para o flagelo crescente. A flagelina possui um domínio central que se projeta sobre a superfície do eixo flagelar e representa a variação antigênica utilizada na sorotipagem H de E. coli. As regiões conservadas da flagelina (amino e carboxi) interagem com as subunidades adjacentes viradas para o eixo do núcleo inacessível do flagelo. (YONEKURA et al., 2000; YONEKURA et al., 2003).

[0019] A adesina descrita como EtpA é uma proteína extracelular grande que pertence à família das proteínas conhecida como TPS (two-partner secretion) e foi recentemente identificada em ETEC por Roy e colaboradores (2009). De acordo com Roy e colaboradores (2009), estudos recentes demonstraram que a patogênese de ETEC é consideravelmente mais complexa do que previamente apreciada, e envolve moléculas de virulência adicionais. Estas incluem a exoproteína EtpA. A EtpA interage com as regiões altamente conservadas da flagelina. Essas interações são críticas para a adesão e a colonização intestinal de ETEC (Figura 3). Os recentes esforços levaram à identificação de dois loci descobertos no mesmo plasmídeo de virulência da cepa H10407 de ETEC que codifica o fator de colonização CFA/I. Estes, incluem o etpBAC que é o responsável pela produção e a exportação de EtpA (FLECKENSTEIN et al., 2006).

[0020] Luo e colaboradores (2015) demonstraram que a proteína EtpA é amplamente representada em um conjunto diversificado de isolados de ETEC. Segundo os autores, a adesina EtpA é expressa em mais da metade de diferentes ETEC, distribuídas ao longo de diversas linhagens filogenéticas pertencentes a vários grupos de fatores de colonização e exibiu surpreendentemente pouca variação de suas sequências. Os autores utilizaram 181 cepas no estudo, das quais 56% expressaram a adesina EtpA.

[0021] Embora tanto a adesão bacteriana e colonização intestinal sejam considerados pré-requisitos importantes para entrega eficiente das toxinas, o papel preciso da EtpA na entrega da toxina era até então desconhecido. No entanto, como mostrado por Roy e colaboradores (2012), em algumas cepas de ETEC foi realizado a deleção de EtpA. Como resultado, estas cepas foram menos eficientes na estimulação de respostas de AMP cíclico nas células-alvo em relação ao tipo selvagem de ETEC H10407. Estes dados suportam os pressupostos anteriores sobre a importância de aderência bacteriana e fornecem evidências adicionais de que a entrega da toxina é um processo complexo que envolve vários genes de virulência.

[0022] Kansal e colaboradores (2012) demonstraram que as interações de ETEC com as células hospedeiras promovem alterações nítidas no transcriptoma de ETEC. Estas alterações são acompanhadas por uma modificação significativa da arquitetura destes organismos na interface patogéno-hospedeiro. Coletivamente, os dados obtidos pelos autores sugerem que as interações ETEC/hospedeiro são finamente orquestradas, com a implantação sequencial de múltiplas adesinas à medida que as bactérias se envolvem nas alças epiteliais culminando na liberação efetiva de suas toxinas.

[0023] No lúmen intestinal, as bactérias encontram glicoproteínas de mucina, incluindo MUC2 que é secretada por células de cálice dentro da mucosa. No cólon, a MUC2 forma uma barreira complexa e espessa entre a pesada carga de organismos comensais e o epitélio. A glicoproteína MUC2 localizada na região adjacente à superfície epitelial do cólon está fortemente empacotada e unida, excluindo de modo eficaz as bactérias. As cepas de ETEC colonizam preferencialmente o intestino delgado onde estes organismos conseguem de maneira efetiva entregar suas toxinas. Em contraste com a camada de mucina no cólon, a camada da glicoproteína MUC2 no intestino delgado é relativamente fina e ligeiramente ligada à superfície epitelial (JOHANSSON et al., 2008; BERGSTROM et al., 2010).

[0024] Os autores Kumar e colaboradores (2016) demonstraram que as bactérias ETEC podem estar equipadas para a adesão à glicoproteína MUC2. Os dados fornecidos sugerem que a colonização do intestino delgado mediada anteriormente por EtpA ocorre em parte por meio das interações desta adesina com MUC2 no lúmen intestinal. Além disso, verificou-se que molécula efetora principal de ETEC, a toxina termolábil (LT), pode aumentar as interações das bactérias com as células intestinais por meio da estimulação da produção de mucina MUC2 formadora de gel.

[0025] Alguns estudos mostraram que EtpA participa das interações mais complexas e dinâmicas entre ETEC e as mucosas gastrointestinais nas quais as glicoproteínas hospedeiras promovem a ligação bacteriana, ao mesmo tempo que limitam o engajamento epitelial necessário para a liberação eficaz das toxinas.

[0026] Knutton e colaboradores (1984) já haviam demonstrado que as bactérias ETEC interagem com o glicocálice na superfície apical dos enterócitos. Esta rica camada de glicoproteínas que revestem as microvilosidades do intestino delgado é formada por um certo número de mucinas transmembranares. A mucina mais abundante e melhor estudada é denominada de MUC3 (WEISS et al., 1996).

[0027] Roy e colaboradores (2009) já haviam demonstrado que a exoproteína EtpA também interage com a superfície das células epiteliais intestinais. Desta forma, os autores Kumar e colaboradores (2016) investigaram se esta adesina também poderia envolver a glicoproteína MUC3. Os autores incubaram a proteína EtpA com secções de intestino delgado de ratos. Após os experimentos, eles demonstraram que EtpA também se liga às vilosidades intestinais superficiais nos locais de expressão da glicoproteína MUC3. Esses resultados sugerem que a exoproteína EtpA pode engatar tanto nas mucinas segregadas formadoras de gel como nas moléculas transmembranares.

[0028] Esses dados fornecem uma visão adicional sobre a natureza das interações de ETEC com os epitélios intestinais e promove implicações potenciais para o uso da adesina EtpA como molécula alvo no diagnóstico de ETEC.

[0029] Os novos dados sobre esse antígeno podem complementar de forma significativa as abordagens atuais e promover melhores estratégias para o desenvolvimento de novas ferramentas para o diagnóstico e vacinas amplamente protetoras de ETEC.

[0030] O diagnóstico dos patógenos que causam as doenças diarreicas é usualmente obtido por meio de vários ensaios, incluindo, sorotipagem, ensaios de cultura em placa, microscopia, biologia molecular e imunoensaios. As principais características de um teste ideal para o diagnóstico dessas doenças devem incluir a rapidez, os custos relativamente baixos e a sensibilidade e especificidade do método devem ser elevados (ANTIKAINEN et al., 2013; ZBOROMYRSKA, 2014).

[0031] O diagnóstico para detecção de ETEC iniciou-se por meio da identificação dos sorogrupos dessa bactéria. No entanto, o seu uso foi limitado em Bangladesh, quando se tornou evidente a existência de um número muito elevado de sorotipos de E. coli (QADRI et al., 2005). A Identificação direta das enterotoxinas de ETEC têm evoluído ao longo dos últimos anos, e se tornou relevante pela interferência direta que a detecção dessa bactéria têm nas investigações epidemiológicas direcionadas para medidas de controle, no monitoramento dos pacientes infectados para o tratamento imediato, na prevenção de procedimentos invasivos desnecessários e nos tratamentos inadequados, como o uso errado de antibióticos (KARCH et al., 1999; QADRI et al., 2005).

[0032] De acordo com Nataro e Kaper (1998), ETEC foi um dos primeiros micro-organismos patogênicos para os quais foram desenvolvidas técnicas de diagnóstico molecular. Os métodos de detecção para o diagnóstico de ETEC estão diretamente relacionados com a identificação de suas enterotoxinas LT/ST. Dentre os vários métodos revistos por Quadri e colaboradores (2005), estão listados os ensaios fisiológicos em coelhos, para detecção da toxina LT, e em ratos recém-nascidos, para toxina ST, tidos como padrão ouro nos primeiros diagnósticos; além destes, a partir da década de 70, foram desenvolvidos dois ensaios com linhagens de cultura de tecidos para detecção da toxina LT, sendo amplamente utilizados até o surgimento da tecnologia de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Os ensaios por aglutinação (ITO et al., 1983), ensaio de aglutinação de látex passiva reversa e ensaio de coaglutinação estafilocóccica (SCOTLAND et al., 1989), também mostraram-se específicos para o diagnóstico de ETEC, no entanto, não foram amplamente utilizados para fins de diagnóstico.

[0033] Com o advento das técnicas moleculares, a partir da década de 80, novas metodologias de diagnóstico foram elaboradas para a detecção das toxinas LT/ST e dos fatores de colonização (CFs) de ETEC. Tais métodos foram baseados em análises com sondas radioativas, reações em cadeia da polimerase e imunoensaios (FUJIOKA et al., 2009; STEINSLAND et al., 2003).

[0034] A técnica de reação em cadeia da polimerase emergiu como uma ferramenta útil para a detecção desse patógeno. Essa técnica pode ser realizada isoladamente ou em combinação com eletroforese em gel, hibridização de sondas, ou em tempo real para a detecção de fluorescência (LIU et al., 2012). Diversos estudos têm explorado a metodologia baseada na PCR para fins de diagnóstico de ETEC e também de outros agentes causadores da diarreia como EPEC, EHEC e EIEC (ANTIKAINEN et al., 2013; FUJIOKA et al., 2009; LIU et al., 2012). No entanto, ressalta-se que ainda não existe um teste de diagnóstico perfeito para ETEC, e os testes por PCR podem ser caros, demorados e exigir mão de obra bem treinada e especializada (SHEN et al., 2014).

[0035] Ensaios utilizando anticorpos são ferramentas essenciais que têm sido utilizadas no desenvolvimento de ensaios diagnósticos. De modo geral, anticorpos policlonais são obtidos a partir do soro de animais imunizados com o antígeno alvo e conferem a sensibilidade ao teste (HORNBECK, 1991). O imunoensaio convencional de ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) têm elevada reprodutibilidade e possibilidade para a quantificação simultânea de um grande número de ensaios. Esse método tem sido amplamente utilizado para detectar a presença de bactérias, vírus e proteínas (CHUNGLOK et al., 2011; ZHU et al., 2013). No entanto, o limite de detecção de ELISA convencional para cepas de E. coli é de 105 a 107 UFC mL-1, o que torna o método inadequado quando a dose infecciosa é menor que 100 células (SHEN et al., 2014).

[0036] Nos últimos anos, com surgimento da nanotecnologia, novos horizontes e perspectivas têm sido exploradas para avançar sobre os limites de detecção de patógenos (ZHOU et al., 2012). Diferentes formas, tamanhos e composições de nanopartículas têm sido utilizadas para a detecção de diversos microrganismos (NAJAFI et al., 2014; SUNG et al., 2013; YANG et al., 2007). Além disso, um dos focos centrais no uso das nanopartículas é o aumento da amplificação do sinal de detecção. Um exemplo, é a utilização de nanopartículas magnéticas que têm sido utilizadas para melhorar o limite de detecção de ELISA convencional (SHEN et al., 2014; WANG et al., 2012).

[0037] As nanopartículas magnéticas exibem propriedades únicas e têm sido amplamente utilizadas em diversas áreas, incluindo a médica, eletrônica, ambiental, farmacêutica e energética. Essas nanopartículas são plataformas sintéticas versáteis para revestimentos de superfície por meio de conjugação química a bioreceptores (tais como anticorpos, aptâmeros e outros agentes). Devido às suas excelentes propriedades, tornam-se ferramentas poderosas para o monitoramento de várias espécies sob diferentes propósitos biológicos e ambientais (KLOEPFER et al., 2003; KOEDRITH et al., 2015).

[0038] Métodos clássicos para a detecção de bactérias patogênicas envolvem os seguintes passos básicos: pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo, plaqueamento seletivo, triagem bioquímica e confirmação sorológica. Assim, os métodos clássicos, tais como a cultura e a contagem de colônias, a eletroforese em gel e as transferências de membrana, para a detecção de bactérias se tornam demorados e os resultados desses testes muitas vezes não estão disponíveis na escala de tempo desejada no laboratório clínico, razão pela qual o desenvolvimento de tecnologias alternativas de detecção e identificação tornou-se cada vez mais importante nos últimos anos (DOU et al., 2013; LI et al., 2014). Nesse sentido, diversas pesquisas têm sido feitas para melhorar a sensibilidade e rapidez da detecção de bactérias patogénicas por meio do uso de biossensores que incluem principalmente a imunossensibilidade, que se baseia nas interações anticorpo-antígeno específicos (LI et al., 2012; NADZIRAH et al., 2015).

[0039] Na literatura há alguns exemplos da utilização de beads magnéticas para a detecção da cepa enterohemorrágica de E. coli O157:H7. Jayamohan e colaboradores (2015), desenvolveram um método de detecção eletroquímica indireta ultra-sensível de E. coli O157:H7 usando esferas primárias (magnéticas) funcionalizadas com anticorpos para a captura e esferas secundárias (poliestireno) funcionalizadas com oligonucleotídos de poliguanina como uma marca eletroquímica. Segundo os autores, a quantidade de sinal de polyG pode ser correlacionada com a quantidade de E. coli na amostra. O método foi capaz de detectar concentrações de até 3 CFU/100 mL de E. coli O157:H7, o que é 67 vezes menor do que a técnica mais sensível relatada na literatura. Os autores também demonstraram a utilização funcional deste método para a detecção de E. coli O157: H7 semeado em amostras de efluentes de águas residuais.

[0040] Os autores Shen e colaboradores (2014), desenvolveram um método imunoenzimático (FNP-ELISA) para detecção de Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC) O157:H7. As nanopartículas imunomagnéticas (IMMP) foram conjugadas com anticorpo monoclonal anti-O157:H7 para serem utilizadas para capturar esta cepa. Segundo os autores, o sinal foi significativamente amplificado com limites de detecção de 68 CFU mL-1 em PBS e 6,8 × 102 a 6,8 × 103 CFU mL-1 nas amostras de alimento. O método desenvolvido por esses autores foi de quatro ordens de magnitude mais sensível do que o C-ELISA, e o processo de detecção completo de EHEC O157:H7 durou apenas 3 h, gerando assim uma grande economia de tempo.

[0041] Os autores Wang e colaboradores (2015), desenvolveram um imunossensor de impedância baseado no uso de beads magnéticas e eletrodos interdigitados com tela impressa para a detecção rápida de E. coli O157:H7. Segundo os autores, as beads magnéticas acopladas com anticorpos antiEHEC O157:H7 foram misturados com uma amostra de E. coli para realizar o isolamento e a concentração das células bacterianas. A amostra foi suspensa em solução de sonda redox e colocada num eletrodo interdigitado impresso em tela. Um campo magnético foi aplicado para concentrar as células na superfície do eletrodo e a impedância foi medida. O imunossensor de impedância detectou E. coli O157:H7 a uma concentração de 104,45 CFU/mL-1 (~ 1400 células bacterianas em um volume aplicado de 25 μL) em menos de 1 h sem pré-enriquecimento. Uma relação linear entre a concentração de bactérias e o valor de impedância foi obtida entre 104 CFU/mL-1 e 107 CFU/mL-1. O campo magnético e a impedância foram simulados usando o software COMSOL Multiphysics.

[0042] A adesina EtpA utilizada para a detecção das bactérias ETEC por meio de anticorpos policlonais acoplados a beads magnéticas foi escolhida como proteína alvo no desenvolvimento desse trabalho porque é uma proteína conservada dentro do patovar ETEC (LUO et al, 2015; KUMAR et al., 2016).

[0043] Até o presente momento, não foi encontrado em nenhuma base de dados da literatura a utilização de anticorpos anti-EtpA acoplados às beads magnéticas para a detecção da bactéria Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).

[0044] Novas técnicas para a detecção de ETEC são de grande relevância, pois direcionam as investigações epidemiológicas, previnem os procedimentos invasivos desnecessários e também servem como ferramenta para monitorar os pacientes infectados para o tratamento imediato (KARCH et al., 1999; QADRI et al., 2005).

[0045] Há, portanto, uma necessidade na técnica por um imunoensaio que permita o diagnóstico ou a identificação de ETEC sem as limitações apresentadas pelos métodos propostos pelo estado da técnica. Particularmente, existe na técnica uma necessidade por métodos diagnósticos que permitam a detecção de ETEC com alta sensibilidade e sem a ocorrência de reação cruzada, gerando falsos negativos ou falsos positivos.

[0046] Assim, a presente invenção propõe a produção de uma nova ferramenta de diagnóstico para detecção específica de ETEC por meio de técnicas imunológicas que detectam um novo marcador (EtpA). Além disso, por associar ferramentas imunológicas à nanotecnologia, a invenção propicia testes com maior rapidez e especificidade, o que preliminarmente é um diferencial em relação aos testes encontrados que tratam principalmente de diagnóstico por PCR. O estudo em questão pode ser aplicado também a pesquisas/métodos aplicados para o isolamento de ETEC.

[0047] A invenção passará a ser apresentada com maiores detalhes abaixo.

Sumário da Invenção

[0048] Em um primeiro aspecto, a invenção provê uma proteína recombinante, que compreende pelo menos um fragmento imunogênico da proteína EtpA, em que o fragmento é selecionado do grupo representado pela SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0049] Em um segundo aspecto, a invenção provê uma sequência de DNA sintético que é representada pela SEQ ID NO: 1 ou suas degenerações, que codifica a proteína como definida acima.

[0050] Em um terceiro aspecto, a invenção provê cassete de expressão, que compreende a sequência de DNA sintético da invenção.

[0051] Em um quarto aspecto, a invenção provê vetor de expressão, que compreende a sequência de DNA sintético descrita acima ou um cassete de expressão descrito acima.

[0052] Em um quinto aspecto, a invenção provê célula hospedeira, que compreende a sequência de DNA sintético como definida acima ou um vetor de expressão como definido acima ou um cassete de expressão como definido acima.

