CN104215779B - 一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法 - Google Patents

一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104215779B
CN104215779B CN201410477971.5A CN201410477971A CN104215779B CN 104215779 B CN104215779 B CN 104215779B CN 201410477971 A CN201410477971 A CN 201410477971A CN 104215779 B CN104215779 B CN 104215779B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpha
synapse nucleoprotein
haemoglobin
monoclonal antibody
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410477971.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104215779A (zh
Inventor
于顺
杨巍巍
李昕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Khun New District Kang Shun Biotechnology Co., Ltd.
Original Assignee
Xuanwu Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xuanwu Hospital filed Critical Xuanwu Hospital
Priority to CN201410477971.5A priority Critical patent/CN104215779B/zh
Publication of CN104215779A publication Critical patent/CN104215779A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104215779B publication Critical patent/CN104215779B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测与血液中红细胞内血红蛋白结合的总α-突触核蛋白含量的方法，所述方法包括利用抗人血红蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，利用抗人α-突触核蛋白单克隆抗体作为检测抗体，利用抗原-抗体反应原理检测帕金森病人和正常健康人与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的含量并进行比较。

Description

一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测与血液红细胞内血红蛋白结合的α-突触核蛋白含量的方法，该方法可用于帕金森病的诊断。
背景技术：
帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病，临床上主要表现为静止振颤、运动迟缓、肌肉僵直和姿势不稳定等运动症状。引起这些症状的原因是中脑黑质多巴胺神经元大量死亡和由此引起的纹状体部位的多巴胺神经递质的大幅度减少。帕金森病的主要病理特征是神经细胞内出现嗜酸性包涵体——路易体(Lewybody)和路易神经索(Lewyneurite)构成路易体和路易神经索的主要成分是纤维化的α-突触核蛋白(α-synuclein)。大量研究表明，α-突触核蛋白是在帕金森病的发病中起关键作用的蛋白质。α-突触核蛋白基因点突变和多倍体变异可以引起家族性早发性帕金森病，其基因启动子多态性与帕金森病的发病风险有关。已经证明，帕金森病人脑组织中的α-突触核蛋白存在改变，表现为该蛋白的表达量异常增高，磷酸化、硝基化、泛素化和糖基化的修饰体增加。异常表达和修饰的α-突触核蛋白引起该蛋白异常聚集成寡聚体，并进而形成纤维而沉积在路易体中。大量证据表明，异常表达、修饰的α-突触核蛋白促进其聚集成对神经元具有毒性作用的蛋白寡聚体，是各种原因导致神经元退变和帕金森病的关键。鉴于α-突触核蛋白在帕金森病发病和病理生理过程中的关键作用，检测该蛋白在体液中的变化被认为对帕金森病具有诊断意义。目前对脑脊液的检测表明，帕金森病人脑脊液中的总的α-突触核蛋白含量降低和寡聚化α-突触核蛋白含量增高，具有较高的诊断特异性和敏感性。目前对帕金森病人血液中的α-突触核蛋白的检测主要限于血清和血浆。然而，受限于检测技术的敏感性和稳定性以及其它干扰因素的影响，血清和血浆中的α-突触核蛋白的检测结果及其在帕金森病的诊断意义尚不能定论。不同研究者报道的正常值相差数百甚至上千倍。帕金森病人血浆和血清中的α-突触核蛋白含量有报道高于正常对照、低于正常对照和没有明显变化等不同结果。
研究表明，血液中的α-突触核蛋白99％存在于红细胞中。由于红细胞是无核细胞，不能表达α-突触核蛋白，其胞浆的主要成分是血红蛋白，由此推测，红细胞中的α-突触核蛋白含量较高的原因很可能与血红蛋白有关。基于上述推测，我们证明了血红蛋白可以与α-突触核蛋白结合成复合体。由于α-突触核蛋白可以以被动扩散的方式通过细胞膜，因此，血红蛋白可以将胞浆中的α-突触核蛋白富集到红细胞中，导致红细胞中α-突触核蛋白含量明显高于血液中的其它组分。因此，检测红细胞中血红蛋白结合α-突触核蛋白含量将有可能反应不同生理病理情况下该蛋白的变化情况。
