CN101093215A

CN101093215A - 对肺癌筛查和预后评估的质谱试剂盒和方法

Info

Publication number: CN101093215A
Application number: CN 200710090685
Authority: CN
Inventors: 许洋; 周清华
Original assignee: Individual
Current assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Priority date: 2007-04-03
Filing date: 2007-04-03
Publication date: 2007-12-26

Abstract

本发明涉及一种用磁珠支持基质的方法捕获体外生物样品中肺癌蛋白质组，用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。然后用质谱法进行分析的蛋白指纹法。本发明的方法可用于正常人与肺癌体外样品检测和预后判断的蛋白指纹或质谱多肽图谱的试剂盒。用血清质谱多肽图谱对肺癌体外样品进行早期检测、预后评估及分期。本方法准确、方便且快捷。

Description

对肺癌筛查和预后评估的质谱试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及一种新的肺癌生物样品中蛋白质分析方法的试剂盒。一种通过能与蛋白质结合的基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测肺癌生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域，为一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的肺癌生物标志组合的检测方法或试剂盒。

背景技术

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用质谱联合可克服这一技术缺点。

肺癌是我国发病率和死亡率增加最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。目前，肺癌已占男性恶性肿瘤发病率和死亡率的首位，女性发病率第二位，死亡率第一位的恶性肿瘤，全国肿瘤防办的资料显示2005年我国死于肺癌的病人大约有45～50万人。目前，我国肺癌治愈水平仍然低于13％，究其原因，一方面是由于吸烟人群的增加、环境污染等因素使肺癌发病率持续上升，而另一方面是我们缺乏符合我国国情、行之有效的肺癌早期筛查的方法和技术，绝大多数肺癌患者就诊时已属晚期，失去了外科治疗的机会。此外，即使外科手术前诊断为I期肺癌的“早期肺癌”，外科手术后有30％～40％变为IIIA期，30％～40％最终死于远处转移，故真正意义上的早期肺癌不到全部肺癌的5％。因此，寻找和建立真正有意义的早期筛查的新方法、新技术，是提高我国肺癌治愈率的希望所在。

吸烟是导致肺癌的首要危险因素，因肺癌死亡的患者中，87％是由吸烟(包括被动吸烟)引起的。近20年来，美国等西方发达国家通过控制吸烟等干预措施已使肺癌的发病率及死亡率开始下降。但目前我国的控烟效果并不理想，男性烟草使用的流行水平已达到高峰，短时间内烟草流行率不会明显下降，而且还存在吸烟低龄化的倾向。1996年全国吸烟行为的流行病学调查结果显示，全国人群总吸烟率为37.6％，现在吸烟率为35.1％，常吸率为34.1％，开始吸烟年龄较1984年提前了3岁。男性吸烟率为66.9％，现在吸烟率为63.0％，常吸烟率为61.4％，较1984年上升了5％，开始吸烟的年龄较1984年提前了2.7年。女性吸烟率为4.2％，现在吸烟率为3.8％，常吸率为3.4％，开始吸烟年龄比男性晚5年。此外，长期吸烟者即使戒烟后肺癌的发病危险仍很高。肺癌发病率和死亡率非常接近，5年生存率只为7-13％，其效果直接与分期有关，I期肺癌外科手术后的5年生存率为75％-85％，但临床只有5％左右的肺癌患者能在I期被发现。因此，除开展戒烟运动以外，肺癌的早期筛查和早期治疗是提高肺癌患者生存率和降低死亡率的必要手段。

肺癌筛查的技术现状和趋势：肺癌早期筛查技术主要为利用影像学技术如X线胸片和低剂量螺旋CT(LDCT)、细胞和分子生物学技术如痰细胞、近年来发展迅速的肺癌肿瘤标志物和分子遗传标志检测、内镜学技术。

1、利用传统的X线胸片和痰细胞学的肺癌的筛查

上世纪90年代以前，肺癌的筛查方法主要为X线胸片和痰细胞学。胸片检查主要有助于发现早期周围型肺癌；而痰细胞学检查对早期累及大气管及支气管的鳞癌更为敏感。然而这两种方法在肺癌的普查中都存在局限性。胸片普查难以发现并诊断1cm以下的肺癌，并且由于胸部结构在胸片上重叠较多，一些较大的肺癌在胸片上有时也易漏诊。而痰细胞检查仅对鳞癌累及到大支气管时较敏感，且灵敏度低于X线胸片。