[0053] Em um sexto aspecto, a invenção provê método para produzir uma proteína recombinante ou sintética, que compreende:
(a) transferir para uma célula hospedeira a sequência de DNA sintético como definida acima para obter uma célula hospedeira transformada ou transfectada;
(b) cultivar a célula hospedeira transformada ou transfectada para obter uma cultura de células;
(c) expressar a proteína recombinante como definido acima em uma célula hospedeira transformada ou transfectada para produzir uma proteína recombinante;
e (e) isolar a proteína recombinante da célula ou da cultura de célula.

[0054] Em um sétimo aspecto, a invenção provê um método para detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) em uma amostra biológica, que compreende as etapas de:

• (a) expor um agente de detecção primário a uma ou mais proteínas recombinantes como definidas acima;
• (b) acoplar o dito agente de detecção primário a beads magnéticas;
• (c) contatar o dito agente de detecção primário a um agente de detecção secundário ligado a um marcador;
• (d) detectar os isolados de ETEC pela ligação específica do dito agente de detecção secundário ao dito agente de detecção primário.

[0055] Em um oitavo aspecto, a invenção provê um kit para detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) em uma amostra biológica, compreendendo uma ou mais proteínas recombinantes como definidas acima, um agente de detecção marcado, beads e instruções de uso.

[0056] Em um nono aspecto, a invenção provê o uso da proteína recombinante da invenção na manufatura de um kit para detecção de ETEC em uma amostra biológica, ou em um método para detecção de ETEC.

Breve Descrição das Figuras

[0057] Figura 1. Fatores de colonização produzidos por ETEC (fímbrias/pili). A) Fator de colonização linear CFA/III produzidos por ETEC (fímbrias de 5-7 nm de diâmetro). B) Fator de colonização CFA/I. Fímbrias abundantes e longas medindo aproximadamente 5 a 7 nm. Fonte: Adaptado de Kaper, 2004.

[0058] Figura 2. Mecanismos de ancoragem e patogênese de ETEC. Fonte: Adaptado de CROXEN e FINLAN, 2010.

[0059] Figura 3. A) ETEC fazendo a ancoragem nas células hospedeiras através das pontas dos flagelos. B e C) EtpA se concentra nas pontas dos flagelos se interagindo com regiões altamente conservadas de flagelina. Fonte: Adaptado de Roy e colaboradores, 2009.

[0060] Figura 4. Mapa e sequencia de pontos de referência do vetor pGEM®-T Easy (Promega) utilizado para clonagem do gene EtpA.

[0061] Figura 5. Mapa do vetor de expressão pRSET A,B,C. Este vetor foi utilizado para a expressão da proteína recombinante EtpA de ETEC.

[0062] Figura 6. Modelagem tridimensional da proteína nativa EtpA para análises e desenho da quimera (I-Tasser).

[0063] Figura 7. Análise dos produtos da PCR das amostras 1; 2; 3; 4; 5 que foram amplificados no vetor pGEM T-EtpA. M - Marcador de massa molecular de 500 pb (Ludwigbiotec).

[0064] Figura 8. 1) Análise do perfil de restrição do plasmídeo recombinante com as enzimas EcoRI e BamHI. 2) Vetor não digerido. M - Marcador de massa molecular 1 Kb (Ludwigbiotec).

[0065] Figura 9. Perfil eletroforético do gene EtpA purificado. M - marcador de massa molecular 1 Kb (Ludwigbiotec).

[0066] Figura 10. Perfil de Análise de restrição do cassete de expressão pRSET-Etpa. Amostras 2 e 5 confirmando a correta construção do vetor com o tamanho das bandas esperadas. M - Marcador de massa molecular 1Kb (Ludwigbiotec).

[0067] Figura 11. Imunoblot contra a cauda de histidina para a detecção da proteína EtpA expressa em E. coli BL21. M - Marcador de massa molecular preparado com diferentes proteínas (caseiro).

[0068] Figura 12. Perfil eletroforético em gel SDS-PAGE da proteína recombinante EtpA expressa pelos clones 2 e 5. Lavagens e primeiras eluições com diferentes concentrações de Imidazol. Setas indicam as bandas correspondentes à proteína expressa. M – Marcador de massa molecular (Color Plus Biolabs: 10-230 kDa).

[0069] Figura 13. Perfil eletroforético em gel SDS-PAGE das eluições da proteína EtpA purificada em coluna Ni-NTA-Agarose. M – Marcador de massa molecular (Color Plus Biolabs: 10-230 kDa).

[0070] Figura 14. Perfil Eletroforético da excisão da cauda de histidina pela ação da enzima enterokinase. Seta mostrando as bandas proteicas com e sem cauda respectivamente. M – Marcador de massa molecular (Color Plus Biolabs: 10-230 kDa).

[0071] Figura 15. Gráfico representando os resultados do primeiro teste de ELISA indireto para os anticorpos policlonais produzidos contra a proteína EtpA. C1 à C4: animais imunizados com EtpA purificada. CADJ -: animal imunizado apenas com adjuvante.

[0072] Figura 16. Dot blot com peptídeos sintetizados a partir da sequência quimérica de EtpA. Circulo amarelo destaca a revelação do peptídeo número 1.1 do epítopo 1 contra o pool de soros dos camundongos imunizados. O quadro verde representa os controles positivos de 2 lisados bacterianos, e o dot apontado pela flecha representa a proteína EtpA-Recombinante.

[0073] Figura 17. Perfil das regiões imunogênicas da proteína recombinante EtpA. Análise predita no programa BepiPred 1.0 Server.

[0074] Figura 18. Análise do reconhecimento de EtpA por citometria de fluxo em amostras ETEC positiva confirmadas por PCR. (A) População das bactérias analisadas; (B) Controle negativo: bactérias sem marcação. (C) Controle secundário: Bactéria + Anti-IgG mouse Alexa flúor 488; (D) Bactéria + Anti-EtpA + Anti-IgG mouse Alexa flúor 488 (2°).

[0075] Figura 19. Avaliação da especificidade de anticorpos antiEtpA contra diferentes cepas de E. coli diarreiogênicas. Foram analisados por citometria de fluxo, a porcentagem de bactérias reconhecidas por anticorpos anti-EtPA. EHEC (0.5%); EAEC (0,7%); EIEC (1,2%); EPEC (0.5%); DAEC (0,8%) e ETEC (7.2%).

[0076] Figura 20. Diferentes isolados de ETEC evidenciando porcentagens variadas da proteína alvo EtpA.

[0077] Figura 21. Avaliação da marcação de bactérias por brometo de etídeo. (A) Bactérias sem marcação; (B) Bactérias marcadas com EtBr (FL3- Percp).

[0078] Figura 22. Avaliação do acoplamento dos anticorpos antiEtpA em beads magnéticas. (A) beads magnéticas não acopladas. (B) beads acopladas ao anti-EtpA e reconhecidas pelo anticorpo anti-IgG mouse Alexa flúor 488.

[0079] Figura 23. Avaliação da captura dos isolados 144 e 178 de ETEC-EtpA por citometria de fluxo utilizando beads associadas ao anticorpo Anti-EtpA.

[0080] Figura 24. Esquema de captura da proteína EtpA de ETEC por beads magnéticas acopladas ao anticorpo Anti-EtpA.

[0081] Figura 25. Porcentagem de captura de bactérias diarreiogênicas por beads acopladas ao anticorpo Anti-EtpA.

Descrição Detalhada da Invenção

[0082] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular e imunologia são bem conhecidas de um técnico no assunto. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.

[0083] Frente à necessidade de desenvolvimento de um imunoensaio específico para detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC), os inventores deste trabalho evidenciam de forma inesperada um método e kit útil para realizar detecção imunológica de ETEC, com alta sensibilidade, especificidade e rapidez. Também estão inclusos no escopo da invenção a sequência de DNA sintético, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produção da dita proteína recombinante, bem como o uso da dita proteína.

[0084] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma proteína recombinante que compreende pelo menos um fragmento imunogênico da proteína EtpA, em que o fragmento é selecionado do grupo representado pela SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0085] Em uma forma de concretização, a dita proteína recombinante apresenta pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 7.

[0086] Em outra forma de concretização, a dita proteína recombinante é para uso na detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).

[0087] A atividade imunogênica refere-se à capacidade que uma substância tem de induzir uma resposta imunológica.

[0088] Mais especificamente, o termo proteína recombinante da presente invenção pode também ser entendido como antígeno, poliantígeno, antígeno multi-epítopo ou proteína quimérica.

[0089] Como usado aqui, o termo “antígeno” deve ser entendido no seu significado amplo e pode ser qualquer molécula, célula ou partícula. Por exemplo, um antígeno inclui, mas não é limitado a uma célula, um polissacarídeo, uma proteína, um ácido nucleico e um lipídio, ou uma mistura de dois ou mais destes.

[0090] Um antígeno pode estar em sua forma pura, ou estar em uma mistura. Um antígeno pode estar em uma forma modificada (por exemplo, modificada por químicos), ou pode estar em uma forma não modificada.

[0091] A identificação e a seleção de um antígeno adequado podem ser feitas através do uso de abordagens computacionais de imunoinformática, seguindo um fluxo de trabalho analítico-computacional desenvolvido com esse propósito. Assim, na presente invenção, um fluxograma de análises in silico foi desenvolvido e utilizado para escolha da melhor sequência antigênica da proteína quimérica EtpA, tendo como ponto de partida a sequência da proteína EtpA nativa. Os epítopos escolhidos para a construção antígeno recombinante têm potencial para serem considerados bons candidatos para o diagnóstico de ETEC, uma vez que passaram por todos os critérios de seleção para serem potenciais antígenos.

[0092] Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” ou “proteína” podem ser utilizados intercambiavelmente, e fazem referência a um polímero de aminoácidos conectado por ligações peptídicas, independentemente do número de resíduos de aminoácido que constituem esta cadeia. Os polipeptídeos, como aqui usados, incluem “variantes” ou “derivados” dos mesmos, que se referem a um polipeptídeo que inclui variações ou modificações, por exemplo, substituição, deleção, adição ou modificações químicas em sua sequência de aminoácido em relação ao polipeptídeo de referência. Exemplos de modificações químicas são glicosilação, PEGlação, PEG alquilação, alquilação, fosforilação, acetilação, amidação, etc. O polipeptídeo pode ser produzido artificialmente a partir de sequências nucleotídicas clonadas através da técnica de DNA recombinante ou pode ser preparado através de uma reação de síntese química conhecida.

[0093] Pelo termo “peptídeo sintético” é entendido um peptídeo que não compreende uma molécula de proteína que ocorre na natureza. O peptídeo é sintético no sentido de que pode ser produzido pela intervenção humana usando técnicas como síntese química, técnicas do DNA recombinante, ou fragmentação de uma proteína inteira, e outros. Métodos para obtenção de peptídeos sintéticos são conhecidos na arte, por exemplo, conforme descrito por métodos na arte, como o método de Merrifield (Merrifield RB. J. Am. Chem. Soc. 1963; 85: 2149-2153). Peptídeos podem ser sintetizados em grandes quantidades usando métodos em fase sólida automático, provendo assim um antígeno reproduzível de alta integridade e pureza.

[0094] O termo “aminoácido” denota o grupo α-aminoácidos que diretamente ou na forma de um precursor pode ser codificado por uma sequência de DNA sintético. Os aminoácidos individuais são codificados por ácidos nucleicos consistindo de três nucleotídeos, conhecidos como códons ou terno de bases. Cada aminoácido é codificado por pelo menos um códon. O fato do mesmo aminoácido ser codificado por diferentes códons é conhecido como “degeneração do código genético”. O termo “aminoácido”, como usado no presente pedido, denota os α-aminoácidos que ocorrem naturalmente, compreendendo alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina.

[0095] A não ser que seja requerido, os aminoácidos podem ser tanto um D-aminoácido quanto um L-aminoácido. Como discutido aqui, pequenas variações na sequência de aminoácidos de proteínas/peptídeos são contempladas como parte do conceito inventivo da invenção, desde que as as variantes mantenham pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 75%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade com SEQ ID NO: 7, ou um fragmento do mesmo. Mais especificamente, a proteína compreende ou consiste da SEQ ID NO: 7, ou sequências com identidade de pelo menos 80%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferencialmente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 7.

[0096] O termo “códon” denota um oligonucleotídeo consistindo de três nucleotídeos que codifica um aminoácido definido. Devido à degeneração do código genético, a maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um códon. Estes diferentes códons que codificam o mesmo aminoácido têm diferentes frequências relativas de uso nos diferentes organismos. Portanto, um aminoácido específico é codificado tanto por um códon exato ou por um grupo de diferentes códons. Da mesma forma, a sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser codificada por diferentes ácidos nucleicos. Portanto, um aminoácido específico (resíduo) em uma proteína pode ser codificado por um grupo de diferentes códons, cada um destes códons tendo uma frequência de uso dentro de uma determinada célula ou organismo.

[0097] “Oligonucleotídeo” refere-se a qualquer polímero curto de nucleotídeos, em que os nucleotídeos podem ser ribonucleotídeos, deoxirribonucleotídeos, dideoxirribonucleotídeos, nucleotídeos degenerados, e similares. Ditos oligonucleotídeos são preferencialmente fita simples. O comprimento de ditos oligonucleotídeos pode variar, e é usualmente menor que 150 nucleotídeos (nt), preferencialmente na faixa de 10-100 nt, mais preferencialmente de 10-60 nt, ainda mais preferencialmente de 20-50 nt. Podem ainda apresentar modificações químicas, tais como uma etiqueta (“tag”) ou uma marcação, por exemplo, fluorescente, radioativa, biotinilada, DIG (digoxigenina), e similares. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser tanto forward (senso) quanto reverse (antisenso).

[0098] Em uma concretização, os oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção incluem iniciadores e, opcionalmente, sondas. A não ser que seja informado do contrário, as sequências são apresentadas na direção de 5’ para 3’. Ditos oligonucleotídeos podem estar em várias formas, por exemplo, em solução/suspensão em um solvente adequado e em uma concentração desejada, secos ou liofilizados. O técnico no assunto tem conhecimento dos solventes, concentrações e condições de estocagem adequadas para os oligonucleotídeos da invenção. Em particular, o técnico no assunto tem conhecimento de como preparar ditos oligonucleotídeos como soluções de estoque. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem apresentar vários graus de pureza, que podem ser avaliados por um técnico no assunto, por exemplo, através de cromatografia por HPLC.

[0099] Com relação à definição de “iniciador”, um técnico no assunto sabe que inclui qualquer oligonucleotídeo fita simples capaz de se anelar a um molde alvo complementar, em condições de estringência adequada, e que serve como ponto de início para a síntese de um produto de extensão (amplicon) a partir do iniciador, pela elongação da fita por uma DNA polimerase em condições adequadas. Estas condições incluem 4 tipos diferentes de desoxinucleosídeos trifosfatos e DNA polimerase ou transcriptase reversa em condiçes de temperatura adequadas e em uma solução tampão adequada. O comprimento do iniciador pode variar de acordo com diversos fatores, mas o comprimento típico de um iniciador é de 5-50 nt. De acordo com a presente invenção, é preferível que cada iniciador tenha de 20-35 nt. Os iniciadores forward e reverse são iniciadores que se ligam, respectivamente, a uma extremidade 3’ e a uma extremidade 5’ de uma região específica do alvo que é amplificado pela reação de PCR.

[00100] A proteína EtpA é o alvo ou a fonte do alvo para a reação de amplificação da presente invenção. A expressão “sequência alvo”, ou simplesmente “alvo”, se refere a uma sequência de ácido nucleico que serve como um molde para a amplificação em uma reação de PCR. Estas sequências de ácido nucleico podem conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou seus análogos. A sequência pode ser um gene ou fragmento de gene, mRNA, cDNA, DNA total isolado, RNA total isolado, e similares. Mais especificamente, as sequências alvo da presente invenção correspondem a um ou mais fragmentos imunogênicos da proteína EtpA.

[00101] Uma vez que os iniciadores estão preparados, a amplificação de ácido nucleico alvo pode ser realizada por uma variedade de métodos, incluindo, mas não se limitando a, PCR convencional, PCR em tempo real, PCR quantitativo e outros.

[00102] "Amplificação" refere-se aos procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos utilizando iniciadores e polimerases que geram múltiplas cópias de um ácido nucleico alvo. Tais reações de amplificação são conhecidas pelo técnico no assunto como “PCR” (reação em cadeia da polimerase), que por sua vez, inclui, para fins desta invenção, qualquer método baseado em PCR, incluindo PCR convencional, PCR em tempo real, PCR quantitativo e similares.

[00103] Um “amplicon” ou “produto de PCR”, os termos sendo usados de forma intercambiável, referem-se ao um ácido nucleico (ou coletivamente, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico) que foi sintetizado durante os procedimentos de amplificação. Um amplicon é tipicamente, mas não exclusivamente, um fragmento de DNA.

[00104] Um “tampão” é uma composição adicionada à reação de amplificação, compreendendo um agente tamponante, que modifica a estabilidade, atividade e/ou longevidade de um ou mais componentes da reação de amplificação, através da manutenção do pH da reação de amplificação. Os agentes tamponantes da invenção são compatíveis com a atividade da polimerase a ser utilizada, qual seja, uma DNA polimerase. Agentes tamponantes são bem conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a Tris, Tricina, MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propano-sulfônico), e HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfônico).

[00105] Além disto, os tampões de PCR podem geralmente conter até cerca de 70 mM KCl e cerca de 0,5-4,5 mM ou mais de MgCl2, e cerca de 50- 500 µM de cada um dos nucleotídeos dATP, dCTP, dGTP e dTTP.

[00106] Os tampões da invenção podem ainda conter aditivos. Um aditivo é um composto adicionado a uma composição que modifica a estabilidade, a atividade e/ou a longevidade de um ou mais componentes da composição. Em algumas concretizações, a composição é uma composição de amplificação. Em algumas concretizações, um aditivo inativa enzimas contaminantes, estabiliza o dobramento de proteínas e/ou diminui a agregação. De acordo com a invenção, aditivos podem ser adicionados para melhorar a seletividade do anelamento de um iniciador e/ou de uma sonda, desde que o aditivo não interfira com a atividade da DNA polimerase.

