CN101308144A - 检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外检测受试者体液促进疾病相关蛋白聚合能力的方法。更具体地说，涉及一种体外检测受试者体液促进疾病相关蛋白如α－突触核蛋白的寡聚体形成能力的方法。该方法包括将纯化的重组人疾病相关蛋白与受试者体液在一定温度下进行振荡孵育，使其聚合，然后利用能够检测蛋白质寡聚体的方法(如ELISA方法)检测孵育后的体液中的疾病相关蛋白如α－突触核蛋白的寡聚体的含量。本发明提供的方法具有以下优点：1)体液样本需要量少，受试者容易接受；2)操作简单；3)本检测方法获得的结果反映了受试者各种导致疾病相关蛋白聚合的因素的综合作用，这尤其对判定由复杂因素导致的帕金森病人的综合病理生理状况更有利。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2007年5月16日向中国专利局提交的题为“检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法”(申请号为200710107817.9)的优先权，将其全部内容结合于此作为参考。
技术领域
本发明涉及一种体外检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法，更具体地说，涉及一种体外检测帕金森病(PD)受试者体液(包括血清、血浆或脑脊液)内疾病相关蛋白如α-突触核蛋白(也称为α-Syn)的寡聚体形成能力的方法。
背景技术
帕金森病(PD)是常见的神经退行性疾病，在60岁以上人口的发病率高达2％，临床上以静止性振颤、运动徐缓、僵直和姿势不稳定为主要症状。上述症状出现的主要原因是黑质多巴胺能神经元退变死亡，导致纹状体多巴胺神经递质释放的减少。但是，从黑质多巴胺能神经元变性死亡开始到出现临床症状为止需要有很长的潜伏期(推测需至少5年之久)，直到70％-80％的黑质多巴胺神经元丢失后才出现临床症状。目前，PD的诊断主要依据临床症状，但由于PD临床症状的异质性，依据临床症状的误诊率可以高达10-25％。脑功能影像如PET和SPECT无疑在PD的早期诊断、鉴别诊断和病程监控方面具有潜在的前景，但其特异性仍然有待于提高，此外，价格昂贵和放射性使这一技术的普遍应用受到限制。PD临床症状虽然通过左旋多巴可以得到较好的纠正，然而，这些对症治疗不能阻止多巴胺神经元的进行性退变和死亡。因此，努力寻找能够阻止或延缓多巴胺神经元退变和死亡的神经保护药是PD治疗的方向，然而神经保护药的研发需要令人信服的、临床上简便易行的、能够反映帕金森病病理变化严重程度的生物标记物。至今，在症状前和出现症状的病人中，还没有容易进行的以血液、脑脊液或尿液分析为基础的可靠检测方法可以对PD进行诊断、早期诊断以及病理进程的监测。普通神经科医生对于这种病的临床诊断正确率大约在75％，运动障碍专家所做的诊断正确率大约在85％，这些充分表明了对这种诊断方法的需要。这种方法也有利于对运动障碍病人的早期治疗和对神经保护药物疗效的生物监测和评价。
α-突触核蛋白是一种小分子蛋白(～14KD)，在神经组织中的丰度较高，但也存在于其它组织、血液和脑脊液中。α-突触核蛋白属于突触核蛋白家族(包括α-，β-和γ-突触核蛋白)的成员，大量证据表明该蛋白与多种神经退行性疾病的发病相关，包括帕金森病、路易体痴呆、阿尔兹海默病、多系统萎缩。编码α-突触核蛋白基因的三个点突变(A53T、A30P及E46K)与家族性帕金森病的发病有关，并提示该蛋白在原发性PD的发病中起重要作用。此外，α-突触核蛋白基因的二倍体和三倍体可以导致野生型α-突触核蛋白的过表达，并引起家族性早发性PD。遗传学分析显示，α-突触核蛋白的某些基因多态性是散发性PD的危险因素。纤维化的α-突触核蛋白是PD特征性病理变化——路易体的主要成份。α-突触核蛋白及其片段的病理性聚合和沉积也见于多种其它神经退行性疾病如阿尔兹海默病、路易体痴呆和多系统萎缩。有足够的证据表明，脑内α-突触核蛋白从可溶性的单体到不溶性的纤维的变化过程是PD和相关疾病的病理变化过程中的关键事件，其中，纤维化过程中形成的α-突触核蛋白的寡聚体被证明对神经元具有毒性。
