CN101666798A - 检测帕金森病的蛋白标志物、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组检测帕金森病血清的蛋白标志物、检测该蛋白标志物的试剂盒及其应用。本发明中的蛋白标志物由血清蛋白质组图谱中的5个不同分子量的蛋白质组成：A：2961Da、B：4309Da、C：5234Da、D：6121Da和E：8170Da。检测该蛋白标志物的试剂盒由以羧基为配基的纳米磁珠，裂解液，缓冲液，蛋白质阅读仪，质控血清及其他试剂组成。该试剂盒在检测帕金森病中的应用方法为：利用裂解液处理待测血清样本；利用以羧基为配基的纳米磁珠孵育并捕获血清蛋白；洗脱纳米磁珠，并用蛋白质阅读仪检测洗脱组分中的5个特异蛋白。本发明的试剂盒及检测方法具有快速、敏感、特异、灵敏、操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明涉及检测帕金森病的蛋白标志物、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
随着人类基因组计划的完成，生命科学又迎来了后基因组时代的挑战——人类蛋白质组学(Proteome)。因为人类基因组虽然包含了我们身体的全部遗传信息，但那也只是制造蛋白质的设计图纸。而构成细胞并表现各种生命现象则是由蛋白质通过其发挥生理功能来完成的。因此，惟有蛋白质才是生命现象的表现者和承担者。蛋白质也是机体各种不同类型细胞之间差异的决定因素，尽管所有的细胞都拥有同样的基因组，但在不同的细胞内会有不同的基因处于开放(表达)状态，从而合成不同的蛋白质。同样，病变细胞和正常细胞的差异在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白质的不同来决定的。
帕金森病(Parkinson′s Disease，PD)是临床最常见的神经变性疾病之一。帕金森病的临床期检测主要依靠症状和体征。由于缺乏疾病特异性生物标志物和有效的实验室辅助检测方法，所以帕金森病在临床前期无法检测。当帕金森病发展到临床期时，其患者的中脑多巴胺能神经元蜕变已达70％。因此，早诊早治是目前改善食管癌患者长期生存的最佳途径。帕金森病的辅助检测方法如嗅觉测试、影像学(PET、SPECT)检查等尚在探索之中。这些检测结果似乎也能对临床期帕金森病的检测提供支持，但它们的敏感性和特异性都无法满足临床需要，或不能对帕金森病的早期检测及基础研究提供明确的信息。SPECT和PET等影像学检查由于花费昂贵、需要应用示踪剂(存在放射性损伤)、需要特殊仪器等，难以在临床大规模地推广。而体液(血清、血浆、尿液和脑脊液)的生物标志物由于检测方法简便、快速、来源相对丰富，特别适合于临床的大规模检测或筛查，是未来发展的方向。迄今为止，人们仍在积极地、不懈地寻找帕金森病特异的或相关的生物标记物。如帕金森病患者外周血的丙二醛、超氧阴离子自由基、DNA氧化修饰的产物8-羟基脱氧鸟苷及RNA氧化产物8-羟基鸟苷[16]等氧化应激指标的水平与正常对照相比存在差异。帕金森病患者外周血淋巴细胞多巴胺转运体的活性降低。帕金森病患者血小板单胺氧化酶B的活性增加而血浆β-苯乙胺的水平降低。但是，这些所谓的标志物无论是单用还是联合应用，均没有足够的敏感性和特异性来用于帕金森病的检测。
发明内容
本发明的第一个目的是提供可用于检测帕金森病的一组特异性强、灵敏度高的蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种操作简便、结果准确的可用于检测帕金森病的试剂盒。
本发明的第三个目的是提供一种快捷、准确、方便的检测帕金森病的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一组检测帕金森病的蛋白标志物，由血清蛋白质组图谱中的5个不同分子量的蛋白质组成：A：2961Da、B：4309Da、C：5234Da、D：6121Da和E：8170Da。
一种检测所述蛋白标志物的试剂盒，由以下成分组成：
1)以羧基为配基的纳米磁珠；
2)裂解液：9M Urea，20g/L CHAPS，10g/IL DTT，50mMTris-HCl，pH9.0；
3)缓冲液：50mM NaAC，pH4.0；
4)去离子水；
5)芥子酸；
6)0.5％v/v三氟乙酸；
7)50％乙腈；
8)蛋白质阅读仪；
9)质控血清。
