CN112180096A

CN112180096A - 用于诊断线虫感染的新测定法

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Publication number: CN112180096A
Application number: CN202010628004.XA
Authority: CN
Inventors: B·蒙格; K·斯特恩哈格; J·谢弗; C·普罗布斯特; A·德尔伯格; M·尤恩格; C·麦司林
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2021-01-05
Also published as: US20210003591A1; EP3761029A1; EP3761029B1; BR102020012760A2; LT3761029T; US11519919B2

Abstract

本发明涉及诊断上有用的载体，其包含(a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽，以及(b)犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。本发明进一步涉及包含本发明的诊断上有用的载体的试剂盒、用途、方法、组合物。

Description

用于诊断线虫感染的新测定法

技术领域

本发明涉及诊断上有用的载体，其包含(a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽，以及(b)犬弓蛔虫(Toxocara canis)幼虫的体细胞裂解物。此外，本发明涉及包含本发明的诊断上有用的载体的试剂盒、用途、方法、组合物。

背景技术

弓蛔虫病是由蛔虫、犬弓蛔虫或猫弓蛔虫(Toxocara cati)所引起的人体蠕虫感染。这种感染发生在摄入含有完全发育的弓蛔虫属物种感染性幼虫的含胚卵时。人体肠道中的幼虫会穿透肠壁并通过血管迁移到达肝脏、肌肉和肺部，甚至迁移到眼睛和大脑中。

弓蛔虫病通常被称为内脏幼虫移行症(VLM)。其他名称或相关症状可能是眼幼虫移行症(OLM)、Weingarten病、Frimodt-

综合征或嗜酸性假白血病、线虫眼炎、弓蛔虫疾病、toxocarose或隐性弓蛔虫病。这种动物传染的蠕虫感染是罕见的致盲原因并可能引发风湿、神经或哮喘症状[Schantz,PM(1994),Journal of the American VeterinaryMedical Association；204(7):1023–8]。人通常通过从污染源(土壤、未煮熟的肉、新鲜或未洗涤的蔬菜)摄入含胚卵(每个都含有发育完全的幼虫，L2)而受到感染。

犬弓蛔虫是一种线虫，其基本生命周期由七个时期组成，一个虫卵期、四个幼虫期(L1、L2、L3、L4)和包括雌雄分开的两个成虫期。线虫在幼虫期蜕皮四次，在每个幼虫期结束时发生蜕皮。

因为用于弓蛔虫病的诊断和检测的方法对于其预防和治疗是至关重要的，本领域公开了几种基于PCR、蛋白质印迹(western-blot)和ELISA的检测测定法。然而，PCR测定法需要更熟练的技术人员和更昂贵的设备。这可能是限制性因素，特别是在弓蛔虫血清阳性率较高的国家中。

因此，诊断依赖于使用弓蛔虫排泄分泌抗原的灵敏的免疫学方法(例如，ELISA和蛋白质印迹)。但是，目前的免疫学弓蛔虫测定法无法同时提供高特异性和高灵敏性。dosSantos等人[dos Santos等人(2019),PLoS One；14(3)]、Jin等人[Jin等人(2013),KoreanJ Parasitol；51(4):433-9]、Mohamad等人[Mohamad等人(2009),J Clin Microbiol；47(6):1712-7]和Norhaida等人[Norhaida等人(2008),Ann Trop Med Parasitol；102(2):151-60]公开了这样的测定法的实例。

因此，长期以来都存在提供用于对弓蛔虫感染进行灵敏性和特异性相结合的诊断的血清学测定法的需求。

发明内容

本发明人令人惊讶地发现，结合使用包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸的肽和犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物产生了提供高灵敏性和高特异性比例均衡的免疫学测定法(例如，ELISA)。优选地当将肽和裂解物混合并共定位到诊断载体上时，能够观察到这种高灵敏性和高特异性比例均衡。

因此，在第一方面，本发明涉及诊断上有用的载体，其包含(a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽，以及(b)犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。

在其他优选实施方案中，所述载体选自玻璃载玻片、生物芯片、微量滴定板、侧流装置、测试条、膜、线性印迹(line blot)、层析柱和珠粒。

在第二方面，本发明涉及试剂盒，其包含本发明的诊断上有用的载体和用于检测人、犬科或啮齿目抗体的标记抗体。

在第三方面，本发明涉及用于诊断弓蛔虫感染的方法，其包括在患者样品中检测针对SEQ ID NO:1的抗体和/或针对犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的抗体的存在。

在第四方面，本发明涉及组合物，其包含(a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽，以及(b)犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。

在第五方面，本发明还涉及用于诊断弓蛔虫感染的本发明的组合物或本发明的诊断上有用的载体。

在第六方面，本发明涉及确定针对根据SEQ ID NO:1的犬弓蛔虫蛋白的抗体和/或针对来自犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的蛋白的抗体的存在的方法，其包括：(i)使分离自患有弓蛔虫感染的受试者的样品与包含SEQ ID NO:1和/或其变体的多肽以及与犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物接触，其中所述多肽和/或所述裂解物与结合至SEQ ID NO:1或体细胞裂解物的抗体特异性结合；以及(ii)确定针对SEQ ID NO:1的抗体和/或针对所述体细胞裂解物的抗体的存在。

在第七方面，本发明还涉及根据SEQ ID NO:1的犬弓蛔虫蛋白和犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物在制备用于检测弓蛔虫感染的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含(a)包含SEQID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽以及(b)犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。

在本发明各个方面的优选实施方案中，所述弓蛔虫感染是犬弓蛔虫感染。

在本发明各个方面的优选实施方案中，所述样品是血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿液或唾液。

在本发明各个方面的其他优选实施方案中，能够将弓蛔虫感染与棘球绦虫(Echinococcus)、类圆线虫(Strongyloides)和蛔虫(Ascaris)感染区分开来。

此外，在本发明各个方面的优选实施方案中，所述肽和所述裂解物是结合在一起的。

在本发明各个方面的优选实施方案中，针对SEQ ID NO:1的抗体和/或针对体细胞裂解物的抗体选自IgG、IgA和IgM类抗体。

在本发明各个方面的优选实施方案中，所述检测或确定包括印迹测定法、化学发光免疫测定法、光散射免疫测定法、放射性标记免疫测定法或免疫荧光测定法。

本发明基于发明人令人惊讶的发现，即针对SEQ ID NO:1和犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的抗体可用于线虫感染(即弓蛔虫感染)的灵敏和特异性诊断。实验证明，结合使用犬弓蛔虫TES-30(SEQ ID NO:1)与犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物得到了同时具有高特异性和高灵敏性的均衡的测定法。这种测定法优于使用单独的蛋白质、单独的裂解物的测定法以及包含弓蛔虫排泄分泌(TES)抗原的标准测定法。

根据本发明，所述(多)肽可以是重组蛋白，其中如本文所使用的术语“重组”是指在产生过程的任何阶段使用基因工程方法产生的多肽，例如通过将编码所述多肽的核酸与强启动子融合以在细胞或组织中过表达，或通过改造所述多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和所编码的多肽的方法(例如，在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH或在Brown T.A.(1986),Gene Cloning–anintroduction,Chapman&Hall中所描述的)以及用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如，GE Healthcare Life Sciences出版的手册“Strategies for ProteinPurification”,“Antibody Purification”，以及在Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009):Guide to Protein Purification中)。