[00107] Exemplos de aditivos são, mas não estão limitados a, betaína, glicerol, formamida, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, trealose, DMSO, etileno glicol, ditiotreitol (“DTT”), pirofosfatase (incluindo, mas não limitado a pirofosfatase inorgânica de Thermoplasma acidophilum ("TAP"), albumina de soro bovino (“BSA”), propileno glicol, glicinamida, CHES, Percoll™, ácido aurintricarboxílico, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO (Ndodecil-N,N-dimetilamino-N-óxido), Zwittergente 3-10, Xwittergente 3-14, Xwittergente SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, SSB de E. coli, RecA, 7- deazaG, dUTP, UNG, detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes não-iônicos, zwittergente, esteróis, cátions, e quaisquer outros químicos, proteínas, ou cofatores que podem alterar a eficiência da amplificação.

[00108] As concentrações das substâncias para a manutenção do tampão, das enzimas e outros aditivos, além dos reagentes empregados na presente invenção estão de acordo com aquelas comumente utilizadas nas reações de amplificação de PCR.

[00109] A “atividade de polimerase” refere-se a uma atividade enzimática que catalisa a polimerização de desoxirribonucleotídeos. Geralmente, a enzima irá iniciar a síntese na extremidade 3’ do iniciador anelado à sequência alvo, e irá prosseguir em direção à extremidade 5’ da fita molde. Em determinadas concretizações, essa enzima é uma DNA polimerase termoestável.

[00110] O termo “termoestável”, quando aplicado à enzima, refere-se a uma enzima que retém sua atividade biológica em temperaturas elevadas (por exemplo, a 55ºC ou mais), ou retém sua atividade biológica após ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento. Polimerases de nucleotídeos termoestáveis são particularmente preferidos para a presente invenção, uma vez que eliminam a necessidade de adicionar enzima antes de cada ciclo de PCR.

[00111] Exemplos não limitantes de DNA polimerases termoestáveis incluem, mas não se limitam a, polimerases isoladas de Thermus aquaticus (Taq polimerase), Thermus thermophilus (Tth polimerase), Thermococcus litoralis (Tli ou VENT™ polimerase), Pyrococcus furiosus (Pfu ou DEEPVENT™ polimerase), Pyrococcus woosii (Pwo polimerase) e outras espécies de Pyrococcus, Bacillus stearothermophilus (Bst polimerase), Sulfolobus acidocaldarius (Sac polimerase), Thermoplasma acidophilum (Tac polimerase), Thermus rubber (Tru polimerase), Thermus brockianus (DYNAZYME™ polimerase) (Tne polimerase), Thermotoga maritime (Tma) e outras espécies de Thermotoga genus (Tsp polimerase), e Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth polimerase).

[00112] A reação de PCR pode conter mais do que uma enzima polimerase termoestável com propriedades complementares, resultando em amplificação mais eficiente das sequências alvos. Por exemplo, uma polimerase com alta habilidade de amplificar segmentos grandes de nucleotídeos pode ser complementada com outra polimerase com capacidade de corrigir erros ocorridos durante a elongação da sequência de ácido nucleico alvo, assim criando uma reação de PCR que pode amplificar uma sequência alvo longa com alta fidelidade. A polimerase termoestável pode ser usada em sua forma selvagem, ou, alternativamente, a polimerase pode ser modificada para conter um fragmento de uma enzima ou para conter uma mutação que forneça propriedades benéficas para facilitar a reação de PCR. Em uma concretização, a polimerase pode ser a Taq polimerase. Muitas variantes da Taq polimerase com propriedades melhoradas são conhecidas e incluem, mas não são limitadas a AmpliTaqTM, fragmento Stoffel, SuperTaqTM, SuperTaqTM plus, LA TaqTM, LApro TaqTM, e EX TaqTM.

[00113] Para a amplificação, um par de iniciador é utilizado (por exemplo, um iniciador forward e um iniciador reverse de EtpA). As concentrações finais dos iniciadores podem ser ajustadas de forma apropriada, variando de cerca de 2,5 pmol a cerca de 10 pmol (a concentração final na reação), preferencialmente de cerca de 5 pmol a cerca de 6 pmol de cada um dos iniciadores. As condições de amplificação envolvem um ciclo de desnaturação (94ºC/5 minutos) seguido de 35 ciclos (94ºC/1 minuto e 60ºC/40 segundos; 72ºC/1,5 minutos) e um ciclo de extensão a 72ºC/5 minutos. Pequenas alterações tanto nas concentrações de reagentes quanto no programa com as condições de amplificação podem ser realizadas sem compromisso do produto final gerado (amplificação do fragmento específico).

[00114] O técnico no assunto tem conhecimento das condições de reação de PCR, em particular, as condições de ciclagem termal, por exemplo, temperaturas, duração, número de ciclos, taxa de aquecimento/resfriamento, etc. Em uma concretização preferida, as condições de reação de PCR incluem condições adequadas para uma PCR convencional.

[00115] De acordo com a presente invenção, o amplicon é preferencialmente visualizado por eletroforese em géis de agarose 0,8% com brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta.

[00116] Em uma concretização, pelo menos uma etapa, a de amplificação do DNA, é realizada em tubos de 200 uL de parede fina ou em placas dependendo do termociclador utilizado.

[00117] Em uma concretização preferida, pelo menos uma etapa, preferivelmente várias etapas, mais preferivelmente a maioria das etapas é realizada em um termociclador. A seguir estão alguns termocicladores para PCR: Bio-rad (example: thermal cyclers, C1000 series), Eppendorf (ex: Mastercycle). Agilent (ex: SureCycler), MJR (ex: PTC100, Thermo Fisher Scientific (ex: SimpliAmp, Veriti). Na presente invenção, o termociclador utilizado é o Mastercycler® personal (Eppendorf).

[00118] De acordo com a presente invenção, a digestão do produto da amplificação é realizado por enzimas de restrição. As enzimas de restrição são capazes de reconhecer e “cortar” ou “digerir” uma sequência específica de DNA de fita dupla, conhecida como “sequência de reconhecimento” ou “sítio de restrição”. Particularmente, as enzimas de restrição utilizadas na presente invenção são a BamHI e EcoRI.

[00119] A separação e análise dos produtos resultantes ocorrem de acordo com técnicas disponíveis no estado da técnica. Um exemplo é a posterior separação dos produtos de amplificação por eletroforese.

[00120] Os ensaios de eletroforese se valem do princípio que determina que a carga global de uma fita de DNA é negativa. Portanto, uma solução que possua íons livres (eletrolítica) e que tenha moléculas de DNA em suspensão pode ser purificada aplicando–se uma dada voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo (positivo), atraente de moléculas de carga negativa. No entanto, o foco da técnica é separar os fragmentos por tamanho, uma vez que a reação gera fragmentos de mesma extensão. A solução é “peneirar” o resultado da PCR por peneiras moleculares. As cadeias são “empurradas” através da peneira pela corrente elétrica, e de acordo com o tamanho dos furos dela, elas serão retidas ou liberadas. Na verdade, se vale do fato de que cadeias maiores demoram mais tempo para passar pelos poros da “peneira”, e cadeias menores viajam mais rapidamente através dela. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos variáveis, normalmente equidistantes entre si. Por exemplo, um Ladder de 50bp quer dizer na prática que ele mostrará várias bandas, cada uma variando em 50 pares de base do que a anterior (50bp, 100bp, 150bp, 200bp, 250bp...).

[00121] Existem dois modelos básicos de eletroforese: baseada em géis de agarose ou em géis de poliacrilamida. As duas substâncias formam tramas de poros de tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos fragmentos, que terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada. Em qualquer um dos casos, estas substâncias são dissolvidas numa solução-tampão eletrolítica, obrigatoriamente a mesma que recobrirá o gel na cuba de eletroforese e possibilitará a passagem de corrente elétrica (tampão de corrida). Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA). Quanto à aplicação das amostras no gel, é importante ressaltar que antes disso elas são misturadas a uma outra (tampão de amostra), que tem como função aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampão de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Além disso, o tampão de amostra possui um corante, que possibilita a visualização da sua separação no gel. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampão de corrida apropriado para cada reação, outras misturas comercialmente disponíveis também podem ser utilizadas como tampões de amostras, tais como, mas não apenas restritas à, DNA loading buffer ou Gel loading buffer.

[00122] A eletroforese é seguida de técnicas apropriadas de coloração que permitam a visualização adequada de ácido nucléico no gel, compreendendo, mas não limitados a: coloração por sais, a exemplo do brometo de etídio e de sais de prata, radioisótopos e enzimas em combinação com substratos que permitam a sua detecção. Particularmente, o brometo de etídio e os derivados do SybrGreen (SybrSafe , Sybr gold, Eva Green) tem a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de DNA e apresenta fluorescência quando excitado com radiação ultravioleta.

[00123] Os fragmentos antigênicos que compõem a proteína da presente invenção podem ser obtidos de forma recombinante ou sintética. Em uma modalidade particular, a proteína recombinante da presente invenção é obtida por meio de um sistema de expressão.

[00124] Por sistema de expressão, entende-se um sistema compreendendo as sequências nucleotídicas, as quais são capazes de codificar proteínas associado a um organismo vivo.

[00125] Numerosos sistemas de expressão in vivo, compreendendo o uso de células hospedeiras adequadas, estão disponíveis no comércio e a utilização destes sistemas é bem conhecida do versado na técnica.

[00126] Sistemas de expressão particularmente adequados incluem microrganismos, como bactérias transformadas com vetores de expressão de DNA recombinante de bacteriófago, plasmídeo ou cosmídeo; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão de vírus (por exemplo, baculovírus); sistemas de células de plantas transformados com vetores de expressão de vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV [cauliflower mosaic virus]; vírus do mosaico do tabaco, TMV [tobacco mosaic virus]) ou com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais.

[00127] Em um segundo aspecto, a invenção provê uma sequência de DNA sintético que é representada pela SEQ ID NO: 1 ou suas degenerações, que codifica a proteína como definida acima.

[00128] Os termos “sequência de DNA sintético” e “polinucleotídeo” são usados de forma intercambiável, e referem-se a DNA. Os polinucleotídeos podem ser simples ou dupla fita. Exemplos não limitantes de polinucleotídeos incluem genes, fragmentos de genes, éxons, íntrons, DNA complementar, DNA genômico, DNA sintético, DNA recombinante, cassetes, vetores, sondas e iniciadores. O termo “DNA recombinante” refere-se a qualquer sequência nucleotídica artificial que resulta da combinação de sequências de DNA de diferentes origens.

[00129] O termo “sequência de nucleotídeos degenerada” denota uma sequência de nucleotídeos que inclui um ou mais códons degenerados quando comparada com uma molécula de ácido nucleico de referência que codifica um dado polipeptídeo. Códons degenerados contêm diferentes tripletes de nucleotídeos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (p.ex., GAU e GAC ambos codificam Asp).

[00130] Um técnico no assunto reconheceria que as degenerações são integralmente suportadas com base nas informações fornecidas no pedido e no conhecimento comum do estado da técnica. Por exemplo, a degeneração do código genético (isto é, diferentes códons podendo codificar os mesmos aminoácidos) é um conhecimento comum na técnica e a identidade do aminoácido codificado por cada códon é bem estabelecida.

[00131] Com base nas informações bem conhecidas e estabelecidas no estado da técnica, o técnico no assunto é capaz de identificar as substituições de nucleotídeos que não alteram a sequência de aminoácidos resultante. Assim, quando em posse tanto da sequência de nucleotídeos de um gene quanto da sequência de aminoácidos da proteína codificada, o técnico no assunto identificará facilmente as degenerações que codificam a mesma proteína, com a mesma sequência de aminoácidos.

[00132] As sequências nucleotídicas podem estar inseridas em cassetes de expressão, os quais são colocados em condições que conduzam à expressão da proteína correspondente.

[00133] Em um terceiro aspecto, a invenção provê cassete de expressão, que compreende a sequência de DNA sintético descrita acima.

[00134] O cassete de expressão pode compreender, ainda, sequências necessárias à sua expressão, tais como, promotores, sequências intensificadoras e terminadoras compatíveis com o sistema de expressão. Ademais, o cassete de expressão pode compreender sequências espaçadoras, sequências ligadoras e sítios de restrição adequados. Além disso, o cassete pode compreender, ainda, uma sequência codificante para cauda de histidina.

[00135] Em um quarto aspecto, a invenção provê vetor de expressão, que compreende a sequência de DNA sintético descrita acima ou um cassete de expressão descrito acima. Este vetor de expressão pode ser utilizado para transformar uma célula hospedeira e permitir a expressão do ácido nucleico de acordo com a invenção na referida célula.

[00136] Com vantagem, o vetor de expressão compreende elementos reguladores que permitem a expressão da sequência de DNA sintético e elementos que permitem a sua seleção na célula hospedeira de acordo com a invenção. Os métodos para selecionar estes elementos em função da célula hospedeira na qual a expressão é desejada, são bem conhecidos do versado na técnica e amplamente descritos na literatura.

[00137] Os vetores podem ser construídos por técnicas clássicas de biologia molecular, bem conhecidas do versado na técnica. Exemplos não limitantes de vetores de expressão adequados para expressão em células hospedeiras são plasmídeos e vetores virais ou bacterianos.

[00138] Em um quinto aspecto, a invenção provê célula hospedeira, que compreende a sequência de DNA sintético como definida acima ou um vetor de expressão como definido acima ou um cassete de expressão como definido acima. A sequência de DNA sintético, o cassete ou o vetor pode estar contido na célula sob a forma de epissoma ou sob forma cromossômica.

[00139] A célula hospedeira pode ser uma célula de bactéria, levedura, fungos filamentosos, protozoários, insetos, células animais e vegetais.

[00140] Em uma forma de concretização, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, preferivelmente uma célula de Escherichia coli, ainda mais preferivelmente uma célula de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).

[00141] A sequência de DNA sintético, cassete de expressão ou o vetor é inserido em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas competentes. Os clones recombinantes são selecionados e então, submetidos à análise por enzimas de restrição e sequenciamento de DNA, possibilitando a confirmação da sequência clonada, utilizando-se para isso métodos, kits e equipamentos amplamente conhecidos por um técnico no assunto.

[00142] Assim, as sequências de DNA sintético da invenção podem ser preparadas usando tecnologia de DNA recombinante, em que um cassete ou vetor de expressão compreendendo uma sequência de polinucleotídeo da invenção, por exemplo, que codifica a proteína recombinante de SEQ ID NO: 7 , é operacionalmente ligada a um promotor.

[00143] A introdução da sequência de DNA sintético, cassete de expressão ou o vetor que codifica uma proteína recombinante ou sintética da presente invenção em células hospedeiras pode ser realizada por meio de métodos descritos em muitos manuais de laboratório padrão, como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989).

[00144] A célula hospedeira transformada ou transfectada descrita acima é depois cultivada em um meio nutriente adequado sob condições conducentes que permitam a expressão das proteínas recombinantes da invenção. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para desenvolver as células hospedeiras, tal como meio mínimo ou complexo contendo suplementos apropriados. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, nos catálogos da American Type Culture Collection). A proteína da invenção produzida pela célula pode ser depois recuperada da célula ou do meio de cultura por procedimentos convencionais incluindo separar as células hospedeiras do meio pela centrifugação ou filtração, precipitando os componentes aquosos de proteína do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amônio, purificação por uma variedade de procedimentos cromatográficos, por exemplo cromatografia por troca iônica, cromatografia por exclusão, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por filtração em gel, cromatografia por afinidade ou similares, dependente do tipo de polipeptídeo em questão.

[00145] O polipeptídeo recombinante obtido é analisado e tratado de modo a solubilizá-lo, quando pertinente. O polipeptídeo solubilizado é, então, purificado e caracterizado bioquimicamente, utilizando-se, por exemplo, métodos comuns ao campo da bioquímica, como HPLC, SDS-PAGE, Western Blotting, focalização isoelétrica com gradiente de pH, dicroísmo circular, espalhamento dinâmico de luz.

[00146] Os polipeptídeos podem ser expressos “fusionados” a uma etiqueta. O termo “etiqueta” ou o termo em inglês “tag” refere-se a sequências codificadoras incorporadas próximas ao sítio múltiplo de clonagem de um vetor de expressão, possibilitando a sua tradução concomitante e adjacente à sequência do polipeptídeo recombinante clonada. Assim, a etiqueta é expressa fusionada ao polipeptídeo recombinante. Tais etiquetas são bem conhecidas no estado da técnica e incluem compostos e peptídeos como poli-histidina, poli-arginina, FLAG, glutationa-S-transferase, proteína ligante a maltose (MBP), domínio ligante a celulose (CBD), Beta-Gal, OMNI, tioredoxina, NusA, mistina, domínio ligante a quitina, cutinase, compostos fluorescentes (como GFP, YFP, FITC, rodamina, lantanídeos), enzimas (como peroxidase, luciferase, fosfatase alcalina), compostos quimioluminescentes, grupos biotinila, epítopos reconhecidos por anticorpos como zíper de leucina, c-myc, domínios ligantes a metais e sítios de ligação para anticorpos secundários.