本发明提供一种检测红细胞内与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，可以显著区分帕金森病人和正常健康人的血红蛋白结合α-突触核蛋白含量，是筛选帕金森病高危人群和临床诊断帕金森病的重要手段。
发明内容：
本发明提供一种检测红细胞内与血红蛋白结合的总α-突触核蛋白含量的方法，利用该方法所获得的结果，有助于对帕金森病以及其它突触核蛋白病进行诊断和判定治疗效果。
本发明所述方法，利用抗人血红蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，利用抗人α-突触核蛋白单克隆抗体作为检测抗体，利用抗原-抗体反应原理检测帕金森病人、其它突触核蛋白病人和正常健康人与血红蛋白结合的总α-突触核蛋白的含量并进行比较。
为此，本发明提供一种检测红细胞内与血红蛋白结合总α-突触核蛋白含量的方法，所述方法，包括以下步骤：
(1)分离红细胞中的胞浆蛋白；
(2)用抗人血红蛋白单克隆抗体捕获胞浆蛋白中的血红蛋白；
(3)用生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体检测与血红蛋白结合的α-突触核蛋白；
(4)加入亲和素标记的碱性磷酸酶和显色剂，进行显色；
(5)用分光光度法对显色的样品进行吸光度测定，用标准曲线计算样品中与血红蛋白结合的总α-突触核蛋白的含量。
以下对本发明所用名称术语进行解释：
(1)抗人血红蛋白单克隆抗体：识别血红蛋白A亚基，抗原为纯化人血红蛋白A亚基，与灵长类动物，大鼠，小鼠发生反应。
(2)血红蛋白结合总α-突触核蛋白：与血红蛋白发生相互作用的所有的α-突触核蛋。
(3)血红蛋白-α-突触核蛋白复合体：在红细胞胞浆中，血红蛋白与α-突触核蛋白发生相互作用形成的复合物，称为血红蛋白-α-突触核蛋白复合体。
(4)抗人α-突触核蛋白单克隆抗体：为任何特异性识别人α-突触核蛋白的单克隆抗体。
(5)链霉亲和素标记碱性磷酸酶：在ELISA测定中，链霉亲和素标记碱性磷酸酶复合物中的链霉亲和素可以与生物素化的α-突触核蛋白的单克隆抗体结合，而复合物中的碱性磷酸酶可以催化色原底物对硝基苯磷酸盐(pNPP)生成黄色的对硝基酚(pNP)，其在入＝405nm处有最大光吸收。
(6)显色剂：为对硝基苯磷酸盐二钠盐，或4硝基苯磷酸盐，英文名称p-nitrophenylphosphatedisodium或4-nitrophenylphosphatedisodium，缩写为pNPP。用于ELISA的化学显色底物，可在碱性磷酸酶的催化下形成对硝基酚(pNP)，后者是黄色水溶产物，该产物在405nm处有最大光吸收。
(7)ELISA酶标板：在酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)中，作为载体的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附起重要作用。抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附，通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。
(8)PBS：磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline)，浓度为0.01mol/L。NaHCO3缓冲液：碳酸氢钠缓冲液，浓度为200mmol/L，pH9.6。
(9)封闭液：明胶含量为2.5％的PBST溶液，作用为封闭非特异结合，降低ELISA背景。
(10)PBST：在0.01mol/LPBS中含有0.05％Tween-20即为磷酸盐吐温缓冲液，PBST。
(11)标准曲线的制作方法如下：每次试验时将血红蛋白-α-突触核蛋白复合物标准蛋白根据其中的α-突触核蛋白的摩尔浓度进行系列稀释，与样品同时进行检测，读取相对应405nm处吸光值，做出其与α-突触核蛋白浓度之间的关系曲线。
优选的本发明的检测红细胞内血红蛋白结合总α-突触核蛋白含量的方法，步骤如下：
步骤1，
取静脉血，必要时可以加入EDTA、肝素或枸橼酸抗凝，分离红细胞，经过离心即得红细胞胞浆蛋白；
步骤2，
抗人血红蛋白单克隆抗体包被ELISA酶标板，并加入封闭液进行封闭，随后加入上步得到的红细胞胞浆蛋白，或血红蛋白-α-突触核蛋白复合物标准蛋白；步骤3，
向上步ELISA酶标板中加入生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体，亲和素标记的碱性磷酸酶，对硝基苯磷酸显色液；
步骤4，
在405nm处测定酶标板各孔的吸光度值，根据标准曲线计算红细胞内血红蛋白结合α-突触核蛋白含量。
特别优选的本发明的检测红细胞内血红蛋白结合总α-突触核蛋白含量的方法，步骤如下：
步骤1，
取5-10ml抗凝血，混匀，贴壁加入至离心管中，记录全血的体积，1:1加入PBS，充分混匀。
将稀释后的全血缓慢加至淋巴细胞分离液上，离心，分离红细胞层。将红细胞转移到新的离心管中，加PBS，离心，-80℃保存。
冻存红细胞在室温融化后放入离心机，离心，上层即为红细胞胞浆蛋白。
步骤2，
包被：用NaHCO3缓冲液稀释抗人血红蛋白抗体至终浓度为0.1-4μg/mL。向酶标板各孔加入该抗体稀释液，孵育过夜。冲洗。
