CN101424661B - 一种活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法，其步骤如下：(1)血清来源和制备：包括实验组和对照组；采集受检者静脉血，分离血清后分装，置-80℃冰箱保存，备用；(2)血清的质谱分析，包括：样品处理；蛋白芯片检测；质谱分析；数据采集；(3)统计学分析和差异蛋白的筛选；(4)诊断模型的建立：应用Biomarker Pattern 5.0软件建立诊断活动性肺结核的模型。该模型鉴别活动性肺结核和对照组的灵敏度为96.9％，特异性为97.8％，阳性预测值和阴性预测值分别为97.7％和97.1％，总准确率为97.3％。
Description
技术领域
本发明涉及一种活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法，特别涉及一种应用蛋白质谱技术建立活动性肺结核病的血清诊断模型的方法，属于蛋白质谱应用技术领域。
背景技术
我国的结核病疫情相当严重，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。早期诊断、发现病人、选择敏感的抗结核药物进行有效治疗是控制结核病的关键。目前临床上常规应用的诊断方法中，临床标本涂片检测的灵敏度低，阳性率只有20-30％；传统的罗氏培养阳性率低，只有30％左右，而且需4-8周时间；传统的药敏试验和菌种鉴定烦琐、费时，需1—2月时间；血清结核抗体检测的灵敏度和特异性不理想；PPD含有许多分枝杆菌共同的抗原，诊断的特异性差，使得全国451万活动性肺结核患者中，通过痰涂片检查发现涂阳肺结核患者150万，菌阳肺结核患者200万，菌阴肺结核患者251万。由此可见，在诊断的肺结核患者中33.3％为涂阳肺结核患者，通过细菌培养使菌阳肺结核患者增加到44.4％，菌阴肺结核患者占活动性肺结核患者的55.6％，肺结核患者检出率低，漏诊率高，导致结核菌继续传播和病人治疗延误。因此，迫切需要发现新的结核病诊断标志物，建立快速、敏感、高效的结核病诊断、鉴别诊断新方法。
随着质谱仪的发展和蛋白质组学研究的深入，产生了蛋白质指纹图谱的诊断新技术，该技术是通过质谱分析不同疾病血清中循环蛋白的差异，以特异性差异蛋白作为诊断标志物来诊断疾病。由于不同的疾病在血清中有许多潜在的生物标志物，通过质谱定量和定性分析这些生物标志物可用于疾病的诊断。该方法已成功地用于研究SARS、癌症等诊断标志物。
因此，提供一种诊断模型简便、快速，标本用量少，可直接检测血清标本，灵敏度高，特异性好的活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法就成为该技术领域急需要解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种诊断模型简便、快速，标本用量少，可直接检测血清标本，灵敏度高，特异性好的活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法，其步骤如下：
1.血清来源和制备：
包括实验组和对照组；采集受检者静脉血，分离血清后分装，放置在-80℃冰箱保存，备用；
2.血清的质谱分析：
(1)样品处理
取3μl血清与6μl U9缓冲液混匀，冰浴震荡30min；样品变性后，加入360μlCM10结合缓冲液；
(2)蛋白芯片检测
用200μl CM10结合缓冲液洗涤CM10蛋白芯片后，加入100μl步骤(1)处理后的样品，室温孵育1小时；弃液体，用CM10结合缓冲液洗涤2次；风干后，取出蛋白芯片，每个点加0.5μl饱和的芥子酸溶液；风干后，再重复一次；
(3)质谱分析
采用质谱仪进行蛋白质谱分析，参数设置如下：激光强度220，最高分子量1000kDa，检测灵敏度9，焦点分子量10kDa；
(4)数据采集
应用Ciphergen蛋白芯片3.1.1软件采集信噪比为10的血清蛋白峰；
3.统计学分析和差异蛋白的筛选：用Ciphergen BiomarkerWizard软件对步骤2中之(4)所获得的数据进行统计学分析，设置P<0.01，筛选出50个差异蛋白；
4.诊断模型的建立：
应用Biomarker Pattern 5.0软件建立诊断活动性肺结核的模型。