1951-1975年间，世界各国共有10项利用X射线和/或传统痰细胞学对肺癌进行筛查的前瞻性研究。二十世纪五十年代，“Philadelphia Pulmonary Neoplasm ResearchProject”，“Veterans Administration Trial”，“Tokyo Metropolitan GovernmentStudy”和“South London Lung Cancer Study”4个非随机非对照的筛查研究表明，通过肺癌的胸片筛查，生存得到改善，但并未评价肺癌死亡率。之后，又进行了两个非随机的对照试验：1959年开始的“North London Cancer Study”和1972年的“Erfurt CountyStudy”，两个试验中，筛查组的早期肺癌检出的数量，存活率要较对照组高，但没有观察到肺癌死亡率的降低。随机对照实验是评价肺癌筛查效果的证据最强的研究方法。前瞻性随机对照研究共有4项，其中3项由美国国立癌症研究所启动，分别为“Memorial SloanKettering Trial”、“Johns Hopkins Lung Project”以及“Mayo Lung Project”，另一项在捷克斯洛伐克进行。在这4个随机对照试验中，“Mayo Lung Project”被认为是最权威的一项，该研究应用X射线和痰细胞学检查进行了联合筛查研究。基于上述研究，目前的观点是：第一，肺癌的筛查可以检查出更多的早期肺癌，并且这些肺癌患者都可以进行手术治疗，提高了肺癌的治愈率；第二，可以提高肺癌患者的生存率，改善患者预后和生存质量；第三，不能降低肺癌的死亡率。但对于以上4个研究否定肺癌筛查降低死亡率这一结果的有效性，目前仍存在较大争议。有学者认为，在前述随机对照试验中，对照组也接受了检查，故设计有不严格之处；统计学效力不够；筛查组和对照组的依从性不够；数据处理和统计分析有不恰当的地方等，由此得出了“死亡率”未改善的结论。在日本进行了六项肺癌筛查的病例对照研究，“肺癌人群筛查效果评价项目”在四个地区进行的病例对照研究有三个地区显示了显著性的死亡率的降低，另一个地区也接近显著性。但从循证医学证据的强度来看，随机对照试验的强度要大于病例对照研究，故肺癌筛查的效果并未得到肯定。

综上，利用X线胸片和/或传统痰细胞学进行的肺癌的筛查仍然是一个有争议的问题。

2.内镜学技术

诞生于20世纪80年代的荧光纤维支气管镜对癌前病变和原位癌的敏感性较白光纤支镜有明显提高，此结果已经欧洲、北美、日本的数项研究证明。但其只是白光纤支镜的一种改进，很难检测出周围型肺癌，且假阳性率过高使其应用受到限制。另外荧光支气管镜设备昂贵，操作严格、及创伤性操作，难于在大规模无症状高危人群筛查中应用。目前主要用于粗筛阳性可疑早期中心型肺癌的进一步检查的诊断技术。

3.新的影像学技术及细胞和分子生物学技术

迅速发展的影像学和分子生物学技术，不但大大推动了肺癌的基础研究的发展，而且也给肺癌的筛查提供了有力的工具，为肺癌的筛查带来了新的希望。

近几年低剂量螺旋CT(LDCT)作为肺癌筛查的工具引起了人们的广泛兴趣，被认为是最有希望进行人群肺癌筛查的方法。一些国家进行了用低剂量螺旋CT进行肺癌筛查的研究。研究发现，低剂量螺旋CT与常规剂量CT相比，降低了患者接受的放射剂量，同时对肺结节检出也有较高的敏感度。Henschke等于1992年开始进行的“Early Lung CancerProject”(ELCAP)方案，利用非对照研究，在1000名志愿者中同时进行CXR和低剂量CT筛查，在纳入研究的1000名60岁以上吸烟者中，低剂量螺旋CT检出233人肺部有非钙化小结节，而X线检查出68人。结合后续的有选择的高分辨CT和随访，共对28人进行了活检，其中27人被证实是肺癌，23例(85％)为I期肺癌。而在该研究中，X线检查仅检出7例肺癌患者，且只有4例(60％)为I期肺癌。CT对肺癌和I期肺癌的检出率分别为X线的4倍和6倍。另一个前瞻性的队列研究在Mayo Clinic进行，研究者认为低剂量螺旋CT可以检出早期肺癌，但其缺点是良性结节率太高。