[00147] Após a reação química, a proteína recombinante pode ser separada e purificada por um método de purificação conhecido. Preferencialmente, podem ser utilizados métodos de cromatografia. Exemplos não limitativos incluem o método de afinidade, troca iônica, fase reversa e exclusão molecular. Pode-se utilizar qualquer coluna conhecida na técnica adequada à purificação de polipeptídeos. Em certas modalidades da presente invenção pode ser empregada uma coluna cromatográfica de afinidade carregada com íons metais tais como Cu(II), Zn(II), Ni(II), Ca(II), Co(II), Mg(II), Fe(III), Al(III) entre outros, ou com moléculas com bioafinidade como imunoglobulinas, heparina, ácidos nucléicos, enzimas ou outro substrato ou ligante especifico para uma parte da sequência de aminoácidos dos antígenos, uma coluna de troca iônica carregada com grupamentos funcionais tais como carboxilatos e sulfonatos, que podem ser trocados livremente com íons em solução, e uma coluna de fase reversa que em alguns casos pode ser funcionalizada por ligantes formados por cadeias de carbono. Os grupamentos funcionais destas colunas estão ligados a uma fase sólida que pode ser composta, de forma não restritiva, por polímeros de polissacarídeos (agarose ou celulose) ou outras matrizes como sílica, dextran, estireno polimerizado, poliacrilamida, e derivados dos referidos materiais.

[00148] Os tampões de purificação utilizados podem ser aqueles conhecidos na técnica. Em modalidades particulares, podem ser compostos por reagentes como Tris, CAPS (ácido N-ciclohexil-3- aminopropanosulfônico), MES (ácido 2-(N-morfolino) etanosulfônico), PBS (tampão de salina fosfatada), CABS (ácido 4-(Ciclohexilamino)-1- butanosulfônico), ACES (ácido N-(2-Acetamido)-2-aminoetanosulfônico), ADA (ácido N-(2-Acetamido)iminodiacético), BES (ácido N,N-Bis(2- hidroxietil)-2-aminoetanosulfônico), AMP (2-amino-2-metil-1-propanol), AMPD (2-Amino-2-Metil-1,3-Propanodiol; amediol), HEPES (4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico), EPPS (ácido 3-[4-(2-hidroxietil)-1- piperazinil]propanosulfônico), TAPS (N-[tris(hidroxietil)metil]-3- aminopropanosulfônico), MOPS (3-morfolinopropano-1-sulfônico), PIPES (ácido 1,4-Piperazinediethanesulfonic, TES (N-[tris(hidroximetil)metil]-2- aminoetanosulfônico), podendo ainda conter sais, ácidos ou bases de fosfato, carbonato, citrato, acetato e succinato, ácido hidroclórico, ácido orto-fosfórico e bicarbonato. Para resultar em eficiência podem variar em concentrações de 20 a 250 mM. Os tampões de eluição que requeiram mudança de condutividade para recuperação dos polipeptídeos poderão conter sais como KCl, NaCl ou imidazol.

[00149] Em um sexto aspecto, a invenção provê método para produzir uma proteína recombinante, que compreende:
(a) transferir para uma célula hospedeira a sequência de DNA sintético como definida acima para obter uma célula hospedeira transformada ou transfectada;
(b) cultivar a célula hospedeira transformada ou transfectada para obter uma cultura de células;
(c) expressar a proteína recombinante ou sintética como definido acima em uma célula hospedeira transformada ou transfectada para produzir uma proteína recombinante ou sintética; e
(e) isolar a proteína recombinante da célula ou da cultura de célula.

[00150] As condições de cultivo da célula hospedeira referido na etapa (b) são de conhecimento de um técnico no assunto. Em uma concretização, o cultivo é feito em meio LB na presença de um antibiótico, sob agitação. Em uma modalidade específica, o antibiótico é ampicilina. O cultivo pode ser realizado a diferentes temperaturas durante diferentes períodos de tempo. Em uma modalidade específica, o cultivo pode ser feito por cerca de 4 a cerca de 16 horas, a uma temperatura de cerca de 16ºC a cerca de 37ºC. Em uma concretização preferida, o cultivo é feito a 37ºC por 16 horas, sob agitação.

[00151] A produção da proteína pode ser realizada com qualquer técnica conhecida no estado da técnica. Em uma concretização, a indução da expressão dos polinucleotídeos da invenção é feita por meio de adição de IPTG ao meio de cultura.

[00152] O isolamento da proteína referida na etapa (d) pode ser realizado com qualquer técnica conhecida no estado da técnica. Em uma concretização, a purificação é feita por técnicas de cromatografia. Em uma modalidade específica, a purificação é realizada por cromatografia de afinidade. Exemplos não limitativos incluem o método de afinidade à resina de níquel, troca iônica, outros métodos por afinidade ou adsorção, par iônico, fase reversa e exclusão molecular.

[00153] Em um sétimo aspecto, a invenção provê um método para detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) em uma amostra biológica, que compreende as etapas de:

• (a) expor um agente de detecção primário a uma ou mais proteínas recombinantes como definidas acima;
• (b) acoplar o dito agente de detecção primário a beads magnéticas;
• (c) contatar o dito agente de detecção primário acoplado a beads magnéticas a um agente de detecção secundário ligado a um marcador;
• (d) detectar os isolados de ETEC pela ligação específica do dito agente de detecção secundário ao dito agente de detecção primário.

[00154] Em uma forma de concretização, a proteína recombinante é ligada, conjugada ou imobilizada sobre ou a um suporte sólido.

[00155] Assim, em uma concretização, no método da presente invenção, uma proteína recombinante é imobilizada a um suporte sólido e contatado com um agente de detecção primário, assim formando um complexo antígeno-agente de detecção primário. O suporte sólido é então contatado com uma solução compreendendo um agente de detecção secundário ligado a um marcador. Os agentes de detecção primário e secundário formam um complexo, e o anticorpo é qualitativa e/ou quantitativamente detectado.

[00156] O suporte sólido pode ser sensibilizado com os antígenos usando uma variedade de técnicas conhecidas pelo técnico no assunto, que são amplamente descritos na arte. No contexto da presente invenção, o termo “sensibilização”, utilizado intercambiavelmente com o termo “imobilização”, se refere tanto à associação não covalente, tal como a adsorção, como à ligação covalente (que pode ser via uma ligação direta entre o antígeno e grupos funcionais sobre o suporte, ou pode ser uma ligação por meio de um agente de reticulação). Para este fim, o antígeno é dissolvido em um tampão adequado, aqui chamado de “tampão de solubilização”, que apresenta pH alcalino variando tipicamente de 7,0 a 10,0, mais preferencialmente em cerca de 9,0 a 10,0. Um exemplo é o tampão carbonato/bicarbonato, mas o técnico no assunto pode facilmente determinar outros tampões, de acordo com os diferentes protocolos conhecidos na arte. O tempo de contato do antígeno com o suporte sólido varia com a temperatura, mas é tipicamente entre cerca de 1 hora a “overnight”, em temperatura variando de cerca de 2ºC a cerca de 5ºC.

[00157] Em uma outra concretização, na etapa de bloqueio da fase sólida, são usados agentes bloqueadores. A etapa de bloqueio bloqueia quaisquer sítios de ligação hidrofóbicos na fase sólida para evitar a ligação não específica de proteínas, portanto, reduzindo o sinal de fundo e/ou prevenindo resultados falso-positivos.

[00158] Exemplos de agentes bloqueadores incluem, mas não estão limitados a leite desnatado, caseína, BSA, ovoalbumina, gelatina, entre outros. O agente bloqueador é diluído em um tampão, por exemplo, tampão PBS, gerando a solução de bloqueio. Outros tampões da técnica podem ser utilizados. O pH da solução de bloqueio pode estar na faixa de 7,0 a 10,0, mais preferencialmente em torno de 7,0 a 9,0. O tempo de contato desta solução com o suporte sólido varia de cerca de 30 minutos a cerca de 6 horas, em temperatura variando de cerca de 25º C a cerca de 40º C, mais preferencialmente, cerca de 30º C a cerca de 40º C.

[00159] Entre as etapas acima mencionadas, o suporte sólido é lavado com tampão em pH neutro, variando tipicamente de 7,0 a 7,4, por exemplo, PBS, para evitar a ligação inespecífica e, assim, reduzir o sinal de fundo.

[00160] Em uma forma de concretização específica, o suporte sólido é uma placa de microtitulação.

[00161] Em uma forma de concretização preferencial, o agente de detecção primário é um anticorpo presente na amostra biológica.

[00162] A amostra biológica pode ser qualquer amostra obtida do corpo que pode conter um agente de detecção. Uma amostra biológica pode ser também modificada antes do uso, tal como por diluição, purificação em várias frações, centrifugação e semelhantes. Por exemplo, a amostra biológica contendo o agente de detecção primário pode ser usada na forma pura ou diluída em um tampão, como por exemplo, o tampão de bloqueio da etapa anterior.

[00163] Em uma forma de concretização, a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou fluido corporal.

[00164] “Anticorpo” deve ser entendido no seu significado amplo. Um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina que tem a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno em particular. Os anticorpos são bem conhecidos a um técnico no assunto. Um anticorpo inclui, mas não é limitado a, um anticorpo tradicional, um fragmento de um anticorpo tradicional contendo um sítio de ligação ao antígeno, um anticorpo recombinante contendo um sítio de ligação ao antígeno, uma proteína que se liga a um antígeno, e um produto compreendo uma ligação entre duas ou mais destes. Anticorpos podem ser derivados de diferentes espécies, e incluem, mas não estão limitados a cães, humanos, felinos, gambás, raposas, ratos, camundongos, aves, entre outros. Anticorpos comercialmente disponíveis a uma grande variedade de antígenos são conhecidos na arte.

[00165] Um anticorpo pode estar em sua forma pura, ou estar em uma mistura. Um anticorpo pode estar em uma forma modificada (por exemplo, modificada por químicos), ou pode estar em uma forma não modificada.

[00166] O termo “agente de detecção” refere-se a um agente usado para detectar um antígeno ou um anticorpo. Um agente de detecção pode ser tanto um antígeno quanto um anticorpo. Um agente de detecção pode ser tanto um antígeno ou um anticorpo marcado ou um antígeno ou um anticorpo não marcado. Métodos adequados de marcação podem ser usados na presente invenção e incluem, sem limitação, marcação com isótopos, modificação química, conjugação com enzima, marcação com corante fluorescente, luminescente e outros métodos de marcação comumente conhecidos pelo técnico no assunto. Portanto, um agente de detecção inclui, mas não está limitado a, uma molécula química, uma molécula de peptídeo, uma molécula de proteína, um molécula de RNA, uma molécula de DNA, um anticorpo mono ou policlonal, um fragmento de um anticorpo tradicional contendo um sítio de ligação a antígeno, um anticorpo recombinante contendo um sítio de ligação a antígeno, uma proteína que se liga a um antígeno, uma célula, uma partícula, e um produto compreendendo uma ligação entre duas ou mais do acima. Ainda outros agentes de detecção comumente utilizados é avidina ou estreptavidina, que podem se ligar a anticorpos ou polipeptídeo biotinilados.

[00167] Um agente de detecção pode estar na forma pura, ou pode estar em uma forma impura (por exemplo, contido em uma mistura com outros compostos ou materiais). Um agente de detecção pode estar em uma forma modificada ou não modificada. De acordo com a ordem de um agente de detecção usado em um método, um agente de detecção pode ser chamado de “agente de detecção primário”, “agente de detecção secundário”, “agente de detecção terciário” e assim por diante.

[00168] Para os fins da presente invenção, o agente de detecção primário é um anticorpo policlonal anti-EtpA.

[00169] O técnico no assunto irá saber como selecionar um agente de detecção secundário para o complexo antígeno-agente de detecção primário. Um agente de detecção secundário pode ser, mas não está limitado a uma molécula química, uma molécula de peptídeo, uma molécula de proteína, uma molécula de RNA, uma molécula de DNA, um anticorpo poli ou monoclonal, um fragmento de um anticorpo contendo um sítio de ligação a antígeno, um anticorpo recombinante contendo um sítio de ligação a antígeno.

[00170] O agente de detecção secundário é diluído em um tampão, como por exemplo, o tampão de bloqueio utilizado anteriormente. Tipicamente, o agente de detecção secundário permanece em contato com o suporte sólido por cerca de 30 minutos a cerca de 6 horas, em temperatura variando de cerca de 25º C a 40º C, mais preferencialmente, cerca de 30º C a cerca de 40º C.

[00171] Em uma forma de concretização adicional, o agente de detecção secundário é um anticorpo selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses.

[00172] Assim, na presente invenção, utilizam-se anticorpos comerciais de camundongos, por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-IgG mouse.

[00173] O método da presente invenção é útil para detecção de anticorpos específicos para o antígeno usando quaisquer métodos de detecção imunológica, incluindo, mas não limitado a, Western blots, Dot blots, ELISA, Imunocromatografia de fluxo lateral, imunofluorescência, citometria de fluxo. Vide, por exemplo, Harlow e Lane. 1988. Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para uma descrição de formatos de imunoensaios.

[00174] ELISA indireto é um método ELISA que pode ser usado para triagem e determinação de título de anticorpos durante o curso de sua produção. Para detectar um agente de detecção (por exemplo, um anticorpo) que reconheça um antígeno, o antígeno é revestido no suporte ou fase sólida, por exemplo, em poços das placas de microtitulação, e incubado com soluções de teste contendo agentes de detecção específicos. Os agentes de detecção não ligados são lavados. Depois, é necessária uma segunda incubação com uma solução contendo um agente de detecção secundário (por exemplo, fosfatase alcalina conjugada com proteína A, proteína G ou anticorpos que se ligam ao agente de detecção primário). Após a incubação, o agente de detecção secundário marcado não ligado é lavado. Uma incubação com um substrato de enzima repórter também pode ser necessária. Um sistema de detecção, tal como UV, fluorescência, quimioluminescência ou outros métodos, é usado para detectar o agente de detecção secundária ligado, que é proporcional à quantidade do agente de detecção a ser detectado na solução de teste.

[00175] Em uma forma de concretização, é realizado um método de ELISA indireto com os anticorpos policlonais produzidos na presente invenção.

[00176] O técnico no assunto sabe que há uma variedade de métodos de marcação para um agente de detecção. Os métodos de marcação incluem, mas não estão limitados a, uma enzima como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), beta-galactosidase ou outras enzimas. Um agente de detecção também pode ser marcado com isótopos radioativos de iodo ou outros isótopos. Um agente de detecção também pode ser marcado com um fluorocromo (um corante fluorescente) que pode ser detectado por um microscópio de fluorescência ou fluorômetro, escâner ou câmera. Alternativamente, um agente de detecção pode ser marcado por biotina, que pode se ligar à avidina ou estreptavidina.

[00177] Ainda em outra forma de concretização, o marcador é selecionado de uma enzima, um radioisótopo, um grupo fluorescente, um grupo luminescente, biotina, ou partículas de corante.

[00178] Como usado aqui, o termo “beads”, refere-se a microesferas ou nanopartículas, preferencialmente nanopartículas. Microesferas estão disponíveis a partir de uma variedade de fornecedores comerciais, tais como THERMO e BIOCLONE. Adequadamente, as microesferas têm entre 1 e 10 µm de diâmetro, especialmente adequadas são microesferas com diâmetros de 2 a 5 µm. Microesferas podem ser feitas de uma variedade de materiais incluindo, mas não limitados a, agarose, poliestireno e látex. Opcionalmente, as microesferas podem ser magnéticas, ou adequadamente paramagnéticas ou superparamagnéticas. As nanopartículas variam em tamanho de 1-300 nm de diâmetro, adequadamente de 50-150 nm de diâmetro. As nanopartículas podem ter um núcleo magnético que pode incluir vários metais. As nanopartículas também podem incluir um núcleo pigmentado ou um corante. As nanopartículas adequadas para utilização no método da presente invenção incluem, mas não estão limitadas àquelas comercialmente disponíveis da Bioclone.

[00179] No método da presente invenção, os anticorpos policlonais anti-EtpA são acoplados em beads magnéticas previamente ativadas para a captura e detecção de isolados de ETEC.

[00180] A ativação das beads, assim como o acoplamento de anticorpos às beads é realizado seguindo as instruções dos fabricantes ou de acordo com métodos conhecidos na arte. Na presente invenção, foi utilizada uma quantidade de 1 μg/μL dos anticorpos anti-EtpA por 20mg de beads. O conjugado bead-anticorpo foi armazenado a 4ºC em solução até o momento do uso.

[00181] Vários tipos de beads podem ser utilizadas para separar os contaminantes de um material de partida. O método de separação de células por beads magnéticas é fácil, rápido e sem centrifugações. Neste método, as beads podem ou não ser conjugadas com anticorpos específicos do modelo celular que ele precisa separar. Essa seleção pode ser negativa (remoção da célula que não é de interesse) ou seleção positiva (remoção da célula de interesse). Esse processo consiste de 3 etapas: 1 – Ligação da célula que será removida com a bead marcada com o anticorpo. 2 – Lavagem para remover as células que não são de interesse ou não aderiram as beads. 3 – Eluição, momento que é colocado o meio de cultura e as células são plaqueadas junto com as beads magnéticas. As beads se soltam das células aproximadamente 24 horas quando colocadas em cultura. Por exemplo, no caso da presente invenção, anticorpos anti-EtpA provenientes de soros de camundongos a serem investigados foram fundidas à superfície de nanopartículas magnéticas (denominadas de "beads") e tal híbrido foi submetido então a processos de captação (seleção).

[00182] O termo “sistema de detecção” refere-se a um sistema que pode ser usado para fornecer uma leitura compreendendo informação relacionada com a quantidade ou qualidade de uma proteína ou um agente em uma amostra. A escolha de um sistema de detecção depende da escolha do agente de detecção usado em um método da invenção. Por exemplo, um sistema de detecção inclui, mas não é limitado a, filme de raio-X, ou outro material sensível a radiação beta/gama se o agente de detecção for marcado com isótopo; uma câmera CCD ou inspeção visual ou outro dispositivo capaz de perceber o sinal se o agente de detecção for marcado com enzima e gerar uma reação química que pode resultar em sinal colorido ou quimioluminescente capaz de ser detectado; e se o agente de detecção for marcado com fluorescência, um microscópio, um escâner ou uma câmera de fluorescência pode ser usado. Estes sistemas de detecção incluem, mas não estão limitados a sistemas de detecção usando reações cromogênicas ou enzimas repórteres como peroxidase de rábano (HRP) e fosfatase alcalina (AP). As enzimas repórteres podem usar diferentes substratos para detecção cromogênica. Por exemplo, HRP pode usar OPD (ortofenilenediamina), 4CN (4-cloro-1-naftol), DAB/NiCl2 (3,3’-diaminobenzidina/NiCl2), ou TMB como substratos para a detecção cromogênica.