在优选实施方案中，所述多肽是犬弓蛔虫TES-30，其具有或包含SEQ ID NO:1或A0A1D8MBE4(Uniprot)，更优选SEQ ID NO:1。如本申请全文所使用的任何数据库代码都是指在与所述申请相关的第一优先权日从所述数据库可获得的序列。在另一个实施方案中，可使用包含在犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物中的多肽。在另一优选实施方案中，根据本发明并用于本发明各个实施方案的多肽是分离的多肽，其中如本文所使用的术语“分离的”是指该多肽与其在使用生物技术或合成方法进行产生时的状态相比已经被富集，并且优选是纯的，即在各样品中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳然后进行考马斯蓝染色和使用计算机辅助密度计的定量测定所判断出的。备选地，术语“分离的”可以是指包含多种不同蛋白质的富集溶液，而该溶液已被纯化或基本上已从其他分子类型(例如，脂质或核酸分子)中纯化出来。

在优选实施方案中，如本文所使用的术语“变体”可以是指所述全长序列(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，更优选SEQ ID NO:1)的至少一种片段，更具体地说是相对于全长序列在一个或两个末端截短一个或多个氨基酸后的一种或多种氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原序列或其变体的至少10、13、15、25、50、75、100、150、200或230个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以是至少13、25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多氨基酸。

在另一优选实施方案中，术语“变体”不仅涉及至少一种片段，而且还涉及包含氨基酸序列的多肽或其片段，优选包含至少25个、更优选50个、更优选100个、更优选150个、更优选200个、更优选230个连续氨基酸的片段，它们与所述参考氨基酸序列或其片段至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一，其中除生物学活性(例如与目标抗体特异性结合的能力)或者多肽的折叠或结构所必需的氨基酸以外的氨基酸被缺失和/或置换了，和/或以保守方式取代一个或多个这样的必需氨基酸，和/或以使多肽的生物学活性至少部分保留的方式添加或缺失氨基酸。已知方法包括可以用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction tobioinformatics,Oxford University Press,2008,第3版。在优选实施方案中，使用应用了默认设置的ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W and Clustal X version2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)。

在优选实施方案中，所述变体是包含与根据SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列的多肽。在一个更优选的实施方案中，所述变体是包含与根据SEQ ID NO:1的序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽。

与TES-30/SEQ ID NO:1相关的蛋白质的结构，特别是其他凝集素蛋白质的结构，是本领域技术人员众所周知的。例如，可以在https://modbase.compbio.ucsf.edu/modbase-cgi/model_details.cgi？queryfile＝1592383498_9335&searchmode＝default&displaymode＝moddetail&referer＝yes&snpflag＝&下找到此类蛋白质结构。此外，本领域技术人员知道提供免疫原性活性的TES-30片段。Ebrahimi等人(Ebrahimi,M.等人(2019),Int J Pept Res Ther(2019).https://doi.org/10.1007/s10989-019-09940-1)描述了氨基酸残基52至102和172至207的TES-30片段具有高免疫原性。因此，在本发明的优选实施方案中，SEQ ID NO:1的变体包含TES-30的52至102(根据SEQ ID NO:3)和/或172至207(根据SEQ ID NO:4)的片段的序列。在甚至更优选的实施方案中，SEQ ID NO:1的变体包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4两者。

在优选实施方案中，变体还可以包括化学修饰，例如同位素标记或者共价修饰(例如，糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、羟基化等)。本领域技术人员熟悉多肽的修饰方法。此外，变体还可以通过与其他已知多肽或其他变体融合的方式形成。

所述多肽的变体具有生物学活性。在优选实施方案中，如果该变体是选自SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2(优选SEQ ID NO:1)的序列的变体，则这种生物学活性是与相应抗体结合、优选特异性捕获相应抗体的能力。例如，SEQ ID NO:1的变体具有能够在获自罹患或疑似罹患线虫感染(优选犬弓蛔虫感染)的受试者的样品中特异性捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的能力。这样的变体具有被待捕获抗体所识别的至少一个表位，例如，如果捕获的是针对SEQ ID NO:1的抗体，就是SEQ ID NO:1中的一个表位。SEQ ID NO:2的变体具有能够在获自罹患或疑似罹患线虫感染(优选犬弓蛔虫感染)的受试者的样品中特异性捕获针对SEQ IDNO:2的抗体的能力。

本领域技术人员能够通过下列方式来设计变体：从原始SEQ ID NO:1序列开始，引入修饰(例如，点突变、截短等)，并随后通过在获自罹患待诊断疾病(优选感染，更优选线虫感染，更优选弓蛔虫感染，最优选犬弓蛔虫感染)的受试者的样品中测试所述变体是否与针对SEQ ID NO:1的抗体结合来确认所述变体仍具有生物学活性。可通过下述方式来鉴别变体：鉴别源自全长蛋白质或其前体的天然存在的片段，例如使用包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2(优选SEQ ID NO:1)的多肽作为亲和配体来纯化它们，然后进行N-末端Edman测序和/或胰蛋白酶消化以及相结合的质谱法，并将它们用来实施本发明。保守氨基酸置换可用于所有变体。

本发明的范围包括诊断上有用的载体，其包含用于特异性捕获针对抗原(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，优选SEQ ID NO:1，以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)的抗体的工具。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“特异性捕获...抗体”是指这样的能力，即特异性结合至目标抗体(优选IgA、IgM或IgG类抗体)，以致于其被结合并可从样品中移除，而其他抗体(优选来自相同类别和/或针对另一种抗原)基本上不结合并保留在样品中。所述抗体优选为仅与目标抗原(例如，由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、优选SEQ ID NO:1代表的抗原以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)结合的抗体。

根据本发明的诊断上有用的载体用作用于特异性捕获抗体的一种或多种工具的支架，所述抗体优选为针对弓蛔虫抗原(例如由SEQ ID NO:1代表的抗原和/或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)的诊断上相关的抗体。所述载体适于进行诊断方法。通过使用载体而不是游离的、可溶的工具来特异性捕获抗体，更容易从样品中分离和分开包含所述工具和所述抗体的复合物以及洗涤所述复合物，例如为了除去与所述工具、复合物或载体非特异性结合的任何分子。在优选实施方案中，所述诊断上有用的载体是诊断装置，优选选自珠粒(优选顺磁性珠粒)、测试条、微量滴定板、微阵列、印迹和膜，以及优选线性印迹或微量滴定板，更优选微量滴定板。所述载体可以包含一种或多种对照，优选全部选自IgM缀合物对照(其确定已添加识别人IgM的二抗)、IgG缀合物对照(其确定已添加识别人IgG的二抗)、IgA缀合物对照(其确定已添加识别人IgA的二抗)、血清对照(其确定已添加血清)、阴性对照(其表明没有假阳性信号)、阳性对照(其表明没有假阴性信号)以及一种或多种校准物对照(其优选是允许半定量测定的弱阳性斑点)。如果所述载体包含几种抗原，则所述载体可包含可以指示条带的空间分离的分开条带，例如一边是对照条带，另一边是抗原条带。此外，所述载体可以包括截止条带。