在日本，从上个世纪90年代就开始利用低剂量螺旋CT进行肺癌筛查的研究，并与以前的结果进行了比较。Kaneko等报道了1975-2002年分两阶段进行肺癌筛查的结果，表明低剂量螺旋CT可显著提高早期肺癌检出率。

美国NCI的“Lung Cancer Study”(LSS)在前列腺、肺、结肠、直肠以及卵巢(PLCO)肿瘤筛选试验中，以肺部筛选研究(LSS)证实了在美国进行LDCT扫描的RCT的可能性。因此美国NCI于2002年开始启动了“国家肺癌筛查试验”(National Lung ScreeningTrial)比较CT筛查与普通X片筛查的效果。此外，在荷兰和比利时也已经开展了利用低剂量螺旋CT进行肺癌筛查的随机对照试验。

虽然LDCT是肺癌筛查最有前途的工具之一，但仍存在一些问题：(1)相对较高的假阳性率；(2)很难准确测量小结节的生长速度；(3)早期中央型肺癌发现比较困难；(4)可能存在过度诊断的问题；(5)LDCT虽然增加了早期肺癌的检出率，但未能降低死亡率。

近年来，液基细胞学技术被应用于痰检，大大提高了癌细胞的检出率和准确性，此外，痰液基细胞还可用于肺癌易感基因免疫组化染色或/和抽提DNA行肺癌易感基因多态性、甲基化和微卫星检测。

分子遗传学改变可为肺癌的早期诊断提供一系列的分子生物学标志。迄今已经报道的肺癌相关分子病理学异常包括：染色体畸变-异倍体；端粒酶活性异常；3p、9p、8p、17p的等位基因缺失；p53、ras基因突变；p16、MGMT基因异常甲基化；hnRNPA2/B1抗原过表达，抑癌基因FHIT异常等。因此利用痰、支气管肺泡灌洗液(BALE)、外周血等无创或微创样品检测肺癌的早期分子事件已经成为研究热点和未来的研究方向。

尽管现在有许多肿瘤标志物不断被发现、研究和应用，但是敏感度和特异性都相对较低，今后的研究方向：一是进一步研究已有肺癌肿瘤标志物并进行优化组合、多元分析、综合评价，建立有效的联合检测，以提高敏感性和特异性；二是继续探索新的更灵敏、更特异的肺癌肿瘤标志物。随着基因组学、蛋白质组学的发展，蛋白指纹或质谱多肽图谱技术在肺癌的早期筛查中将得到越来越广泛的应用。蛋白指纹或质谱多肽图谱技术不仅使我们从了解单个相关基因走向探索多个基因构成的表达模式，而且使我们可从蛋白所构成的复杂系统着眼进行研究，从而克服了建立在电泳基础上的基因表达、序列测定、突变和多态性检测等研究方法，如PCR法、mRNA差异显示、Northern Blot、Western Blot等，由于费时、费力、信息量少且不利用于自动化的缺点。

总之，肺癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。基因组学研究由于自身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用，而近年来蛋白质组学的发展为人们从整体上了解恶性肿瘤的发生、发展提供了较为理想的技术平台。目前临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志(tumormarkers)，但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得到且重复性差。血清肿瘤标志物的研究与筛选成已为肺癌早期检测的热点。现阶段，已有的肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA-199)、neuron specific enolase(NSE，神经元特异性烯醇化酶)、cytokeratin-19 fragments(Cyfra21-1)等几类血清标志物已应用于肺癌临床检测，但敏感度和特异性均较低。目前没有血清肺癌细胞转移的肿瘤标志物，难以用于肺癌早期检测及肺癌正确分期。因此从血清中寻求特异生物标志物用于肺癌的早期检测、预后评估及分期是临床急需解决的难题。

发明内容：

本发明的目的是建立一种在肺癌生物样品中检测的方法。该方法为肺癌的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的肺癌生物标志提供了基础。

本发明涉及一种通过生物标志结合的基质表面，并用定量性质谱分析来同时检测多种生物标志状态。

本发明中的生物标志是利用一台质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为+/-0.1％。

基质是任何能与生物标志选择性或特异性结合的物质。举例说明，WCX阴离子，C8/C18疏水作用基质吸附剂，分离生物化学中的这些方法和由这些方法产生的吸附剂具有诊断反面的用途(即阴离子吸附剂捕获阳离子蛋白质)。底基洗去未吸附的物质。任何适宜的洗液均可使用。