封闭：向酶标板各孔加入封闭液，孵育1～2小时。冲洗。加入红细胞胞浆样品，或血红蛋白-α-突触核蛋白复合物标准蛋白，孵育1～2小时。冲洗。
步骤3，
用封闭液稀释生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体至终浓度为0.1～2μg/mL。向酶标板的各孔加入该抗体稀释液，孵育1～2小时。冲洗。
用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶，向酶标板的各孔加入该酶的稀释液，孵育0.5～2小时。冲洗。
向酶标板的各孔加入对硝基酚磷酸显色液，显色10～50分钟。
步骤4，
在紫外分光光度计405nm处测定酶标板各孔的吸光度值。
根据体外制备的血红蛋白-α-突触核蛋白复合物标准蛋白中α-突触核蛋白的浓度与405nm处吸光值之间的关系曲线，计算样品中与血红蛋白结合总α-突触核蛋白的含量。
本发明所述的方法，其中，抗人血红蛋白单克隆抗体可以是任何一种特异性识别人血红蛋白的单克隆抗体，市场上可以买到。
本发明所述的方法，其中，其中抗人α-突触核蛋白单克隆抗体可以是任何一种特异性识别人α-突触核蛋白的单克隆抗体，市场上可以买到，如：1B2小鼠抗人α-突触核蛋白单克隆抗体。
本发明所述的方法，其中，其中血红蛋白-α-突触核蛋白复合体标准蛋白的制备方法如下：
1，用500μL的0.01mol/LPBS溶解α-突触核蛋白和血红蛋白分别至终浓度为2mol/L与1mol/L，于37℃、230rpm、振荡孵育24h；
2，孵育样品在10000×g离心5min，吸取上清，以PBS为流动相，HiPrep26/60SephacrylS-200HighResolution层析柱凝胶过滤；
3，分离血红蛋白-α-突触核蛋白复合物；
4，用SWATH定量蛋白组方法，确定平均每个血红蛋白结合的α-突触核蛋白分子数，从而计算出α-突触核蛋白占复合物的重量百分比和摩尔百分比。
本发明所述的方法，其中，1B2抗人α-突触核蛋白抗体其制备方法如下：
步骤1，抗原的制备：本实验室制备并纯化人全长α-突触核蛋白作为抗原。
步骤2，免疫小鼠：使用Freund’s完全佐剂(第一次免疫)与不完全佐剂(随后的免疫)乳化人α-突触核蛋白，每隔2周对BALB/c雌性小鼠进行免疫(50μg抗原/只小鼠)。抽取动物血清，利用ELISA与Westernblot方法检测其效价与特异性。
步骤3，筛选杂交瘤细胞株：选取血清效价高的小鼠，分离其脾细胞，在聚乙二醇(PEG)3000–3700存在的条件下与小鼠骨髓瘤细胞Sp2融合，随后使用HAT培养基筛选融合细胞，最后用ELISA方法筛选可以产生特异性抗体的杂交瘤细胞。ELISA阳性杂交瘤细胞进一步利用免疫组化与免疫印迹来检测杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。经筛选，1B2杂交瘤细胞可以产生特异性抗人α-突触核蛋白抗体。
步骤4，抗体制备：大量扩增1B2杂交瘤细胞，将其注射入BALB/c裸鼠腹膜腔内，产生腹水。然后利用proteinA亲和层析纯化腹水中的1B2抗人α-突触核蛋白抗体。
本发明所述的方法，其中，其中生物素化抗人α-突触核蛋白单克隆抗体制备方法如下：
1)用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。
2)用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.8)配制浓度至少为1～3mg/mL的抗体溶液，若抗体储存时加入了叠氮钠，则标记前须先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠。
3)按25～100μg的比率将生物素酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4h。在完成结合反应之前，DMSO的终浓度不能低于5％，否则生物素酯会出现沉淀。高浓度的生物素酯会导致多个生物素分子结合在抗体上，因此可能会使所有抗体都被标记。较低的比率则会是使生物素化保持在最低限度(25μg生物素酯抗体的最初摩尔比为10：1)。
4)每250μg生物素酯内加入20μL的1mol/L的氯化铵，室温孵育10min。
5)将抗体溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素。由于生物素分子较大，故透析比预料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G层析柱再次纯化抗体。按纯化抗体的储存方法保存标记抗体。本发明所述方法与现有技术相比具有如下优点：
1、在现有方法中，针对脑脊液总α-突触核蛋白和寡聚化α-突触核蛋白的检测虽然获得较高的诊断特异性和敏感性(最高90.6％和89.3％)，但由于脑脊液采集需要比较专业技术，不易被一些患者所接受，因此很难用于大规模筛查。此外，脑脊液样本的α-突触核蛋白测试结果有时也会受溶血等因素的影响。本发明所用方法是检测血液样本中的α-突触核蛋白，与检测脑脊液样本中的α-突触核蛋白相比较，血液样本的采集技术简单，便于操作，容易为患者所接受，因此适合大规模筛查。
2、迄今针对血液样本中α-突触核蛋白的检测，主要针对血浆或血清中总α-突触核蛋白、磷酸化α-突触核蛋白和寡聚化α-突触核蛋白进行检测，结果不一致，其诊断特异性和敏感性也较低。导致测试结果不稳定的重要原因之一是溶血引起的血浆样本的污染。因为红细胞中的α-突触核蛋白含量占全血的99％，因此，即使是少量溶血也能够影响测试结果。本发明所述方法是检测红细胞中血红蛋白结合α-突触核蛋白含量，避免了溶血对检测的影响。