所述试剂盒在检测帕金森病中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用裂解液处理待测血清样本30min；
2)利用以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白；
3)洗脱以羧基为配基的纳米磁珠，并用蛋白质阅读仪检测血清中的5个特异蛋白；
4)质控血清检测结果为阴性；受试样品检测结果重复性CV应小于10％，否则，此次实验视为无效。受试样品中5个蛋白质符合A：2961Da≤3.89μJ；B：4309Da≤4.39μJ；C：5234Da≤3.49μJ；D：6121Da≤1.53μJ；E：8170Da＞15.06μJ为阴性，有一项或多项蛋白不符合则为阳性。
本发明的有益效果为：1)快速：从样品处理到结果判断仅需1小时左右；2)敏感：检测蛋白最低浓度为1fmol；3)特异：与传统的临床检查帕金森病指标不存在相关性，而且还利用羧基基团在pH为4.0溶液中的电荷作用，特异性捕捉血清中含有赖氨酸，精氨酸，组氨酸的五个蛋白质；4)灵敏：检测蛋白分子量可精确到0.1Da，血清稀释40倍仍可检出；5)操作简单：试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任此项工作并且操作重复性CV达到5％以下。
附图说明
图1是建立帕金森病检测模型的5个差异蛋白峰在帕金森病组和健康对照组之间的典型图谱
图2是帕金森病的检测模型示意图
图3是该检测模型的受试者工作特征曲线(receive operating characteristiccurve，ROC曲线)
具体实施方式
仪器及试剂：以羧基为配基的纳米磁珠：购自Bruker公司，货号MBWCX；裂解液：9M Urea，2％ w/v CHAPS，50mM Tris-HCl，pH9.0购自SIGMA公司，货号U0631，C5070，T2819；缓冲液：50mM NaAC，pH4.0购自SIGMA公司，货号S7545；去离子水：购自SIGMA公司，货号27，073-3；芥子酸：购自SIGMA公司，货号S5019；三氟乙酸(TFA)：购自SIGMA公司，货号T6508；蛋白质阅读仪：购自BIORAD公司，货号PBSIIc；质控血清：购自BIORAD公司，货号StandardS10。
实施例1.检测血清蛋白标志物及建立帕金森病检测模型
1)血清样本：2007年首都医科大学宣武医院帕金森病专科门诊、体检中心及住院患者共160例血清样品。其中原发性帕金森病81例，其他神经变性病39例(包括帕金森综合症10例，进行性核上性麻痹9例，痴呆6例，特发性震颤5例，肌张力障碍4例，多系统萎缩3例及WILSON综合征2例)，健康对照40例。建模血清样本：随机选择120例样本建模，其中帕金森病疾病组61例，年龄56.8±12.8岁；非帕金森病对照组59例，包括其他神经变性病(OND)9例和正常人30例，年龄64.3±13.2岁(见表1)。
表1160例样本的临床资料和分组信息
血清样品的采集：清晨空腹采集病人全血5mL，置于真空负压管中，不加抗凝剂，室温静置1h，2000g离心20min，取上清。分装为50μl/管，-80℃冰箱保存。
样本的制备：从-80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10000rpm离心20min。取上清10μl与20μl的U9裂解液(9mol/L Urea，20g/L CHAPS，10g/L DTT，50mmolTris-HCl，pH9.0)混合。4℃振荡孵育30min后稀释40倍。
2)用以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白：向以羧基为配基的纳米磁珠中加入100μl处理好的血清样品，振荡孵育1h。置于磁性分离板上2min，弃上清液。加入100μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，5min/次。用10μl 0.5％(v/v)的TFA洗脱以羧基为配基的纳米磁珠5min。取5μl洗脱液与等量的SPA溶液(含饱和的芥子酸，50％乙腈，0.5％TFA)充分混合，吸取2μl混合物点样于载片上，室温下自然干燥，用PBS II-C型蛋白质阅读仪检测血清中五个特异蛋白。
