JP7002190B2 - 糖ペプチドと反応するモノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents
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Description
重鎖のCDRが、配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号2で示されるアミノ酸配列、配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む。
軽鎖のCDRが、配列番号4で示されるアミノ酸配列、配列番号5で示されるアミノ酸配列、配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む。
重鎖のCDRが、配列番号7で示されるアミノ酸配列、配列番号8で示されるアミノ酸配列、配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む。
軽鎖のCDRが、配列番号10で示されるアミノ酸配列、配列番号11で示されるアミノ酸配列、配列番号12で示されるアミノ酸配列を含む。
抗体の取得:
(1)抗体群の取得
マウス脾臓法により抗体群を産生するハイブリドーマを得た。具体的には、下記表1に記載の構造の糖ペプチドA(配列番号16)を合成し、これをKLHとコンジュゲートし、マウス3匹へ免疫した。抗体価が上がったことを確認した後、マウスの脾臓よりリンパ球を単離し、ミエローマと細胞融合させハイブリドーマを得た。
上記(1)で得たハイブリドーマから表2に記載の陽性抗原(糖ペプチドA)または陰性抗原(非フコシル化糖ペプチドA:配列番号17)を用いた抗原固相ELISAにより、陽性抗原に反応を示し、陰性抗原への反応が少ないウェルを選定した。抗原固相ELISAは以下の手法で行った。結果を図1に示した。
(1)96穴プレート(nunc Maxisoap/446612)に、各スクリーニング抗原1μg/ml(希釈液10mMリン酸バッファーpH7)を50μl/well添加し、37℃、1hr固相化する。
(2)各ウェルをPBST 300μl/well×5回洗浄する。
(3)各ウェルを1%BSA-PBS 100μl/well、4℃、Overnightブロッキングする。
(4)各ウェルをPBST 300μl/well×5回洗浄する。
(5)抗体培養上清(一次抗体)を1%BSA-PBSで10倍希釈し、50μl/well添加し、RT、1hr反応させる。
(6)各ウェルをPBST 300μl/well×5回洗浄する。
(7)anti mouse IgG-HRP(JIR/715-035-151)およびanti mouse IgG Lchain-HRP(JIR/115-035-174)を1%BSA-PBSで20,000倍希釈し、50μl/well添加し、RT、0.5hr反応させる。
(8)各ウェルをPBST 300μl/well×5回洗浄する。
(9)HRP発色基質を100μl/well添加し、発色させる。
(10)停止液を100μl/well添加し、発色を停止させる。
(11)OD450を測定する。
一次スクリーニングと同様に、抗体生産細胞の培養上清を用いてAFP-L3、AFP、フコース修飾したALPを抗原として、抗原固相ELISAを実施した。結果を図2に示した。
取得した抗体の特異性確認:
実施例1で選択したクローンからそれぞれ生産された抗体S4-1F8、S4-4F9の反応特異性を調べるため、以下の検討を実施した。
(1)抗原固相ELISA
<材料>
固相抗原:リコンビナントAFP-L3、非フコシル化AFP、フコシル化ALP
一次抗体:S4-1F8、S4-4F9(ハイブリドーマ培養上清)
二次抗体:anti mouse IgG-HRP(医学生物学研究所/IM-0817 )
(1) 96穴プレート(nunc Maxisoap/446612)に、各抗原0.5μg/ml(希釈液10mMトリスバッファーpH7.4)を100μl/well添加し、RT、1hr固相化する。
(2) 各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(3) 各ウェルを1%BSA-TBS 300μl/well、4℃、Overnightブロッキングする。
(4) 各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(5) 抗体培養上清(一次抗体)を1%BSA-TBSTで10倍希釈し、100μl/well添加し、RT、1hr反応させる。
(6) 各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(7) 二次抗体を1%BSA-TBSTで10,000倍希釈し、100μl/well添加し、RT、0.5hr反応させる。
(8) 各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(9) HRP発色基質を100μl/well添加し、発色させる。
(10) 停止液を100μl/well添加し、発色を停止させる。
(11) OD450を測定する。
抗原固相ELISAの結果を図3に示した。S4-1F8、S4-4F9はいずれもAFP-L3特異的に反応を示した。
<材料>
泳動抗原:リコンビナントAFP-L3 (lane1)、非フコシル化AFP (lane2)、フコシル化ALP (lane3) 各0.05μg
一次抗体:S4-1F8, S4-4F9(10倍希釈ハイブリドーマ培養上清) 4℃ O/N
二次抗体:以下の二種混合 RT 1hr
