JP6000239B2 - 未変性Cochlin−tomoprotein(CTP)に反応する抗体及びそれを用いたCTPの測定方法 - Google Patents
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Description
(1)配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドに含まれる抗原決定基を認識し、未変性CTPに反応することを特徴とする抗CTP抗体。
(2)配列番号1のアミノ酸番号118〜132からなるペプチドを免疫原として得られる、(1)に記載の抗CTP抗体。
(3)未変性CTPに反応する第1の抗体で捕捉した未変性のCTPを用意し、該未変性のCTPを認識する第2の抗体を選別する工程を含む、未変性のCTPに反応する抗体のスクリーニング方法。
(4)前記第1の抗体が(1)に記載の抗体である、請求項3に記載の未変性のCTPに反応する抗体のスクリーニング方法。
(5)(1)または(2)に記載の抗体を少なくとも一つ使用する、配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含む蛋白質の免疫学的測定方法。
(6)配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含む蛋白質がCTPである、(5)に記載の方法。
(7)(1)または(2)に記載の抗体を少なくとも一つ使用してCTPを免疫学的に測定する工程を含む、外リンパ瘻の検査方法。
(8)(1)または(2)に記載の抗体を少なくとも一つ含む、CTP測定キット。
(9)外リンパ瘻の診断のための(8)に記載の測定キット。
なお、本明細書において、蛋白質の精製及び解析、並びに抗体の作製等の手法は、特に明記しない限り、新生化学実験講座(日本生化学会編;東京化学同人)、Antibodies − A Laboratory Manual(E.Harlow, et al., Cold Spring Harbor Laboratory(1988))等の一般的実験書に記載の方法またはそれに準じて行うことができる。
本発明の抗体は、配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドに含まれる抗原決定基(以下、これを「エピトープ」と称することがある)を認識し、未変性CTPに反応することを特徴とする。そして配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含む蛋白質以外の蛋白質には反応しない抗体であることが好ましい。なお、本発明の抗体は未変性CTPに反応する限り、さらに変性CTPに反応してもよいし、さらに配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含むCochlinのアイソフォームに反応してもよい。ここで、配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含むCochlinのアイソフォームとしては、CTP以外にp63が知られており(Ikezono et al., Biochem.Biophys.Acta, 1535,3,258−265(2001))、それに反応してもよい。
未変性のCTPとは、タンパク質の3次構造が著しく変化するような変性処理を施していないCTPを指す。変性処理としては、たとえば、タンパク質変性剤(SDS等の界面活性剤、DTT等の還元剤、尿素、アセトンなど)の添加や加熱処理等が挙げられる。なお、免疫測定法におけるサンプル希釈液等では、低濃度の界面活性剤等が含まれている場合もあるが、このような条件は変性処理とは言わない。
という。またIgGをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記2つのFab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')2という。
本発明の未変性のCTPに反応する抗体のスクリーニング方法は、未変性CTPに反応する第1の抗体で捕捉した未変性のCTPを用意し、該未変性のCTPを認識する第2の抗体を選別する工程を含む。ここで、第1の抗体としては、上記配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドに含まれる抗原決定基を認識し、未変性CTPに反応する抗体であることが好ましい。