α-突触核蛋白在PD的病理变化过程中的重要作用使其成为非常有希望的、潜在的、能够反映PD病理变化严重程度的生物标记物。对脑脊液和血液中的α-突触核蛋白的分析表明，PD病人和路易体痴呆病人血液与脑脊液中的α-突触核蛋白的寡聚体的含量高于对照病人，但α-突触核蛋白总含量的变化在不同实验者之间得出相反的结果：Lee等利用双抗体夹心的ELISA方法证明血液中α-突触核蛋白的总含量在PD升高，而Li和Tokuda等分别用蛋白质印迹法(Western blot)和ELISA方法证明血液和脑脊液中α-突触核蛋白的总含量明显降低，产生这种差别的原因尚不清楚。上述研究提示血液和脑脊液中的α-突触核蛋白含量的变化作为PD诊断的生物标记物仍然需要进行大量的研究工作。我们认为，机体中存在促进和抑制α-突触核蛋白聚合的因素，这些因素在PD病人的机体中朝向有利于α-突触核蛋白寡聚体形成的方向，这些影响聚合的因素不仅存在于脑组织，而且也存在于体液中。因此，检测体液(血液和脑脊液)促进α-突触核蛋白聚合的综合能力比直接检测α-突触核蛋白寡聚体的含量更能够完整地反映患者的病理状态。最近的一项研究支持这种推测：阿尔兹海默病人和路易体痴呆病人的脑脊液促进α-突触核蛋白纤维的形成。
表1列出了目前已报道的对血液与脑脊液突触核蛋白检测的方法与结果。
表1：对血液与脑脊液突触核蛋白检测的现有方法及其结果
| 样本 | 方法 | 分子形式 | 结果：PD病人与对照相比较 | 文献 |
| 血浆 | 免疫印迹 | 单体 | 降低 | Exp Neurol.2007204(2)：583-8 |
| 脑脊液 | ELISA | 单体 | 降低 | Biochem Biophys ResCommun.2006，13；349(1)：162-6 |
| 血浆 | ELISA | 单体 | 升高 | J Neural Transm.2006；113(10)：1435-9 |
| 血浆/脑脊液 | ELISA | 寡聚体 | 升高 | FASEB J.2006Mar；20(3)：419-25 |
| 血小板 | 免疫印迹 | 单体 | 无差异 | J Alzheimers Dis.2002；4(4)：309-15；Neurosci Lett.2005Jun24；381(3)：294-8 |
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外检测受试者体液(包括血清、血浆或脑脊液)内疾病相关蛋白(如α-突触核蛋白)聚合能力的方法，本发明的方法不是直接检测体液中疾病相关蛋白(如α-突触核蛋白)寡聚体的水平，而是检测受试者体液促进疾病相关蛋白(如α-突触核蛋白)形成寡聚体的能力。该方法并不直接用于疾病的检测或治疗，而是检测疾病相关蛋白聚合能力的一种方法，其目的用于获得相关的信息。
根据本发明的一方面，提供一种体外检测受试者体液(包括血清、血浆或脑脊液)内疾病相关蛋白聚合能力的方法，所述方法包括将纯化的重组人疾病相关蛋白如重组人α-突触核蛋白与受试者体液(例如，正常人和帕金森病人血清)进行振荡孵育，使其聚合，然后利用能够检测蛋白质寡聚体的方法(如ELISA方法)检测孵育后的体液如血清或血浆中的疾病相关蛋白如α-突触核蛋白的寡聚体的含量。
根据本发明的具体实施方式，所述方法包括：
a.提供来自受试者的体液样本；
b.制备α-突触核蛋白的寡聚体：通过将纯化的重组人α-突触核蛋白与受试者体液样本(例如，正常人和帕金森病人血清)进行振荡孵育，使其聚合而制得；
c.用ELISA方法检测孵育后的体液如血清中的α-突触核蛋白寡聚体的含量。
与文献报道的方法相比较，本发明提供的方法具有例如但不限于以下的优点：只需要少量的(10-100μL)的体液样本(如血清或脑脊液样本)，受试者容易接受；操作简单，通过将外源α-突触核蛋白加入体液如血清中，振荡孵育之后，直接可以进行检测；本检测方法在不明显降低检测特异性的前提下，明显提高检测的敏感性；本发明方法所获得的结果反映了受试者各种导致疾病相关蛋白如α-突触核蛋白聚合的因素的综合作用，这尤其对判定帕金森病人的综合病理生理状况更有利。
本方法是测定受试者体液(包括血清、血浆或脑脊液)内疾病相关蛋白聚合能力的一种方法，因此，不仅适合于与帕金森病相关的α-突触核蛋白的测试，而且也将适合于检测其他蛋白变性病如阿尔兹海默病人、路易体痴呆病人血液和脑脊液对相关疾病蛋白如β-淀粉样肽的聚合能力。