所述诊断上有用的载体可以是载玻片，优选用于显微术的玻璃或塑料载玻片，其包含一种或多种真核细胞，每种真核细胞在空间上彼此分开，并且每种真核细胞表达作为用于特异性捕获抗体的工具的多肽。所述一种或多种真核细胞可以是活细胞，但优选是经固定的细胞。用于固定细胞的现有技术实验方案是可获得的，例如使用甲醇或甲醛。可使用间接免疫荧光来检测使用这种载体所捕获的抗体。一种细胞可包含根据SEQ ID NO:1或其变体的肽。此外，还能够将犬弓蛔虫幼虫裂解物固定在载玻片上。

所述诊断上有用的载体可以是配置用于免疫测定法的珠粒，其包含含有SEQ IDNO:1或其变体的多肽以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。在更优选的实施方案中，所述珠粒是固体珠粒，其包含碳水化合物(例如琼脂糖凝胶)或合成聚合物(例如乳胶)，优选顺磁性珠粒，其可通过施加磁场而从溶液中移除并浓缩(优选在容器表面)。所述珠粒包括通过共价键或非共价键与所述珠粒连接的用于捕获抗体的工具。可以使用珠粒的混合物，例如其中一种珠粒与SEQ ID NO:1或其变体连接和/或一种珠粒与SEQ ID NO:2或其变体连接。

在优选实施方案中，所述诊断上有用的装置是微量滴定板，其包括一系列配置用于免疫测定法(例如ELISA测定法)的孔。优选所述微量滴定板包含用用于特异性捕获针对SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2(优选SEQ ID NO:1)以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的抗体的工具包被的孔，所述工具优选为包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。在优选实施方案中，术语“微量滴定板”是诊断装置，优选由玻璃或塑料(更优选塑料)制成，其包括一个或多个孔、优选多于一个孔、更优选至少8个孔，在所述孔中在液体缓冲液中的反应可分开进行而不会交叉污染。至少一个所述孔包被有多肽，优选可用于特异性捕获诊断上有用的抗体的抗原性多肽。如果使用了多于一种用于特异性检测抗原的工具，则优选每种工具与其他工具充分分开。所述微量滴定板可用于平行地运行几个样品，优选以自动化方式。所述孔优选与至少一种常规检测技术(例如，比色法、免疫荧光、酶活性检测、化学发光、放射性等)相容。此外，单独的孔可以包括用于检测另一种线虫感染的一种或多种抗原。

在本发明的优选实施方案中，所述方法和测定法不包括核酸扩增步骤，例如PCR或环介导等温扩增(LAMP)。

在优选实施方案中，如本文所使用的术语“特异性检测所捕获的抗体”是指所述抗体特异性结合至用于特异性捕获所述抗体的工具(优选包含SEQ ID NO:1或SED ID NO:2、优选SEQ ID NO:1或其变体的多肽，或者犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)，捕获后，特异性结合至用于检测所述抗体的工具(例如，二抗)。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“特异性捕获抗体”是指用于特异性捕获抗体的工具与所述抗体特异性结合，并且不以显著的或可检测的水平与任何其他抗体结合。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“特异性结合”是指所述结合比特征在于解离常数为1×10^-5M、更优选1×10^-7M、更优选1×10^-8M、更优选1×10^-9M、更优选1×10^-10M、更优选1×10^-11M，更优选1×10^-12M的结合反应更强，如通过使用Biacore设备在25℃下于pH 7的PBS缓冲液中进行的表面等离子体共振所测定的。

在优选实施方案中，术语“特异性检测抗体”是指在与涉及检测与另一类别相关的相同抗原的抗体的任何结合反应空间上分开的测定法中检测到所述抗体(该抗体属于某类抗体，例如IgA、IgM或IgG类抗体)，以及更优选在相同反应(例如ELISA孔)中未检测到针对相同抗原的另一类抗体。换言之，所进行的测定法使得读出结果能够区分抗体类别(例如，区分IgG或IgM抗体与其他抗体类别)，并断定和特异性检测所检测的抗体所属的抗体类别，或者仅检测针对目标抗原的特定抗体类别，优选针对SEQ ID NO:1或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的IgM抗体或者针对SEQ ID NO:1或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的IgG抗体。这并不排除可在空间上分开的反应中同时检测到针对相同抗原但与另一抗体类别相关的抗体。例如，涉及相同抗原(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其变体)的结合反应可在ELISA微量滴定板的分开的孔中进行，但可使用分别与不同类别的抗体(例如，IgM和IgG)结合的二抗来显影。

在优选实施方案中，检测针对包含SEQ ID NO:1的肽和/或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的IgG类抗体。

根据本发明，提供了用于特异性检测所捕获的抗体的工具，或者将其用于实施本发明，任选地作为试剂盒的一部分。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“用于特异性检测所捕获的抗体的工具”是指特异性结合至所捕获的抗体(优选结合至抗体恒定区)的试剂，使得所捕获的或待捕获的抗体仍然能够与其抗原结合。恒定区的序列取决于从其取样并分析样品的生物体和抗体类别。优选所述工具与人IgA、IgM或IgG类抗体结合。如果检测针对SEQ ID NO:1的抗体，则优选二抗识别IgG类抗体的恒定区。如果检测针对犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的抗体，则优选二抗识别IgG类抗体的恒定区。

在更优选的实施方案中，用于特异性检测所捕获的抗体的工具选自二抗、适体和anticalin(Skerra,A.(2008)."Alternative binding proteins:anticalins-harnessingthe structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novelbinding activities".FEBS J.275(11):2677–83)，并且最优选二抗。二抗可以是哺乳动物抗体，更优选选自牛、山羊、鸡、大鼠、鼠类、猪、马或兔抗体。所述工具可包含可检测标记，优选选自酶活性标记、颜色标记(优选选自金标记和乳胶标记)、化学发光标记和荧光标记。

如果将多肽用作用于特异性捕获抗体的工具，则所述多肽(优选包含选自SEQ IDNO:1和/或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的一种或多种序列，当用于实施本发明的教导时)可以以任何形式和任何纯化程度来提供，从以内源性形式包含所述多肽的组织或细胞，更优选过表达所述多肽的细胞，这些细胞的粗制或富集的裂解物，直到纯化和/或分离的多肽(其可能基本上是纯的)。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“过表达”是指已经被基因工程改造的细胞(优选真核细胞，更优选哺乳动物或昆虫细胞，更优选哺乳动物细胞，更优选人细胞，最优选HEK293或HEK293T细胞)，使其比未改造的野生型细胞表达更多的目标蛋白质。在优选实施方案中，所述多肽是天然多肽，其中如本文所使用的术语“天然多肽”是指包含至少15、30、50、100、150、200、300或350个氨基酸(优选超过30个氨基酸)的折叠多肽，更优选从组织或细胞纯化的折叠多肽，更优选从哺乳动物细胞或组织纯化的折叠多肽，任选地从非重组的组织或细胞纯化的折叠多肽。在另一优选实施方案中，所述多肽是具有至少7个、更优选至少10个氨基酸残基的线性肽。如果使用天然多肽，其优选与其天然状态相比是被富集的。重组多肽可包含用于亲和纯化、固定化或检测的C-末端或N-末端标签，例如，His标签(如SEQ ID NO:2所示例的)或链霉亲和素标签，优选链霉亲和素，作为纯化或方法的一部分，可以优选通过使用蛋白酶(分别识别所述标签和N-末端或C-末端之间的多肽接头中的蛋白酶切割位点)来切割除去该标签。随后可将切割的多肽连接至诊断上有用的载体以产生根据本发明的诊断上有用的载体。在另一优选实施方案中，用于特异性捕获抗体的工具是弓蛔虫感染的真核细胞，优选人细胞。这种细胞可通过荧光显微术进行评估。细胞可被瞬时或稳定转染，优选瞬时转染，优选用包含在诱导型或持续诱导型启动子控制下的编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2(优选SEQ ID NO:1)的序列的载体进行转染。