[00183] Ainda em outra forma de concretização adicional, a detecção é selecionada do grupo consistindo de detecção de fluorescência, de imunoluminescência, de absorbância ou de radioisótopos, preferencialmente fluorescência.

[00184] Na presente invenção, a ausência de sinal emitido pelo agente de detecção marcado é comparável a um controle negativo (por exemplo, bactérias sem marcação). Ao contrário, um sinal emitido pelo agente de detecção marcado é indicativo de material genético das bactérias ETEC.

[00185] Nos métodos da presente invenção, o técnico no assunto sabe das modificações a serem realizadas para melhorar a razão de sinal / sinal de fundo. Estas modificações incluem, mas não estão limitadas, a adicionar uma ou múltiplas etapas ao método descrito acima.

[00186] Em uma forma de concretização da invenção, o reconhecimento específico dos anticorpos anti-EtpA produzidos e acoplados às beads foram avaliados por citometria de fluxo.

[00187] A citometria de fluxo é uma técnica capaz de analisar simultaneamente diversos parâmetros de partículas microscópicas que se encontram em meio aquoso e em fluxo. Isso ajuda a desvendar a especificidade e a quantidade de células e partículas, possibilitando diagnósticos precisos.

[00188] Em um oitavo aspecto, a invenção provê um kit para detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) em uma amostra biológica, compreendendo uma ou mais proteínas recombinantes como definidas acima, um agente de detecção marcado, beads e instruções de uso.

[00189] Por exemplo, tais instruções podem incluir um ou mais componentes para realizar o método. Por exemplo, o kit pode compreender controle negativo e/ou positivo, agente de detecção secundário marcado e quaisquer outros reagentes necessários para a condução do método de diagnóstico aqui descrito.

[00190] Em um nono aspecto, a invenção provê o uso da proteína recombinante da invenção na manufatura de um kit para detecção de ETEC em uma amostra biológica, ou em um método para detecção de ETEC.

[00191] Os resultados do presente trabalho evidenciam que a sequência escolhida para a construção da proteína quimérica a partir das análises in silico, permitiu a produção de anticorpos policlonais que foram capazes de reconhecer a proteína EtpA nativa da bactéria ETEC de forma específica. Anticorpos policlonais foram produzidos com êxito em modelo murino a partir das imunizações com a proteína recombinante O mapeamento de epítopos demonstrou que os anticorpos produzidos neste modelo possuem uma reatividade específica para a região N-terminal da proteína recombinante.

[00192] Assim, o método de separação das bactérias ETEC realizado por beads magnéticas ligadas aos anticorpos anti-EtpA foi um método eficaz de separação desse patógeno. As análises por citometria de fluxo permitiram a caracterização dos anticorpos obtidos e demonstrou uma alta sensibilidade e especificidade do método de separação e detecção de bactérias ETEC por beads magnéticas ligadas aos anticorpos anti-EtpA.

[00193] A ferramenta aqui desenvolvida, procurou adequar-se dentro das principais exigências de um método de detecção que se aproxima do ideal, ou seja, a alta especificidade (detectando apenas a bactéria de interesse), a alta sensibilidade (capacidade de detectar as bactérias em baixas concentrações nas amostras), e o tempo de execução operacional relativamente rápido.

[00194] A presente invenção é descrita pelos exemplos não limitantes abaixo, que são meramente ilustrativas. Várias modificações e variações das concretizações são evidentes ao técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Desenho da sequência de EtpA e análises genéticas in silico

[00195] A sequência do gene correspondente à proteína EtpA foi adquirida na base de dados do genbank (número de registro: AAX13509.2 - ncbi.nih.org). O desenho da proteína recombinante foi realizado em estrutura de quimera e na sua extremidade foi inserida uma sequência de restrição para a enzima enterokinase e uma cauda de histidina (6XHis). Por meio de análises in silico foram escolhidas três regiões da proteína nativa que apresentaram maior imunogenicidade. O programa utilizado para prever as regiões imunogênicas foi o BepiPred 1.0 Server. Também foram realizadas as análises in silico de predição da acessibilidade à superfície proteica utilizando o programa NetSurfP (ver.1.1); predição da desordem proteica por meio do programa IUPRED.enzim.hu e a predição do peso molecular pelo programa Expasy-ProtParam. A estrutura da proteína EtpA nativa foi visualizada no programa I-TASSER que também corroborou para o desenho da quimera. Após as análises genéticas in silico, a sequência recombinante foi enviada para empresa IDT (Integrated DNA Technologies) para realizar a síntese química da sequência gênica.

Exemplo 2: Linhagens de micro-organismos utilizados

[00196] Escherichia coli TOP10™ (Invitrogen) genótipo: F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. Esta linhagem possibilitou que o DNA correspondente à EtpA, presente nos vetores de clonagem e expressão, fossem manipulados e multiplicados por meio da transformação e clonagem dessas bactérias.

[00197] Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS™ (Life Technologies) genótipo: F-ompT hsdSB (rB-, mB) galdcmrne131 (DE3) pLysS (CamR). Esta linhagem foi utilizada para expressão da proteína recombinante EtpA.

[00198] Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC). As linhagens de ETEC que foram utilizadas no desenvolvimento da pesquisa, pertencem ao banco de amostras do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD-FIOCRUZ).

Exemplo 3: Meios de cultivo para bactérias

[00199] Meio LB (Luria-Bertani) Ágar: peptona bacteriológica 10g; extrato de levedura 5g; NaCl 10g; Agar bacteriológico 10,5g; H2O destilada q.s.p. 1L, pH 7.5 ajustado com NaOH). Este meio de cultivo foi utilizado para o crescimento das colônias bacterianas após os eventos de clonagem e subclonagem.

[00200] Meio LB (Luria-Bertani) Líquido: peptona bacteriológica 10g; extrato de levedura 5g; NaCl 10g; H2O destilada q.s.p. 1L, pH 7.5 (ajustado com NaOH). Este meio de cultivo foi utilizado para crescimento das linhagens de E. coli e também para a expressão da proteína recombinante.

[00201] Meio SOC líquido. Composição do meio: Bacto-triptona 2,0 %; extrato de levedura 0,5 %; NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM; estoque de magnésio 1 mL; estoque de glicose 1 mL. Este meio foi utilizado na transformação bacteriana por eletroporação para recuperação das células após o pulso elétrico.

Exemplo 4: Estratégias de Clonagem

[00202] Após a síntese química da sequência gênica EtpA (SEQ ID NO: 1) foi realizada a inserção de dATP (2'-deoxiadenosina 5'-trifosfato) nas extremidades do gene seguindo a metodologia proposta pelo manual CloningQuick Instructions (Empresa IDT). Essa inserção foi necessária para a realização da clonagem do gene no vetor pGEM®-T Easy (Promega) (Figura 4). O vetor pGEM®-T Easy apresenta um tamanho de 3015 pares de bases, gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina, origem de replicação funcional em E. coli, um gene lacZα (e seu promotor) para a enzima βgalactosidase, e uma região do fago f1.

[00203] O fragmento gênico correspondente à proteína EtpA foi clonada no vetor pGEM®-T Easy com a utilização da enzima T4 DNA ligase e seu tampão (2X). A ligação ocorreu por meio do pareamento das adeninas 3’ terminais do gene com as timinas 5’ terminais do vetor linearizado. A relação vetor/inserto utilizado na clonagem foi de 1:3 respectivamente, e a reação ocorreu em um volume final de 20μL. Após a clonagem, o sistema de ligação foi precipitado com 1/10 V de acetato de amônia 7,5M e 2,5 V de etanol 100% gelado.

[00204] Em seguida, foi realizada a transformação do sistema de ligação em células de E. coli TOP 10 (Invitrogen). Foi adicionado 1,5 μL do sistema de ligação precipitado em 50 μL de células eletrocompetentes. As células foram submetidas a pulso elétrico de 1,8kV (200 Ω) em eletroporador (Mod. Eletroporator 2510 Eppendorf) com o objetivo de permitir a entrada do vetor recombinante na bactéria. Posteriormente as células foram inoculadas em 1 mL de meio SOC e o conteúdo foi transferido para um microtubo de 1,5 mL. Esse microtubo foi incubado a 37º sob agitação (150 rpm) por 1 hora. Em seguida a suspensão bacteriana foi semeada nos volumes de 50, 100 e 150 μL em 3 placas contendo meio LB sólido e 200 μg/mL de ampicilina. As placas por sua vez, foram incubadas a 37ºC durante 18 horas. Devido à presença do antibiótico ampicilina, foi possível fazer a seleção das bactérias transformadas.

Exemplo 5: Confirmação da construção do vetor de clonagem por PCR e análise de restrição

[00205] Após o crescimento dos transformantes, foram coletadas 10 colônias aleatoriamente. Em seguida, estas colônias foram inoculadas em meio LB líquido contendo 100 μg/mL de ampicilina para a extração do DNA plasmidial recombinante. Após 16 horas de crescimento, foi realizado a Miniprep utilizando o kit: ”QIAprep Spin Miniprep Kit” de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN). Em seguida a etapa de extração do DNA plasmidial, foi realizada uma corrida eletroforética em gel de agarose 0,8% em tampão TBE 1X (40mM Tris, 40 mM acido bórico e 0,5M EDTA) para a confirmação do produto de extração.

[00206] A confirmação da construção do vetor de clonagem foi feita por PCR e análise de restrição. O gene EtpA foi amplificado por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase, utilizando-se a enzima Taq DNA Polimerase (InvitrogenTM) e os iniciadores R-EtpA e F-EtpA previamente sintetizados (Tabela 1). Foram inseridos nas extremidades dos oligonucleotídeos R-EtpA (SEQ ID NO: 2) e F-EtpA (SEQ ID NO: 3) as sequencias de corte correspondentes às enzimas de restrição EcoRI e BamHI respectivamente, para realizar posteriormente a clonagem direcional do gene ao vetor de expressão.

[00207] A reação de amplificação foi elaborada em um volume total de 25 μl em termociclador Mastercycler® personal (Eppendorf). Foram utilizados aproximadamente 20 ng de DNA, 1 U (unidade) de Taq DNA polimerase (InvitrogenTM), tampão da enzima Taq 1X; 0,25 mM de uma mistura de dNTPs (2’-desoxinucleotídeos 5’-trifosfatos), 1 mM de MgCl2, 5 pmol de cada iniciador e água deionizada esterilizada que completasse o volume de 25 μL. O programa utilizado para amplificação consistiu de um ciclo de desnaturação inicial a 94ºC/5 minutos; seguidos de 35 ciclos (ciclo = 94ºC/1 minuto; 60ºC/40 segundos; 72ºC/1,5 minutos); e um ciclo de extensão final a 72ºC/5 minutos. O amplicon foi visualizado por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultravioleta em equipamento de fotodocumentação.

[00208] A correta construção do vetor de clonagem também foi confirmada por uma digestão analítica utilizando as endonucleases de restrição BamHI e EcoRI conforme descrito na tabela 2. A confirmação da liberação da sequencia codificante de EtpA foi visualizada por eletroforese em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídio (0,5μg/ml) e visualizado em luz ultravioleta.
Tabela 2. Sistema utilizado para digerir o vetor pGEM-T Easy com as enzimas BamHI e EcoRI.

Exemplo 7: Construção do vetor de expressão pRSET – EtpA

[00209] O vetor utilizado para expressar a proteína EtpA na bactéria Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS™, foi o vetor de expressão pRSET-A (Invitrogen™) (Figura 5). Este vetor possui um tamanho de 2.9 kb, gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina, uma região de origem de replicação para vetores tipo pUC, uma região do fago f1 e o forte promotor T7 que regula a expressão do gene heterólogo.

[00210] A construção do vetor de expressão se iniciou com a retirada do inserto EtpA do vetor de clonagem pGEM-T Easy e finalizou com ligação do mesmo ao vetor de expressão pRSET-A. A primeira etapa da construção foi feita por uma dupla digestão enzimática em ambos os vetores com as mesmas endonucleases de restrição. Os vetores pGEM-T Easy e pRSET-A foram digeridos com as enzimas BamHI e EcoRI (New England Biolabs). O sistema de digestão foi incubado em estufa a 37 ºC durante 2 horas, sendo utilizado 1 U/μg de cada enzima e aproximadamente 100ng de DNA. Em seguida procedeu-se uma análise qualitativa dos produtos das digestões por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio (0,5 μg/mL) e visualizado sob luz ultravioleta (UV). A segunda etapa consistiu do processo de purificação em gel de agarose dos insertos liberados e do vetor de expressão pRSET-A. O procedimento de purificação foi realizado utilizando o kit comercial “QIAquick Gel Extraction Kit Protocol” seguindo as recomendações do fabricante (QIAGEN). Este processo foi necessário para a realização da subclonagem dos genes no vetor de expressão pRSET-A.

Exemplo 8: Subclonagem do gene EtpA no vetor de expressão pRSET-A

[00211] A subclonagem ocorreu por meio da ligação do gene purificado EtpA ao vetor de expressão pRSET-A linear. Foram utilizados os seguintes reagentes nas determinadas concentrações: enzima T4 DNA ligase (400 U/uL), tampão da enzima (10X); vetor pRSET linearizado (500 ng/uL); inserto EtpA (150 ng/uL) e água deionizada estéril. O sistema de ligação foi elaborado em um volume final de 20 uL. A reação foi incubada por 18 horas a 16 ºC obedecendo às especificações do fabricante da enzima T4 DNA ligase (New England Biolabs). Após a reação de ligação, foi realizado o processo de precipitação do sistema com 1/10 V de acetato de amônio 7,5M e 2,5 V de etanol 100% gelado. A mistura foi incubada por 4 horas e após procedeu-se a centrifugação a 12.000 rpm por 15 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com 1 mL de etanol 70% gelado. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi seco em temperatura ambiente. O pellet seco foi dissolvido em 10 μL de água deionizada estéril e estocado a 4 ºC.

Exemplo 9: Confirmação da construção do vetor de expressão pRSET – EtpA

[00212] Depois do evento de subclonagem, foi realizada a transformação do plasmídio recombinante (cassete de expressão) em células de E. coli TOP 10 (Invitrogen). Os eventos de transformação bacteriana seguiram a mesma metodologia supracitada para o vetor de clonagem. Após a transformação, foi selecionado aleatoriamente das placas oito colônias para a realização da extração do DNA plasmidial. Estas colônias foram inoculadas em meio LB líquido contendo 100 μg/mL de ampicilina. Após 16 horas de crescimento, as culturas foram centrifugadas e a extração do DNA plasmidial foi realizada com o kit: “QIAprep Spin Miniprep Kit” de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN). A construção do vetor de expressão foi confirmada por três metodologias diferentes que incluíram análise de restrição, PCR e sequenciamento.

[00213] Inicialmente o DNA plasmidial extraído foi digerido com as endonucleases BamHI e EcoRI. No sistema de digestão foi pré-estabelecido uma concentração de 1 Unidade/μL de cada enzima e aproximadamente 100 ng de DNA plasmidial. A reação foi incubada em estufa a 37 ºC por 2 horas. A análise do resultado foi visualizada por eletroforese em gel de agarose 1%, sob luz ultravioleta.

[00214] Na reação de PCR, os iniciadores R-EtpA e F-EtpA foram utilizados para amplificar o DNA plasmidial extraído das oito colônias. As reações foram elaboradas em um volume final de 25 μL e incubadas em termociclador Mastercycler® personal (Eppendorf). O programa para as amplificações constituiu-se de um ciclo de desnaturação inicial a 94ºC/5 minutos; seguido de 35 ciclos (94ºC/35 s, 60ºC/40 s, 72ºC/90 s); e um ciclo de extensão final a 72ºC/5 minutos. Para a análise da presença do produto da PCR correspondente ao gene de interesse, procedeu-se uma corrida eletroforética em gel de agarose 1%.

[00215] A terceira e última metodologia empregada para a confirmação da construção foi o sequenciamento do vetor pRSET-EtpA e também dos amplicons gerados pela PCR. O iniciador T7 sense foi usado para o sequenciamento do vetor e os iniciadores R-EtpA e F-EtpA foram usados para o sequenciamento dos amplicons. As reações foram elaboradas com o Kit Big Dye Terminator 3.1 (Life Technologies) e sequenciadas no equipamento ABI 3130 Genetic Analyzer 96 poços (Applied Biosystems). Os fragmentos obtidos no sequenciamento foram comparados com a sequência original do gene EtpA por meio do programa BLASTn (ncbi.nih.org).

Exemplo 10: Preparo de células eletrocompetentes de E. coli BL21 (DE3) pLysSTM

[00216] As bactérias Escherichia coli da linhagem BL21 (DE3) pLysSTM foram preparadas para se tornar eletrocompetentes e receber o cassete de expressão resultante da subclonagem. Uma colônia do estoque dessa linhagem de E. coli foi inoculada em um tubo de ensaio contendo 3 mL de meio LB líquido. Esse tubo foi incubado em agitador a 37ºC por 16 horas. Em seguida, o pré-inóculo foi transferido para um Erlenmeyer de 1L contendo 500 mL de meio LB líquido e 34 mg/mL do antibiótico cloranfenicol (as cepas de BL21 (DE3) pLysSTM apresentam resistência ao antibiótico cloranfenicol). Após a transferência, o inóculo foi levado ao agitador à temperatura de 37ºC até atingir 0,6 de transmitância (λ600) medido em espectrofotômetro. O frasco contendo a cultura com a D.O desejada foi resfriado em gelo por 1 hora e seu volume foi distribuído em tubos de 50 mL. O conteúdo de cada tubo foi centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos em uma temperatura de 4ºC. O sobrenadante resultante da centrifugação foi descartado e em seguida ressuspenso gentilmente com 10 mL de glicerol 10% gelado e estéril. As etapas de centrifugação e lavagens dos pellets foram repetidas seis vezes. Na última lavagem, o pellet foi ressuspenso em 1 mL de glicerol 10% gelado, aliquotado em volume de 50 μL, congelados imediatamente e estocados em freezer – 80ºC, tornando assim as células eletrocompetentes.