3)蛋白质阅读仪参数设置：采用337nm波长的氮气激光光源照射芥子酸与血清样品的混合物，最高分子量为50KD，优化范围1-15KD，激光强度为180μJ，检测灵敏度为8。检测前用All-in-one多肽标准芯片校正仪器，系统质量偏≤0.1％。原始数据用Biomaker Wizard 3.1软件标化处理得到准确的含量数值。
4)质控血清：测试前加入标准化质控血清作为标准参照。
5)血清蛋白质组图谱的初步分析：
利用SPSS 13.0(Statistical Program for Social Sciences，即社会科学统计程序软件)对已经整合的所有数据进行进一步处理，选择其中的一些参数如K-S检验、t检验等，共检测到228个蛋白质峰，经过非参数检测得到17个P＜0.01的蛋白质峰(见表2)。
表2PD组和对照组17个差异蛋白详细信息(P＜0.01)
注：倾斜加粗字体表示被选用建立PD诊断模型的5个差异蛋白峰
6)帕金森病患者血清五个特异的蛋白质标志物的获得：
使用Biomarker Patterns software 5.0高级树状模型分析软件处理已经初步得到的蛋白质的数据，选择特定的参数配置，通过对42例帕金森病和42例正常对照的分析，寻找出最佳的分析模型：A：2961Da≤3.89μJ；B：4309Da≤4.39μJ； 如图1所示。帕金森病血清蛋白指纹由5个不同分子量的蛋白质组成。在这种分析模型中得到5个在帕金森病组和对照组中具有差异表达的蛋白质峰，并联合应用这5种蛋白质的差异可以有效地区分帕金森病和正常对照组(如图2所示)。在对这两组共计84例标本的分析中，检测的灵敏度为90.4％，特异性为97.6％。该检测模型的受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve，ROC曲线)如图3所示。
实施例2检测帕金森病特异蛋白标志物试剂盒的临床试用
1)血清样本：选择40例进行试用，包括帕金森病20例、OND10例、健康对照组10例(见表3)。
表3PD诊断模型的诊断特性和盲法验证结果
注：建模对照组包括健康人30例和OND29例，盲法验证组包括健康人10例和OND10例，建模组样品和盲法验证组的样品的H-Y分级均为1-3级
所有原发性帕金森病病人的检测均符合帕金森病国际检测评分标准，H-Y分级为I-IV级。
血清样品的采集：清晨空腹采集病人全血5mL，置于真空负压管中，不加抗凝剂，室温静置1h，2000g离心20min，取上清。分装为50μl/管，-80℃冰箱保存。
2)样本的制备：从-80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10000rpm离心2min。取上清10μl与20μl的U9裂解液(9mol/L Urea，20g/L CHAPS，10g/L DTT，50mmolTris-HCl，pH9.0)混合。4℃振荡孵育30min后加入370μl醋酸钠缓冲液(100mmol/L醋酸钠，pH4.0)。
3)以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白：向以羧基为配基的纳米磁珠中加入100μl处理好的血清样品，振荡孵育30min。置于磁性分离板上1min，弃上清液。加入100μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，2min/次。用10μl 0.5％(v/v)的TFA洗脱以羧基为配基的纳米磁珠2min。取5μl洗脱液与等量的SPA溶液(含饱和的芥子酸，50％乙腈，0.5％TFA)充分混合，吸取2μl混合物点样于载片上，室温下自然干燥，用PBS II-C型蛋白质阅读仪检测血清五个蛋白。
4)蛋白质阅读仪参数设置：采用337nm波长的氮气激光光源照射芥子酸与血清样品的混合物，最高分子量为50KDa，优化范围1-15KDa，激光强度为180μJ，检测灵敏度为8。检测前用All-in-one多肽标准芯片校正仪器，系统质量偏≤0.1％。原始数据用Biomaker Wizard 3.1软件标化处理得到准确的含量数值。
5)质控血清：测试前加入标准化质控血清作为标准参照。
6)应用五个蛋白组成的检测模型进行检测：利用本发明检测模型A：2961Da≤3.89μJ；B：4309Da≤4.39μJ；C：5234Da≤3.49μJ；D：6121Da≤1.53μJ；E：8170Da≤15.06μJ将受检者血清中五个蛋白质的具体数值与本发明中的检测模型逐一对比分析，判断其是否为帕金森病患者。检测结果如表3所示。敏感性为85％，特异性为70％。