所述用于特异性捕获抗体的工具及其所附着至的不溶性载体可以用直接的方式从受试者的样品中分离出来，例如通过过滤、离心、磁性或倾析。可以以可逆或不可逆的方式固定所述工具。例如，如果所述工具是通过离子相互作用(其可通过添加高浓度盐来掩蔽)与载体相互作用，或者如果所述分子是通过可切割共价键或非共价键结合的，则固定化是可逆的。相反，如果所述工具是通过水溶液中不能被切割的共价键连接到载体上的，则固定化是不可逆的。所述工具可被间接固定，例如通过固定对所述多肽具有亲和力的抗体或其他实体，然后添加所述工具并形成工具-抗体复合物。可通过将配体化学连接到载体上，优选通过共价键，并融合到对所述配体具有亲和力的多肽工具上来形成非共价键。在优选实施方案中，所述配体选自生物素(在这种情况下，具有亲和力的多肽可以是与生物素结合的链霉亲和素或其变体)、谷胱甘肽(具有亲和力的多肽：谷胱甘肽-S-转移酶)、镍(具有亲和力的多肽：His标签)、Flag标签(具有亲和力的多肽：抗flag抗体)、诸如麦芽糖或纤维素的碳水化合物(具有亲和力的多肽：麦芽糖或纤维素结合蛋白)，优选为生物素。

根据本发明，提供了编码根据本发明的多肽(例如包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2(优选SEQ ID NO:1)或其变体的多肽)的核酸，其任选地具有诱导型启动子，所述多肽优选用于诊断疾病或者制备用于这种用途的试剂盒或试剂。所述核酸可以是载体(优选用于表达所述核酸)的一部分。还提供了包含该载体并优选表达由所述载体编码的多肽的真核细胞或原核细胞，优选真核细胞。所述核酸、载体和细胞可用于制备用于根据本发明的用途的试剂盒，例如针对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2(优选SEQ ID NO:1)的抗体的用途。所述核酸可以被表达，纯化并使用所编码的多肽，优选将其固定在诊断上有用的载体上，以制备根据本发明的诊断上有用的载体。可使用所述核酸来设计和制备编码所述多肽的变体的核酸构建体，以表达和使用所得变体用于制备诊断上有用的载体以及用于检测相应的抗体，例如针对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2(优选SEQ ID NO:1)的抗体。

本发明的教导提供了试剂盒，优选用于诊断感染，更优选用于诊断线虫感染，最优选弓蛔虫感染。这种试剂盒是容器，其包含实施本发明方法所需的特定试剂，特别是根据本发明的诊断上有用的载体，任选除了实施本发明方法所需的一种或多种试剂和溶液以外，优选选自或全部选自样品稀释缓冲液、洗涤缓冲液和用于检测任何特异性捕获的抗体的工具以及任选用于检测该特异性捕获的抗体的工具，其可任选地连接至二抗，例如荧光、酶活性、放射性、化学发光、优选电化学发光标记或自旋标记。所述试剂盒可包括用于进行检测反应的化学溶液，例如用于比色反应的3,3',5,5'-四甲基联苯胺、磷酸对硝基苯酯、2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]或邻苯二胺二盐酸盐，用于电化学发光反应的三丙胺。此外，它可包括详细说明如何使用试剂盒的说明以及用于使本发明的多肽与来自受试者(优选人受试者)的体液样品接触的本发明的诊断上有用的载体。所述试剂盒可包括阴性和/或阳性对照血清，更优选两者。

此外，所述试剂盒可以包括阳性对照，例如已知与SEQ ID NO:1结合的重组抗体和/或已知与犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物结合的重组抗体，以及阴性对照，例如对SEQ IDNO:1或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物没有可检测的亲和力的蛋白质。最后，所述试剂盒可包括一种或多种校准物，其优选为包含SEQ ID NO:1结合抗体和/或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物结合抗体，优选SEQ ID NO:1结合抗体的溶液，以用于制备校准曲线。在更优选的实施方案中，所述试剂盒包括一种以上、优选三种或更多种校准物，其包含不同浓度的针对SEQ ID NO:1的抗体，所述抗体优选被针对人IgG类抗体的二抗识别。在更优选的实施方案中，所述试剂盒包括至少一种针对犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的抗体，所述抗体优选被针对人IgG类抗体的二抗识别。这样的校准物可以是或包含嵌合抗体，其包含人恒定区和任选的来自除人以外的其他哺乳动物的可变区。如果使用一种以上校准物，则所述两种或更多种校准物包含不同浓度的抗体，优选在允许使用者建立校准曲线的浓度范围内。

如果要检测与SEQ ID NO:1或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物(优选SEQ ID NO:1)结合的IgG类抗体，则可在测定IgG类抗体之前除去IgM和IgA类抗体或者降低其浓度。这可以通过预吸收IgM和IgA类抗体来实现，例如通过使它们与抗IgM或抗IgA抗体接触来实现，例如哺乳动物(优选山羊)抗人IgM或IgA抗体。该抗体可吸收可能干扰IgG检测测定法的抗体。合适的试剂可商购获得，例如由EUROIMMUN,Lübeck商品化的EUROSORB。备选地，这可以通过在检测针对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2(优选SEQ ID NO:1)的IgG抗体之前分离全部IgG类抗体来实现。

为了治疗目的，可提供疫苗，所述疫苗含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和/或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物，其可与一种或多种稀释剂、一种或多种助流剂和/或一种或多种填充剂一起配制。在现有技术中描述了合适制剂的制备，例如在US20130022631A1中。除纯化的多肽外，疫苗制剂还可包括药学上可接受的缓冲剂，例如pH范围为6.4-7.5的磷酸盐或磷酸盐-柠檬酸盐缓冲剂，所添加的稳定剂可包括以下一种或多种，但不限于：人血清白蛋白、明胶、还原糖和非还原糖、氨基酸、多元醇(例如山梨糖醇和甘露醇)、甘油有机和无机盐、聚乙烯吡咯烷酮等。稳定的制剂可以是适于人宿主中的肌肉内/真皮内/皮下/静脉内施用的液体形式。稳定的制剂可以是干燥的冻干形式，其能够在施用前用合适的溶剂重构。所述制剂可适于在人中口服和鼻内施用。