一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤2中所述步骤(1)中的U9缓冲液的组成为：9M尿素、2％3-环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、50mMTris-HCL、1％二硫苏糖醇(DTT)，pH9.0；所述CM10结合缓冲液为50mM NaAC，pH4.0。
一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤2中所述步骤(2)中的所述芥子酸溶液为：芥子酸溶于50％乙腈和0.5％三氟乙酸。
一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤2中所述步骤(3)中的所述蛋白分子量的优化范围1000—30000Da。
一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤3中所述50个差异蛋白峰具体如下。
一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤4中所述建立诊断活动性肺结核的模型的具体步骤如下：
对照组中包括非结核呼吸疾病患者和健康人，包括PPD阳性者和PPD阴性者，通过Biomarker Pattern 5.0软件选择5个蛋白峰4360、3311、8160、5723、15173m/z建立活动性肺结核诊断预测模型1；并计算出活动性肺结核诊断预测模型1中各个差异蛋白高、低表达的临界值：4360m/z为2.381、3311m/z为0.975、8160m/z为3.558、5723m/z为2.163、15173m/z为1.725。
一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤4中所述建立诊断活动性肺结核的模型的具体步骤如下：
对照组中只包括非结核呼吸疾病患者，不包括健康人，通过Biomarker Pattern5.0软件选择3个蛋白峰5643、4486、4360m/z建立活动性肺结核诊断预测模型2；并计算出活动性肺结核诊断预测模型2中各个差异蛋白高、低表达的临界值：5643m/z为5.162、4486m/z为0.943、4360m/z为2.039。
本发明的有益效果：
本发明的活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法简便、快速，标本用量少，可直接检测血清标本，鉴别活动性肺结核和对照组的灵敏度为96.9％，特异性为97.8％，阳性预测值和阴性预测值分别为97.7％和97.1％，总准确率为97.3％，是筛选结核病特异性标志物的有效手段。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1中的a-1是本发明实施例1中对照组中编码为59的m/z5643蛋白峰，a-2是活动性肺结核组中编码为P985的m/z5643蛋白峰；b-1是健康组中编码为59的m/z4360蛋白峰，b-2是活动性肺结核组中编码为P985的m/z4360蛋白峰；c-1是健康组中编码为59的m/z4486蛋白峰，c-2是活动性肺结核组中编码为P985的m/z4486蛋白峰。
图2为本发明实施例中诊断预测模型1的分类树。
图3为本发明实施例中诊断预测模型2的分类树。
具体实施方式
实施例1
一种活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法，其步骤如下：
1.血清来源和制备：129例活动性肺结核血清来源于2007年2—5月解放军总医院第二附属医院全军结核病研究所确诊的住院患者，平均年龄41.31±20.63岁，其中男性85例，女性44例，结核杆菌涂片或培养阳性58例、阴性71例；69例非结核呼吸疾病血清来源于2007年2—5月解放军总医院第二附属医院呼吸科、肿瘤科确诊的住院患者(包括肺癌18例，肺炎23例，慢性支气管炎、肺气肿15例，哮喘4例，上呼吸道感染4例，其它5例)，平均年龄59.33±19.15岁，其中男性42例，女性27例；66例健康人血清来源于2007年入伍新兵体检血清，平均年龄18.91±1.14岁，均为男性，其中PPD皮肤试验阴性者30例，PPD皮肤试验阳性者36例。
采集受检者静脉血2ml，分离血清后分装，放置于-80℃冰箱保存，备用，避免反复冻融。