3、本发明所述方法与现有方法相比较，还有如下优点：1)红细胞内血红蛋白样本量大，提取与保存样本较便捷；2)血红蛋白结合α-突触核蛋白含量较高，测试结果稳定；3)具有较高的诊断值：迄今获得的特异性和敏感性数值分别为87.3％和89.0％。这是目前基于血液样本α-突触核蛋白测试的诊断值最高的方法。
以下为目前诊断方法的主要文献及其结果：
1.ParkMJ,CheonSM,BaeHR,KimSH,KimJW.Elevatedlevelsofα-synucleinoligomerinthecerebrospinalfluidofpatientswithParkinson'sdisease.JClinNeurol.2011；7(4):215-522.(脑脊液α-突触核蛋白检测，脑脊液寡聚化α-突触核蛋白增高，总α-突触核蛋白无显著改变，没有诊断特异性、敏感性数据)。
2.TokudaT,QureshiMM,ArdahMT,VargheseS,ShehabSA,KasaiT,IshigamiN,TamaokaA,NakagawaM,El-AgnafOM.Detectionofelevatedlevelsofα-synucleinoligomersinCSFfrompatientswithParkinsondisease.Neurology.2010；75(20):1766-1772.(脑脊液α-突触核蛋白检测，寡聚化和总α-突触核蛋白比率在帕金森病诊断特异性和敏感性分别为90.6％和89.3％)。
3.MollenhauerB,LocascioJJ,Schulz-SchaefferW,F,TrenkwalderC,SchlossmacherMG.α-Synucleinandtauconcentrationsincerebrospinalfluidofpatientspresentingwithparkinsonism:acohortstudy.LancetNeurol.2011；10(3):230-240.(脑脊液α-突触核蛋白检测，脑脊液总α-突触核蛋白水平降低，诊断特异性和敏感性分别为52.83％和70.72％)。
4.KangJH,IrwinDJ,Chen-PlotkinAS,SiderowfA,CaspellC,CoffeyCS,WaligórskaT,TaylorP,PanS,FrasierM,MarekK,KieburtzK,JenningsD,SimuniT,TannerCM,SingletonA,TogaAW,ChowdhuryS,MollenhauerB,TrojanowskiJQ,ShawLM；Parkinson'sProgressionMarkersInitiative.Associationofcerebrospinalfluidβ-amyloid1-42,T-tau,P-tau181,andα-synucleinlevelswithclinicalfeaturesofdrug-naivepatientswithearlyParkinsondisease.JAMANeurol.2013；70(10):1277-1287.(脑脊液α-突触核蛋白检测，脑脊液总α-突触核蛋白水平降低并与总tau以及磷酸化tau有相关性)。
5.ParnettiL,ChiasseriniD,BellomoG,GiannandreaD,DeCarloC,QureshiMM,ArdahMT,VargheseS,BonanniL,BorroniB,TambascoN,EusebiP,RossiA,OnofrjM,PadovaniA,CalabresiP,El-AgnafO.CerebrospinalfluidTau/α-synucleinratioinParkinson'sdiseaseanddegenerativedementias.MovDisord.2011；26(8):1428-1435.(脑脊液α-突触核蛋白检测，脑脊液总α-突触核蛋白水平降低，总tau/α-synuclein比值在帕金森病的诊断特异性和敏感性分别为61％和89％)。
6.ShiM,BradnerJ,HancockAM,ChungKA,QuinnJF,PeskindER,GalaskoD,JankovicJ,ZabetianCP,KimHM,LeverenzJB,MontineTJ,GinghinaC,KangUJ,CainKC,WangY,AaslyJ,GoldsteinD,ZhangJ.CerebrospinalfluidbiomarkersforParkinsondiseasediagnosisandprogression.AnnNeurol.2011；69(3):570-580.(脑脊液α-突触核蛋白检测，脑脊液总α-突触核蛋白水平降低，在帕金森病的诊断特异性和敏感性分别为38％和92％)。
7.DuranR,BarreroFJ,MoralesB,LunaJD,RamirezM,VivesF.Plasmaalpha-synucleininpatientswithParkinson'sdiseasewithandwithouttreatment.MovDisord.2010；25(4):489-493.(血液α-突触核蛋白检测，证明帕金森病人血浆α-突触核蛋白水平增高，没有诊断特异性、敏感性数据)。
8.LeePH,LeeG,ParkHJ,BangOY,JooIS,HuhK.Theplasmaalpha-synucleinlevelsinpatientswithParkinson'sdiseaseandmultiplesystematrophy.JNeuralTransm.2006；113(10):1435-1439.(血液α-突触核蛋白检测，证明帕金森病人血浆α-突触核蛋白水平增高，没有诊断特异性、敏感性数据)。