本发明提供了药物组合物或疫苗，该组合物或免疫原性组合物(例如疫苗)含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和/或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。免疫原性组合物或疫苗可包含使线虫或细菌失活并稳定疫苗的成分，有助于保存疫苗并防止其随时间失去其效力。向疫苗中加入佐剂以刺激针对疫苗的抗体的产生，以使疫苗更有效。佐剂可以是有机的或无机的。用于人类疫苗的最常见的无机佐剂包括磷酸铝和氢氧化铝。有机佐剂可以基于有机化合物角鲨烯并且能够使用水包油[角鲨烯]佐剂。

免疫原性组合物可包含有助于疫苗在储存期间保持其有效性的稳定剂(例如MgCl₂、MgSO₄、乳糖-山梨糖醇或山梨糖醇-明胶)以及防止细菌和真菌生长的防腐剂(例如硫柳汞、甲醛或苯酚衍生物、抗生素)。该组合物优选适于向受试者、优选哺乳动物受试者、更优选向人施用。这种药物组合物可包含药学上可接受的载体。该药物组合物可以例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、通过滴眼液、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或通过植入的储库施用，其中如本文所使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输液技术。该药物组合物可以以合适剂型提供，例如胶囊、片剂、水性混悬剂和溶液，优选以无菌形式提供。它可用于疾病治疗方法中，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。

用于诊断线虫感染(优选用于区分弓蛔虫感染与棘球绦虫、类圆线虫和蛔虫感染)的本发明方法可包括以下步骤：在来自受试者的第一样品中检测针对SEQ ID NO:1和犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的IgG类抗体，任选还包括在所述第一样品中检测针对SEQ IDNO:1和犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的IgM和/或IgA类抗体。

本发明的方法、试剂盒和载体可用于检测线虫感染。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“线虫感染”是指罹患弓蛔虫感染、更优选犬弓蛔虫感染的人的感染。

在优选实施方案中，如本文所使用的术语“在样品中检测”和/或“在样品中确定”是指对所述样品中化合物或分子的定性或定量测量。在许多情况下，检测抗体或检测抗体的存在就足以进行诊断，任选地是指确定样品中的抗体浓度是否超过优选通过使用ELISA测量所设定的某一阈值(通常由检出限所建议)，优选地如实施例中所述，该阈值在该方法的隐含检出限范围内。如果能够检测到该抗体，这将是有助于临床医生诊断的信息，并表明患者罹患疾病的可能性增加。在优选实施方案中，与在普通健康受试者中可发现的水平相比，可确定血清中抗体的相对浓度。在优选实施方案中，如本文所使用的术语“检测...存在”是指足以核实是否可以使用合适的复合检测方法来检测充足超出任何背景水平的信号，其表明存在目标抗体或比健康受试者存在更多目标抗体。在更优选的实施方案中，这可以涉及确定该浓度是否比在普通健康受试者中发现的目标抗体的浓度高至少0.1倍、优选0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、10000倍或100000倍。

在优选实施方案中，如本文所使用的术语“诊断”是指旨在获得信息的任何类型的程序，所述信息有助于评估患者是否在过去、诊断时或将来罹患或可能罹患或比普通受试者或对比受试者(后者优选具有类似症状)更有可能罹患某种疾病或病症，以发现疾病如何发展或在将来可能发展，或者评价患者对某些治疗(例如向过敏患者施用合适的药物(例如脱敏药物))的反应性。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，而且包括预测和/或监测疾病或病症的过程。

因此，术语“诊断”优选并不意味着根据本发明的诊断方法或试剂将是确定的并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断，但是可以指对所谓的“鉴别诊断”(即基于一系列诊断参数考虑一系列可能条件的可能性的系统诊断过程)的贡献。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或试剂。换句话说，该方法或试剂可涉及为受试者选择治疗方案。

本发明可用于提供受试者是否罹患内脏幼虫移行症(VLM)、眼幼虫移行症(OLM)、Weingarten病、Frimodt-

综合征或嗜酸性假白血病、线虫眼炎、弓蛔虫疾病、toxocarose或隐性弓蛔虫病的诊断或预后。

如本文所使用的“弓蛔虫感染”是指具有犬弓蛔虫、猫弓蛔虫、口鬃弓蛔虫(Toxocara mystax)或狮弓蛔虫(Toxascaris leonine)的受试者的感染。

如本文所使用的术语“样品”是指液体(血液、血清、尿液、精液、脑脊液)、完整的细胞或其提取物或者组织样品。所述样品可以是临床细胞学样本(例如细针乳腺活检或肺细胞学样本)或者来自例如胃、肺、乳腺、卵巢、胰腺、前列腺或脑肿瘤的人体组织样本。组织样本可以是新鲜的或冷冻的。优选地，所述样品是全血或血清。

如本文可互换使用的“受试者”或“患者”涉及人或动物，优选哺乳动物，更优选涉及人、犬科、啮齿目或猫科动物，并且最优选人。

本发明涉及一种方法，其包括在来自受试者的样品中检测是否存在针对抗原性多肽(例如包含SEQ ID NO:1的多肽和犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)的抗体。该方法优选包括固定所述抗体，然后进行所述抗体的特异性检测，例如通过以下步骤：a)(任选地)提供来自受试者的样品，b)使所述样品与根据本发明的诊断上有用的载体接触，在与包括所述诊断上有用的载体和所述抗体(更具体地说，用于特异性捕获所述抗体的工具和所述抗体)的复合物形成相容的条件下，c)分离任何所述复合物，例如通过除去所述样品，d)任选地洗涤所述复合物，以及e)任选地检测所述复合物。该方法优选是体外方法。根据本发明的用于预后、诊断、方法或测试试剂盒的复合物的检测包括使用选自免疫扩散技术、免疫电泳技术、光散射免疫测定法、凝集技术、标记免疫测定法(例如选自放射性标记免疫测定法、酶免疫测定法(例如比色测定法)、化学发光(优选电化学发光)免疫测定法和免疫荧光技术的那些)的方法。本领域技术人员熟悉这些方法，也在现有技术中进行了描述，例如在Zane,H.D.(2001):Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company中，特别是在第14章。该方法还可涉及在样品中测试针对SEQ IDNO:1或犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的抗体(优选针对SEQ ID NO:1的抗体)的亲和力。

