CN102661884B

CN102661884B - 含有肺结核血清特征蛋白的样品及其制备方法

Info

Publication number: CN102661884B
Application number: CN201210133113.XA
Authority: CN
Inventors: 李继承; 刘姬艳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2032-05-03
Also published as: CN102661884A

Abstract

本发明涉及含有肺结核血清特征蛋白的样品及其制备方法，其包括未治疗的活动性肺结核者血清、肺癌患者、肺炎患者、慢性阻塞性肺病患者或者经体检确定为正常的健康者的血清蛋白，所述的血清蛋白包括3个上调蛋白和1个下调蛋白，所述的蛋白单独存在、任意或者全部混合在一起，所述的样品适合使用质谱进行检测。本发明为进一步发现新的活动性肺结核生物标志提供了基础。本发明对于活动性肺结核的检测优于目前所采用的任何单一检测方法，为活动性肺结核的早期发现、早期治疗提供一种非侵入性技术，从而为降低活动性肺结核的传染率，提高肺结核的治愈率提供了一种新方法。

Description

含有肺结核血清特征蛋白的样品及其制备方法

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及含有肺结核血清特征蛋白的样品及其制备方法和应用。

背景技术

肺结核病是结核分枝杆菌所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病，是影响全球人类健康的一个严重传染病。肺结核病的高发病率和死亡率，以及通过空气传播，对病人、病人所接触的事物、社会都产生了相当大的负担，因此早期诊断对肺结核病的控制起着至关重要的作用。但目前肺结核的诊断技术不够理想，结核分枝杆菌培养灵敏度特异度高，但需要长时间培养，增加了肺结核病病情加重和传播的风险；快速的方法如痰涂片显微镜检查、结核菌素皮肤试验，显示低灵敏度。因此快速、简便、灵敏度和特异高的肺结核检测方法的建立是防止肺结核疾病恶化、疾病蔓延和永久性纤维化损害的根本手段。

血清蛋白质作为血液循环的重要组分，蕴藏着人体许多生理、病理过程中的重要信息，且血清是最方便和容易得到的样品，从血清中寻找疾病生物标志物一直以来是人们研究的热点。各种传染病病原体的致病机制及其引起的病理学改变均以蛋白质表达及蛋白质间的相互作用为基础，宿主主要通过免疫反应及炎症反应来完成其对病原体的防御。结核分枝杆菌侵入人体后可通过很多途径产生相关蛋白质而释放到血液循环中。生物质谱技术、蛋白分离纯化技术和生物信息学的迅速发展，为获得肺结核蛋白标志物成为可能。

增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)是一种重要的蛋白质组技术，特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白质的分离技术使蛋白指纹图谱技术克服了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织液等；检测快速。近来，蛋白芯片与质谱技术(SELDT-TOF-MS)的结合，已被成功地用于许多不同类型的人类疾病的早期诊断：肿瘤疾病、心血管疾病和感染性疾病。由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白质组和质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007，27：193-197)。磁珠具有优于二维电泳、蛋白芯片和其他质谱的特点。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清，尿液等)、样品用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，已被广泛地用于肿瘤生物标志的筛查等研究(屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临床，2007)。但国内迄今尚无采用磁珠与质谱技术获得检测肺结核血清特征蛋白的报道。

发明内容：

本发明的目的是为克服对目前活动性肺结核血清检测技术的不足之处，建立一种血清蛋白样品及其制备方法，该样品为早期检测和进一步发现新的肺结核生物标志提供了基础。

本发明一方面涉及一种血清特征蛋白样品，其特征在于：其包括未治疗的活动性肺结核者血清、肺癌患者、肺炎患者、慢性阻塞性肺病患者或者经体检确定为正常的健康者的血清蛋白，所述的血清蛋白包括3个上调蛋白和1个下调蛋白，所述的蛋白单独存在、任意或者全部混合在一起，所述的样品适合使用质谱进行检测。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的蛋白包括m/z为4824.4±0.1、5325.7±0.1、2554.6±0.1、8606.8±0.1的蛋白。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的血清蛋白吸附在Au或Steel片上。

本发明另一方面还涉及上述样品的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1.)收集经病理明确诊断的未治疗的活动性肺结核者血清、肺癌患者、肺炎患者、慢性阻塞性肺病患者和/或经体检确定为正常的健康者的血清作为血清样本；

2.)采用WCX磁珠对所述活动性肺结核患者、肺癌患者、肺炎患者、慢性阻塞性肺病患者或正常人的血清标本的蛋白进行吸附和解析；

3.)将血清蛋白溶液加到Au或Steel片上，晾干。

本发明另一方面还涉及上述样品的检测方法，其特征在于所述的样品使用质谱进行检测，所述的检测是非诊断目的的。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标。

在本发明的另一个优选实施方式中，其特征在于质谱仪的设定为最高检测分子量为50kDa，，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心7000-9000Da之间。

本发明另一方面还涉及上述样品在制备肺结核早期检测和/或筛查的检测样品或试剂盒中的应用。

利用该检测样品进行质谱检测，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别活动性肺结核患者与非活动性肺结核患者的敏感性为75.0％，特异性为83.5％。

说明书附图

图1肺结核、正常人、肺癌、肺炎及慢性阻塞性肺病患者血清中4824.4m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱。

图2肺结核、正常人、肺癌、肺炎及慢性阻塞性肺病患者血清中5325.7m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱。

图3肺结核、正常人、肺癌、肺炎及慢性阻塞性肺病患者血清中2554.6m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱。