2.血清的质谱分析
应用阳离子交换蛋白芯片CM10(Ciphergen，Fremont，CA，USA)对血清标本进行分析。
(1)样品处理
取3μl血清与6μl U9缓冲液[9M尿素、2％3-环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、50mMTris-HCL、1％二硫苏糖醇(DTT)，pH 9.0]混匀，冰浴震荡30min；样品变性后，加入360μl CM10结合缓冲液(50mM NaAC，pH4.0)。
(2)蛋白芯片检测
用200μl CM10结合缓冲液洗涤CM10蛋白芯片后，加入100μl处理好的样品，室温孵育1小时；弃液体，用CM10结合缓冲液洗涤2次。风干后，取出蛋白芯片，每个点加0.5μl饱和的芥子酸溶液(芥子酸溶于50％乙腈和0.5％三氟乙酸)；风干后，再重复一次。
(3)质谱分析
采用PBS-IIc型质谱仪(Ciphergen，Fremont，CA，USA)进行蛋白质谱分析，参数设置如下：激光强度220，最高分子量1000kDa，检测灵敏度9，焦点分子量10kDa，蛋白分子量的优化范围1000—30000Da。
(4)数据采集
应用Ciphergen蛋白芯片3.1.1软件采集信噪比为10的血清蛋白峰。
3.统计学分析和差异蛋白的筛选：用Ciphergen 
BiomarkerWizard软件对步骤(4)所获得的数据进行初步的统计学分析(计算均值、SD和P值)，发现了50个差异蛋白(P<0.01)。
具体如下：
表1 活动性肺结核组和对照组之间有显著差异的50个蛋白峰(P<0.01)
4.诊断模型的建立：
应用Biomarker Pattern 5.0软件建立诊断活动性肺结核的模型。
任何一个单一的蛋白峰都无法完全鉴别活动性肺结核和对照组。本发明人采用下列2种方式建立诊断模型：
第一种方式是对照组中包括非结核呼吸疾病患者和健康人(包括PPD阳性者和PPD阴性者)，通过Biomarker Pattern 5.0软件选择了5个蛋白峰4360、3311、8160、5723、15173m/z建立活动性肺结核诊断预测模型1，其分类树分布详见附图2。并计算出诊断预测模型1中各个差异蛋白高、低表达的临界值：4360m/z为2.381、3311m/z为0.975、8160m/z为3.558、5723m/z为2.163、15173m/z为1.725。
活动性结核病的检测：
该模型鉴别264例活动性肺结核和对照组(包括非结核呼吸疾病患者和健康人)的灵敏度为83.0％，特异性为89.6％，阳性预测值和阴性预测值分别为88.4％和84.6％，总准确率为86.4％。22例肺结核血清和14例对照组血清被错误诊断。结果见下表2。
表2 应用诊断模型1诊断活动性肺结核的结果
第二种方式是以对照组中只包括非结核呼吸疾病患者，不包括健康人，通过Biomarker Pattern 5.0软件选择了3个蛋白峰5643、4486、4360m/z建立活动性肺结核诊断预测模型2，其分类树分布详见附图3。
代表性样本的m/z5643和4360蛋白峰见图1(其中图1中的a-1是健康组中编码为59的m/z5643蛋白峰，a-2是活动性肺结核组中编码为P985的m/z5643蛋白峰；b-1是健康组中编码为59的m/z4360蛋白峰，b-2是活动性肺结核组中编码为P985的m/z4360蛋白峰；c-1是健康组中编码为59的m/z4486蛋白峰，c-2是活动性肺结核组中编码为P985的m/z4486蛋白峰)。
其中，P985为原某某，女，83岁，粟粒型肺结核。59为张某某，男，19岁，PPD阴性健康人。
并计算出诊断预测模型1中各个差异蛋白高、低表达的临界值：5643m/z为5.162、4486m/z为0.943、4360m/z为2.039。
活动性结核病的检测：
该模型鉴别264例活动性肺结核和对照组(包括非结核呼吸疾病患者和健康人)的灵敏度为96.9％，特异性为97.8％，阳性预测值和阴性预测值分别为97.7％和97.1％，总准确率为97.3％。只有4例肺结核血清和3例对照组血清(包括上呼吸道感染者1例，PPD皮肤试验阳性和阴性健康人各1例)被错误诊断，结果见下表3。其中质荷比峰为5643m/z的蛋白峰在62.8％(81/129)的活动性肺结核患者血清中表达显著增高，在71.9％(97/135)的非结核呼吸疾病患者和健康人血清中表达显著降低。