此外，由于测定的是外加的疾病相关蛋白如α-突触核蛋白形成的寡聚体，浓度较高，使测试比较容易，数据的重复性和稳定性也高。
附图说明
图1示出了稀释的振荡后样品与新鲜样品的吸光度比较；
图2示出了不同孵育时间、不同α-Syn浓度在帕金森病(PD_及对照血清中聚合体形成量的分析；
图3示出了本发明检测方法在诊断帕金森病的灵敏性、特异性和总符合率的分析结果。
具体实施方式
除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书中，如果没有具体指明，则所有提及的试剂或化合物都是常用的试剂或化合物，优选为分析纯级以上，其制备方法或获取方法对于本领域技术人员来说都是已知的。
尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但是下面将描述合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅用于说明目的而不用于限制。本发明的其它特征和优点根据详细描述和权利要求将会显而易见。
为了更清楚地描述本发明，在下文的描述中，本发明主要针对疾病相关蛋白中的α-突触核蛋白作为示例性具体实例进行描述。
如本文所述的，术语“疾病相关蛋白”是指在疾病病理生理过程中起作用的蛋白质，如α-突触核蛋白。
如本文所述的，术语“α-突触核蛋白”是在神经退行性疾病如帕金森病(PD)的病理生理过程中起重要作用的蛋白质，主要存在于中枢神经系统。该蛋白同时也存在于正常人和帕金森病人的脑脊液和血液中。α-突触核蛋白总含量在帕金森病人和正常人的血液中的变化尚不能肯定，但是血液中聚合形式的α-突触核蛋白的含量在帕金森病人却多于对照受试者。帕金森病人的血液中存在α-突触核蛋白寡聚体这一现象提示病人血液中有促进α-突触核蛋白聚集的因素。根据这一原理，本发明的发明人将纯化的重组人α-突触核蛋白与正常人和帕金森病人体液如血清进行振荡孵育，使其聚合，然后利用特殊的ELISA方法检测孵育后的血清中的α-突触核蛋白寡聚体的含量。如果帕金森病人的血液中有促进α-突触核蛋白寡聚体形成的因素，则病人血清中的α-突触核蛋白寡聚体含量则会高于对照病人或正常人。
根据本发明的具体实施方式，所述方法的工艺流程包括：
首先，从受试者提取体液样本。作为本发明的体液样本来源的受试者可以是临床明确诊断的PD病人血清或血浆(H-Y分期在I-IV)，年龄在40-70岁，而对照体液样本可以为正常健康体检的40-70岁的中、老年人或其它年龄匹配的非PD的患者。在本发明中，体液可以是例如但不限于血液和脑脊液。体液样本的提取方法对于本领域技术人员来说是熟知的。正常人和病人血液中α-突触核蛋白的水平很低，病人血液中α-突触核蛋白寡聚体的含量非常低，因此直接测定α-突触核蛋白寡聚体的含量难度较大。由于本发明的方法是检测病人和正常人的体液(如血液或脑脊液)促进α-突触核蛋白形成寡聚体的能力，所以体液样本取样量相比于现有方法的取样量大大降低，通常为约≥10μL，优选为10～100μL，例如20μL，使得样本易于获得并且受试者容易接受。将体液样本按照种类不同进行不同处理，现以脑脊液及血液为例进行说明：脑脊液收集于干净塑料管中冷冻储存；血液可以收集在含有柠檬酸钠或钾-EDTA的塑料管中，经3000rpm，4℃离心15-30分钟，取上层血浆冷冻储存(血浆)；血液样本也可以收集在不含任何抗凝物质的塑料管中，室温静置1-2小时后，经3000rpm离心15-30分钟，取上层血清冷冻储存(血清)。
其次，制备α-突触核蛋白寡聚体。将10μL以上体液样本用PBS(磷酸缓冲液(pH 7.4))稀释1～5倍，加入重组人α-突触核蛋白，用0.22μm的滤膜(由PALL公司出售，型号4612)过滤除菌。在摇床或Eppendorf漩涡振荡混匀器振荡孵育，其中振荡孵育的温度为约25～40℃，优选约37℃；频率范围约100～1000rpm，优选约300rpm；时间为约24～72小时，优选约为48小时。将上述反应液用PBS稀释100～200倍，备用。
最后，利用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法检测α-突触核蛋白寡聚体，步骤如下：