实施例3检测一名帕金森病患者的临床应用
1)血清样本：一名帕金森病志愿者，2007年首都医科大学宣武医院帕金森病专科门诊提供。
血清样品的采集：清晨空腹采集病人全血5mL，置于真空负压管中，不加抗凝剂，室温静置1h，2000g离心2min，取上清。分装为50μl/管，-80℃冰箱保存。
2)样本的制备：从-80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10000rpm离心2min。取上清10μl与20μl的U9裂解液(9mol/L Urea，20g/L CHAPS，10g/L DTT，50mmolTris-HCl，pH9.0)混合。4℃振荡孵育30min后40倍稀释。
3)用以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白：向以羧基为配基的纳米磁珠中加入100μl处理好的血清样品，振荡孵育30min。置于磁性分离板上2min，弃上清液。加入100μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，2min/次。用10μl 0.5％(v/v)的TFA洗脱以羧基为配基的纳米磁珠2min。取5μl洗脱液与等量的SPA溶液(含饱和的芥子酸，50％乙腈，0.5％TFA)充分混合，吸取2μl混合物点样于载片上，室温下自然干燥，用PBS II-C型蛋白质阅读仪检测血清五个蛋白。
4)蛋白质阅读仪参数设置：采用337nm波长的氮气激光光源照射芥子酸与血清样品的混合物，最高分子量为50KDa，优化范围1-15KDa，激光强度为180μJ，检测灵敏度为8。检测前用All-in-one多肽标准芯片校正仪器，系统质量偏≤0.1％。原始数据用Biomaker Wizard 3.1软件标化处理得到准确的含量数值。
5)质控血清：测试前加入标准化质控血清作为标准参照。
6)应用五个蛋白组成的检测模型进行检测：利用本发明检测模型A：2961Da≤3.89μJ；B：4309Da≤4.39μJ；C：5234Da≤3.49μJ；D：6121Da≤1.53μJ；E：8170Da≤15.06μJ，将受检者血清中五个蛋白质的具体数值A：2961Da＝3.52μJ；B：4309Da＝3.98μJ；C：5234Da＝8.52μJ；D：6121Da＝4.31μJ；E：8170Da＝13.07μJ与本发明中的判断模型逐一对比分析，其中两项C：5234Da＝8.52μJ、D：6121Da＝4.31μJ高于判断模型指标，按照如图2所示的检测模型，判断其为帕金森病患者。
Claims (3)
1.一组检测帕金森病的蛋白标志物，其特征在于，所述的蛋白标志物由以羧基为配基的纳米磁珠捕获并展示在血清蛋白质组图谱中的5个不同分子量的蛋白质组成：A：2961Da、B：4309Da、C：5234Da、D：6121Da和E：8170Da。
2.一种检测权利要求1所述的蛋白标志物的试剂盒，其特征在于，由以下成分组成：
1)以羧基为配基的纳米磁珠；
2)裂解液：9M Urea，20g/L CHAPS，10g/L DTT，50mMTris-HCl，pH9.0；
3)缓冲液：50mM NaAC，pH4.0；
4)去离子水；
5)芥子酸；
6)0.5％v/v三氟乙酸；
7)50％乙腈；
8)蛋白质阅读仪；
9)质控血清。
3.权利要求2所述的试剂盒在检测帕金森病中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用裂解液处理待测血清样本30min；
2)向以羧基为配基的纳米磁珠中加入处理后的血清样本，捕获血清蛋白；
3)洗脱以羧基为配基的纳米磁珠，并用蛋白质阅读仪检测洗脱液中的5个蛋白标志物；
4)质控血清检测结果为阴性且受试样品检测结果重复性变异系数小于10％时该次实验结果有效，受试样品中5个蛋白标志物符合A：2961Da≤3.89μJ；B：4309Da≤4.39μJ；C：5234Da≤3.49μJ；D：6121Da≤1.53μJ；E：8170Da＞15.06μJ为阴性，有一项或多项蛋白不符合则为阳性。
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