JP6745351B2 - 凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法 - Google Patents
凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6745351B2 JP6745351B2 JP2018548776A JP2018548776A JP6745351B2 JP 6745351 B2 JP6745351 B2 JP 6745351B2 JP 2018548776 A JP2018548776 A JP 2018548776A JP 2018548776 A JP2018548776 A JP 2018548776A JP 6745351 B2 JP6745351 B2 JP 6745351B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- label
- peptide
- sample
- antibody
- detection antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 title claims description 12
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 title claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 72
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title description 71
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 56
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 18
- 238000012421 spiking Methods 0.000 claims description 18
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 67
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 13
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 12
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 5
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 4
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 4
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 4
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 230000007134 Aβ oligomerisation Effects 0.000 description 3
- 101100453350 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) HBR1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 208000034846 Familial Amyloid Neuropathies Diseases 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 206010019889 Hereditary neuropathic amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 3
- 208000005531 Immunoglobulin Light-chain Amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 101100337984 Scheffersomyces stipitis (strain ATCC 58785 / CBS 6054 / NBRC 10063 / NRRL Y-11545) GSM1 gene Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 3
- 201000007905 transthyretin amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 208000007487 Familial Cerebral Amyloid Angiopathy Diseases 0.000 description 2
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 2
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 2
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 2
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N bromo chloro 1h-indol-2-yl phosphate Chemical compound C1=CC=C2NC(OP(=O)(OBr)OCl)=CC2=C1 XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 2
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 2
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 208000027121 wild type ATTR amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- UCLKLGIYGBLTSM-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrachloro-5-(2,5-dichlorophenyl)benzene Chemical compound ClC1=CC=C(Cl)C(C=2C(=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C=2)Cl)=C1 UCLKLGIYGBLTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 1-(3,7-dihydroxyphenoxazin-10-yl)ethanone Chemical compound OC1=CC=C2N(C(=O)C)C3=CC=C(O)C=C3OC2=C1 PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWTAKVLMACWHLD-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-carbazol-1-yl)ethanamine Chemical compound C12=CC=CC=C2NC2=C1C=CC=C2CCN HWTAKVLMACWHLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WONRDHPFOHAWOG-UHFFFAOYSA-N 2-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C(Cl)C=CC2=C1 WONRDHPFOHAWOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)-2,2,6,6-tetramethylcyclohex-3-en-1-amine Chemical compound CC1(C)C(N)C(C)(C)CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 description 1