●包被：用NaHCO3缓冲液稀释非生物素化的3D5抗α-突触核蛋白抗体(在下文描述)至终浓度为约0.1～2μg/mL。向酶标板(96孔板，由Corning公司出售，型号3590)各孔加入50～150μL该抗体稀释液，在0～10℃，优选4℃孵育过夜。用PBST(其为含有吐温的PBS)冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
●封闭：向酶标板各孔加入50～200μL封闭液(其为含有明胶和吐温的PBS)，在35～40℃，优选37℃孵育1～5小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。向各孔加入100μL已制备的α-突触核蛋白寡聚体样品(经100～200倍稀释)，在35～40℃，优选37℃孵育1～5小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
●用封闭液稀释生物素化的3D5抗体至终浓度为约0.1～2μg/mL。向酶标板的各孔加入50～150μL该抗体稀释液，在35～40℃，优选37℃孵育1～5小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
●用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶标板的各孔加入50～150μL该抗体稀释液，在35～40℃，优选37℃孵育0.5～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
●向酶标板的各孔加入50～150μL pNPP(对硝基酚磷酸显色液，由Sigma公司出售)，室温显色10～50分钟。
●测定405nm处酶标板各孔的吸光度值。
其中，ELISA试剂盒(该试剂盒为现有技术)中可以使用对α-突触核蛋白特异的抗体，在本文中所用抗体是本发明人研制的已经过严格特异性检测的单克隆抗体，命名为3D5抗体。该抗体识别人α-突触核蛋白C-末端的一段特异性序列，并与大鼠和小鼠产生较弱的交叉反应。其识别的氨基酸序列如下：NH2-MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA-COOH。该抗体识别α-突触核蛋白的第115-121氨基酸序列。这部分氨基酸序列是人、猩猩和猴的α-突触核蛋白所特有。与大鼠和小鼠相差1个氨基酸，即121位氨基酸。该测试中所用抗体也可以为除3D5以外的其他可以特异性识别人α-突触核蛋白的抗体。例如，Invitrogen公司的Anti-ALPHA-SYNUCLEIN Monoclonal Antibody(clone LB509)，Chemicon公司的mouse anti-alpha-synuclein monoclonal antibody(Cat No.MAB5320)，Covance Innovative Antibodies公司的monoelonal antibodyagainst α-synuclein(Cat No.MMS-530R，clone syn204)，Santa Cruz公司的α-synuclein(clone 211，cat.No.SC-12767)。
生物素化3D5抗体的制备：将3D5抗体与硫-NHS-LC-生物素(pierce)反应而被生物素化。然后用柱子去除未偶合的生物素，储存在4℃直至使用。
现在将参考以下非限制性实施例详细描述本发明的具体实施方式。
实施例
实施例1
体液样本准备
在本发明中，体液样本以血清为例加以说明，但本领域技术人员应当理解，以其它体液如脑脊液作为体液样本的制备方法类似。
在本实施例中，血清获自34位临床明确诊断为PD病人(17位男性，17位女性，年龄在54～82岁，平均年龄65.4岁)，而对照血清获自5位体检正常健康人(3位男性，2位女性，平均年龄为60岁)。在本实施例中，提取的血清体积为约20μL。
制备PBS溶液
本实施例中使用的PBS溶液的组成如下：
| KCl | 0.1g |
| KH2PO4 | 0.1g |
| Na2HPO4.12H2O | 1.45g |
| NaCl | 4g |
| DDW(双蒸馏水) | 500mL |
通过常规方法将各组分加以混合，配制成约0.01M PBS溶液，其pH为约7.4。
制备包被液
本实施例中使用的包被液的组成如下：
| NaHCO3 | 0.84g |