图4肺结核、正常人、肺癌、肺炎及慢性阻塞性肺病患者血清中8606.8m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱。

图5活动性肺结核患者鉴别的质谱模型

图中m/z表示特异蛋白的质荷比，TB表示肺结核，Non-TB表示非肺结核，Lung Cancer表示肺癌，PNA表示肺炎，COPD表示慢性阻塞性肺病，NOR表示正常人。

具体实施方式

本发明将结合附图和具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1正常与肺结核患者的区别及质谱的检测

(1)实验方法

180例肺结核患者，平均年龄为43.8±12.2(18-65岁)。肺结核患者无合并肝、肾、代谢自身免疫性疾病、内分泌、血液、神经系统疾病、恶性肿瘤、长期服用免疫抑制剂患者。120例肺部其他疾病对照(其中40例肺癌、40例肺炎、40例COPD)，经临床诊断排除肺结核，。91例健康志愿者为经健康查体正常的正常人群，非肺结核组平均年龄为46.3±14.1(19-65岁)。受检者空腹采集静脉1mL，采集后立即于4℃冰箱静置2小时，4℃4000r/min离心10分钟分离血清，将血清于4℃12000r/min再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不容物，在冰上将血清分装为100uL/管，共五管，保存于-80℃冰箱。避免反复冻融。

磁珠操作步骤

血清样品处理：从-80℃冰箱中取出血清，于4℃，10000rpm离心5min，取10μL血清样品，加20μL U9处理液(9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Trist-CL，ph9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360uL结合缓冲液(100mmol/LNaAc，pH4.0)，立即混匀。

磁珠上样及洗脱：将处理好的样品100μL加至已装好WCX磁珠(弱阳离子交换)的PCR管中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100μL磁珠结合缓冲液(50mmol/LNaAc，pH4.0～4.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10μL Elution Buffer2min，洗脱标本至上清液。取5μuLL上清液移至另一个PCR管中，加入5μLSPA饱和溶液充分混匀，取1μL混合溶液加样到Au或Steel片上，晾干后上机测量。

数据收集

将处理好的Au或Steel片置入SELDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子误差＜0.1％。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20～80，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白质谱图谱。

统计学分析

应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白质谱图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至40～50％信号强度的最大值，并且用显著的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5，最小的峰强度＞1.6)。分析所有1～50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均值M，标准误差(SD)和变异系数(CV％)。用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算P值。

肺结核检测多肽蛋白筛选

用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，初步分析筛选出P＜0.01的肺结核患者与非肺结核人群有35个差异多肽蛋白，不同峰的分子量(m/z)、P值及特征蛋白的表达变化见表一；

表一活动性肺结核患者特征蛋白的表达变化

表一中，向上箭头“↑”为在肺结核患者血清中高表达的上调特征蛋白：向下箭头“↓”为在患者血清中低表达的下调特征蛋白；

图1-4为肺结核、正常人、肺癌、肺炎及慢性阻塞性肺病患者血清中4个差异蛋白峰(4824.4、5325.7、2554.6、8606.8m/z)的原始质谱图谱。其中5325.7m/z在肺结核中表达下调，而8606.8、4824.4和2554.6m/z在肺结核中表达升高；

将上述35个差异蛋白作为肺结核质谱检验模型的特征蛋白；

实施例2临床试用及双盲测试

由于多个特征蛋白组合起来才可将肺结核与正常人等完全分开，故选取上述35个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m./z值及该蛋白的临界峰值均值M建立了肺结核患者与非肺结核人群鉴别的血清特征蛋白质谱模型(图5)，所说的特异蛋白质质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M分别为m/z＝5325.7，M＝5.77；m/z＝8608.8，M＝2.80；m/z＝4824.4，M₁＝6.70，M₂＝2.43；m/z＝2554.6，M＝3.37绘制而成；分子量(m/z)误差＜0.01％，临界峰值均值M的CV＜5～10％。利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于肺结核检验。

利用该质谱模型，将受检者血清中的相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别活动性肺结核患者与非活动性肺结核患者的敏感性为75.0％，特异性为83.5％。

在本发明所提及的所有文献都在本中请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样，并且作为整体被完整的引用到本申请中作为本中请原始记载内容的一部分。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种肺结核血清特征蛋白质谱模型的建模方法，其特征在于，包括以下步骤：

1.)收集经病理明确诊断的未治疗的活动性肺结核患者、肺癌患者、肺炎患者、慢性阻塞性肺病患者和/或经体检确定为正常的健康者的血清作为血清样本；

2.)采用WCX磁珠对所述血清样本中的血清蛋白进行吸附；

3.)将WCX磁珠上吸附的血清蛋白洗脱至上清液；

4.)将含有血清蛋白的上清液加到Au或Steel片上，晾干；

5.)将处理好的Au或Steel片进行蛋白质谱分析，获得蛋白质谱图谱；

6.)将质谱分析中质荷比m/z为4824.4±0.1、5325.7±0.1、2554.6±0.1、8606.8±0.1的四种差异蛋白作为肺结核血清特征蛋白质谱模型的特征蛋白；

7.)根据差异蛋白的质荷比m/z及其临界峰值均值M建立肺结核血清特征蛋白质谱模型；其中差异蛋白5325.7±0.1m/z在肺结核中表达下调，4824.4±0.1、2554.6±0.1、8606.8±0.1m/z在肺结核中表达上调。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述四种差异蛋白适用于质谱检测，用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标。