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 1
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004849 abnormal protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010380 label transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2821—Alzheimer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(a)本発明は生試料(biosample)の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法またはキットを提供する。
(b)本発明の方法は生試料の中に測定しようとする凝集型−形成ポリペプチドの凝集型(抗原)の量が非常に少ないか、または凝集型−形成ポリペプチドの凝集型(抗原)の大きさが非常に小さくて測定し難いか、または人体内凝集型−形成ポリペプチドの凝集型(抗原)の量と生試料の中の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型(抗原)の量が比例しない場合に、ポリペプチドの凝集型形成を抑制する防御システム(clearing system)の差を用いて患者と正常人との間の診断シグナルの差(differentiation)を極大化した。
(c)本発明は、便利で、迅速な方式により実施することができ、これは生試料(biosample)の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法の自動化を可能にする。
まず、本発明の方法は分析対象の生試料に前記凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型をスパイキング(spiking)するステップを含む。
次に、本発明の方法は、(b)前記ステップ(a)の結果物をインキュベーションさせて前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を追加的に形成させるステップを含む。
そして、本発明の方法は(c)前記ステップ(b)の結果物に前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させるステップを経る。
最後に、本発明の方法は、(d)前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出するステップを含む。
実施例1:実験材料の準備
コーティングバッファ(Carbonate−Bicarbonate Buffer)、PBST、TBST、及びPBSはsigma社から購入した。Block AceはBio−rad社から購入した。バッファAはTBSTにBlock Aceを0.4%に希釈して製造した。ブロッキング(blocking)バッファはD.Wに1%のBlock Aceが希釈されるように製造した。HBR1はScantibodies Laboratory社から購入した。6E10抗体はBiolegend社から購入した。WO2−HRP抗体はAbsolute Antibody社から購入した。FF51−HRPは(株)The H labから購入した。WO2−HRP抗体はAbsolute Antibody社から購入した。組換え(recombinant)Aβ1−42はBiolegend社から購入した。組換えS26C−Beta−アミロイド(Amyloid)(1−40)ダイマー(Dimer)はJPT社から購入した。血漿(plasma)サンプルは盆唐ソウル大学校病院及び中央大学校病院から提供を受けた。ECL溶液はRockland社から購入した。プレートはNunc社から購入した。6E10、FF51、及びWO2抗体に対するエピトープはヒトAβペプチド配列の各々、アミノ酸3−8、1−4、及び4−10からなるアミノ酸配列を有する。S26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーのシーケンスはDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGCNKGAIIGLMVGGVVであり、各単量体の26番システイン残基によってジスルフィド結合したダイマー(Dimer)形態をなしている。
6E10抗体(抗Aβタンパク質、Biolegend)30μgをコーティングバッファ(sigma)10mlに希釈し、プレート(Nunc)に100μlを各ウェルに分注後、4℃冷蔵庫に一日間反応させた。前記プレートをPBSに3回洗浄し、D.Wに1%Block Aceが溶けているブロッキングバッファ240μlを分注後、室温で2時間反応させた。前記プレートはPBSで3回洗浄し、室温に30分間乾燥させた後、使用した。
陽性対照群(positive control)は組換えAβ1−42(rec.Aβ)(1μg/ml)10μlにPBST 990μlを添加して100μlを使用した。陰性対照群(negative control)はPBS 100μlを使用した。
サンプルは2サンプルを基準として準備した。凍らせた血漿サンプルを37℃ヒートブロック(heat block)に15分間溶かした後、30秒間ボルテックスした(vortexing)後、使用した。S26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマー 0.25ngがスパイキング(spiking)されたサンプルは、血漿20μlにHBR1(0.123mg/ml)8.08μlとPBST 180μl、S26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマー(0.25ng/10μl)20μlを混合して全体228.08μlになるように準備した。また、組換えペプチドをスパイキングしないサンプルは、血漿20μlにHBR1(0.123mg/ml)8.08μlとPBST 200μlを混合して全体228.08μlになるように準備した。
前記実施例4で、S26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが処理されて準備されたサンプルは37℃インキュベーターで各0日、1日、2日、3日、4日、5日の間インキュベーションさせた(6E10/FF51HRP set)。また、前記実施例4でS26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが無処理されて準備されたサンプルは、37℃インキュベーターで0日、5日の間インキュベーションさせた(6E10/FF51HRP set)。そして、前記実施例4で、S26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが処理されて準備されたサンプルは37℃インキュベーターで各1日、2日、3日、4日の間インキュベーションさせた(6E10/WO2HRP set)。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に陽性対照群及び、陰性対照群にS26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが0.25ng処理されて3日と4日の間インキュベーションされたサンプルを各々100μlずつ分注した後、室温で1時間反応させた。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体をバッファAに0.5μg/mlになるように製造後、100ulずつ分注した。前記プレートをTBSTで3回洗浄後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応されたプレートはルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、以下の図1、2の通りである。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に陽性対照群及び、陰性対照群にS26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが0.25ng処理されて0日、1日、2日、3日、4日、5日の間インキュベーションされたサンプルを各々100μlずつ分注した後、室温で1時間反応させた。