9.LiQX,MokSS,LaughtonKM,McLeanCA,CappaiR,MastersCL,CulvenorJG,HorneMK.Plasmaalpha-synucleinisdecreasedinsubjectswithParkinson'sdisease.ExpNeurol.2007；204(2):583-588.(血液α-突触核蛋白检测，证明帕金森病人血浆α-突触核蛋白水平降低，没有诊断特异性、敏感性数据)。
10.El-AgnafOM,SalemSA,PaleologouKE,CurranMD,GibsonMJ,CourtJA,SchlossmacherMG,AllsopD.Detectionofoligomericformsofalpha-synucleinproteininhumanplasmaasapotentialbiomarkerforParkinson'sdisease.FASEBJ.2006；20(3):419-425.(血液α-突触核蛋白检测，证明帕金森病人血浆α-突触核蛋白寡聚体水平增高，诊断特异性85。2％、敏感性52.9％)。
11.GorostidiA,BergarecheA,Ruiz-MartínezJ,Martí-MassóJF,CruzM,VargheseS,QureshiMM,AlzahmiF,Al-HayaniA,LópezdeMunáinA,El-AgnafOM.Αlpha-synucleinlevelsinbloodplasmafromLRRK2mutationcarriers.PLoSOne.2012；7(12):e52312.(血液α-突触核蛋白检测，证明帕金森病人血浆α-突触核蛋白水平降低，没有诊断特异性、敏感性数据)。
12.FouldsPG,DiggleP,MitchellJD,ParkerA,HasegawaM,Masuda-SuzukakeM,MannDM,AllsopD.Alongitudinalstudyonα-synucleininbloodplasmaasabiomarkerforParkinson'sdisease.SciRep.2013；3:2540.(血液α-突触核蛋白检测，证明帕金森病人血浆磷酸化α-突触核蛋白水平增高，没有诊断特异性、敏感性数据)。
13.ShiM,LiuC,CookTJ,BullockKM,ZhaoY,GinghinaC,LiY,AroP,DatorR,HeC,HippMJ,ZabetianCP,PeskindER,HuSC,QuinnJF,GalaskoDR,BanksWA,ZhangJ.Plasmaexosomalα-synucleinislikelyCNS-derivedandincreasedinParkinson'sdisease.ActaNeuropathol.2014Jul6.[Epubaheadofprint]PubMedPMID:24997849.(血液α-突触核蛋白检测，证明帕金森病人血浆来自于脑的exsosomalα-突触核蛋白水平增高，诊断特异性53.5％、敏感性76.8％)。
通过上述文献发现，在脑脊液中总α-突触核蛋白水平在帕金森病人中普遍降低，而寡聚化α-突触核蛋白水平则增高，脑脊液中的α-突触核蛋白变化对帕金森病具有一定的诊断价值。但是脑脊液难以取得，不能实现对帕金森病的大规模检查。血液样本容易获得，适用于大规模健康检查。但以往针对血浆或血清中的α-突触核蛋白的检测，由于易受溶血的影响，使检测结果不稳定。
由于血液中99％以上的α-突触核蛋白都存在于红细胞中，故本发明可以直接检测红细胞中与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的含量，不受溶血影响，并且具有较高的特异性和敏感性。
由于本发明效果的优越性，本发明人根据上述方法制备了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：
抗人血红蛋白单克隆抗体
抗人α-突触核蛋白单克隆抗体
根据需要，所述试剂盒还可包括以下辅助试剂：
碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶
对硝基苯磷酸显色液
ELISA酶标板
PBS
NaHCO3缓冲液
封闭液
PBST
其中，
PBS的浓度为0.01mol/L，配制方法为
NaHCO3缓冲液的浓度为200mmol/L，pH9.6，配制方法为
NaHCO30.84g
20％叠氮钠(NaN3)50μl
DDW50ml
封闭液的浓度为2.5％，配制方法为
明胶2.5g
PBST100ml
PBST为含0.05％Tween20的0.01mol/LPBS，配制方法为
上述试剂盒的使用是以血红蛋白-重组人α-突触核蛋白复合体作为标准蛋白，以该复合体浓度与吸光度值的关系曲线作为标准曲线，通过测定样本中的与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的浓度达到诊断帕金森病的目的。
本发明的试剂盒，各试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。
本发明的试剂盒的使用是根据上述检测红细胞内与血红蛋白结合的α-突触核蛋白含量的方法进行的，使用时将试剂盒中的试剂根据需要配制成相应的浓度，按照所述方法测定即可。
为研究本发明，还进行了以下重复性试验，精密度试验，检测方法的筛选等试验。