Exemplo 11: Transformação de E. coli BL21 (DE3) pLysSTM por eletroporação e expressão proteica

[00217] A transformação foi realizada com a adição de 1 μL do cassete de expressão recombinante em 50 μL de células eletrocompetentes. A cubeta de eletroporação e as células misturadas com o DNA recombinante foram previamente resfriadas em gelo e em seguida submetidas a um pulso elétrico de 1,9 kV (200 Ω) no Eletroporador 2510 (Eppendorf). Posteriormente as células foram inoculadas em 1 mL de meio SOC e o conteúdo foi transferido para um microtubo de 2,0 mL. O microtubo foi incubado a 37º sob agitação (150 rpm) por 1 hora para a recuperação das células recém transformadas. Os volumes de 100 e 150 μL das células foram semeados em duas placas contendo meio LB sólido com 200 μg/mL de ampicilina e 34 mg/mL de cloranfenicol. As placas por sua vez, foram incubadas a 37ºC durante 16 horas.

[00218] A expressão proteica foi realizada com cinco colônias de E. coli BL21 (DE3) pLysS™ que cresceram após o evento de transformação com o cassete de expressão. Estas colônias foram escolhidas aleatoriamente das placas e pré-inoculadas separadamente em tubos de ensaio contendo 3 mL de meio LB líquido com 100 μg/mL de ampicilina e 34 mg/mL de cloranfenicol. Os tubos foram incubados em agitador a 37ºC durante 16 horas. Em seguida, houve a transferência dos pré-inóculos para um frasco Erlenmeyer de 2 L contendo 1L de meio LB líquido e os antibióticos ampicilina (100 μg/mL) e cloranfenicol (34 mg/mL). Após a transferência, o inóculo foi levado novamente ao agitador na mesma temperatura até atingir uma transmitância de λ600 de 0,6 medido em espectrofotômetro. Nesse momento, foi acrescido na cultura bacteriana 1 mM de IPTG (isopropyl-betaD-thiogalactopyranoside). Esse reagente é um análogo sintético de lactose altamente estável. Sua função é inativar o repressor lac e induzir a síntese de beta-galactosidase, uma enzima que promove a utilização de lactose. O IPTG é utilizado para induzir a expressão de genes clonados em vetores que possui o controle do operon lac, como por exemplo, o vetor pRSET-A. A indução da expressão com IPTG foi mantida por 4 horas e depois a cultura foi centrifugada à 4000 rpm por 15 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o pellet bacteriano formado foi armazenado em freezer – 20 ºC para o posterior processo de sonicação.

Exemplo 12: Purificação da proteína recombinante EtpA

[00219] Para proceder a purificação da proteína recombinante, inicialmente o pellet das bactérias induzidas foi lisado por sonicação. A sonicação foi realizada com a adição de 2,5 mL do tampão MCAC-O (20 mM de Tris pH = 7,9; 0,5 M de NaCl; 10% de glicerol e 1 mM de PMSF) nos tubos de 50 mL que continham os pellets bacterianos. Em seguida, o conteúdo sonicado foi centrifugado a 12.000 rpm a 4 ºC e o sobrenadante nativo formado foi utilizado para a purificação da proteína recombinante.

[00220] A proteína recombinante foi purificada em coluna Ni-NTAAgarose de 5 mL de acordo com as recomendações do fabricante (QIAGEN). Essa coluna é uma matriz de cromatografia de afinidade para a purificação de proteínas recombinantes que possuem uma cauda de histidina. A coluna de purificação é constituída de níquel ligado ao ácido nitrilotriacético, associada a uma matriz de agarose a 6% que tem afinidade à histidina. A eluição da proteína EtpA foi realizada por diferença de concentração de imidazol adicionado na coluna Ni-NTA-Agarose de acordo com o fabricante (QIAGEN). Após a eluição, foi feita a confirmação da purificação em gel SDS-PAGE e western blot.

Exemplo 13: Análise da proteína recombinante em gel SDS-PAGE e Imunoblot

[00221] A análise do resultado da expressão e da purificação da proteína recombinante EtpA foi feita por meio de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) conforme descrito por Sambrook e colaboradores (1989) e por Western blot seguindo o protocolo de imunodetecção cromogênica Western Breeze (QIAGEN).

[00222] Foram preparados quatro géis de poliacrilamida para a corrida eletroforética. A eletroforese foi realizada em tampão de corrida Tris-glicina 1X pH 8,3 por 2 horas em voltagem de 110V. Foi utilizado como marcador de massa molecular o marcador PageRulerTM Unstained-Protein ladder (Fermentas Life Sciences). As amostras que apresentavam a proteína recombinante foram ressuspensas em tampão de amostra de eletroforese 1X (200 mM Tris-Hcl pH 6,8; 0,1% azul de bromofenol p/v; 4% SDS v/v; βmercaptoetanol 4%; 20% glicerol v/v), incubadas a 95 ºC por 5,0 minutos e aplicadas nos geis. Após a corrida, três géis foram corados por 18 horas com a solução de Azul Brilhante de Coomassie G250 para a detecção da expressão e da purificação proteica. Em seguida, os géis foram descorados com solução descorante (100mL ácido acético; 450 mL de água; 450 mL de etanol 100%) para as análises e fotografia.

[00223] O outro gel foi sobmetido à técnica de Western blot revelado com um anticorpo monoclonal anti-histidina seguindo as instruções do fabricante (QIAGEN). A última etapa consistiu da fotografia do gel para as análises dos resultados.

Exemplo 14: Excisão da cauda de histidina

[00224] Antes de proceder as imunizações dos camundongos com a proteína recombinante EtpA, foi necessário retirar a cauda de histidina presente na proteína expressa. Esse experimento foi realizado para excluir a possibilidade de geração de resposta imune contra a cauda após as imunizações. Para a produção de anticorpos específicos apenas contra a proteína EtpA recombinante, esta etapa exclui possíveis reações cruzadas no reconhecimento de E. coli. A excisão foi feita pela ação da enzima enterokinase (NEB).

[00225] A proteína purificada (5 mL) foi concentrada na coluna Centriprep Centrifugal Filter devices YM-3 (Millipore) por 50 minutos a 3.000 g. Após a centrifugação, o volume recuperado foi ressuspenso no tampão da enzima enterokinase (20 mM de Tris-HCl pH = 8,0; 50 mM NaCl; 2 mM de CaCl2) e então foi adicionado a enzima. O sistema de digestão da cauda foi incubado por 20 horas a 23 ºC. Em seguida, a amostra foi adicionada à resina de níquel por 10 minutos. A cauda excisada foi ligada ao níquel e o sobrenadante contendo apenas a proteína EtpA purificada foi eluída. Também foi retirada a enzima enterokinase do sistema por meio da resina Tripsin Inibidor Agarose de acordo com as instruções do fabricante (SIGMA-ALDRICH). A confirmação da excisão da cauda de histidina foi feita em gel SDS-PAGE.

Exemplo 15: Imunização dos camundongos contra a proteína EtpA recombinante

[00226] Foram utilizados para a produção dos anticorpos anti-EtpA, dez camundongos da linhagem Balb/C. A solicitação de autorização para uso de animais em experimentação, foi submetida ao CEUA/INPA de acordo com a Lei Arouca 11.794/2008. O parecer consubstanciado sobre o protocolo da presente pesquisa foi aprovado sob o número 019/2014.

[00227] Cinco camundongos dessa linhagem foram utilizados para o primeiro teste de imunização. Os animais foram capturados e imobilizados por um curto período de tempo. Em seguida, foram contidos pela parte posterior da cabeça e seguros na palma da mão. Quatro animais foram imunizados com a proteína recombinante purificada EtpA e um animal serviu de controle sendo imunizado apenas com adjuvante de Freund completo. Após as imunizações, os camundongos foram anestesiados via intraperitoneal com 90 mg.Kg-1 de Quetamina (Dopalen, Vetbrands) em associação com 16 mg.Kg-1 de Xilazina (Anasedan, Vetbrands) para a coleta do sangue por meio de venopunção da veia caudal. Todas as imunizações foram realizadas na região intraperitoneal. Foram imunizados 50μg da proteína recombinante purificada EtpA somadas (volume/volume) com o adjuvante de Freund completo. Quinze dias depois, os camundongos foram novamente imunizados (reforço) com a proteína recombinante e com adjuvante de Freund incompleto (volume/volume). No total foram realizadas três imunizações com um intervalo de 15 dias cada, totalizando 45 dias. Ao final dos 45 dias, os animais foram anestesiados e submetidos à eutanásia para a coleta do sangue total. Os soros obtidos foram analisados pelo método de ELISA que será descrito no próximo tópico.

[00228] Após a confirmação da produção dos anticorpos policlonais, foi realizado uma segunda etapa de imunização com os outros 5 animais restantes. O desenho experimental seguiu a mesma metodologia supracitada, afim de se obter maiores concentrações de anticorpos anti-EtpA.

Exemplo 16: Confirmação da produção de anti-EtpA por ELISA “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assays”

[00229] Os soros obtidos após a coleta foram utilizados nos testes de reatividade. O teste de ELISA foi realizado para avaliar a resposta dos camundongos contra a proteína recombinante imunizada. Esse teste detecta a ligação de um antígeno ao seu anticorpo específico. Quando os anticorpos reconhecem o antígeno, ocorre uma ligação específica e forma o complexo antígeno-anticorpo. A fase subsequente é a detecção do anticorpo primário por um anticorpo secundário acoplado a uma enzima. Um substrato cromogênico para a enzima produz uma mudança de cor visível, o que indica a presença do antígeno (GAN e PATEL, 2013).

[00230] O antígeno EtpA recombinante e purificado em fase fluida foi sensibilizado na placa de microtitulação de 96 poços durante 18 horas e incubada a 37 ºC. Em seguida, foi realizado o bloqueio da placa com BSA 3% e PBS 1X por duas horas. Após o bloqueio foi feita lavagens da placa com PBS 1X. A próxima etapa foi a adição dos soros dos animais imunizados que possuíam os anticorpos policlonais produzidos. Nessa fase, a placa foi incubada por uma hora a 37 ºC. Em seguida, a placa foi novamente lavada com PBS 1X e então foi adicionado o anticorpo secundário biotinilado anticamundongo (KPL) diluído 1/5000. Após uma hora de incubação e lavagens, houve a adição de Streptavidina peroxidase (1/5000). A última etapa consistiu da revelação com a solução cromogênica TMB 0,1 mg/mL e peróxido de hidogênio (H2O2 0,04%) diluído em tampão fosfato-citrato. A leitura colorimétrica após a revelação foi feita em 450 ƞm em leitor de ELISA (BIORAD).

Exemplo 17: Purificação e quantificação dos anticorpos anti-EtpA obtidos após as imunizações em Balb/C

[00231] A purificação dos soros dos camundongos imunizados foi feita em coluna de proteína A - high salt. Foi misturado 1/10 do volume da solução de NaCl 3.3 mM e 1 M de borato de sódio pH 8,9 aos soros. Em seguida, os soros foram adicionados na coluna de proteína A - high salt. A próxima etapa consistiu da lavagem da coluna com a solução 3 M de NaCl e 50 mM de Borato de Sódio pH 8,9. Foi feita dez lavagens seguidas da coluna com a adição de 1 mL por vez da solução supracitada. A coluna foi novamente lavada por dez vezes, porém, com a diminuição da concentração do Borato de sódio para 10 mM. Os anticorpos foram eluídos da coluna pela passagem do tampão Tris-glicina 0,1 M pH 3,0 e então foram estocados a temperatura de – 20 ºC.

[00232] A quantificação dos anticorpos purificados seguiu o método de Bradford. Para realizar a quantificação, fez-se necessário a construção de uma curva padrão de BSA. A construção da curva foi realizada pelas variações de concentração de BSA 1% variando de 0 a 32. As leituras das absorbâncias em espectrofotômetro foram feitas em filtro de 595 ƞm. As diferentes concentrações de BSA gerou uma equação da reta que foi utilizada para fazer a quantificação dos anticorpos.

Exemplo 18: Dot Blot com peptídeos sintéticos da proteína recombinante EtpA

[00233] Foram sintetizados pela empresa Peptidase 2.0 dez peptídeos baseados na sequência da proteína quimérica EtpA conforme a Tabela 3.
Tabela 3. Sequências dos peptídeos sintéticos baseado na proteína recombinante EtpA.

[00234] Esses peptídeos foram utilizados para o determinar quais regiões da proteína recombinante foram imunogênicas. O mapeamento dos epítopos foi realizado pela técnica de Dot Blot utilizando os peptídeos sintetizados contra um pool de soros dos animais imunizados com a proteína recombinante EtpA.

[00235] A membrana de nitrocelulose (MN) foi recortada e disposta num aparelho de blot (Minifoldtm SRC-96) de 96 poços onde adicionou-se, em cada poço, 50 μL de uma solução de PBS 1X. As membranas contendo os peptídeos sintéticos foram lavadas três vezes com tampão PBS 1X pH 7.4 e então saturadas em solução contendo 1 mL de tampão de bloqueio (coating buffer, Sigma) e 0,5 g de sacarose, em 20 mL de tampão PBS-Tween 0,1%, overnight. Em seguida, a membrana foi lavada com o tampão PBS-Tween 0,1% e incubada com o pool de soros dos camundongos, diluído na mesma solução bloqueio, durante 1h e 30 min sob agitação constante. Após a incubação, a membrana foi lavada com PBS-Tween 0,01% por 10 min. A revelação foi realizada com o anticorpo secundário ligado à fosfatase alcalina.

Exemplo 19: Imunofenotipagem de bactérias por citometria de fluxo 19.1 Teste de padronização dos anticorpos anti-EtpA para reconhecimento de bactérias ETEC

[00236] Para a detecção da proteína EtpA encontrada nos flagelos das bactérias ETEC nativa foi utilizado os anticorpos anti-EtpA purificados (concentração de 1μg/μL). O reconhecimento específico dos anticorpos antiEtpA contra a proteína alvo de ETEC foi avaliado por citometria de fluxo, a fim de se obter valores numéricos precisos desse reconhecimento por meio da análise de fluorescência de anticorpos anti-IgG mouse (2°) conjugados ao fluorocromo Alexa flúor 488 na concentração de 1μL/200 μL de PBS-Wash 1X.

[00237] Os experimentos foram realizados por citometria de fluxo no equipamento BD FACSCanto™ II (BD). Inicialmente duas amostras clínicas de ETEC padrão mais um controle negativo para EtpA (EPEC) pertencentes ao banco de amostras da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz Amazônia) foram utilizadas no teste. As amostras foram crescidas em meio LB líquido a 37 ºC por 16 horas e após foram centrifugadas a 14.000 rpm em temperatura ambiente. O pellet formado foi lavado três vezes com PBS-Wash filtrado (PBS 1X; 5% de Albumina; 1% de Azida pH 7,2) e ressuspensos com 300 μL da mesma solução. Foram adicionados aos pellets os anticorpos policlonais purificados (diluído 1/50 em PBS-Wash) e posteriormente as amostras foram incubadas por 45 minutos em temperatura ambiente. Após o período de incubação, as amostras foram lavadas três vezes por centrifugação (5000 rpm) com PBS-Wash. A etapa seguinte foi da adição do anticorpo secundário AntiIgG Mouse (Alexa Fluor 488) diluído 1/200 em PBS-Wash. Após a adição do anticorpo secundário as amostras foram incubadas por 45 minutos, lavadas novamente com PBS-Wash por três vezes por centrifugação e lidas no citometro de fluxo BD FACSCanto™ II (BD). O experimento supracitado foi realizado três vezes, a fim de analisar a reprodutibilidade e gerar confiabilidade nos resultados obtidos.

19.2 Padronização do experimento de especificidade dos anticorpos anti-EtpA contra isolados de E. coli diarreiogênicas

[00238] Após a padronização dos títulos dos anticorpos primários e secundários, foi avaliado por citometria de fluxo a especificidade do anticorpo anti-EtpA contra as cepas de ETEC. Deste modo, os anticorpos anti-EtpA produzidos foram analisados contra diferentes cepas de E. coli diarreiogênicas.

[00239] Inicialmente as amostras de E. coli diarreiogênicas EHEC; EAEC; EIEC; EPEC; DAEC e ETEC pertencentes ao banco de amostras da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz Amazônia) foram crescidas separadamente em tubos de ensaio contendo meio LB líquido. Após o crescimento das cepas (37 ºC por 16 horas), as bactérias foram centrifugadas a 14.000 rpm em temperatura ambiente. Os pellets formados foram lavados três vezes com PBS-Wash filtrado (PBS 1X; 5% de Albumina; 1% de Azida pH 7,2) e ressuspensos com 300 μL da mesma solução. Foram adicionados aos pellets os anticorpos policlonais purificados anti-EtpA (diluído 1/50 em PBS-Wash) e posteriormente as amostras foram incubadas por 60 minutos em temperatura ambiente. Após o período de incubação, as amostras foram novamente lavadas por três vezes por centrifugação (5000 rpm) com PBS-Wash. Em seguida foram adicionados aos tubos o anticorpo secundário Anti-IgG Mouse (Alexa Fluor 488) diluído 1/200. Em seguida as amostras foram incubadas por 45 minutos, lavadas novamente com PBS-Wash por três vezes por centrifugação e levadas ao citometro de fluxo BD FACSCanto™ II (BD) para as leituras e análises.

[00240] O experimento supracitado também foi repetido três vezes, a fim de analisar a reprodutibilidade e gerar confiabilidade nos resultados obtidos.