すなわち、上記本発明の抗体を用いることにより、未変性CTPに反応する新たな抗体を得ることができる。例えば、ELISA法において、第1の抗体として上記本発明の抗体を用い、第2の抗体として抗CTP抗体のライブラリーを使用し、スクリーニングを行うことにより、未変性CTPに反応する新たな抗体を選別することができる。なお、スクリーニング方法で得られる抗体は未変性CTPに反応する抗体である限り、特に限定されないが、高次構造や配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチド以外の領域に含まれる抗原決定基を認識する抗体であることが好ましい。
本発明の測定方法は、上記本発明の抗体を少なくとも一つ使用して配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含む蛋白質、好ましくはCTPを免疫学的に測定する工程を含む。なお、定性的な測定も定量的な測定も含まれる。
本発明において、外リンパ瘻(Perilymph fistula)とは、内耳組織に存在する外リンパが何らかの要因により内耳窓(正円窓、卵円窓のいずれかまたは両者)あるいはfissura ante fenestram(内耳と中耳の間の骨裂隙)から鼓室内(中耳)に漏出して聴覚・平衡感覚の障害を生じる疾患である。該疾患は、外リンパが中耳へ漏出していることを確認することにより検出することができる。本発明の外リンパ瘻の検出方法は、該疾患に罹患していることが疑われる患者の中耳に存在し得る体液のうち、外リンパのみに存在するCTPの存在を検出して、該患者が外リンパ瘻に罹患している可能性の指標とすることを特徴とする方法である。本法によれば、外リンパ瘻発症の要因や機構によらず検出を行うことができる。
該疾患に罹患していることが疑われる患者には、突発性難聴、内耳性難聴、メニエール病、前庭神経炎、頭位めまい症、内耳性めまい等の患者も挙げられる。厳密に言えばこれらは症候診断名であり、原因診断名である外リンパ瘻が、上記の疾患の原因となっていることは以前から指摘されている。したがって、本発明の方法により外リンパ瘻を検査することでこれらの疾患の検査も可能である。
例えば、真珠腫性中耳炎や外耳腫瘍、中耳腫瘍、聴神経腫瘍等では骨破壊により外リンパ瘻をきたすことが知られており、この病変の深さがどの程度であるかを本検査により診断できる。すなわち、病変が骨を破壊し内耳に至っていれば、中耳に存在する体液からCTPが検出され、それよりも浅ければCTPは検出されない。また、鼓室形成術、アブミ骨手術等では、正円窓や卵円窓に外科的処置を加えることがあり、手術操作によりこれらを損傷したか否かを本測定により判断できる。さらには、人工内耳手術において、人工内耳の電極挿入部位を決定するのにも役立つ。特に内耳、中耳奇形を有する症例ではその有用性が高い。これらの検査においては中耳洗浄液、あるいは病変部位や手術操作部位からの漏出液を直接採取して検査に供することができる。
ELISA法による測定では、発光シグナルの定量化により、外リンパの中耳への漏出量を定量的に測定することが可能となる。CTPアナログを用意する必要がないため、異なるエピトープでCTPを認識する2種類の抗体を用いたサンドイッチ型測定が特に好ましい。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロタイタープレート等の容器中で、試料と固相担体に担持させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。なお、目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
本発明のCTP測定キットは、上記本発明の抗体を含む。該試薬キットを用いれば、本発明の外リンパ瘻の検出を必要時に簡便・迅速に行うことができ、その結果を、他の疾患との鑑別や、治療方針の決定等に役立てることができる。
ヒトCTPのシグナル配列を除いた配列番号1のアミノ酸番号32〜132に相当するアミノ酸のN末端側にポリヒスチジンタグを融合させて大腸菌内で発現させ、これを免疫原としてモノクローナル抗体を作製した。
まず、ヒトCochlinのヌクレオチド配列を参考にして大腸菌発現用ベクターに組込み、これを大腸菌に形質転換させた。大腸菌にIPTGを加えることによって組込まれたベクターにコードされたrCTP(リコンビナントCTP)を誘導発現させた。誘導発現した菌体を遠心集菌し、超音波処理によって菌体を破砕した。破砕後、遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分画した。得られた発現タンパク質は不溶性凝集体を形成したので、不溶性画分を尿素にて可溶化し、ニッケルカラムにてアフィニティー精製した。得られたrCTPをマウスに免疫し、モノクローナル抗体を得た。抗体のスクリーニングは、ELISA法によりrCTPとの反応を確認することにより行い、最終的に得られたモノクローナル抗体とヒトCTPとの反応はウェスタンブロット法により確認した。