| 20％叠氮钠 | 500μL |
| DDW | 50mL |
通过常规方法将各组分加以混合，配制的包被液为约200mMNaHCO3缓冲液，其pH为约9.6。
制备PBST溶液
本实施例中使用的PBST溶液的组成如下：
| Na2HPO4 | 2.72g |
| NaH2PO4 | 0.28g |
| NaCl | 9g |
| DDW | 1000mL |
| 吐温(Tween)20 | 500μL |
通过常规方法将各组分加以混合即可制得PBST溶液。
制备封闭液
本实施例中使用的封闭液的组成如下：
| 明胶 | 2.5g |
| PBST | 100mL |
通过常规方法将各组分加以混合即可制得封闭液。
α-突触核蛋白寡聚体的制备
将10μL血清用0.01M PBS(pH约7.4)稀释3倍，加入50μM重组人α-突触核蛋白，用0.22μm滤膜过滤除菌。在37℃、280rpm的摇床中振荡孵育48小时。将上述反应液用PBS稀释200倍。
利用ELISA方法检测α-突触核蛋白寡聚体
利用ELISA方法检测α-突触核蛋白寡聚体的步骤如下：
●包被：用200mM NaHCO3缓冲液稀释非生物素化的3D5抗体至终浓度为约1μg/mL，向酶标板每孔加入100μL抗体稀释液，4℃孵育过夜。用PBST冲洗酶标板各孔4次，每次4分钟。
●封闭：酶标板各孔加入200μL封闭液，在37℃孵育2小时。PBST冲洗酶标板各孔4次，每次4分钟。向各孔加入100μL已制备的α-突触核蛋白寡聚体样品(经100倍或200倍稀释)，在37℃孵育2小时。用PBST冲洗酶标板各孔4次，每次4分钟。
●用封闭液稀释生物素化的3D5抗体至终浓度为约1μg/mL，向酶标板各孔加入100μL该抗体稀释液，在37℃孵育2小时。用PBST冲洗酶标板各孔4次，每次4分钟。
●用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶(3∶5000)，向酶标板各孔加入100μL该抗体稀释液，在37℃孵育1小时。用PBST冲洗酶标板各孔4次，每次4分钟。
●向酶标板各孔加入100μL pNPP，室温显色30分钟
●测定405nm处酶标板各孔吸光度值。
作为检测结果，图1示出了稀释的振荡后样品与新鲜样品的吸光度的比较结果。经过老化(振荡)的样品含有突触核蛋白寡聚体，本发明的试剂盒在样品200倍稀释前不识别新鲜样品(主要含单体)，但识别老化样品(含寡聚体)，但当浓度高于200倍时，由于新鲜样品中也可有寡聚体形成，因此，出现吸光度增加的趋势；
图2示出了不同孵育时间、不同α-Syn浓度在帕金森病及对照血清中聚合体形成量的分析。随着振荡时间的延长，寡聚体的含量增加，在0～96小时之间寡聚体的含量与振荡时间呈线性关系；以上图1和图2的结果说明，本发明的试剂盒主要识别寡聚体。
图3示出了本发明检测方法在诊断帕金森病的灵敏性、特异性和总符合率的分析结果。其中灵敏度及特异度评价结果如下：
·以OD＝0.5为诊断标准
a＝29 b＝9 灵敏度 93.55％
c＝2 d＝21 特异度 70.00％
总符合率 81.97％
·以OD＝0.55为诊断标准
a＝28 b＝6 灵敏度 90.32％
c＝3 d＝24 特异度 80.00％
总符合率 85.25％。
实施例2
在本实施例中，检测方法及步骤与实施例1相同，只是提取的血清体积为40μL。
作为检测结果，经过老化(振荡)的样品含有突触核蛋白寡聚体，本发明的试剂盒在样品200倍稀释前不识别新鲜样品(主要含单体)，但识别老化样品(含寡聚体)，但当浓度高于200倍时，由于新鲜样品中也可有寡聚体形成，因此，随着振荡时间的延长，寡聚体的含量增加，出现吸光度增加的趋势，说明了本发明的试剂盒主要识别寡聚体。
实施例3
在本实施例中，检测方法及步骤与实施例1相同，只是提取的体液样本为脑脊液，并且提取的脑脊液量为10μL。
作为检测结果，证实了本发明的试剂盒主要识别寡聚体，确认了本发明方法能够在取样量很小(约10～100μL)的情况下反映受试者脑脊液内α-突触核蛋白的聚合能力。
综上所述，与文献报道的方法相比较，本发明提供的方法具有例如但不限于以下的优点：只需要少量(约10～100μL)的体液样本，受试者容易接受；操作简单，通过将外源疾病相关蛋白如α-突触核蛋白加入体液样本如血清中，振荡孵育之后，直接可以进行测试；本测试方法所获得的结果反映了受试者各种导致疾病相关蛋白如α-突触核蛋白聚合的因素的综合作用，这尤其对判定帕金森病人的综合身体状况更有利。