将实施例3中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验。以实施例3中所抽取的试剂盒测定三份高、中、低值样本0.5mmol/L、0.125mmol/L和0.03125mmol/L各8次。计算测定浓度的变异系数。实施例3中的三批试剂盒的结果表明变异系数小于8.0％。
相同样本重复实验3次，结果显示相对标准差RSD为0.60％。
采用棋盘滴定试验确定抗体包被浓度、样本稀释倍数以及生物素化抗体浓度。根据初步确定的浓度缩小间距，再做进一步棋盘滴定，确定最佳试验条件。最终确定人血红蛋白抗体包被浓度为2μg/mL，样本稀释倍数为1：4，生物素化抗体浓度为1μg/mL为最佳实验条件。
附图说明：
图1红细胞胞浆蛋白分离过程示意图
图2血红蛋白结合总α-突触核蛋白在帕金森病患者明显高于健康受试者(左图，P<0.01)。受试者工作曲线(Receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC)分析表明，血红蛋白结合α-突触核蛋白在帕金森病诊断的特异性和敏感性分别为89.0％和87.3％。CTL：健康对照；PD：帕金森病人
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1，
红细胞胞浆蛋白的制备(图1)
步骤1，
取5-10ml抗凝血(EDTA、肝素或枸橼酸抗凝)。将抗凝血上下颠倒轻轻混匀，贴壁加入至50ml离心管中，记录全血的体积，1：1加入PBS，充分混匀。步骤2，
将稀释后的全血缓慢加至淋巴细胞分离液上，400×g，离心20min。此时管内液体由上至下的顺序依次为血浆层、白膜层(外周血单个核细胞)、分离液层以及红细胞层。
步骤3，
吸去血浆层、白膜层和分离液层，将底层的红细胞转移到新的50ml离心管中，加PBS至40ml，2000rpm，离心10min，如此反复3次。分装，-80℃保存备用。
步骤4，
冻存红细胞在室温融化后放入4℃离心机，13000rpm，离心10min，抽提红细胞胞浆蛋白备用。
实施例2，
血红蛋白结合α-突触核蛋白的ELISA检测过程
步骤1，
包被：用NaHCO3缓冲液稀释抗人血红蛋白抗体至终浓度为约0.1—2μg/mL。向酶标板各孔加入100μL该抗体稀释液，4℃孵育过夜。用PBST(其为含有吐温的PBS)冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
步骤2，
封闭：向酶标板各孔加入100μL封闭液(其为含有明胶和Tween-20的PBS)，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
步骤3，
加样：向各孔加入100μL已制备好的红细胞胞浆样品，浓度为8～10μg/mL，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
步骤4，
加检测抗体：用封闭液稀释生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体至终浓度为0.1～2μg/mL。向酶标板的各孔加入100μL该抗体稀释液，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
步骤4，
加标记酶和显色液：用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶标板的各孔加入100μL该标记酶的稀释液，在37℃孵育0.5～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。
向酶标板的各孔加入100μLpNPP(对硝基苯磷酸显色液，由Sigma公司出售)，37℃显色10～50分钟。
步骤5，
测定吸光度值：用酶标仪测定405nm处酶标板各孔的吸光度值。
根据体外制备的血红蛋白-人α-突触核蛋白复合体标准蛋白中α-突触核蛋白的浓度与405nm处吸光值之间的关系曲线，计算样品中与血红蛋白结合总α-突触核蛋白的量。
实施例3，
真实样品的检测(图2)
采用相对定量ELISA法，对100例临床诊断的帕金森病人和100例健康对照人群血液红细胞胞浆中与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的量进行检测。结果显示帕金森病人红细胞中与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的量为0.83μmol/L，帕金森病人红细胞中与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的最高值为1.025μmol/L；而正常健康对照红细胞中与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的量为0.454μmol/L，最高值为0.597μmol/L。帕森病人红细胞中与血红蛋白结合的α-突触核蛋白的量明显高于正常健康对照(p＜0.01)。
实施例4，
试剂盒成分举例(1块ELISA酶标版，可用于24个人样本检测)
抗人血红蛋白单克隆抗体20μg
生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体10μg
碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶5μL
对硝基苯磷酸显色液10mL
ELISA酶标板
PBS0.01mol/L，10mL
NaHCO3缓冲液200mmol/L，10mL
封闭液10mL
PBST300mL。