在优选实施方案中，犬弓蛔虫幼虫处于幼虫期L2。能够根据de Savigny[deSavigny(1975),J.Parasitol.,61(1975),781-782页]培养和获得犬弓蛔虫幼虫。简而言之，在用哌嗪(不杀死虫卵的驱虫药)驱虫后或者在尸检后从幼犬身上采集雌虫。用自来水冲洗雌虫，然后解剖。生殖道在胃蛋白酶-HCl混合液中进行受控的人工消化以除去周围组织。将收集到的虫卵分散在用药棉塞住的玻璃管中，其中含有补充了1％福尔马林的0.9％NaCl溶液。将管在搅拌水浴中于37℃孵育2-3周。定期通过显微镜检查评估胚化水平。当比率为约50％时，将虫卵在Potter研磨机中剖开。进一步的步骤需要层流工作台所提供的无菌环境。将得到的含有活幼虫和死幼虫以及卵壳碎片的混合物在RPMI1640培养基中稀释。使用类似于用于从粪便中回收粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)幼虫的Baermann技术的方法，从粗混合物中提取出活幼虫。然后将幼虫分散在用于病毒学细胞培养的扁平小瓶中，其中装满了补充有谷氨酰胺的RPMI 1640培养基。最终的幼虫浓度为约1000个幼虫/mL。将小瓶在5％二氧化碳气氛中于37℃孵育。术语“体细胞裂解物”、“裂解物”和“提取物”在本文中可互换使用，是指包含通过犬弓蛔虫幼虫的裂解而产生的细胞蛋白和因子的水溶液或悬浮液。这种裂解物可包含大分子(例如DNA、RNA、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质等)和/或小分子(例如氨基酸、糖、脂肪酸等)或者来自经裂解的细胞的级分。在这种裂解物中存在的细胞碎片可以具有光滑的或颗粒状的结构。优选地，所述水性介质是水、生理盐水或缓冲溶液。

如本文所使用的术语裂解物还包括从上述裂解物制备或获得的制备物或级分。这些级分能够通过本领域技术人员已知的方法获得，例如层析法(包括例如亲和层析，离子交换层析，尺寸排阻层析，反相层析以及在柱中具有其他层析材料的层析)或分批法，其他分级方法(例如过滤方法(例如超滤，透析，离心中具有尺寸排阻的透析和浓缩，密度梯度或阶梯基质中的离心)，沉淀(例如亲和沉淀，盐溶或盐析(硫酸铵沉淀)，醇沉淀))或者用于分开裂解物中的上述成分的其他蛋白质化学、分子生物学、生物化学、免疫学、化学或物理学方法。在优选实施方案中，免疫原性比其他更强的那些级分是优选的。本领域技术人员能够参照上述一般说明和本文实施例中的具体说明来选择合适的方法并确定其免疫原性潜力，以及必要时对这些方法进行适当的修改或改变。

本文所使用的术语“结合在一起”是指包含至少两种抗原(即包含SEQ ID NO:1中所示序列或其变体的肽，以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)的诊断上有用的载体。在优选实施方案中，所述抗原位于所述诊断上有用的载体上使得两种抗原能够同时与同一样品接触。在甚至更优选的实施方案中，将包含SEQ ID NO:1中所示序列或其变体的肽以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物在它们连接到本发明的诊断上有用的载体上之前混合。这意味着，如果所述诊断上有用的载体是用于进行ELISA的微量滴定板，则包含SEQ ID NO:1中所示序列的肽和包含在犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物中的抗原可在同一孔中共定位。如果所述诊断上有用的载体是膜，则两种抗原可以共定位以形成一个蛋白斑点、点或泳道。

在优选实施方案中，所述抗原(即包含SEQ ID NO:1中所示序列或其变体的肽以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)在连接到所述诊断上有用的载体上之前是在溶液中的，而所述溶液具有不超过40.0μg/ml、不超过35.0μg/ml、不超过30.0μg/ml、不超过25.0μg/ml、不超过20.0μg/ml、不超过18.0μg/ml、不超过16.0μg/ml、不超过14.0μg/ml、不超过12.0μg/ml、不超过10.0μg/ml、不超过8.0μg/ml、不超过7.5μg/ml、不超过7.0μg/ml、不超过6.5μg/ml、不超过6.0μg/ml、不超过5.5μg/ml、不超过5.0μg/ml、不超过4.5μg/ml、不超过4.0μg/ml、不超过3.5μg/ml、不超过3.0μg/ml、不超过2.5μg/ml或不超过2.0μg/ml的抗原浓度，其包含一种或两种抗原。在其他优选实施方案中，所述诊断上有用的载体表面上一种或两种抗原的抗原(即包含SEQ ID NO:1中所示序列或其变体的肽以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物)密度为每0.32cm²(对应96孔板的单个孔的面积)不超过2.0μg、不超过1.8μg、不超过1.6μg、不超过1.4μg、不超过1.2μg、不超过1.0μg、不超过0.9μg、不超过0.8μg、不超过0.7μg、不超过0.6μg、不超过0.5μg、不超过0.4μg、不超过0.3μg、不超过0.2μg、不超过0.1μg或者不超过0.05μg。对于其他诊断上有用的载体(例如载玻片和印迹膜)，在优选实施方案中能够使用相同的抗原密度。

通过以下实施例、序列和附图进一步说明了本发明，从中可以获得本发明的其他特征、实施方案、方面和优点。与本文所描述的方法和材料类似或等效的所有方法和材料都能够用于用本文所描述的合适方法和材料进行的本发明的实施或测试中。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用将其整体并入。此外，除非另有说明，所述材料、方法和实施例都仅仅是说明性的而不旨在限制。

SEQ ID NO:1(犬弓蛔虫TES-30)

MIAAIVVLLCLHLSATNACATNNDCGIFQVCVNNVCVANNQGCNPPCVAPQVCVAPMCVAPPAATTTAAPGVTTTRPRACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWCTQTGSRVVWFDQSTVGNFGSELNFVNSFAVGRGVTRYWIGVNRQFGQWVFTNGSPVIFSNWRPSQPDGCCG SNVTCAFVNYANFLGQWDDAPCGSLFTTPQGFVCKRPL

SEQ ID NO:2(犬弓蛔虫TES-30N末端His-标签化)

MSHHHHHHHHSMIAAIVVLLCLHLSATNACATNNDCGIFQVCVNNVCVANNQGCNPPCVAPQVCVAPMCVAPPPAATTTAAPGVTTTRPRACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWCTQTGSRVVWFDQSTVGNFGSELNFVNSFAVGRGVTRYWIGVNRQFGQWVFTNGSPVIFSNWRPSQPDGCCGSNVTCAFVNYANFLGQWDDAPCGSLFTTPQGFVCKRPL

SEQ ID NO:3(犬弓蛔虫TES-30 52至102aa片段)

VCVAPMCVAPPPAATTTAAPGVTTTRPRACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFL

SEQ ID NO:4(犬弓蛔虫TES-30 172至207aa片段)

RPSQPDGCCGSNVTCAFVNYANFLGQWDDAPCGSLF

附图说明

图1显示了使用犬弓蛔虫TES-30、犬弓蛔虫幼虫体细胞裂解物、犬弓蛔虫排泄分泌(TES)抗原以及TES-30与体细胞幼虫裂解物的结合以检测罹患弓蛔虫感染的患者的样品中弓蛔虫结合抗体的不同ELISA的结果。统计上显著的阳性检测结果以粗体显示。不明确的结果加下划线。

图2显示了使用犬弓蛔虫TES-30、犬弓蛔虫幼虫体细胞裂解物、犬弓蛔虫排泄分泌(TES)抗原以及TES-30与体细胞幼虫裂解物的结合以检测健康对照组的样品中弓蛔虫结合抗体的不同ELISA的结果。统计上显著的阳性检测结果以粗体显示。不明确的结果加下划线。