CTPのシグナル配列を除いたORFの5'末端に翻訳開始コドンを付加するためのプライマー(5'−ATG ATC ACA TGT TTT ACC AG−3':配列番号9)、および3'末端に終止コドンを付加するためのプライマー(5'―TAT TCA TTACTC CTG TGT ACT ACT−3': 配列番号10)を用意し、COCH遺伝子を含むイメージクローン(IMAGE:27789)(クラボウ 大阪)を鋳型としてPCR増幅を行った。この項で示した配列では、開始コドンおよび終止コドンを下線で示した。
得られたPCR産物を、pCR T7/NT−TOPO TA Expression Kit(Invitrogen社)の添付文書に従って大腸菌用発現ベクターpCR T7/NTに組込んだ後、キット添付の大腸菌BL21(DE3)pLysS株に形質転換して、rCTP発現用組換え大腸菌を得た。
得られたrCTP発現用組換え大腸菌をアンピシリン添加LB培地1500mlに接種し、37℃で振とう培養した。培養液の600nmの吸光度が0.5に到達した時点で、培養液にIPTGを終濃度0.1mMとなるように添加し、引き続き37℃で3時間振とう培養した。
該培養液を、4℃、3000rpmで30分間遠心分離し、沈澱した菌体を回収し、10mlの破砕用緩衝液(50mM Tris−HCl pH8.0、50mM NaCl、1mM EDTA)に懸濁した。氷冷しながら菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理することにより菌体を破砕し、これを4℃、3000rpmで30分間遠心分離した。その沈殿を封入体洗浄液(0.5% TrironX−100、1mM EDTA)に懸濁し、これを4℃、3000rpmで30分間遠心分離するという洗浄操作を3回繰り返した。洗浄後の沈殿を8M尿素に溶解し、封入体溶液とした。
得られた封入体溶液を変性結合緩衝液(8M Urea、500 mM NaCl、20 mM Sodium Phosphate pH 7.8)で平衡化させたNi−NTA Agaroseに加え、室温で1時間反応させた。反応後の樹脂をグラスフィルター付ロートで回収し、これを樹脂容積の5倍量の変性結合緩衝液で洗浄した後、さらに樹脂容積の5倍量の変性洗浄緩衝液(8M Urea、500 mM NaCl、20 mM Sodium Phosphate pH 6.0)で洗浄した。洗浄後の樹脂に変性溶出緩衝液(8M Urea、500 mM NaCl、100mM imidazol、20 mM Sodium Phosphate pH 6.0)を樹脂容積の5倍量加え、室温で1時間反応させた。該反応液をグラスフィルター付ロートで回収し、大腸菌発現rCTPを得た。
大腸菌発現rCTPをKLHで架橋したものを抗原として、該抗原をC57BL6マウスに50μgずつ2週間おきに3回投与した。最後の免疫感作から1週間後に、大腸菌発現rCTP固定化プレートを用いたELISA法により抗体価が上昇していることを確認した上で、採取した脾臓を細胞融合用ミエローマ(P3U1)とPEG法にて融合した。得られたハイブリドーマをHAT培地にて選択し、抗体産生ハイブリドーマを得た。
96穴プレートに免疫原である大腸菌発現rCTPを固相化し、それとハイブリドーマ培養上清との反応を確認した。検出には、Rabbit anti Mouse IgG/HRP(ZYMED社)を使用した。同時に、ブランクとしてβアクチン固相プレートとの反応も確認し、ブランクとは反応せず、大腸菌発現rCTPに反応する抗体を選別した。最終的に得られた陽性株は1種のみであった(これを「抗CTP(E.coli)抗体」と称することがある)。
試料として用いたヒト外リンパは、患者に対して採取および研究目的の使用について十分な説明を行い、同意を得た上で用いた。
試料を3×Loading buffer(150mM Tris−HCl pH6.8、300mM DTT、6%SDS、0.3% bromophenol blue、30% glycerol)と混合し、100℃で5分間加熱した。該試料を15% polyacrylamide(PAGEL、ATTO社)にアプライし、running buffer(25 mM Tris、192mM Glycine、0.1% SDS)を使用して、20mAで2時間、電気泳動を行った後、セミドライ法によりPVDF膜(Immobilon−PSQ、Millipore社)に転写した。転写後のPVDF膜に、一次抗体として抗CTP(E.coli)抗体を反応させた後、二次抗体としてHRP−Rabbit anti−Mouse IgG(H+L)(ZYMED社)を反応させた。その後、ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GEヘルスケア社)を使用してCTPに由来する16kDaのバンドを検出し、抗CTP(E.coli)抗体がヒト生体試料中のCTPを認識することを確認した。