Claims (8)

1.一种用于检测与血红蛋白结合的总α-突触核蛋白含量的试剂盒，试剂盒中包括以下试剂：抗人血红蛋白单克隆抗体，生物素化抗人α-突触核蛋白单克隆抗体，血红蛋白-α-突触核蛋白复合体标准蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下辅助试剂：碱性磷酸酶，对硝基苯磷酸二钠显色液，ELISA酶标板，磷酸缓冲液，NaHCO3缓冲液，封闭液，PBST。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中
磷酸缓冲液的浓度和pH值为0.01mol/L，pH7.4，
NaHCO3缓冲液的浓度和pH值为200mmol/L,pH9.6，
PBST的浓度为含0.05％Tween-20的0.01mol/LPBS，
封闭液的成分为含2.5％明胶的PBST。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中各试剂分别包装，每个包装装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，抗人血红蛋白单克隆抗体可以是任何一种特异性识别人血红蛋白的单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中抗人α-突触核蛋白单克隆抗体可以是任何一种特异性识别人α-突触核蛋白的单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中抗人α-突触核蛋白单克隆抗体为：1B2小鼠抗人α-突触核蛋白单克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中血红蛋白-α-突触核蛋白复合体标准蛋白的制备方法如下：
1)用500μL的0.01mol/LPBS溶解α-突触核蛋白和血红蛋白分别至终浓度为2mol/L与1mol/L，于37℃、230rpm、振荡孵育24h；
2)孵育样品在10000×g离心5min，吸取上清，以PBS为流动相，HiPrep26/60SephacrylS-200HighResolution层析柱凝胶过滤；
3)分离血红蛋白-α-突触核蛋白复合体；
4)用SWATH定量蛋白组方法，确定平均每个血红蛋白分子结合的α-突触核蛋白分子数，从而计算出α-突触核蛋白占复合体的重量百分比和摩尔百分比。
CN201410477971.5A 2014-09-18 2014-09-18 一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法 Active CN104215779B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410477971.5A CN104215779B (zh) 2014-09-18 2014-09-18 一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410477971.5A CN104215779B (zh) 2014-09-18 2014-09-18 一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104215779A CN104215779A (zh) 2014-12-17
CN104215779B true CN104215779B (zh) 2016-01-20