anti mouse-IgG(Fc) Ab -HRP(BET/cat#A90-131P)(20,000倍希釈)
anti mouse-IgM Ab -HRP(SBA/cat#1020-05)(5,000倍希釈)
(1)各抗原にNuPAGE LDS Sample Buffer (4X) (Thermo/NP0008)を1/4量、NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) (Thermo/NP0009)を1/10量添加し混和する。
(2)分子量マーカーおよび(1)の各抗原を電気泳動(SDS-PAGE)する。
(3)PVDFメンブレンにブロッティングする。
(4)PVDF Blocking Reagent for Can Get Signalに室温で1時間浸しブロッキングする。
(5)TBSTで3回洗浄する。
(6)一次抗体を1%BSA-TBSTで下記の希釈倍率に希釈し、4℃、Overnight反応させる。
(7)TBSTで3回洗浄する。
(8)二次抗体を1%BSA-TBSTで上記<材料>に記載の希釈倍率になるよう希釈し、室温で1時間反応させる。
(9)TBSTで3回洗浄する。
(10)化学発光にて検出する。
ウェスタンブロットの結果を図4に示した。S4-1F8、S4-4F9はいずれもAFP-L3にのみ反応を示した。
抗体S4-1F8、S4-4F9のエピトープ範囲を調べるため、以下の検討を実施した。
<材料>
固相抗原:下表3に示す糖ペプチド(配列番号18~25)を用いた(Fuc+, Fuc-)
一次抗体:S4-1F8、S4-4F9(ハイブリドーマ培養上清)
二次抗体:anti mouse IgG-HRP(医学生物学研究所/IM-0817 )
(1)96穴プレート(nunc Maxisoap/446612)に、各抗原2μg/ml(希釈液10mMトリスバッファーpH7.4)を100μl/well添加し、RT、1hr固相化する。
(2)各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(3)各ウェルを1%BSA-TBS 300μl/well、4℃、Overnightブロッキングする。
(4)各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(5)抗体培養上清(一次抗体)を1%BSA-TBSTで10倍希釈し、100μl/well添加し、RT、1hr反応させる。
(6)各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(7)二次抗体を1%BSA-TBSTで10,000倍希釈し、100μl/well添加し、RT、0.5hr反応させる。
(8)各ウェルをTBST 300μl/well×5回洗浄する。
(9)HRP発色基質を100μl/well添加し、発色させる。
(10)停止液を100μl/well添加し、発色を停止させる。
(11)OD450を測定する。
抗原固相ELISAの結果を図5に示した。S4-1F8、S4-4F9はいずれの陽性糖ペプチド(Fuc+)には反応性を示し、陰性糖ペプチド(Fuc-)には反応性を示さなかった。
フコースを持つ別のタンパク質(ALP)に対しては反応性を示さなかったことから、フコースだけではなく、ペプチド部分もエピトープに含まれていることが示唆される。
ペプチド鎖の最も短い糖ペプチド(7a.a. 3糖)にも反応していることから、ペプチド部分のエピトープは“TKVNFT”に含まれていると考えられる。
S4-1F8、S4-4F9のCDR解析を行った。S4-1F8抗体のCDR配列(配列番号1~6)を表4に示した。S4-4F9抗体のCDR配列(配列番号7~12)を表5に示した。
サンドイッチELISAの構築およびSDSによる反応性への影響:
実施例1で得られたS4-1F8またはS4-4F9を用い、以下のようにしてサンドイッチELISAの構築を試みた。また、SDSによる反応性への影響を検討した。
<材料>
抗体感作プレート(S4-1F8, S4-4F9/2.5μg/mL 100μL/well)
リコンビナントAFP-L3抗原
抗AFP抗体:Polyclonal Antibody to Alpha-Fetoprotein(WLS/# PAA153Hu01)
標識抗体:Goat anti rabbit immunoglobulin-HRP
Buffer A: 150mM NaCl + 1% BSA / 10mMリン酸緩衝液 (pH7)
Buffer B: 150mM NaCl +0.05% Tween20 / 10mMリン酸緩衝液 (pH7)
(1)(抗原前処理)20μg/mLのAFP-L3抗原溶液に2%、1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.06%のSDS溶液を等量加え、混合後3分以上静置する。(前処理SDS濃度:0.03 - 1%)
(2)抗原濃度が1μg/mL, 0.5μg/mL, 0.25μg/mLとなるようにBuffer Aで希釈する。(最終SDS濃度:0.00075% - 0.1%)
(3)抗体感作プレートに抗原溶液を100μL/well添加し、室温で60分反応させる。
(4)Buffer Bで各ウェルを洗浄後、400倍希釈した抗AFP抗体を100μL/well添加し、室温で60分反応させる。
(5)Buffer Bで各ウェルを洗浄後、4000倍希釈した標識抗体を100μL/well添加し、室温で40分反応させる。
(6)Buffer Bで各ウェルを洗浄後、HRP発色基質を100μl/well添加し、20分発色させる。