生物标志首先能够被具有能与生物标志物结合基质吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在质谱仪中被检测。生物标志通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。生物标志的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，生物标志的数量与质量都可以被检测出来。

飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。

通过对生物标志的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的生物标志的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个生物标志的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。

计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生物标志物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。

分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。

发明中使用的生物标志是基质所捕获。这些生物标记是进一步通过质谱(massspectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。

肺癌检测多肽蛋白筛选。通过Mann-Whitney U检验分析几百种血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹或质谱图谱可以用于区分正常与肺癌的血清。峰值CV＞30％或者p＜0.01为有显著性差异：

正常与肺癌蛋白指纹或质谱图谱的显著性差异(±15Da)

2538.676 8161.143 5348.828 3854.698

2960.537 8590.546 7511.546 3283.008

3209.509 13611.77 4627.502 6651.948

3286.707 6459.806 8719.444 5814.505

5335.187 8627.957 4431.444 13804.30

6221.784 3299.366 3541.527 11683.23

8000.692 5587.763 4858.258 15939.20

10284.30 5047.147 1465.621 11495.08

肺癌检测多肽蛋白筛选

用Mann-Whitney U 检验比较配对样本的蛋白峰，初步分析筛选出肺癌患者与健康人群有5个差异多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及P值见表一：

表一86例肺癌与86例年龄匹配的健康人生物样品中的差异峰情况

m/z	p	肺癌(n＝86)	肺炎(n＝20)	健康人(n＝86)
		肺癌(n＝86)	肺炎(n＝20)	健康人(n＝86)	mean±sd	mean±sd	mean±sd
		2538.65335.13286.711683.215938.2	1.9E-93.0E-93.2E-94.5E-71.2E-5	16.95±8.7518.72±9.124.61±3.573.07±3.4110.90±7.52	mean±sd	mean±sd	mean±sd	2.98±0.6910.61±5.631.92±1.980.68±0.323.13±2.92	3.87±0.797.99±0.860.97±0.650.27±0.212.41±1.35

从中筛选出几个特征蛋白峰，2538、5335、3286、15938±15Da 4个差异峰组成的检验模型对肺癌患者和健康人群盲筛检验及ROC曲线，用此分类法分析71份肺癌样本(I期肺癌11例；II期肺癌23例；III期肺癌26例；IV期肺癌11例)的质谱结果，其中68份区分正确，3份区分错误，敏感性为95.8％；71份对照样品中69份区分正确，2份区分错误，特异性为97.2％(见表二、图2)：

表二：生物样品中检验模型的判别情况

分组	肺癌	健康人	合计
分组	肺癌	健康人	合计	肺癌健康人	683	269	7072
合计	71	71	142	肺癌健康人	683	269	7072

注：敏感性95.8％(68/71)；特异性97.2％(69/71)

其中I期肺癌11份区分100％正确，故肺癌的早期检测率为100％。可正确区分肺癌I-IV期。吸烟十年、二十年健康人和肺癌患者中特征蛋白峰p＜0.01，故2538、5335、3286、15938±15Da 4个差异峰可用于肺癌的早期检测。所述的检测试剂盒对Cyfra21-1及NSE阴性肺癌的检测率高。可用于Cyfra21-1及NSE阴性肺癌检测、预后评估及分期的用途。

利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。

将11683.2生物标志用多级质谱(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片，可生成蛋白质梯度(protein ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。鉴别出11683.2 Da蛋白为变异的血清淀粉样蛋白A。其化学结构为(氨基酸从N端至C端排列)：

N端

RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPG

GVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGL

PEKY

C端。

合成血清淀粉样蛋白A。血清淀粉样蛋白A序列：

N端

RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPG

GVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGL

PEKY

C端。

将合成的变异的生物标记免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞。用溶血噬菌斑分析法选择并分离出能分泌所需抗体的单个淋巴细胞。将单个细胞扩增至1×10⁷个以上，用Quick mRNA Purification Kit提取mRNA。以提取的mRNA为模板，合成cDNA链。以此cDNA为模板，加入鼠抗体重链可变区(V_H)通用引物，轻链可变区(V_L)通用引物，进行聚合酶链反应，获得扩增的V_H基因片段和V_L基因片段。将扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离。用glass milk回收扩增的V_H基因片段和V_L基因片段。与等摩尔尝试的Limker Primer Mix混合，进行聚合酶链反应，连接V_H和V_L。扩增产物分离纯化后，获得特异性单链抗体(ScFV)。此ScFV可用于制备检测所需DNA片。将此扩增产物两端加限制性酶切位点，纯化定量后，连接到P^UC19载体上。将连接产物转化感染大肠杆菌TOP10。经蓝白斑筛选及酶切鉴定，筛选出重组质粒。在96孔板形成单克隆抗体。用ELISA法筛选出效价最高的单克隆抗体株，大量制备，并从培养上清中提取所需抗体。此抗体可用于制备检测所需试剂盒。