抗LCCL抗体、抗LCCL1抗体、抗LCCL2抗体および抗LCCL3抗体は、特開2004−85552号公報に記載のものを使用した。また、これらとは別のポリペプチドを抗原として、新たに3種類の抗体を作製した。得られたポリクローナル抗体とヒトCTPとの反応はウェスタンブロット法により確認した。
新たな抗原ポリペプチドとしては、配列表の配列番号1のアミノ酸番号34〜49に相当するアミノ酸よりなるポリペプチド(これを抗原ポリペプチドとして作製した抗体を「抗CTP−A抗体」と称することがある)、同じくアミノ酸番号91〜108に相当するアミノ酸よりなるポリペプチド(これを抗原ポリペプチドとして作製した抗体を「抗CTP−B抗体」と称することがある)、更にアミノ酸番号118〜132に相当するアミノ酸よりなるポリペプチド(これを抗原ポリペプチドとして作製した抗体を「抗CTP−C抗体」と称することがある)をそれぞれ選択した。
上記(1)において選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを合成した。ここで、抗CTP−B抗体、抗CTP−C抗体作製用抗原ポリペプチドについては、該アミノ酸配列中にシステインが含まれていないので、それぞれの配列のN末端にシステインが付加されたポリペプチドを合成した。システインを介し、キャリア蛋白質としてウシサイログロブリンを結合させて免疫原とした。
免疫は、ウサギ1羽に対して1〜2週間おきに免疫原を100μg投与することにより行った。8回免疫後、採血を行い、血清を分離しこれを抗血清とした。これらの抗血清は、実施例1(4)と同様なELISA法により、それぞれ、各免疫原である抗原ポリペプチドおよび大腸菌発現rCTPとの反応を確認した後、別途作成した抗原ポリペプチド結合カラムを用いて精製した。
一次抗体に抗CTP−A抗体、抗CTP−B抗体、または抗CTP−C抗体を使用し、二次抗体としてImmunoglobulins/HRP[Goat Polyclonal Anti−Rabbit](DAKO社)を使用した以外は、実施例1(5)に記載の方法で行い、各ポリクローナル抗体は、いずれもヒト生体試料中のCTPを認識することを確認した。
実施例1および実施例2で作製した抗体が、ウェスタンブロット法によりCTPを検出できたことから、変性されたCTPもしくは変性条件下にあるCTPは検出可能であることがわかった。そこで、これらの抗体が未変性のCTPも検出可能であるかを確認するために、以下の検討を行った。
実施例1および実施例2で作製した各抗体をプロテインG固定化担体に結合させた後、ブタ外リンパ又はヒト外リンパと反応させた。反応後、遠心分離により沈殿(プロテインG固定化担体に結合した抗原抗体複合体)および上清(抗体未反応画分)を回収し、それぞれSDS−PAGE後にウェスタンブロッティングを行った。どちらの画分にCTPが検出されるかを調べることで、各抗体が未変性CTPを認識するか否かを確認した。
具体的には、PBSで平衡化した20μgのProteinG on Sepharose 4B(GEヘルスケア)に各抗体30μgを反応させた後、未結合抗体を除去した。この抗体結合体に、PBSで10倍に希釈したブタ外リンパまたはヒト外リンパの20μlを添加し、4℃で一晩振盪反応させた。反応後、4℃、3000rpmで2分間遠心分離し、上清と沈殿をそれぞれ回収した。
ウェスタンブロッティングは、一次抗体に抗LCCL3抗体を使用し、二次抗体としてImmunoglobulins/HRP[Goat Polyclonal Anti−Rabbit](DAKO社)を使用した以外は、実施例1(5)に記載の方法で行った。その結果を表2に示す。未変性CTPと結合したものを○、結合しなかったものを×で示した。抗CTP−C抗体のみが、外リンパ中の未変性CTPを認識できることが確認された。
未変性CTPを認識するモノクローナル抗体の作製のため、抗CTP(Baculo)モノクローナル抗体の作製を試みた。
ヒトCTPの全長にあたる配列番号1のアミノ酸番号1〜132に相当するアミノ酸のC末端側にFLAGタグを融合させてカイコ体内で発現させ、これを免疫原としてモノクローナル抗体を作製した。
まず、ヒトCochlinのヌクレオチド配列を参考にしてトランスファーベクターに組込み、組換えバキュロウイルス株を樹立した。これをカイコ蛹に感染させることによって、カイコ体内にrCTPを生産させた。このカイコ体液から、抗FLAG担体にてアフィニティー精製した。得られたrCTPをマウスに免疫し、モノクローナル抗体を得た。抗体のスクリーニングは、ELISA法によりrCTPとの反応を確認すると共に、実施例3で作製した抗CTP−C抗体に補足させた未変性のヒトCTPとの反応を確認することにより行った。