19.3 Avaliação da detecção da proteína EtpA entre diferentes isolados de ETEC por citometria de fluxo

[00241] Com o objetivo de avaliar o grau de reconhecimento dos anticorpos anti-EtpA entre diferentes isolados de ETEC, foram contabilizados por citometria de fluxo as porcentagens de reconhecimento da proteína EtpA entre 11 isolados diferentes de ETEC. Esses isolados foram escolhidos aleatoriamente do banco de amostras clínicas de E. coli da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz Amazônia). A busca pelas bactérias classificadas como ETEC foram feitas por PCR utilizando um par de iniciadores dirigidos contra a região conservada de EtpA.

[00242] O gene EtpA foi amplificado por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase, utilizando-se a enzima Taq DNA Polimerase (InvitrogenTM) e os primers previamente sintetizados (R-EtpA 5`- TCTAGAGAATTCTTATGCTGATCCTGCAGCA - 3` e F-EtpA 5` - GGATCCGATGATGACGATAAG - 3`).

[00243] A reação de amplificação foi elaborada em um volume total de 25 μl em termociclador Mastercycler® personal (Eppendorf). Foram utilizados aproximadamente 20 ng de DNA de cada amostra, 1 U (unidade) de Taq DNA polimerase (InvitrogenTM), tampão da enzima Taq 1X; 0,25 mM de uma mistura de dNTPs (2’-desoxinucleotídeos 5’-trifosfatos), 1 mM de MgCl2, 5 pmol de cada iniciador e água deionizada esterilizada que completasse o volume de 25 μL. O programa utilizado para amplificação consistiu de um ciclo de desnaturação inicial a 94ºC/5 minutos; seguidos de 35 ciclos (ciclo = 94ºC/1 minuto; 60ºC/40 segundos; 72ºC/1,5 minutos); e um ciclo de extensão final a 72ºC/5 minutos. O amplicon foi visualizado por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultravioleta em equipamento de fotodocumentação.

[00244] Os diferentes isolados confirmados como ETEC foram crescidos em meio LB a 37˚C por 16 horas e após foi realizado o experimento de imunofenotipagem conforme descrito aqui.

Exemplo 20: Acoplamento dos anticorpos anti-EtpA às nanopartículas magnéticas (Beads)

[00245] As nanopartículas magnéticas foram inicialmente ativadas para o acoplamento dos anticorpos produzidos. Foram pesado 20 mg de beads e após foi adicionado 1 mL de água ultrapura. Em seguida a mistura foi agitada por vórtex e submetido à base magnética para a decantação das beads. O sobrenadante foi retirado e então foi adicionado o tampão de acoplamento (10 mM potássio fosfato + 0,15 M NaCl pH 5,5). Após a adição do tampão, a solução foi agitada no vórtex. Em seguida, a solução foi incubada por 3 minutos em temperatura ambiente sem agitação, e o sobrenadante foi retirado após o processo de decantação. Esse procedimento foi repetido 2 vezes.

[00246] O acoplamento dos anticorpos às beads foi realizado após a retirada do sobrenadante. Foi adicionado 1μg/μL dos anticorpos anti-EtpA purificados e sem a cauda de histidina na solução de beads previamente ativadas. Após a adição dos anticorpos a solução foi homogeneizada por agitação em vórtex durante 3 minutos. Foi adicionado à solução um volume de 400 μL de EDAC [Cloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropril) carbodiimida] a 570 μg/mL. Em seguida a solução foi incubada durante 24 horas sob agitação lenta.

[00247] Após o tempo de incubação, a solução foi colocada na base magnética e o sobrenadante foi retirado e armazenado a 4 °C. As beads com os anticorpos anti-EtpA acoplados foram então lavadas 2 vezes com 1 mL do tampão de lavagem (10 Mm tris base + 0,15 M NaCl + 0,1% BSA + 1 mM EDTA+ 0,1% Azida - pH 7.5). Após as lavagens foi realizado o bloqueio da solução contendo os anticorpos adicionados às beads. A solução foi incubada por uma 1 hora em 500 μL de tampão de bloqueio (1 M de glicina pH 8.0). Após o período de bloqueio, a solução foi novamente lavada por 2 vezes com tampão de lavagem e após foi ressuspensa com o tampão de acoplamento. Após esses procedimentos, às beads acopladas foram armazenadas a 4 °C.

Exemplo 21: Ensaios de separação imunomagnético por beads associadas ao anticorpo Anti-EtpA 21.1 Padronização da marcação do material genético das bactérias ETEC com o corante Brometo de Etídeo para detecção em citometria de fluxo.

[00248] Para avaliar a detecção das bactérias ETEC utilizando beads magnéticas associadas ao anticorpo anti-EtpA, foi realizado um ensaio de padronização com o corante Brometo de Etidio – EtBr (FL3- Percp) para marcar o material genético das bactérias. Inicialmente as bactérias cresceram por 16 horam em meio LB líquido e após foram centrifugadas a 14.000 rpm por 3 minutos. Os pellets formados foram resuspensos em 50 μL de brometo diluído (8 μL de Brometo em 5 mL de PBS 1X). Em seguida, a solução foi incubada por 30 minutos no escuro. Após o período de incubação, os pellets foram lavados duas vezes por centrifugação utilizando PBS 1X para retirar o excesso de brometo. A marcação das bactérias foi analisada por meio do deslocamento da fluorescência no citometro de fluxo.

[00249] Depois dos ensaios de padronização das concentrações do corante brometo de etídeo, anti-EtpA e anti-IgG Mouse Alexa flúor 488, foi realizado o teste de captura com beads magnéticas com dois isolados diferentes de ETEC confirmados anteriormente por PCR e citometria.

21.2 Detecção de bactérias ETEC por beads magnéticas associadas ao anticorpo anti-EtpA

[00250] As amostras clínicas de ETEC pertencentes ao banco de amostras do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD-FIOCRUZ) nomeadas como 144 e 178 foram utilizadas nos ensaios para a detecção por beads. As culturas puras de bactérias foram cultivadas em caldo nutriente a 37 °C durante 16 horas antes da sua utilização. Após o crescimento, as cepas foram marcadas com o corante brometo de etídeo conforme descrito no ítem anterior. Em seguida, as bactérias marcadas foram ressuspensas em 450 μL de PBS 1X e então foi adicionado 2 μL das beads magnéticas associadas ao anticorpo anti-EtpA. Após a adição das beads, a solução foi incubada em agitação lenta por 1 hora. Em seguida, as amostras foram lavadas com PBS 1 X utilizando a rack magnética. Primeiro adicionou-se 1 mL de PBS 1X na solução que continha as beads mais bactérias marcadas com FL3- Percp; após o tubo foi condicionado na rack magnética e então as beads foram puxadas pela força magnética para a lateral do tubo, após o sobrenadante foi retirado. Esse procedimento de lavagem foi realizado 10 vezes com as amostras ETEC e também com os tubos identificados como controles da reação.

[00251] Após as lavagens o anticorpo secundário anti-IgG mouse conjugados ao fluorocromo Alexa flúor 488 na concentração de 1μL/200 μL foi adicionado nos tubos. As amostras foram incubadas durante 30 minutos e depois foi realizado novamente a etapa de 10 lavagens com PBS 1X utilizando a magna rack. Depois das últimas lavagens, as amostras foram ressuspensas em 200 μL de PBS e transferidas para tubos de ensaio para serem lidas no citometro de fluxo BD FACSCantoTM II (BD).

[00252] Os controles da reação foram divididos em 6 tubos denominados de C1: apenas beads magnéticas; C2: beads bloqueadas + anticorpos secundários; C3: beads + anticorpo primário (anti-EtpA) + anticorpo secundário; C4: Bactéria marcada com brometo; C5: somente a cepa bacteriana 144; C6: somente a cepa bacteriana 178. Esse experimento foi repetido por três vezes, a fim de analisar a reprodutibilidade e gerar confiabilidade nos resultados obtidos.

[00253] Também foi realizado o mesmo experimento supracitado para avaliar a especificidade de captura das beads acopladas com anti-EtpA contra diferentes isolados de E. coli diarreiogênicas (DAEC; EPEC; EIEC; EAEC e ETEC).

Exemplo 22: Análises de citometria e confecção dos gráficos

[00254] Os gráficos obtidos de todos os resultados submetidos ao citometro de fluxo foram analisados pela intensidade de fluorescência dos anticorpos utilizados nos experimentos e também das bactérias marcadas com EtBr (FL3- Percp). As análises foram feitas pelos programas FACS DIVA e posteriormente reanalisadas pelo programa Flow-Jo versão 10.0. A confecção dos gráficos após análises de citometria de fluxo foram realizadas utilizando o software Graph Pad Prism 5.0.

Exemplo 23: Análises in silico de EtpA

[00255] A sequência da proteína EtpA nativa obtida no genbank (AAX13509.2 - ncbi.nih.org) e modelada no programa I-TASSER gerou uma estrutura tridimensional conforme a Figura 6. De acordo com Zhang (2008), o programa I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) é uma abordagem hierárquica de modelagem de estrutura de proteínas baseada na estrutura secundária aprimoradas pelo perfil de alinhamentos. Segundo o autor, o programa de bioinformática gerou as melhores previsões de estrutura 3D entre todos os servidores automatizados.

[00256] A quimera foi desenhada com três epítopos conforme a predição da acessibilidade para a superfície proteica, regiões imunogênicas e análises da estrutura tridimendional. As regiões imunogênicas analisadas no programa BepiPred 1.0 foi de acordo com a localização de epítopos lineares de células B usando uma combinação de um modelo de Markov oculto e um método de propensão em escala. De acordo com Pushpakumara e colaboradores (2016), este modelo destina-se principalmente às propriedades dos epítopos, tais como hidrofilicidade, flexibilidade, acessibilidade, voltas, exposição, superfície, polaridade e propensão antigénica. Os epítopos escolhidos após as análises in silico estão apresentados na Tabela 4 (SEQ ID: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente).
Tabela 4. Sequências dos três epítopos escolhidos para a síntese do gene EtpA

[00257] Os aminoácidos escolhidos para os epítopos 1, 2 e 3 da proteína nativa foram nos intervalos do 25º ao 107º; 350º ao 374º e do 470º ao 492º, respectivamente. Após a escolha dos epítopos alvo, foi realizado a síntese química das sequencias do gene conforme demonstrado no anexo B.

Exemplo 24: Análise da construção do vetor de clonagem por PCR e digestão enzimática

[00258] As hospedeiras de E. coli TOP10 foram transformadas com o vetor de clonagem pGEM T- Easy ligado com a sequência EtpA recombinante. Diversos transformantes foram obtidos em meio de cultivo LB sólido. Após a extração do DNA plasmidial dos transformantes, os plasmídeos foram utilizados para a confirmação da construção do vetor de clonagem via PCR e análise de restrição. A confirmação da clonagem da sequência do gene sintético de EtpA feita por PCR com os primers R-EtpA e F-EtpA pode ser observada na Figura 7. O tamanho do amplicon gerado foi de 500 pb como o esperado.

[00259] A proteína EtpA nativa possui um tamanho de 177 kDa (FLECKENSTEIN et al., 2006). Normalmente proteínas de membrana e proteínas com pesos moleculares acima de 60 kDa se tornam mais difíceis de expressar, principalmente pela possível formação de corpos de inclusão e o problema da toxicidade proteica. Quando um gene estranho é introduzido em E. coli, o controle tempo/espaço de sua expressão é perdido. O polipeptídeo recombinante pode diferir da fonte original em termos de pH, osmolaridade, potencial redutor, cofatores e mecanismos de dobragem. O problema da toxicidade da proteína pode surgir quando a proteína recombinante de elevado peso molecular desempenha uma função desnecessária e prejudicial na célula hospedeira. Esta função interfere com a proliferação normal e a homeostase do microrganismo, e o resultado visível é a taxa de crescimento mais lenta, a baixa densidade celular final e a morte (DONG et al., 1995; ROSANO e CECCARELLI, 2014).

[00260] Desta forma, optou-se pela construção de uma proteína recombinante quimérica com um peso molecular bem menor quando comparada à proteína nativa. No resultado acima pode ser observado o amplicon de 500pb que corresponde apenas a quimera construída com as regiões mais imunogênicas anteriormente analisadas in silico.

[00261] Após a reação da PCR, também foi realizada uma digestão analítica para a confirmação do inserto no vetor de clonagem. Foi utilizada para a montagem do sistema de digestão a amostra número 1. O plasmídeo foi duplamente digerido com as endonucleases EcoRI e BamHI conforme mostrado na Figura 8.

[00262] A Figura 8 mostra a liberação do inserto (indicado pela flecha) que apresenta peso molecular de aproximadamente 500 pares de bases conforme o esperado. Também pode ser visualizado o vetor linear pGEMT-Easy não digerido com 3015 pb. Após a confirmação da construção do vetor pGEM T-EtpA foi realizado a construção do vetor de expressão.

Exemplo 25: Análise da construção do vetor de expressão pRSET-EtpA

[00263] Na montagem do vetor de expressão o plasmídeo pGEM TEtpA e o vetor de expressão pRSET-A foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. Após a digestão, o gene liberado e o vetor de expressão linearizado foram purificados do gel de agarose. O gene purificado pelo kit QIAquick Gel Extraction Kit Protocol” foi visualizado analiticamente em gel de agarose 1% conforme mostrado na Figura 9.

[00264] O gene EtpA purificado foi subclonado ao vetor de expressão pRSET-A pela ação da enzima T4 DNA ligase. O sistema de ligação foi precipitado e as hospedeiras da linhagem TOP10 foram transformadas por eletroporação. Após a transformação, seis colônias foram selecionadas aleatoriamente do meio de cultivo contendo ampicilina. Procedeu-se então a extração do DNA plasmidial e a confirmação da construção do cassete de expressão via PCR, análise de restrição e sequenciamento. O resultado da construção do plasmídeo recombinante pRSET-EtpA por digestão com as endonucleases EcoRI e BamHI, foi avaliado em gel de agarose. O fragmento correspondente ao gene de estudo foi liberado da amostra 2 e 5 e apresentou um tamanho de 500 pb. O vetor de expressão apresentou um tamanho de aproximadamente 2.900 pares de bases, assim como representado na Figura 10.

[00265] As amostras 2 e 5 foram utilizadas no sequenciamento. As sequencias de EtpA que estavam no vetor de expressão apresentaram 99% de similaridade com a sequencia depositada no banco de dados após as análises no programa BLASTn. Com esse resultado foi confirmada a correta construção do cassete de expressão.

Exemplo 26: Confirmação da expressão proteica por imunoblot

[00266] O imunoblot do pellet das proteínas insolúveis e do sobrenadante nativo que foram formados após a indução proteica seguido das sonicações é apresentado na Figura 11. O resultado foi positivo na detecção da proteína recombinante expressa por meio do reconhecimento do anticorpo monoclonal anti-histidina à cauda de histidina que estava acoplado na proteína EtpA.

[00267] A cauda de purificação mais comum e utilizada em laboratórios em todo o mundo é a cauda de Poli-histidina ou His-tag. O pequeno tamanho, o custo relativamente baixo e seu efeito mínimo ou nenhum na estrutura ou função da proteína alvo, fizeram da cauda de histidina um sucesso de utilização nos processos de detecção da expressão e purificação proteica (WOOD, 2014).

Exemplo 27: Expressão de pRSET-EtpA em BL21 e purificação proteica

[00268] A linhagem de E. coli BL21 (DE3) pLysS™ foi transformada com as amostras 2 e 5 para realizar a expressão de EtpA. Esta linhagem foi escolhida pois possui diversas vantagens para a expressão de genes heterólogos. Essas células são deficientes na protease Lon, que degrada muitas proteínas estranhas. Outro gene ausente do genoma de BL21 é o que codifica para a protease de membrana externa OmpT, cuja função é degradar proteínas extracelulares. Como essa linhagem não possui OmpT, a proteína recombinante expressa não pode ser clivada por esse mecanismo (GRODBERG e DUNN, 1988). Além disso, a perda plasmídica é impedida graças à mutação denominada hsdSB presente na linhagem parental (B834) que deu origem a BL21. Como resultado desta mutação, a metilação e degradação do DNA é interrompida (ROSANO e CECCARELLI, 2014).

[00269] Quando o gene de interesse é clonado sob um promotor T7, a enzima T7 RNA polimerase deve ser fornecida. A popular linhagem BL21 (DE3) pLysS™ contém o gene da RNA polimerase T7 controlado pelo promotor lacUV5 no seu DNA cromossômico e o gene da lisozima T7 no plasmídeo pLysS. A RNA-polimerase T7 é expressa por adição de isopropil1-tio-p-D-galactopiranosídeo (IPTG) que induz uma expressão proteica de alto nível a partir de vetores de expressão que são acionados pelo promotor T7 (por exemplo, pRSET). A lisozima T7 suprime a atividade da RNA polimerase T7, que reduz a expressão da proteína a nível basal a partir do gene de interesse. Esse mecanismo é importante caso a proteína seja tóxica para as células bacterianas. A presença da lisozima T7 aumenta a tolerância dessas E. coli contra a toxicidade. O plasmídeo pLysS também contém um gene de resistência ao cloranfenicol e uma origem de replicação p15A que é compatível com os vetores pBR322 e plasmídeos derivados de pUC. Todas essas características fazem de BL21 (DE3) pLysS™ e os seus derivados as linhagens mais utilizadas para a expressão de proteínas heterólogas (MOFFATT e STUDIER, 1988; PAN e MALCON, 2000; (ROSANO e CECCARELLI, 2014).