(7)停止液を100μl/well添加して発色を停止させ、OD450を測定する。
S4-1F8を用いた場合の各種抗原濃度、最終SDS濃度、前処理SDS濃度におけるOD450の測定値を表6に示した。また、S4-4F9を用いた場合の各種抗原濃度、最終SDS濃度、前処理SDS濃度におけるOD450測定値を表7に示した。
サンドイッチELISAの特異性確認:
実施例3で構築されたS4-1F8を用いたサンドイッチELISAについて以下のようにして特異性を確かめた。
<材料>
抗体感作プレート(S4-1F8/2.5μg/mL 100μL/well)
陽性抗原:リコンビナントAFP-L3抗原
陰性抗原1:非フコシル化AFP(ヒト血清由来AFP(LEE biosolutions)のLCAレクチン非吸着画分)
陰性抗原2:AFP以外のフコシル化タンパク質ALP(オリエンタル酵母)
ビオチン化抗AFP抗体:anti AFP, Human (mouse)(ABV/ H00000174-M01)
検出試薬:HRP-Conjugated Streptavidin(Thermo / N100)
Buffer A: 150mM NaCl + 1% BSA / 10mMリン酸緩衝液 (pH7)
Buffer B: 150mM NaCl +0.05% Tween20 / 10mMリン酸緩衝液 (pH7)
(1) 20μg/mLの各抗原溶液に0.06%のSDS溶液を等量加え(変性)、あるいは加えずに(非変性)、混合後3分以上静置する。(前処理SDS濃度:0.03%)
(2) 抗原濃度が1000ng/mL, 500ng/mL, 250ng/mL, 125ng/mL, 63ng/mL, 31ng/mLとなるようにBuffer Aで希釈する。
(3) 抗体感作プレートに抗原溶液を100μL/well添加し、室温で60分反応させる。
(4) Buffer Bで各ウェルを洗浄後、480倍希釈したビオチン化抗AFP抗体を100μL/well添加し、室温で60分反応させる。
(5) Buffer Bで各ウェルを洗浄後、10000倍希釈した検出試薬を100μL/well添加し、室温で60分反応させる。
(6) Buffer Bで各ウェルを洗浄後、HRP発色基質を100μl/well添加し、10分発色させる。
(7) 停止液を100μl/well添加して発色を停止させ、OD450を測定する。
S4-1F8を用いた場合の各種抗原濃度におけるOD450の測定値を表8に示した。
天然ヒトAFP-L3との反応性:
S4-1F8が天然ヒトAFP-L3と反応するかどうかを以下のようにしてウェスタンブロットで確かめた。
<材料>
泳動抗原:リコンビナントAFP-L3 (lane1) 50ng、非フコシル化AFP (lane2) 50ng、ミュータスワコー AFP-L3用キャリブレータ1(lane3) 0.5ng、 ミュータスワコー AFP-L3用キャリブレータ2(lane4) 0.5ng
一次抗体:S4-1F8(10倍希釈ハイブリドーマ培養上清) 4℃ O/N
二次抗体:anti mouse-IgG(Fc) Ab -HRP(BET/#A90-131P)(20,000倍希釈)RT 1hr
泳動抗原、一次抗体および二次抗体を上記に代える以外は実施例2の(2)と同様にしてウエスタンブロットを行った。
ウエスタンブロットの結果を図6に示した。S4-1F8はミュータスワコー AFP-L3用キャリブレータ2、即ち天然ヒトAFP-L3にも反応を示した。
Claims (10)
- 重鎖のCDR1が配列番号1で示されるアミノ酸配列、重鎖のCDR2が配列番号2で示されるアミノ酸配列および重鎖のCDR3が配列番号3で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖のCDR1が配列番号4で示されるアミノ酸配列、軽鎖のCDR2が配列番号5で示されるアミノ酸配列および軽鎖のCDR3が配列番号6で示されるアミノ酸配列を含むものである請求項1記載の抗体。
- 重鎖のCDR1が配列番号1で示されるアミノ酸配列、重鎖のCDR2が配列番号2で示されるアミノ酸配列および重鎖のCDR3が配列番号9で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖のCDR1が配列番号4で示されるアミノ酸配列、軽鎖のCDR2が配列番号11で示されるアミノ酸配列および軽鎖のCDR3が配列番号6で示されるアミノ酸配列を含むものである請求項1記載の抗体。
- フコシル化AFPに更に反応する、請求項1~3のいずれかに記載の抗体。
- 0.03質量/質量%以上のSDSを含む溶液で前処理して得られるフコシル化AFPと、0.025質量/質量%以下のSDSの存在下で反応する請求項1~4のいずれかに記載の抗体。
- 国際受託番号がNITE BP-02349またはNITE BP-02350のハイブリドーマ。
- 請求項1~5のいずれかに記載の抗体を用いる、フコシル化AFPの測定方法。
- 0.03質量/質量%以上のSDSを含む溶液でフコシル化AFPを前処理し、前記処理後に0.025質量/質量%以下のSDSの存在下で前記抗体を用いて前記フコシル化AFPと反応させる、請求項7記載の方法。
- フコシル化AFPの捕捉用抗体、フコシル化AFPの検出用抗体、固相を含み、
前記捕捉用抗体または前記検出用抗体が請求項1~5の何れかに記載の抗体である、
フコシル化AFP検出用キット。 - 0.03質量/質量%以上のSDSを含む前処理試薬を更に含む、請求項9記載のキット。
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