用抗体与免疫组质谱检测分析血清蛋白指纹峰，发现下述生物标志可以用于区分正常人、肺癌生物标志群变异表达(表三)。

表三、区分正常人、肺癌生物标志群

筛选试验	NSE检测	Cyfra21-1检测	抗SAA
筛选试验	NSE检测	Cyfra21-1检测	抗SAA	肺癌正常人	41.6％(109/262)26.7％(70/262)	67.2％(176/262)29.0％(76/262)	84.4％(221/262)5.0％(13/262)

NSE检测262例肺癌病人的血清有41.6％阳性；Cyfra21-1检测262例肺癌病人的血清有67.2％阳性；抗SAA检测262例肺癌病人的血清有84.4％阳性。

发现分子量为11683±15Da变异的血清淀粉样蛋白A生物标志的变化区分正常人、肺癌生物标志群变异表达具有重要意义(图3)。变异的血清淀粉样蛋白A可用于肺癌预后评估；变异的血清淀粉样蛋白A高预后差。此结果表明，抗SAA检测肺癌病人的灵敏度为84.4％；肺癌NSE灵敏度为41.6％；肺癌Cyfra21-1灵敏度为67.2％。

本发明利用WCX阴离子基质及利用C8/C18疏水基质磁珠为例对正常人与肺癌血清(浆)进行蛋白质对比分析。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0 Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。

一种对肺癌筛查和预后评估的质谱试剂盒和方法的具体操作步骤：

以下是用本发明提供的一个操作方案及肺癌检测试剂盒实例。

1.样品处理及标准化质控血清(浆)制备

将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中，视需要离心澄清样品。

质谱的标准化质控血清(浆)制备定义符合如下标准：供血者10人，5男5女，血型为O型；年龄为18～30岁；民族汉。生化指标正常，包括：总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功检查、肾功检查；无遗传病家族史；无重大传染病史。女性不能怀孕，男性为不吸烟者。

2.基质与肺癌、标准化质控血清(浆)制备、样品上样

抽取O型血的健康受试者(男女各半)的新鲜血液：(a)4℃下待血液凝固后马上离心，4℃离心5min分离血清。(b)4℃下马上离心，4℃离心5min分离血浆。标准化质控或肺癌血清(浆)样品分装100μl一小管，于-80℃储存；或取混合血清(浆)1∶2稀释于U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0)一小管，25℃储存。即成为肺癌、标准化质控血清(浆)试剂盒。将质谱的标准化质控血清及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物用磁性珠或芯片。基质是用于标记、结合血清(浆)的。标记至液相色谱柱子上的基质可用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)的标准方法去分析。将质谱的标准化质控O血清(浆)用于质谱仪试剂盒的定量方法。

3.洗涤

用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。以下步骤：用0.05％～1％三氟乙酸彻底洗涤整个磁性珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制备的饱和标准溶液)。

吸能分子可用Sinapinic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等。

3.质谱的定量控制及测试

用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)标准方法去分析滞留于各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。

定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50％信号强度的最大值。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准。

本发明将蛋白质分成了几大类，即WCX阴离子、C8/C18疏水作用等蛋白。这样，可用质谱仪直接进行分析及定量。

本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外肺癌质谱检测方法的定量控制，如离体体液的肺癌试剂盒用于临床质谱的肺癌检测方法。可以检测多个肺癌蛋白质生物标志群及质谱多肽图谱。

本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：

(1)准确

质谱直接分析有很强的精确性，一般误差率只有0.1Da。因为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。

(2)方便

本方法将蛋白质分成了几大类，即阴离子、疏水作用蛋白。这样，可用质谱仪直接进行分析。支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁珠或芯片。用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。磁珠表面的结合面积大于芯片，从而其灵敏性比芯片更高。这样，可用质谱仪直接进行分析。