本方法是测定受试者体液(包括血清、血浆或脑脊液等)内疾病相关蛋白聚合能力的一种方法，因此，不仅可用于与帕金森病相关的α-突触核蛋白的测试，而且也有可用于检测阿尔兹海默病人血液和脑脊液对β-淀粉样肽的聚合能力。
此外，由于测定的是外加的疾病相关蛋白如α-突触核蛋白形成的寡聚体，浓度较高，使测试比较容易，数据的重复性和稳定性也很高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种体外检测受试者体液促进疾病相关蛋白聚合能力的方法，所述方法包括：
a.提供来自受试者的体液样本；
b.制备所述疾病相关蛋白的寡聚体，其通过将纯化的重组人疾病相关蛋白与所述体液样本在一定温度条件下进行振荡孵育，使所述疾病相关蛋白聚合而制得；其中所述重组人疾病相关蛋白通过重组质粒原核或真核表达制备，并进行纯化，最后冷冻抽干保存；
c.检测所述疾病相关蛋白的寡聚体，其中检测孵育后的所述体液样本中的所述疾病相关蛋白寡聚体的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病相关蛋白是α-突触核蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中检测α-突触核蛋白寡聚体的方法是ELISA方法。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体液样本是受试者的血清、血浆或脑脊液，其量为10～100μL。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述α-突触核蛋白寡聚体的制备过程包括将体液样本用PBS或生理盐水稀释；接着加入所述重组人α-突触核蛋白，过滤除菌；然后振荡孵育。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述体液样本用所述PBS或生理盐水稀释0～10倍。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述振荡孵育的温度为约20～40℃、频率为约100～1000rpm、时间为约6～72小时。
8.根据权利要求5所述的方法，进一步包括在所述振荡孵育后将所得反应液用所述PBS溶液稀释100～200倍。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，所述ELISA方法检测所述α-突触核蛋白寡聚体的步骤包括：
a.包被：用NaHCO3缓冲液稀释非生物素化的3D5抗α-突触核蛋白单克隆抗体至终浓度为约0.1～2.0μg/mL，向酶标板各孔加入所述抗体稀释液，孵育过夜，用PBST冲洗所述酶标板各孔；
b.封闭：向酶标板各孔加入50～200μL封闭液，在35～40℃孵育1～5小时后，用PBST冲洗所述酶标板各孔，然后向酶标板各孔加入经稀释的所述α-突触核蛋白寡聚体样品，在35～40℃孵育1～5小时后，用所述PBST冲洗所述酶标板各孔；
c.用所述封闭液稀释生物素化的3D5单克隆抗体至终浓度为约0.1～2μg/mL，向酶标板各孔加入该抗体稀释液，在35～40℃孵育1～5小时，用所述PBST冲洗酶标板各孔；
d.用所述封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶，向酶标板各孔加入所述抗体稀释液，在35～40℃孵育0.5～2小时，用所述PBST冲洗所述酶标板各孔；
e.向酶标板各孔加入pNPP，并室温显色10～50分钟；
f.在405nm处测定酶标板各孔的吸光度值。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法在检测与帕金森病相关的α-突触核蛋白聚合能力中的应用。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法在检测路易体痴呆、阿尔兹海默病人或其他蛋白变性病血液和脑脊液对相关蛋白或多肽聚合能力中的应用。
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