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体をバッファAに0.5μg/mlになるように製造後、100ulずつ分注した。前記プレートをTBSTで3回洗浄後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応されたプレートはルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、以下の図3の通りである。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に陽性対照群及び、陰性対照群にS26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが0.25ng処理された後、0日、5日処理されない各0日、5日の間インキュベーションされたサンプルを各々100μlずつ分注した後、27℃インキュベーター(incubator)で静置状態で1時間反応させた。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体をバッファAに0.5μg/mlになるように製造後、100ulずつ分注した。前記プレートをTBSTで3回洗浄後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応されたプレートはルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、以下の図4の通りである。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に陽性対照群及び、陰性対照群にS26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが0.25ng処理されて1日と2日の間インキュベーションされたサンプルを各々100μlずつ分注した後、室温で1時間反応させた。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、WO2−HRP抗体をバッファAに0.25μg/mlになるように製造後、100ulずつ分注した。前記プレートをTBSTで3回洗浄後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応されたプレートはルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、以下の図5、6の通りである。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に陽性対照群及び、陰性対照群にS26C−Beta−アミロイド(1−40)ダイマーが0.25ng処理されて1日、2日、3日、4日の間インキュベーションされたサンプルを各々100μlずつ分注した後、室温で1時間反応させた。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、WO2−HRP抗体をバッファAに0.25μg/mlになるように製造後、100ulずつ分注した。前記プレートをTBSTで3回洗浄後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応されたプレートはルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、以下の図7の通りである。
Claims (24)
- 次のステップを含む生試料(biosample)のAβペプチドの凝集型を検出する方法:
(a)分析対象の生試料に前記Aβペプチドのダイマー型をスパイキング(spiking)するステップ;
(b)前記ステップ(a)の結果物をインキュベーションさせて前記Aβペプチドの凝集型を追加的に形成させるステップ;
(c)前記ステップ(b)の結果物に前記Aβペプチドの凝集型に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させるステップ;及び
(d)前記Aβペプチドの凝集型に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出するステップ、
ここで、前記ステップ(b)のインキュベーションは前記スパイキングしたAβペプチドのダイマー型が前記生試料によりマルチマー化できる充分な時間の間実施し、
前記Aβペプチドのダイマー型は、配列表の配列番号1のアミノ酸配列からなるAβペプチドの26番Cys残基によりジスルフィド結合されてなるダイマー型である。 - 前記スパイキングしたAβペプチドのダイマー型のマルチマー化をさせる前記生試料は、前記Aβペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記生試料によりマルチマー化できる充分なインキュベーション時間は、Aβペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料を用いて発生したシグナルが正常のヒトの生試料を用いて発生したシグナルより1.3〜20倍大きくすることに充分な時間であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記生試料(biosample)は血液であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記血液試料は、血漿(plasma)であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記ステップ(a)の結果物に緩衝液を追加的に添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝液は生試料に対して3〜15倍(v/v)で添加されることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記緩衝液は非イオン性界面活性剤−含有燐酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記ステップ(b)のAβペプチドの凝集型の追加的な形成は、前記ステップ(a)の結果物を温度1〜50℃でインキュベーション(incubation)させて実施することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(c)及び(d)は、次のステップを含む方法により実施されることを特徴とする、請求項1に記載の方法:
(c−1)前記凝集型を捕獲(capturing)する前記Aβペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に前記ステップ(b)の結果物を接触させるステップ;
(c−2)前記Aβペプチド上のエピトープを認識する検出抗体に前記捕獲された凝集型を接触させるステップ;及び
(c−3)凝集型−検出抗体複合体を検出するステップ。 - 前記検出抗体は、前記ステップ(c−1)のエピトープと同一なまたはオーバーラップするエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記捕獲抗体は固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記検出抗体は検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、又はFRET標識であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- Aβペプチドのダイマー型を含む生試料(biosample)のAβペプチドの凝集型を検出するためのキットであって、
前記Aβペプチドのダイマー型は、配列表の配列番号1のアミノ酸配列からなるAβペプチドの26番Cys残基によりジスルフィド結合されてなるダイマー型である、キット。 - 前記生試料(biosample)は血液であることを特徴とする、請求項15に記載のキット。
- 前記血液試料は血漿(plasma)であることを特徴とする、請求項16に記載のキット。
- 前記キットは緩衝液を追加的に含むことを特徴とする、請求項15に記載のキット。