Family

ID=52097491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410477971.5A Active CN104215779B (zh) 2014-09-18 2014-09-18 一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104215779B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3051839A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
CN108020673A (zh) * 2017-11-15 2018-05-11 首都医科大学宣武医院 Aβ试剂盒、检测方法及应用
CN109136202A (zh) * 2018-08-21 2019-01-04 中国医学科学院北京协和医院 一种flnb基因突变的atdc5细胞模型的差异蛋白体系、筛选方法及应用
CN111537738A (zh) * 2020-05-18 2020-08-14 南通大学附属医院 用于超早期帕金森病检测的试剂盒
CN112920274A (zh) * 2021-03-17 2021-06-08 江苏贝格尔生物医药有限公司 一种检测alpha-synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101308144A (zh) * 2007-05-16 2008-11-19 首都医科大学宣武医院 检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法
CN101666798A (zh) * 2009-03-13 2010-03-10 首都医科大学宣武医院 检测帕金森病的蛋白标志物、试剂盒及其应用
CN101692092A (zh) * 2009-09-24 2010-04-07 首都医科大学宣武医院 定量检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009152607A1 (en) * 2008-06-16 2009-12-23 Ottawa Hospital Research Institute Methods and kits for diagnosing neurodegenerative disease

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101308144A (zh) * 2007-05-16 2008-11-19 首都医科大学宣武医院 检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法
CN101666798A (zh) * 2009-03-13 2010-03-10 首都医科大学宣武医院 检测帕金森病的蛋白标志物、试剂盒及其应用
CN101692092A (zh) * 2009-09-24 2010-04-07 首都医科大学宣武医院 定量检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104215779A (zh) 2014-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104215777B (zh) 一种检测血红蛋白结合磷酸化alpha-突触核蛋白的方法
CN104215779B (zh) 一种检测血红蛋白结合alpha-突触核蛋白的方法
CN102680698B (zh) 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)
JP5710699B2 (ja) オートタキシン測定による慢性肝疾患の検査方法および検査薬
CN102608325B (zh) 心型脂肪酸结合蛋白(h-fabp)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)
CN105403693A (zh) 一种磁微粒化学发光试剂的制备方法
CN108680756A (zh) 一种不完全抗体检测试剂盒及检测方法
CN105974106B (zh) 11-脱氢-血栓素b2测定试剂盒及其用途
Iadarola et al. Recent applications of CE‐and HPLC‐MS in the analysis of human fluids
RU2712270C2 (ru) Способы обнаружения маркера для активного туберкулеза
CN107045062A (zh) 检测人ngal的胶体金免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
CN103983778B (zh) 一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白聚合能力的方法
Bailey Colorimetry of serum acetaminophen (paracetamol) in uremia.
JPH0220068B2 (zh)
CN108593811B (zh) 一种测定生物体液中百草枯和敌草快含量的方法
CN103954763A (zh) 一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰能力的方法
CN106771145A (zh) 一种检测d‑二聚体斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法
Loun et al. Adaptation of a quantitative immunoassay for urine myoglobin: predictor in detecting renal dysfunction
CN104880562A (zh) 一种l-fabp快速检测试剂及其制备方法
Serdar et al. Comparison of relationships between FT4 and log TSH in Access DXI 800 Unicel, Modular E170 and ADVIA Centaur XP Analyzer
CN108020673A (zh) Aβ试剂盒、检测方法及应用
Molthan et al. Hemolytic transfusion reaction due to anti-Kell undetectable in low-ionic-strength solutions
Nguyen et al. Drug-induced immune hemolytic anemia investigation: Comparison between tube test and microcolumn agglutination (gel test) for the detection of drug-dependent antibodies in the presence of soluble drug
RU2129717C1 (ru) Способ экспресс - диагностики герпетических нейроинфекций у детей
CN103698533A (zh) Apo-A1蛋白在制备肺癌早期筛查或诊断用血清标记物的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20171208

Address after: 550025 Biologic Science and Technology Industrial Park in Guizhou Province

Patentee after: Khun New District Kang Shun Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 100053 Xuanwu hospital, No. 45, Changchun Street, Xicheng District, Beijing

Patentee before: Xuanwu Hospital, Shoudu Medical Univ.

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20141217

Assignee: Beijing Parr Kang Technology Co., Ltd.

Assignor: Khun New District Kang Shun Biotechnology Co., Ltd.

Contract record no.: 2018990000094

Denomination of invention: Method for detecting hemoglobin-combined alpha-synuclein

Granted publication date: 20160120

License type: Common License

Record date: 20180416