(3)快捷

用本发明提供的蛋白指纹法进行检测时，无需对蛋白质进行测序。本发明采用了计算机“条码格式”，信号强度沿着线性轴以暗度强度值显示。此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动分析对比强弱，从而有助于临床复杂的检测，如可用此“蛋白指纹”或条码格式进行医学分析。

说明书附图

图1 肺癌血清质谱多肽蛋白图谱

图2 肺癌及健康人群盲筛的敏感性、特异性及ROC曲线

图3 变异的血清淀粉样蛋白A的一个特征峰

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1 正常与肺癌患者的区分及质谱的试剂盒制备

(1)实验方法

肺癌患者的术前血清262例，平均年龄65岁。健康体检者262例，平均年龄63岁，来源于肝功能、肾功能等检查均正常的体检人群。受检者空腹采集静脉血1mL，采集后立即于4℃冰箱静置2小时，4℃ 4000r/min离心10分钟分离血清，将血清于4℃ 12000r/min再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为100μL/管，共5管，保存于-80℃冰箱。避免反复冻融。

蛋白质芯片及磁珠操作步骤

血清样品处理：从-80℃冰箱中取出血清，于4℃，10000rpm离心5min。取10μL血清样品，加20μL U9处理液(9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Tris-CL，pH7.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360μL结合缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.0)，立即混匀。

芯片上样及洗脱：将WCX2芯片(弱阴型离子表面，羧基基团，捕获正电荷基团蛋白)装入bioprocessor中，每孔加入200μL结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干。每孔分别加入100μL处理好的样品，振荡孵育1h，甩去样品，用200μl芯片洗脱缓冲液(100mmol/L NaAc，pH 4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。取出芯片，每点加2次0.5μL SPA饱和溶液，晾干后上机测量。

磁珠上样及洗脱：将处理好的样品100μL加至已装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100μL磁珠结合缓冲液(50mmol/L NaAc，pH 4.0～4.1)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10μL Elution Buffer 2min，洗脱标本至上清液。取5μL上清液移至另一个PCR管中，加入5μL SPA饱和溶液充分混匀，取1μL混合溶液加样到Au片上，晾干后上机测量。

数据收集

将处理好的Au片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差＜0.1％。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20～80，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。用血清中的内标峰4091.1Da或6634.0Da校正原始数据中的蛋白指纹图谱，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白指纹图谱。

统计学分析

应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白指纹图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1或6634.0Da强度调至40～50％信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5)。分析所有1～50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均数，标准误差(SD)和变异系数(CV％)。用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算p值.

肺癌检测多肽蛋白筛选

用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，初步分析筛选出肺癌患者与健康人群有5个差异多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及P值见表一：

表一 86例肺癌与86例年龄匹配的健康人生物样品中的差异峰情况

m/z	p	肺癌(n＝86)	肺炎(n＝20)	健康人(n＝86)
		肺癌(n＝86)	肺炎(n＝20)	健康人(n＝86)	mean±sd	mean±sd	mean±sd
		2538.65335.13286.7	1.9E-93.0E-93.2E-9	16.95±8.7518.72±9.124.61±3.57	mean±sd	mean±sd	mean±sd	2.98±0.6910.61±5.631.92±1.98	3.87±0.797.99±0.860.97±0.65

11683.215938.2

4.5E-71.2E-5

3.07±3.4110.90±7.52

0.68±0.323.13±2.92

0.27±0.212.41±1.35

实施例2试剂盒的双盲测试(肺癌的早期检测及分期)

用从实施例1中筛选出几个特征蛋白峰，2538、5335、3286、15938±15Da 4个差异峰组成的检验模型(图1)对肺癌患者和健康人群盲筛检验及ROC曲线，用此分类法分析71份肺癌样本(I期肺癌11例；II期肺癌23例；III期肺癌26例；IV期肺癌11例)的质谱结果，其中68份区分正确，3份区分错误，敏感性为95.8％；71份对照样品中69份区分正确，2份区分错误，特异性为97.2％(见表二、图2)：

表二：生物样品中检验模型的判别情况

注：敏感性95.8％(68/71)；特异性97.2％(69/71)

其中I期肺癌11份区分100％正确，故肺癌的早期检测率为100％。可正确区分肺癌I-IV期。吸烟十年、二十年健康人和肺癌患者中特征蛋白峰p＜0.01，故可用于肺癌的早期检测。所述的检测试剂盒对Cyfra21-1及NSE阴性肺癌的检测率高。可用于Cyfra21-1及NSE阴性肺癌检测、预后评估及分期的用途。