[00270] A indução da expressão de pRSET-EtpA em E. coli BL21 (DE3) pLysS™ foi realizada pela adição do indutor IPTG e teve a duração de 4 horas. Após esse período as culturas foram centrifugadas e os pellets formados foram sonicados para proceder à purificação proteica. Após a sonicação, os sobrenadantes nativos formados foram purificados três vezes em coluna Ni-NTA-Agarose. A análise dos resultados da expressão e da purificação da proteína recombinante EtpA feita por SDS-PAGE estão representadas nas Figuras 15 e 16. A Figura 15 mostra as sequencias das primeiras lavagens com MCAC - 0, MCAC - 20; MCAC - 40; MCAC - 60 e MCAC – 80 e as quatro primeiras eluições da proteína EtpA realizadas com 100 e 200 mM de Imidazol, respectivamente.

[00271] A Figura 13 mostra as eluições utilizando diferentes concentrações de Imidazol (de 300 até 700 mM). A eluição 300-E2 apresentou a maior concentração proteica (indicado pela seta).

[00272] A proteína recombinante EtpA purificada apresentou um tamanho de aproximadamente 16 kDa, resultado consistente com as análises in silico realizadas anteriormente.

Exemplo 28: Análise da excisão da cauda de histidina

[00273] Embora os marcadores de afinidade como a cauda de histidina sejam frequentemente utilizados para facilitar a expressão e purificação de proteínas recombinantes, cada marcador, seja grande ou pequeno, tem o potencial de interferir na estrutura e função da proteína recombinante na qual ele está fusionado. Por esta razão, são necessários métodos confiáveis para a remoção dessas caudas de afinidade e apenas algumas enzimas têm a especificidade requerida para agir neste propósito (WAUGH, 2011).

[00274] A enterokinase ou enteropeptidase é um heterodímero ligado por pontes de dissulfeto composto de cadeias "pesadas" e "leves" (com pesos moleculares aparentes de 110 e 35 kDa, respectivamente), que são extensivamente glicosiladas. Avanços recentes facilitaram a produção de uma cadeia leve recombinante no periplasma de E. coli (New England Biolabs). Essa protease específica catalisa a hidrólise das ligações peptídicas em proteínas e, ao contrário de outras quinases, não catalisa a transferência de grupos fosfato. A enterokinase exibe atividade semelhante à tripsina, clivando as proteínas após a lisina no sítio específico (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (ANDERSON et al., 1977; LIEPNIEKS e LIGHT, 1979; WAUGH, 2011).

[00275] Desta forma, utilizamos a enzima enterokinase (NEB) para a clivagem da cauda de histidina que estava fusionada à proteína EtpA. A excisão da cauda de histidina pode ser observada na Figura 14. Visualmente é possível notar que a banda proteica sem a cauda apresenta um menor peso molecular quando comparada com a banda que representa EtpA fusionada com His-tag.

Exemplo 29: ELISA indireto com os anticorpos policlonais produzidos

[00276] Um teste de ELISA indireto foi realizado com os anticorpos policlonais anti-EtpA produzidos por quatro animais contra a proteína EtpA imobilizada na placa. Os resultados do teste com a imunização da proteína EtpA recombinante purificada e sem cauda de histidina estão representados na Figura 1. O animal que melhor respondeu às imunizações foi o camundongo denominado como C4. Esse animal produziu anticorpos policlonais anti-EtpA que na leitura do teste de ELISA apresentou após a terceira imunização uma D.O de aproximadamente 0,7. O segundo animal que melhor respondeu às imunizações foi o camundongo C1 (D.O = 0,6). Um animal serviu de controle, sendo imunizado apenas com adjuvante de Freund completo. Esse camundongo está representado no gráfico pela linha preta. Os resultados do teste de ELISA indireto confirmam que após três imunizações seguindo intervalos de 15 dias em 15 dias, os camundongos respondem imunologicamente contra a proteína recombinante imunizada, produzindo assim anticorpos policlonais.

Exemplo 30: Mapeamento de epítopos da proteína quimérica EtpA

[00277] Com o objetivo de determinar as regiões imunogênicas da proteína recombinante, realizamos o mapeamento de epítopos utilizando peptídeos sintéticos conforme descritos na tabela 3. Foi reativo ao pool de soros dos animais imunizados apenas o peptídeo 1.1, conforme demonstrado na Figura 16.

[00278] Após as análises da sequência da proteína quimérica no programa BepiPred 1.0 Server, foi possível observar que a região correspondente ao peptídeo 1.1 apresenta uma alta probabilidade de ser reconhecido por células B (Figura 20). Porém, outras regiões também apresentaram alta probabilidade de serem reconhecidas segundo o programa como, por exemplo, a região C-terminal da proteína recombinante. Contudo, os resultados obtidos no dot blot indicam uma reatividade específica na porção N-terminal da proteína recombinante.

Exemplo 31: Imunofenotipagem de bactérias por citometria de fluxo

[00279] Os resultados dos experimentos de imunofenotipagem com as amostras clínicas de ETEC e outras cepas de E. coli diarreiogênicas foram analisados por citometria de fluxo. As populações de bactérias foram analisadas por tamanho (FSC), granulosidade (SSC) e fluorescências emitidas por meio das marcações.

[00280] A citometria de fluxo permite análises multiparamétricas de características morfológicas das células, interações entre moléculas celulares e avaliação qualitativa e quantitativa da composição de bactérias diretamente do material analisado sem a necessidade do cultivo (JUZWA e CZACZYK, 2012). O uso de citometria de fluxo em microbiologia foi originalmente limitado à quantificação de células de culturas puras, uma vez que partículas inorgânicas podem interferir fortemente com as contagens bacterianas (CZECHOWSKA et al., 2008).

[00281] Uma das alternativas mais promissoras consiste na contagem de células por citometria de fluxo após a coloração do ácido nucleico ou marcação de anticorpos ou partículas proteicas usando fluorocromos que também são empregados nas contagens diretas de células na microscopia. A citometria de fluxo supera as duas principais desvantagens da microscopia por fluorescência, o viés do observador e o baixo rendimento da amostra. Deste modo, as análises por citometria aumenta a confiabilidade das estimativas de abundância celular, e reduz muito o tempo de processamento das amostras (HAMMES e EGLI, 2010; FROSSARD et al., 2016).

[00282] O equipamento de citometria avalia as células em suspensão e partículas que fluem por meio da câmara de fluxo. As células da suspensão são convertidas em corrente de fluido, e após são escaneadas pela interceptação do feixe de laser à medida que passam pelo ponto de observação. Os parâmetros medidos são a dispersão de luz do laser e a emissão de luz de fluorocromos (fluorescência) quando são excitados pelo laser. O citómetro de fluxo permite a medição simultânea da intensidade de emissão de fluorescência (proveniente de fluorocromos excitados marcando diretamente a estrutura celular específica ou conjugada com anticorpos) e a luz do laser quando é dispersa em cada evento (SHAPIRO, 2003; COMASRIU e RIUS, 2009; JUZWA e CZACZYK, 2012).

[00283] Deste modo, a utilização desta técnica no presente trabalho foi essencial para a validação da ferramenta desenvolvida.

31.1 Análise do Reconhecimento de EtpA por citometria de fluxo

[00284] Para a detecção da proteína EtpA encontrada nos flagelos das bactérias ETEC foi utilizado os anticorpos anti-EtpA purificados (concentração de 1μg/μL). O reconhecimento específico dos anticorpos antiEtpA contra a proteína EtpA das bactérias ETEC foram avaliados por citometria de fluxo, a fim de se obter valores numéricos precisos desse reconhecimento por meio da análise de fluorescência de anticorpos anti-IgG mouse (2°) conjugados ao fluorocromo Alexa flúor 488 na concentração de 1μL/200 μL de PBS 1X. O resultado deste teste pode ser observado na Figura 18. Os resultados indicam que o anticorpo desenvolvido (anti-EtpA) foi capaz de reconhecer a proteína EtpA nativa que está presente nos flagelos das bactérias ETEC. Na Figura 18 (A) é possível observar a gate que representa a população das bactérias que foram analisadas no citómetro. A Figura 18 (D) demonstra um deslocamento dos eventos dentro da gate (quadrado rosa), resultantes do reconhecimento do anticorpo secundário ao anticorpo primário. Este mesmo deslocamento não é observado no gráfico B e C onde não foi adicionado os anticorpos anti-EtpA (controles da reação).

31.2 Teste de especificidade dos anticorpos anti-EtpA contra isolados de E. coli diarreiogênicas

[00285] Após a padronização dos títulos de anticorpos primários e secundários, o reconhecimento dos anticorpos anti-EtpA contra diferentes cepas de E. coli diarreiogênicas foi avaliado por citometria de fluxo. Os resultados demonstrados na Figura 19 indicam o reconhecimento dos anticorpos com maior porcentagem para o isolado classificado como ETEC (que possui o gene para a proteína EtpA), demonstrando assim a especificidade significativa dos anticorpos desenvolvidos.

[00286] Conforme os resultados demonstrados no gráfico da Figura 22, é possível observar que houve uma fluorescência basal quando foi avaliado a especificidade dos anticorpos anti-EtpA contra as cepas EHEC; EAEC; EIEC; EPEC e DAEC. Esses deslocamentos menores que 2%, provavelmente ocorrem pela interferência dos anticorpos secundários anti-IgG mouse conjugados ao fluorocromo Alexa flúor 488 que podem estar se ligando de forma inespecífica a algum debrie celular. Esse deslocamento basal também foi observado nas amostras controle, onde somente o anticorpo secundário foi adicionado na reação. Porém, quando analisamos a especificidade dos anticorpos anti-EtpA contra a cepa ETEC, é possível observar o maior deslocamento da fluorêncencia dentro da gate. Esses resultados corroboram com a validação da especificidade dos anticorpos anti-EtpA produzidos para o reconhecimento de ETEC. Como dito anteriormente, a proteína EtpA é conservada dentro das cepas de ETEC (LUO et al, 2015; KUMAR et al., 2016).

31.3 Avaliação da detecção da proteína EtpA em diferentes isolados de ETEC por citometria de fluxo.

[00287] Com o objetivo de avaliar o grau de reconhecimento dos anticorpos anti-EtpA em diferentes isolados de ETEC, as porcentagens de reconhecimento de EtpA foram contabilizadas por citometria de fluxo. Os resultados de acordo com a Figura 23, demonstraram diferentes porcentagens de reconhecimento da proteína alvo quando comparados entre 11 isolados diferentes de ETEC.

[00288] Experimentos com microarranjo de DNA confirmaram que a transcrição de múltiplos genes de virulência, incluindo um número de genes de adesina, é modulada quer por exposição a meios condicionados por células hospedeiras ou por contato de células hospedeiras (KANSAL et al., 2016).

[00289] Os resultados conforme demonstrado na Figura 20, evidenciam a ocorrência de variação da expressão da proteína EtpA quando as cepas de ETEC são cultivadas in vitro e sem exposição a células hospedeiras. Contudo, esses níveis de expressão e detecção desta proteína podem ser ainda maiores se esse experimento for testado in vivo, visto que EtpA é modulada pelo contato de ETEC com as céluas hospedeiras intestinais.

[00290] A plasticidade inerente dos genomas de E. coli contribui substancialmente com a dificuldade da busca por antígenos únicos para o patótipo de ETEC que são amplamente conservados. Nenhum antígeno único exclusivo e conservado neste patótipo, foi descrito até a presente data. Alguns autores sugerem que isto poderia ser previsto com base no fato de que as toxinas LT e ST codificadas por plasmídeos, que definem ETEC, poderiam formar um complemento mínimo de genes de virulência numa grande variedade de estirpes de E. coli. No entanto, estudos anteriores conduzidos com cepas filogeneticamente díspares da Guiné Bissau e do Chile, sugeriram que genes que codificam dois antígenos específicos EatA e EtpA, estavam presentes na grande maioria das cepas (CROSSMAN et al., 2010; SAHL et al., 2011; DEL CANTO et al., 2011).

[00291] Neste contexto, Luo e colaboradores (2015) examinaram a conservação genética e a produção real das proteínas EatA e EtpA em uma grande coleção de cepas bem caracterizadas de Bangladesh, complementadas por outras cepas oriundas de outros locais que estavam associados com a doença diarreica grave provocada por ETEC. Os resultados obtidos demonstraram que os dois antígenos EatA (serina protease) e EtpA, são compartilhados amplamente entre as cepas pertencentes a diferentes grupos de fatores de colonização (FC), com exceção das cepas que produzem antígenos descritos como CS4, CS5 e CS6 que raramente produzem a exoproteína EtpA.

[00292] Como se observa nos nossos resultados, os níveis de detecção da exoproteína EtpA difere entre as onze cepas testadas. A cepa número 167 apresenta a menor porcentagem de detecção, enquanto a cepa 178 apresenta a maior porcentagem. Estas diferenças podem estar relacionadas com os diferentes grupos de fatores de colonização a que estas cepas pertencem. Desta forma, estudos adicionais futuros serão necessários para caracterizar estas cepas quanto aos grupos de fatores de colonização.

Exemplo 32: Ensaio de separação imunomagnético por Beads associadas ao anticorpo Anti-EtpA. 32.1 Marcação do material genético das bactérias ETEC com o corante Brometo de Etídeo para detecção em citometria de fluxo

[00293] Para avaliar a detecção das bactérias ETEC por beads magnéticas associadas ao anticorpo anti-EtpA, foi realizado um ensaio de padronização utilizando o corante Brometo de Etidio – EtBr (FL3- Percp). O brometo marcou o material genético das bactérias assim como demonstrado na Figura 21. Na Figura 21-A observamos as bactérias sem a marcação por brometo e na Figura 21-B observamos por meio do deslocamento da fluorescência as bactérias marcadas com o corante.

32.2 Detecção dos anticorpos anti-EtpA acoplados em beads magnéticas (Bioclone)

[00294] Para a detecção dos anticorpos anti-EtpA produzidos e acoplados às beads magnéticas foram utilizados o anticorpo monoclonal antiIgG mouse conjugados ao fluorocromo Alexa flúor 488 na concentração de 1μL/200 μL de PBS 1X. O resultado analisado por meio de citometria de fluxo demonstrou um acoplamento de 98% dos anticorpos anti-EtpA nas beads magnéticas conforme evidenciado na Figura 22.

32.3 Detecção de bactérias ETEC por beads magnéticas

[00295] Depois dos ensaios de padronização das concentrações do corante brometo de etídeo, anti-EtpA e anti-IgG Mouse Alexa flúor 488, foi realizado o teste de captura com beads magnéticas com dois isolados diferentes de ETEC confirmados anteriormente por PCR e citometria. Os resultados do ensaio de captura das duas cepas foram positivos conforme analisado por citometria de fluxo (Figura 23). A fluorescência dentro da gate corresponde às bactérias marcadas com brometo de etídeo e que foram capturadas pelo anticorpo anti-EtpA acoplado as beads magnéticas conforme mostra o esquema da Figura 24. Foi observado que o isolado 178 apresentou uma porcentagem de marcação e detecção maior que o isolado 144, corroborando assim com os resultados anteriores demonstrados na Figura 20.

32.4 Teste de especificidade e captura com diferentes isolados de E. coli diarreiogênicas

[00296] Depois de avaliado o sistema de captura de isolados de ETECEtpA, foram realizados os testes de especificidade de captura das beads acopladas com anti- EtpA contra diferentes isolados de E. coli diarreiogênicas. Os resultados conforme mostrados na Figura 25 evidenciam a diferença significativa da porcentagem de reconhecimento de ETEC pelas beads em relação as outras cepas de E. coli diarreiogênicas. As bactérias ETEC apresentaram a maior porcentagem de captura em comparação aos outros isolados de E. coli.

[00297] É evidente que os exemplos acima foram apresentados apenas em caráter ilustrativo, e que modificações e variações dos mesmos, óbvias para os técnicos no assunto, são consideradas como inclusas no escopo da presente invenção, tal como definida nas reivindicações a seguir.

Claims (20)

1. Proteína recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um fragmento imunogênico da proteína EtpA, em que o fragmento é selecionado do grupo representado pela SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.
2. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 7.
3. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é para uso na detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).
4. Sequência de DNA sintético, caracterizada pelo fato de que é representada pela SEQ ID NO: 1 ou suas degenerações, que codifica a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de DNA sintético como definida na reivindicação 4.
6. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de DNA sintético como definida na reivindicação 4 ou um cassete de expressão como definido na reivindicação 5.
7. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA sintético como definida na reivindicação 4, ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 6 ou um cassete de expressão como definido na reivindicação 5.
8. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é uma célula eucariota.
9. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é Escherichia coli.
10. Método para produzir uma proteína recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) transferir para uma célula hospedeira uma sequência de DNA sintético como definida na reivindicação 4 para obter uma célula hospedeira transformada ou transfectada;
    (b) cultivar a célula hospedeira transformada ou transfectada para obter uma cultura de células;
    (c) expressar a proteína recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em uma célula hospedeira transformada ou transfectada para produzir uma proteína recombinante; e
    (e) isolar a proteína recombinante da célula ou da cultura de célula.
11. Método para detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    • (a) expor um agente de detecção primário a uma ou mais proteínas recombinantes como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3;
    • (b) acoplar o dito agente de detecção primário a beads magnéticas;
    • (c) contatar o dito agente de detecção primário a um agente de detecção secundário ligado a um marcador;
    • (d) detectar ETEC pela ligação específica do dito agente de detecção secundário ao dito primeiro agente de detecção.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é ligada, conjugada ou imobilizada sobre ou a um suporte sólido.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é uma placa de microtitulação.
14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o agente de detecção primário é um anticorpo presente na amostra biológica.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou fluido corporal.
16. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o agente de detecção secundário é um anticorpo selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE, IgY e/ou respectivas subclasses.
17. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador é selecionado de uma enzima, um radioisótopo, um grupo fluorescente, um grupo luminescente, biotina, ou partículas de corante.
18. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a detecção é selecionada do grupo consistindo de detecção de fluorescência, de imunoluminescência, de absorbância ou de radioisótopos.
19. Kit para detecção de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais proteínas recombinantes como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, um agente de detecção marcado, beads e instruções de uso.
20. Uso de uma proteína recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é na manufatura de um kit para detecção de ETEC em uma amostra biológica, ou em um método para detecção de ETEC.

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