ヒトCTPのORFの5'末端にBglII認識部位を付加するためのプライマーおよび3'末端にNheI認識部位を付加するためのプライマーを用意し、COCH遺伝子を含むプラスミドを鋳型としてPCR増幅を行った。このPCR産物をBglIIとNheIで消化し、プラスミドpM23(片倉工業)のBglIIとXbaI認識部位に挿入し、CTP組換えバキュロウィルス発現系を樹立させた。このCTP組換えバキュロウィルスをカイコ蛹に感染させた。感染後のカイコ体液を抗FLAG抗体カラムに吸着させた後、トロンビンによりFLAGタグを切断することで、カイコ発現rCTPを得た。
カイコ発現rCTPを抗原として、該抗原をBalb/cマウスに50μgずつ隔日で4回フットパッド免疫した。その後、採取したリンパ細胞をミエローマ細胞(P3U1)とPEG法にて融合した。得られたハイブリドーマをHAT培地にて選択し、抗体産生ハイブリドーマを得た。
実施例1(4)と同様なELISA法により、免疫原であるカイコ発現rCTPとハイブリドーマ培養上清との反応を確認した。検出には、Goat anti−mouse IgG−POD F(ab')2(MBL社)を使用した。
その結果を表3に示す。11種のハイブリドーマにおいて、カイコ発現rCTPとの反応が確認された。
EIAプレート(MAXISORP、Nunc社)に5μg/ml抗CTP−C抗体を100μl/well添加し、4℃で一晩静置した。翌日、25%ブロックエース(大日本住友製薬)を300μl/well添加し、37℃で2時間ブロッキングした。各ウェルを洗浄用緩衝液(0.05%Tween−20、20mM PBS pH7.4)で洗浄後、PBSで40倍希釈したヒト外リンパを100μ/well添加し、室温で1時間振盪反応させた。各ウェルを洗浄した後、一次抗体としてハイブリドーマ培養上清を100μ/well添加し、室温で2時間振盪反応させた。各ウェルを洗浄した後、二次抗体として、10%ブロックエースで2000倍希釈したRabbit anti−mouse Immunoglobulins/HRP(Dako)を添加し、室温で1時間振盪反応させた。各ウェルを洗浄した後、SureBlue Reserve TMB microwell substrate(KPL社)を100μ/well添加し、室温で15分間反応させた後、stop solutionを添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで波長450nmの吸光度を測定した。
得られた11種のハイブリドーマとヒト外リンパ中のCTPとの反応性を確認した結果を表3に示す。3C10、7C1、および7G1において、ヒト外リンパ中の未変性CTPとの反応が確認された。また、ハイブリドーマにより、カイコ発現rCTPとヒト外リンパ中のCTPとで、反応の強弱に違いが認められた。
固相抗体として抗CTP−C抗体を用い、実施例4で作製した3C10抗体とのサンドイッチELISAにより、PBSを用いて段階希釈したヒト外リンパ中のCTPを測定した。測定は実施例4(4)と同様に行った。その結果を図2に示す。ヒト外リンパ中の未変性CTPを濃度依存的に測定できることを確認した。
Claims (8)
- 配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドに含まれる抗原決定基であって、配列番号1のアミノ酸番号118〜132からなるペプチドを免疫原として得られる未変性Cochlin−tomoprotein(CTP)に反応する抗体によって認識される抗原決定基を認識し、未変性CTPに反応することを特徴とする抗体。
- 配列番号1のアミノ酸番号118〜132からなるペプチドを免疫原として得られる、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体である未変性CTPに反応する第1の抗体で捕捉した未変性のCTPを用意し、該未変性のCTPを認識する第2の抗体を選別する工程を含む、未変性のCTPに反応する抗体のスクリーニング方法。
- 請求項1または2に記載の抗体を少なくとも一つ使用する、配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含む蛋白質の免疫学的測定方法。
- 配列番号1のアミノ酸番号118〜132で表されるポリペプチドを含む蛋白質がCTPである、請求項4に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の抗体を少なくとも一つ使用してCTPを免疫学的に測定する工程を含む、外リンパ瘻の検査方法。
- 請求項1または2に記載の抗体を少なくとも一つ含む、CTP測定キット。
- 外リンパ瘻の診断のための請求項7に記載の測定キット。
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