实施例3 11683.2 Da蛋白的排序鉴定

N端

RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPG

GVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGL

PEKY

C端。

实施例4变异的或修饰的生物标记抗体的制备

变异的或修饰的生物标记的合成：合成血清淀粉样蛋白A。血清淀粉样蛋白A序列：

N端

RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPG

GVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGL

PEKY

C端。

实施例5抗体与免疫组质谱检测的应用

(2)实验方法

一、材料

1.标本来源：A.262例正常人对照组的血清；B.262例肺癌病人的血清。

2.质量控制：A.人标准化质控血清B.质谱激光能量调控：每次测试前，用上述标准化质控血清。

3.基质含已标记的等量抗体：抗SAA(抗血清淀粉样蛋白A)。用Carbodiimide方法(Carbodiimide Method)将带有carboxylate-groups标记的磁性珠上基质与抗体的氨基端(amino-groups)结合(Gunn DL，et al.Preparation of sensitive and stableerythrocytes by the carbodiimide method for the detection of primary and secondaryIgM and IgG antibody.J Immunol Methods.1972；1(4)：381-389.)

二、方法

1.样品的收集：全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；以10,000转/分，4℃离心2分钟；取上清液。

2.样品的准备：每个吸附剂支持物点需要血清1μL，将血清用缓冲液稀释，将样品充分混匀。

3.样品检测：上样，在吸附剂支持物(基质含已标记的等量抗体：抗血清淀粉样蛋白A)中加入处理好的样品，置振荡器，400-600转/分，震荡30～60分钟。加入200μl的结合缓冲液X2。加入200μl HPLC水X1。取出吸附剂支持物后，待干后，样品加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。

4.将上述样品加入质谱中，就会生成飞行时间质谱。外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性。

5.Neuron specific enolase(NSE)和cytokeratin-19 fragments(Cyfra21-1)检测

取空腹静脉血4mL，离心后提取血清，用Elecsys2010电化学发光技术检测系统(美国Roche Diagnostics)测定，按照检测系统步骤进行操作，正常参考值Cyfra21-1＜3.3μg/L；NSE＜15.2μg/L。

实验结果

用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，发现下述生物标志可以用于区分正常人、肺癌生物标志群变异表达(表三)。

表三、区分正常人、肺癌生物标志群

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用磁珠支持基质的方法捕获体外生物样品中肺癌蛋白质组的试剂盒和方法，其特征是采用蛋白指纹法对肺癌中体外样品蛋白质组或质谱多肽图谱进行鉴别检测。用标准化质控血清(浆)控制下的定量性质谱分析来检测。该方法通过以下步骤实现：

(1)样品处理及质谱标准化质控血清(浆)制备；

(2)基质与血清(浆)结合试剂盒制备、样品上样；

(3)洗涤；

(4)质谱的定量控制及质谱检测；

其中所述步骤(1)将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清(浆)；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清(浆)及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物用磁珠或芯片。基质是用WCX阴离子基质及C8/C18疏水基质或抗体基质与血清(浆)选择性结合；所述步骤(3)用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片或位点上。所述步骤(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的饱和标准溶液)用质谱仪去分析滞留与各位点的生物标志或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用质谱仪去分析。对血液进行蛋白质对比分析，用计算机分析血液中质荷比数据。本试剂盒依据几个特征蛋白峰2538、5335、3286、15938±15 Da 4个差异峰，双盲测试肺癌体外样品的敏感性95.8％、特异性97.2％。肺癌的早期检测率为100％。

2.权利要求1所述的蛋白质分析方法，所用的基质包括阴离子、疏水作用及抗体吸附剂。

3.权利要求2中所用吸附剂的支持物是磁珠或芯片。

4.一种权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，它包括：一容器以及装于容器中的权利要求1所述的生物样品。将生物样品分装100μl一小管，于-80℃储存或取生物样品1∶2稀释于一小管U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0)，25℃储存。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征于，所述的生物样品为血清或血浆。

6.一种权利要求4所述的检测试剂盒对肺癌的预后评估及分期。

7.一种权利要求4所述的检测试剂盒用于肺癌的预后评估的11683±15 Da蛋白质是变异的血清淀粉样蛋白A。

8.一种权利要求1所述的检测试剂盒对Cyfra21-1及NSE阴性肺癌的检测、预后评估及分期的用途。