图3显示了使用犬弓蛔虫TES-30、犬弓蛔虫幼虫体细胞裂解物、犬弓蛔虫排泄分泌(TES)抗原以及TES-30与体细胞幼虫裂解物的结合以检测罹患棘球绦虫、类圆线虫或蛔虫感染的患者的样品中弓蛔虫结合抗体的不同ELISA的结果。统计上显著的阳性检测结果以粗体显示。不明确的结果加下划线。

图4显示了ELISA实验的汇总。(a)源自用罹患弓蛔虫感染的患者的样品测试的ELISA结果的灵敏性。(b)源自用健康对照组样品测试的ELISA结果的特异性。(c)源自用罹患棘球绦虫、类圆线虫或蛔虫感染的患者的样品测试的ELISA结果的特异性(寄生虫病)。(d)包括(a)、(b)和(c)的结果的综合得分。

实施例

进行以下实验以在用于检测人血清或血浆中的特异性抗弓蛔虫IgG抗体的间接ELISA中评价不同弓蛔虫抗原。分析下列抗原a)灵敏性、b)对弓蛔虫阴性患者样品的特异性和c)对关于其他寄生虫病阳性的样品的特异性。

所测试的弓蛔虫属物种抗原的描述

分析了以下抗原：1)弓蛔虫属物种的重组mTES-30，2)犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原，3)犬弓蛔虫幼虫的排泄分泌(E/S)抗原和4)犬弓蛔虫的体细胞抗原结合重组mTES-30。

样品：

组1(灵敏性组)

该灵敏性组包含16个已证实患有弓蛔虫感染的患者的样品。通过ELISA和/或印迹技术对样品进行血清学确定(图1)。

组2(特异性组)

该特异性组包含48个源自健康个体(来自德国的孕妇、儿童和献血者)的样品(图2)。

组3(特异性组)

该特异性组包含32个经证实患有关于蛔虫病、棘球绦虫病和类圆线虫病的感染的患者的样品。通过ELISA对样品进行血清学确定(图3)。

实验

1.经包被的微量滴定板的制备

使用以下抗原

·弓蛔虫属物种的重组mTES-30

·犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原(裂解物)

·犬弓蛔虫幼虫的排泄分泌(E/S)抗原

·犬弓蛔虫的体细胞抗原(裂解物)与重组mTES-30结合

为在微量滴定ELISA中使用，将这些抗原在碳酸盐缓冲液中稀释至以下终浓度：

·弓蛔虫属物种的重组mTES-30，2.0μg/ml

·犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原，0.5μg/ml

·犬弓蛔虫幼虫的排泄分泌(E/S)抗原，1.0μg/ml

·犬弓蛔虫的体细胞抗原(0.5μg/ml)与重组mTES-30(2.0μg/ml)结合

用每孔100μl抗原稀释液包被ELISA微量滴定板(NUNC,Roskilde,Denmark)。

2.实验方法

按照商用EUROIMMUN ELISA测试试剂盒(例如EI 2311-9601G)的说明，将样品在IgG样品缓冲液中1:101稀释，加到微量滴定板上并孵育。简而言之：在37℃下60min；使用EUROIMMUN洗涤缓冲液进行3个洗涤步骤；每孔添加100μl的过氧化物酶标记的抗人IgG缀合物(山羊)；在37℃下孵育30分钟；使用EUROIMMUN洗涤缓冲液进行3个洗涤步骤；每孔添加100μl的色原/底物溶液(TMB/H₂O₂)；室温下孵育30分钟；添加100μl的终止溶液(0.5M硫酸)；在450nm处测量光密度。

使用组1来评估各抗原检测特异性抗弓蛔虫IgG抗体的灵敏性。孵育组2和组3以确定测试系统的特异性。

3.结果解释

1.重组mTES-30、犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原、犬弓蛔虫的E/S抗原以及mTES-30与体细胞幼虫抗原结合的灵敏性

弓蛔虫属物种的重组mTES-30、犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原、犬弓蛔虫幼虫的排泄分泌(E/S)抗原以及犬弓蛔虫体细胞抗原与重组mTES-30结合的对比显示出如图4a所示的灵敏性。

用于评估该测试的灵敏性的样品集是源自抗弓蛔虫IgG抗体阳性患者的样品。重组mTES-30与犬弓蛔虫幼虫体细胞抗原的结合表明其对抗弓蛔虫IgG抗体的检测比单一抗原更为灵敏，并且显示出与商用犬弓蛔虫的E/S抗原相当的灵敏性。

2.重组mTES-30、犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原、犬弓蛔虫的E/S抗原以及mTES-30与体细胞幼虫抗原结合的特异性

重组mTES-30、犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原、犬弓蛔虫的E/S抗原以及mTES-30与体细胞幼虫抗原结合的对比显示出如图4b所示的特异性。

测得的抗IgG抗体可能是由于早期的弓蛔虫接触(在德国流行率为2-5％)。重组mTES-30以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原均显示高特异性。在该研究中，犬弓蛔虫的E/S抗原的特异性产生最低的特异性。

3.重组mTES-30、犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原、犬弓蛔虫的E/S抗原以及mTES-30与体细胞幼虫抗原结合对其他寄生虫病的特异性

重组mTES-30、犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原、犬弓蛔虫的E/S抗原以及mTES-30与体细胞幼虫抗原结合的对比显示出如图4c所示的特异性。

测得的抗IgG抗体可能是由于早期的弓蛔虫接触。重组mTES-30以及犬弓蛔虫幼虫的体细胞抗原均显示高特异性。在该研究中，犬弓蛔虫的E/S抗原的特异性产生最低的特异性。

结论

重组mTES-30与犬弓蛔虫幼虫体细胞抗原的结合所产生的数据表明，与基于E/S抗原的ELISA相比，该抗原结合允许以相当的灵敏性开发特异性测试系统(图4d)。

本文所引用的所有文件均通过引用将其整体并入本文。

本文说明性描述的本发明可以在缺乏本文未具体公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下合适地实施。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等都应当广义而不受限制地进行理解。另外，本文中所采用的术语和表述都是用作描述术语而不是限制的术语，并且这些术语和表述的使用无意排除所示和所描述的特征或其部分的任何等价物，但应认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以诉诸于对本文所公开的具体发明的修改和变更，并且这些修改和变更都被认为在本发明的范围内。本文已广义地和一般性地描述了本发明。落入一般公开内容内的每个较窄种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括具有从该类别中移除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般性描述，而不管在本文中是否具体记载了所移除的材料。此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，也就因此而根据该马库什组的任何单独成员或成员亚组描述了本发明。本发明的更多实施方案将随以下权利要求而变得显而易见的。

序列表

<110> 欧蒙医学实验诊断股份公司

<120> 用于诊断线虫感染的新测定法

<130> 19PP127EP

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<213> 犬弓蛔虫

<400> 1

Met Ile Ala Ala Ile Val Val Leu Leu Cys Leu His Leu Ser Ala Thr

1 5 10 15

Asn Ala Cys Ala Thr Asn Asn Asp Cys Gly Ile Phe Gln Val Cys Val

20 25 30

Asn Asn Val Cys Val Ala Asn Asn Gln Gly Cys Asn Pro Pro Cys Val

35 40 45

Ala Pro Gln Val Cys Val Ala Pro Met Cys Val Ala Pro Pro Pro Ala

50 55 60

Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro Gly Val Thr Thr Thr Arg Pro Arg Ala