- 前記緩衝液は非イオン性界面活性剤−含有燐酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項18に記載のキット。
- 前記キットはAβペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体;及び前記捕獲抗体が認識する前記エピトープを認識する検出抗体を追加的に含むことを特徴とする、請求項15に記載のキット。
- 前記検出抗体は前記捕獲抗体が認識する前記エピトープと同一なまたはオーバーラップするエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項20に記載のキット。
- 前記捕獲抗体は固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項20に記載のキット。
- 前記検出抗体は検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項20に記載のキット。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、又はFRET標識であることを特徴とする、請求項23に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020160031534A KR20170108203A (ko) | 2016-03-16 | 2016-03-16 | 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 |
KR10-2016-0031534 | 2016-03-16 | ||
PCT/KR2017/002858 WO2017160104A2 (ko) | 2016-03-16 | 2017-03-16 | 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019512700A JP2019512700A (ja) | 2019-05-16 |
JP6745351B2 true JP6745351B2 (ja) | 2020-08-26 |
Family
ID=59851066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018548776A Active JP6745351B2 (ja) | 2016-03-16 | 2017-03-16 | 凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11255863B2 (ja) |
EP (1) | EP3431999B1 (ja) |
JP (1) | JP6745351B2 (ja) |
KR (1) | KR20170108203A (ja) |
CN (1) | CN108885216B (ja) |
AU (1) | AU2017233132B2 (ja) |
CA (1) | CA3017723C (ja) |
ES (1) | ES2956769T3 (ja) |
TW (1) | TWI698642B (ja) |
WO (1) | WO2017160104A2 (ja) |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
CA1291031C (en) | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
US4908305A (en) | 1987-06-14 | 1990-03-13 | The University Of Maryland | Competitive elisa for determination of neutralizing IBDV antibody |
IT1226712B (it) | 1988-08-05 | 1991-02-05 | Eniricerche Spa | Metodo immunoenzimatico elisa monopiastra con inibizione competitiva per la rivelazione di anticorpi antisporozoitari di plasmodium falciparum. |
US5143825A (en) | 1990-03-01 | 1992-09-01 | Abbott Laboratories | Stabilized substrate for use in an immunoassay |
SE9400088D0 (sv) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Kabi Pharmacia Ab | Bacterial receptor structures |
US8658374B2 (en) * | 2002-02-28 | 2014-02-25 | Microsens Biphage Limited | Binding of aggregated forms of proteins |
KR100987639B1 (ko) | 2005-02-19 | 2010-10-13 | 주식회사 피플바이오 | 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별검출하는 방법 |
CA2598321A1 (en) * | 2005-02-19 | 2006-08-24 | Peoplebio, Inc. | Method for differentially detecting multimeric form from monomeric form of multimer-forming polypeptides |
KR101132293B1 (ko) * | 2006-04-21 | 2012-04-05 | 주식회사 피플바이오 | 삼차원적 상호작용을 이용하여 멀티머-형성 폴리펩타이드의모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법 |
WO2008124585A1 (en) * | 2007-04-06 | 2008-10-16 | Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Planations | Lowering of proteins associated with alzheimer's disease by interrupting gene transcription with a small molecule |
CN101308144A (zh) * | 2007-05-16 | 2008-11-19 | 首都医科大学宣武医院 | 检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法 |
EP2496947A1 (en) * | 2009-11-04 | 2012-09-12 | Novartis AG | Positively charged species as binding reagents in the separation of protein aggregates from monomers |
GB201101140D0 (en) * | 2011-01-21 | 2011-03-09 | Eisai Ltd | Fused aminodihydrothiazine derivatives |
EP2701743A4 (en) | 2011-04-27 | 2015-08-19 | Univ Northwestern | SELECTIVE ANTIBODIES FOR TAU PATHOLOGICAL DIMERS AND PRE-FIBRILLARY TAU PATHOLOGICAL OLIGOMERS AND THEIR USE IN THE TREATMENT, DIAGNOSIS AND MONITORING OF TAUOPATHIES |
DK2579042T3 (da) * | 2011-10-04 | 2014-07-21 | Affiris Ag | Fremgangsmåde til at påvise Aß-specifikke antistoffer i en biologisk prøve |