表3 应用诊断模型2诊断活动性肺结核的结果
本发明活动性肺结核病的血清诊断模型的建立方法，从264例血清标本中共获得100个蛋白峰，50个蛋白峰在活动性肺结核组和对照组之间有显著差异(表1，P<0.01)，其中34个峰在活动性肺结核组表达显著增高，16个峰在活动性肺结核组表达显著减少。通过Biomarker Pattern 5.0软件选择了3个蛋白峰5643、4486、4360m/z建立活动性肺结核诊断预测模型2，其分类树分布详见附图3。该模型只需3个生物标志物，鉴别活动性肺结核和对照组的灵敏度为96.9％，特异性为97.8％，阳性预测值和阴性预测值分别为97.7％和97.1％，总准确率为97.3％。只有4例肺结核血清和3例对照组血清(包括1例上呼吸道感染者，1例PPD皮肤试验阳性(++)、抗结核抗体阳性的健康人，1例PPD皮肤试验阴性、抗结核抗体阴性的健康人)被错误诊断(表3)。潜伏感染者并不影响诊断模型的结果。
其中质荷比峰为5643m/z的蛋白峰在62.8％(81/129)的活动性肺结核患者血清中表达显著增高，在71.9％(97/135)的非结核呼吸疾病患者和健康人血清中表达显著降低，有可能是结核病特异性标志物，我们将进一步鉴定其分子量及氨基酸组成，以便了解该蛋白的性质。
该诊断模型简便、快速，标本用量少，可直接检测血清标本，鉴别活动性肺结核和对照组的灵敏度为96.9％，特异性为97.8％，阳性预测值和阴性预测值分别为97.7％和97.1％，总准确率为97.3％，是筛选结核病特异性标志物的有效手段。
Claims (4)
1.一种活动性肺结核病的血清检测模型的建立方法，其步骤如下：
(1)血清来源和制备：
实验组和对照组的静脉血，分离血清后分装，置-80℃冰箱保存，备用；
(2)血清的质谱分析：
(a)样品处理
取3μl血清与6μl U9缓冲液混匀，冰浴震荡30min；样品变性后，加入360μl CM10结合缓冲液；
(b)蛋白芯片检测
用200μl CM10结合缓冲液洗涤CM10蛋白芯片后，加入100μl步骤(a)处理后的样品，室温孵育1小时；弃液体，用CM10结合缓冲液洗涤2次；风干后，取出蛋白芯片，每个点加0.5μl饱和的芥子酸溶液；风干后，再重复一次；
(c)质谱分析
采用质谱仪进行蛋白质谱分析，参数设置如下：激光强度220，最高分子量1000kDa，检测灵敏度9，焦点分子量10kDa；
(d)数据采集
应用Ciphergen蛋白芯片3.1.1软件采集信噪比为10的血清蛋白峰；
(3)统计学分析和差异蛋白的筛选：用Ciphergen ProteinChipBiomarker Wizard软件对步骤(2)之步骤(d)所获得的数据进行统计学分析，设置P＜0.01，筛选出50个差异蛋白峰；所述的50个差异蛋白峰具体如下：
(4)检测模型的建立：
应用Biomarker Pattern 5.0软件建立活动性肺结核病的血清检测模型。
2.根据权利要求1所述的活动性肺结核病的血清检测模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)的步骤(a)中的U9缓冲液的组成为：9M尿素、2％3-环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、50mMTris-HCL、1％二硫苏糖醇(DTT)，pH 9.0；所述CM10结合缓冲液为50mM NaAC，pH4.0。
3.根据权利要求2所述的活动性肺结核病的血清检测模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)的步骤(b)中的所述芥子酸溶液为：芥子酸溶于50％乙腈和0.5％三氟乙酸。
4.根据权利要求3所述的活动性肺结核病的血清检测模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)的步骤(c)中，所述蛋白质谱分析时，分子量的范围为1000-30000Da。
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| PB01 | Publication | ||
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