65 70 75 80

Cys Pro Pro Asn Trp Thr Pro Phe Asn Asn Asn Cys Tyr Ile Ala Ser

85 90 95

Leu Pro Gly Arg Phe Leu Phe Asn Gln Ala Ser Asp Trp Cys Thr Gln

100 105 110

Thr Gly Ser Arg Val Val Trp Phe Asp Gln Ser Thr Val Gly Asn Phe

115 120 125

Gly Ser Glu Leu Asn Phe Val Asn Ser Phe Ala Val Gly Arg Gly Val

130 135 140

Thr Arg Tyr Trp Ile Gly Val Asn Arg Gln Phe Gly Gln Trp Val Phe

145 150 155 160

Thr Asn Gly Ser Pro Val Ile Phe Ser Asn Trp Arg Pro Ser Gln Pro

165 170 175

Asp Gly Cys Cys Gly Ser Asn Val Thr Cys Ala Phe Val Asn Tyr Ala

180 185 190

Asn Phe Leu Gly Gln Trp Asp Asp Ala Pro Cys Gly Ser Leu Phe Thr

195 200 205

Thr Pro Gln Gly Phe Val Cys Lys Arg Pro Leu

210 215

<210> 2

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 犬弓蛔虫TES-30 His-标签

<400> 2

Met Ser His His His His His His His His Ser Met Ile Ala Ala Ile

1 5 10 15

Val Val Leu Leu Cys Leu His Leu Ser Ala Thr Asn Ala Cys Ala Thr

20 25 30

Asn Asn Asp Cys Gly Ile Phe Gln Val Cys Val Asn Asn Val Cys Val

35 40 45

Ala Asn Asn Gln Gly Cys Asn Pro Pro Cys Val Ala Pro Gln Val Cys

50 55 60

Val Ala Pro Met Cys Val Ala Pro Pro Pro Ala Ala Thr Thr Thr Ala

65 70 75 80

Ala Pro Gly Val Thr Thr Thr Arg Pro Arg Ala Cys Pro Pro Asn Trp

85 90 95

Thr Pro Phe Asn Asn Asn Cys Tyr Ile Ala Ser Leu Pro Gly Arg Phe

100 105 110

Leu Phe Asn Gln Ala Ser Asp Trp Cys Thr Gln Thr Gly Ser Arg Val

115 120 125

Val Trp Phe Asp Gln Ser Thr Val Gly Asn Phe Gly Ser Glu Leu Asn

130 135 140

Phe Val Asn Ser Phe Ala Val Gly Arg Gly Val Thr Arg Tyr Trp Ile

145 150 155 160

Gly Val Asn Arg Gln Phe Gly Gln Trp Val Phe Thr Asn Gly Ser Pro

165 170 175

Val Ile Phe Ser Asn Trp Arg Pro Ser Gln Pro Asp Gly Cys Cys Gly

180 185 190

Ser Asn Val Thr Cys Ala Phe Val Asn Tyr Ala Asn Phe Leu Gly Gln

195 200 205

Trp Asp Asp Ala Pro Cys Gly Ser Leu Phe Thr Thr Pro Gln Gly Phe

210 215 220

Val Cys Lys Arg Pro Leu

225 230

<210> 3

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 犬弓蛔虫TES-30 52至102 aa片段

<400> 3

Val Cys Val Ala Pro Met Cys Val Ala Pro Pro Pro Ala Ala Thr Thr

1 5 10 15

Thr Ala Ala Pro Gly Val Thr Thr Thr Arg Pro Arg Ala Cys Pro Pro

20 25 30

Asn Trp Thr Pro Phe Asn Asn Asn Cys Tyr Ile Ala Ser Leu Pro Gly

35 40 45

Arg Phe Leu

50

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 犬弓蛔虫TES-30 172至207 aa片段

<400> 4

Arg Pro Ser Gln Pro Asp Gly Cys Cys Gly Ser Asn Val Thr Cys Ala

1 5 10 15

Phe Val Asn Tyr Ala Asn Phe Leu Gly Gln Trp Asp Asp Ala Pro Cys

20 25 30

Gly Ser Leu Phe

35

Claims

1.诊断上有用的载体，其包含：

a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽，和

b)犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。

2.根据权利要求1所述的诊断上有用的载体，其中所述肽和所述裂解物结合在一起。

3.根据权利要求1或2所述的诊断上有用的载体，其中所述载体选自玻璃载玻片、生物芯片、微量滴定板、侧流装置、测试条、膜、线性印迹、层析柱和珠粒。

4.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至3所述的诊断上有用的载体和用于检测人、犬科或啮齿目抗体的标记抗体。

5.一种用于诊断弓蛔虫感染的方法，其包括：

在患者样品中检测针对SEQ ID NO:1的抗体和/或针对犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的抗体的存在。

6.一种组合物，其包含

a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽，和

b)犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。

7.根据权利要求6所述的组合物或者根据权利要求1至3所述的诊断上有用的载体，其用于弓蛔虫感染诊断。

8.确定针对根据SEQ ID NO:1的犬弓蛔虫蛋白的抗体和/或针对来自犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物的蛋白的抗体的存在的方法，其包括

i)使分离自患有弓蛔虫感染的受试者的样品与包含SEQ ID NO:1和/或其变体的多肽以及与犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物接触，其中所述多肽和/或所述裂解物与结合至SEQID NO:1或体细胞裂解物的抗体特异性结合；以及

ii)确定针对SEQ ID NO:1的抗体和/或针对所述体细胞裂解物的抗体的存在。

9.根据SEQ ID NO:1的犬弓蛔虫蛋白和犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物在制备用于检测弓蛔虫感染的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含：

a)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其变体的肽，和

b)犬弓蛔虫幼虫的体细胞裂解物。

10.根据权利要求5所述的方法、根据权利要求7所述的用于所述用途的组合物或载体、根据权利要求8所述的方法或者根据权利要求9所述的用途，其中所述弓蛔虫感染是犬弓蛔虫感染。

11.根据权利要求5或8所述的方法，其中所述样品为血液、血清、血浆、尿液或唾液。

12.根据权利要求5所述的方法、根据权利要求7所述的用于所述用途的组合物或载体或者根据权利要求9所述的用途，其中所述弓蛔虫感染能够与棘球绦虫、类圆线虫和蛔虫感染区分开来。

13.根据权利要求8所述的方法或者根据权利要求9所述的用途，其中所述肽和所述裂解物是结合在一起的。

14.根据权利要求5所述的方法或者根据权利要求8所述的方法，其中针对SEQ ID NO:1的抗体和/或针对所述体细胞裂解物的抗体选自IgG、IgA和IgM类抗体。

15.根据权利要求5所述的方法、根据权利要求8所述的方法或者根据权利要求9所述的用途，其中所述检测或确定包括印迹测定法、化学发光免疫测定法、光散射免疫测定法、放射性标记免疫测定法或者免疫荧光测定法。