RU2514115C2 (ru) * | 2011-12-01 | 2014-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Сенсорные системы" | Устройство и способ для определения токсичности жидких сред |
CN103998930A (zh) | 2011-12-02 | 2014-08-20 | 普拉希京公司 | 用于形成和检测斑块的斑块阵列方法和组合物 |
EP2791675B1 (en) * | 2011-12-13 | 2018-04-25 | Baxalta GmbH | Measurement of autoantibodies in low conductivity conditions |
KR101352849B1 (ko) * | 2012-01-03 | 2014-01-21 | 주식회사 나노엔텍 | 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 분별 검출하는 방법 |
KR102117701B1 (ko) * | 2013-07-12 | 2020-06-02 | 주식회사 피플바이오 | 혈액시료 내 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법 |
US9618524B2 (en) * | 2014-03-26 | 2017-04-11 | Plaxgen Inc. | Method, composition, isolation and identification of a plaque particle and related biomarker |
KR101658620B1 (ko) * | 2014-12-02 | 2016-09-23 | 주식회사 피플바이오 | 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 |
-
2016
- 2016-03-16 KR KR1020160031534A patent/KR20170108203A/ko active Search and Examination
-
2017
- 2017-03-16 EP EP17767005.6A patent/EP3431999B1/en active Active
- 2017-03-16 ES ES17767005T patent/ES2956769T3/es active Active
- 2017-03-16 CA CA3017723A patent/CA3017723C/en active Active
- 2017-03-16 AU AU2017233132A patent/AU2017233132B2/en active Active
- 2017-03-16 WO PCT/KR2017/002858 patent/WO2017160104A2/ko active Application Filing
- 2017-03-16 CN CN201780018756.0A patent/CN108885216B/zh active Active
- 2017-03-16 JP JP2018548776A patent/JP6745351B2/ja active Active
- 2017-03-16 US US16/085,070 patent/US11255863B2/en active Active
- 2017-03-16 TW TW106108738A patent/TWI698642B/zh active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017160104A3 (ko) | 2018-08-09 |
CN108885216A (zh) | 2018-11-23 |
AU2017233132B2 (en) | 2021-02-25 |
WO2017160104A2 (ko) | 2017-09-21 |
TW201734457A (zh) | 2017-10-01 |
CA3017723A1 (en) | 2017-09-21 |
US11255863B2 (en) | 2022-02-22 |
ES2956769T3 (es) | 2023-12-27 |
CA3017723C (en) | 2022-09-20 |
EP3431999A2 (en) | 2019-01-23 |
EP3431999B1 (en) | 2023-07-26 |
AU2017233132A1 (en) | 2018-10-25 |
US20190120859A1 (en) | 2019-04-25 |
KR20170108203A (ko) | 2017-09-27 |
JP2019512700A (ja) | 2019-05-16 |
TWI698642B (zh) | 2020-07-11 |
EP3431999C0 (en) | 2023-07-26 |
CN108885216B (zh) | 2022-03-22 |
EP3431999A4 (en) | 2020-01-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101188861B1 (ko) | 삼차원적 상호작용을 이용하여 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법 | |
WO2006088281A1 (en) | Method for differentially detecting multimeric form from monomeric form of multimer-forming polypeptides | |
US20230152334A1 (en) | Detection of Structural Forms of Proteins | |
JP6803334B2 (ja) | 凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法 | |
US10772976B2 (en) | Method for detecting AFP | |
JP6745351B2 (ja) | 凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法 | |
KR102086852B1 (ko) | 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 | |
US20090162943A1 (en) | Reagents and Methods for the Detection of Transmissible Spongiform Encephalopathy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180920 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180920 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20190204 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190802 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191001 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191220 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200219 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200721 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200803 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6745351 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |