CN114814224A - 乳头溢液中的Hsp90α在乳腺癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供乳头溢液中的Hsp90α在乳腺癌中的应用，属于分子生物学和疾病诊断技术领域。本发明研究发现，Hsp90α在乳腺癌患者的乳头溢液中表达上调，可能与肿瘤发生、进展相关。同时利用蛋白质组学技术分析了乳头溢液在乳腺良恶性疾病中的差异蛋白，对其进行验证。乳头溢液中Hsp90α联合CEA检测可以作为乳腺癌潜在的诊断标记物，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

乳头溢液中的Hsp90α在乳腺癌中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和疾病诊断技术领域，具体涉及乳头溢液中的Hsp90α在乳腺癌中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

乳腺癌作为一种生发于乳腺导管及小叶上皮的恶性肿瘤，早期病变往往局限于乳腺导管和小叶内并沿乳管生长，此时可通过外科手术达到治愈的效果。然而肿瘤一旦突破导管基底膜发生浸润，则可能有部分肿瘤细胞进入全身血液循环进展为全身性疾病，此时即便经过规范的外科手术和全身辅助治疗，仍有相当一部分患者死于远处复发转移。因此早发现、早诊断、早治疗是改善乳腺癌病人预后的关键。乳头溢液是乳腺癌患者除乳房肿块以外最常见的就诊主诉，伴有乳头溢液的乳腺癌患者最终病理结果又以导管内癌为主。因此提高伴有乳头溢液的乳腺癌患者的诊治水平有利于提高乳腺癌的总体生存率。目前针对乳头溢液的特异度辅助检查手段主要有：细胞学检查，乳管造影，乳管镜检查等，这些检查手段分别具有各自的优点和应用局限性。乳头溢液细胞学涂片作为一种定性检查，查见癌细胞意味着明确的手术指征，但总体阳性检出率仅为百分之十左右；乳管造影中特征性图像可用于诊断及手术指征的把握，但无法仅根据图像做良恶性的判断；乳管镜作为一种侵入性手段，仅能观察主乳管及分支乳管内的情况，对于起源于终末导管小叶单元的导管内病变无法观察且无法定性。

因此开发一种乳头溢液中高灵敏度和特异度、快速的早期乳腺癌诊断方法是当务之急。肿瘤标记物因其获取无创、方便，患者依从性强，在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。目前临床上肿瘤标记物的应用越来越普遍。目前乳腺肿瘤常用的血清或血浆肿瘤标记物有癌胚抗原(CEA)、CA153等，但因这些肿瘤标志物进入血液是乳腺癌晚期的标志，在早期乳腺癌鉴别诊断中价值有限，常用作提示预后、监测术后复发、评价治疗效果等。临床上迫切需要寻找更具诊断潜力的肿瘤标记物用于乳腺癌辅助检查。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供乳头溢液中的人源热休克蛋白90α(Hsp90α)在乳腺癌中的应用。本发明研究发现，Hsp90α在乳腺癌患者的乳头溢液中表达显著上调，可能与肿瘤发生、进展相关。乳头溢液中Hsp90α联合CEA检测可以作为乳腺癌潜在的诊断标记物。

为实现上述发明目的，本发明公开了以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供Hsp90α作为标志物在制备乳腺癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

其中，所述Hsp90α选自受试者血液或乳头溢液，优选为乳头溢液。经试验证明，Hsp90α在乳腺癌患者的乳头溢液中表达显著上调，可能与肿瘤发生、进展相关。

本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含用于检测上述Hsp90α的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断乳腺癌。

检测上述相关蛋白的物质可以是采用诸如ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片等现有检测蛋白表达情况的物质。

所述产品可以是试剂盒。

本发明的第三个方面，提供一种用于诊断或辅助诊断乳腺癌的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述标志物表达水平的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述标志物表达水平判断所述受试者患病情况。

所述待测样品包括受试者的血液、乳头溢液；优选为乳头溢液。

所述标志物包括Hsp90α、CEA和CA153中的任意一个或多个，优选为Hsp90α和CEA。

本发明的第四个方面，提供一种诊断或辅助诊断乳腺癌的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述标志物的表达水平并判断所述受试者患病情况。

所述待测样品包括受试者的血液、乳头溢液；优选为乳头溢液。

所述标志物包括Hsp90α、CEA和CA153中的任意一个或多个，优选为Hsp90α和CEA。

本发明的第五个方面，提供上述标志物作为靶点在乳腺癌治疗和/或筛选乳腺癌药物中的应用。

所述乳腺癌药物为预防和/或治疗乳腺癌的药物。

本发明的第六个方面，所述筛选乳腺癌药物的方法包括：

1)采用候选物质处理表达和/或含有上述标志物的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；

2)完成步骤1)后，检测体系中所述标志物的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述标志物的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的乳腺癌药物。

与现有技术相比，上述一个或多个技术方案取得了以下有益效果：

上述技术方案提供乳头溢液中的Hsp90α在乳腺癌中的应用。上述技术方案通过研究发现，Hsp90α在乳腺癌患者的乳头溢液中表达上调，可能与肿瘤发生、进展相关，同时利用蛋白质组学技术分析了乳头溢液在乳腺良恶性疾病中的差异蛋白，对其进行验证；乳头溢液中Hsp90α联合CEA检测可以作为乳腺癌潜在的诊断标记物，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中病例信息概览及主要设计思路图。

图2A为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α表达情况图。

图2B为本发明实施例中乳头溢液中CEA表达情况图。

图2C为本发明实施例中乳头溢液中CA153表达情况图。

图2D为本发明实施例中基于乳头溢液中Hsp90α的ROC曲线分析图。

图2E为本发明实施例中基于乳头溢液中CEA的ROC曲线分析图。

图2F为本发明实施例中基于乳头溢液中Hsp90α+CEA的ROC曲线分析图。

图3A为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α与患者年龄关系图。

图3B为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α与患者BMI指数关系图。

图3C为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α在不同患病情况患者(按良性病变、乳腺原位癌和浸润性导管癌区分)的表达情况图。

图3D为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α在不同患病情况患者(按乳腺癌0期、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期区分)的表达情况图。

图3E为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α在ER阳性和阴性患者的表达情况图。

图3F为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α在PR阳性和阴性患者的表达情况图。

图3G为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α在HER2阳性和阴性患者的表达情况图。

图3H为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α与Ki67表达情况图。

图3I为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α在不同分子分型之间的差异图。

图3J-图3M分别为本发明实施例中Hsp90α与肿瘤直径、T分期、淋巴结转移、N分期的相关性图。

图4A为本发明实施例中乳头溢液与血浆中的Hsp90α的表达情况图。

图4B为本发明实施例中乳头溢液与血浆中的Hsp90α的表达比较图。

图5为本发明实施例中乳头溢液中Hsp90α蛋白质组学鉴定实验流程图。

图6为本发明实施例中乳腺癌患者血清中CEA、CA153和血浆中Hsp90α的表达情况图。

图7为本发明实施例中血浆中Hsp90α与乳腺癌患者病理分期之间的关系图。

图8为本发明实施例中PR阴性乳腺癌患者与PR阳性者血浆中Hsp90α表达比较图。

图9为本发明实施例中血浆中Hsp90α水平与患者年龄、体重指数、ER表达、HER-2表达、ki67表达、淋巴结转移、分子分型和肿瘤直径之间关系图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

如前所述，本发明的一个典型具体实施方式中，提供Hsp90α作为标志物在制备乳腺癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述Hsp90α选自受试者血液或乳头溢液，优选为乳头溢液。经试验证明，Hsp90α在乳腺癌患者的乳头溢液中表达显著上调，可能与肿瘤发生、进展相关。

具体的，相比于良性溢液，Hsp90α在恶性溢液中表达上调(P<0.0001)。且，从良性病变到乳腺原位癌，再到浸润性导管癌，Hsp90α表达呈递增趋势，具有统计学差异。因此，所述乳腺癌诊断或辅助诊断产品具体作用为：用于区分乳腺相关疾病的病情程度；即可用于区分良性病变、非浸润性癌和浸润癌。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含用于检测上述Hsp90α的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断乳腺癌。

更具体的，所述产品还包括目前适于诊断或辅助诊断乳腺癌的其他标志物及其组合的物质，所述其他标志物包括但不限于CEA和CA153，优选的，所述生物标志物为CEA，经试验证明，将乳头溢液中的Hsp90α和CEA联合诊断乳腺癌的ROC曲线下面积为0.857，具有更佳的灵敏度和特异度，诊断价值优于单独的Hsp90α及CEA。

检测上述相关蛋白的物质可以是采用诸如ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片等现有检测蛋白表达情况的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以是试剂盒。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断或辅助诊断乳腺癌的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述标志物表达水平的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述标志物表达水平判断所述受试者患病情况。

本发明的又一具体实施方式中，所述待测样品包括受试者的血液、乳头溢液；优选为乳头溢液。

本发明的又一具体实施方式中，所述标志物包括Hsp90α、CEA和CA153中的任意一个或多个，优选为Hsp90α和CEA。

其中，所述评估单元中，以乳头溢液中的Hsp90α为例，标志物表达水平越高，则表明疾病越加恶化。即相比于良性溢液，Hsp90α在恶性溢液中表达上调(P<0.0001)。且，从良性病变到乳腺原位癌，再到浸润性导管癌，Hsp90α表达呈递增趋势，具有统计学差异。因此，可以用于判断所述受试者患病情况，即可用于区分受试者良性病变、非浸润性癌和浸润癌。

需要说明的是，本发明的用于诊断或辅助诊断乳腺癌的系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述分析单元以及评估单元的功能即可。所述的分析单元可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等；所述评估单元可以是任何可以实现对分析单元的检测结果进行分析处理而得出乳腺癌患病风险评估状况的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将各种可能的检测结果与对应的患病风险情况制定相应的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出乳腺癌发病风险评估结果。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诊断或辅助诊断乳腺癌的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述标志物的表达水平并判断所述受试者患病情况。

所述待测样品包括受试者的血液、乳头溢液；进一步研究发现，Hsp90α在早期乳腺癌及良性乳腺疾病患者的血浆中表达水平不具有统计学差异，而Hsp90α在乳腺癌患者的乳头溢液中表达上调，可用于乳腺癌的诊断，因此优选为乳头溢液。

所述标志物包括Hsp90α、CEA和CA153中的任意一个或多个，优选为Hsp90α和CEA。

以乳头溢液中的Hsp90α为例，标志物表达水平越高，则表明疾病越加恶化。即相比于良性溢液，Hsp90α在恶性溢液中表达上调(P<0.0001)。且，从良性病变到乳腺原位癌，再到浸润性导管癌，Hsp90α表达呈递增趋势，具有统计学差异。因此，可以用于判断所述受试者患病情况，即可用于区分受试者良性病变、非浸润性癌和浸润癌。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述标志物作为靶点在乳腺癌治疗和/或筛选乳腺癌药物中的应用。

所述乳腺癌药物为预防和/或治疗乳腺癌的药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述筛选乳腺癌药物的方法包括：

1)采用候选物质处理表达和/或含有上述标志物的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；

2)完成步骤1)后，检测体系中所述标志物的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述标志物的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的乳腺癌药物。

所述体系可以是细胞体系、组织体系、溶液体系、器官体系或动物体系。

其中，所述细胞体系可以是乳腺(癌)细胞；

所述组织体系可以是乳腺(癌)组织；

所述器官体系可以是乳房；

所述动物体系可以是哺乳动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猴和人等。

实施例

一、Hsp90α在乳头溢液中的表达及临床价值分析

材料与方法

1.临床资料与样本收集

1.1临床资料收集

患者入组标准为：1.资料完整；2.均已行手术，并有明确病理结果；3.前期未做其他有创性检查；4.无其他癌症历史；5.无严重发热，炎症或感染性疾病；(5)无HIV、自身免疫性疾病等；(6)无严重心、肺、脑、肾等重要器官并发症。本研究共纳入自2019年1月至2021年3月在山东大学齐鲁医院乳腺外科住院手术的伴有乳头溢液的110例患者，其中18例患者伴有双侧溢液，共得到128例乳头溢液样本。收集其乳头溢液标本及临床病例资料。128例样本包括32例乳腺癌(15例浸润性导管癌，15例导管内癌和2例小叶原位癌)以及96例良性乳腺疾病(72例导管内乳头状瘤，11例导管扩张，7例纤维腺瘤和6例乳腺增生)。

本研究中所有入组患者的最终病理结果由两名以上我院病理科医生进行专业诊断。所有研究都是按照《赫尔辛基宣言》的原则和人体实验负责委员会的道德标准进行的。本研究获得山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

入组患者住院后，临床医生根据患者临床指征进行详细问诊及入院查体。本研究组成员将患者信息进行统一整理，并建立临床患者信息资料库，本研究所有患者信息均来源于资料库。患者具体临床特征，包括：主诉、溢液侧、入院年龄、初潮年龄、是否绝经、平均月经周期、月经持续时间、身高、体重、有无基础疾病等。同时收集纳入标准中所能获得的所有乳头溢液CEA、CA153数据及血液Hsp90α、CEA、CA153数据。所有患者均无血缘关系。根据以上患者临床特征建立电子数据库。

1.2样本采集

1.2.1乳头溢液取材

所有乳头溢液标本收集均在手术前，未对患者进行任何可能对标本产生影响的检查之前完成。每次标本取材，均由一名受过系统训练的外科医生进行。取材步骤如下：

a.先用70％(即75％(V/V)酒精)的医用酒精棉球对患者乳头进行擦拭，去除乳头表面细胞碎屑。

b.对患侧乳房进行人工按压，自乳房四周向乳头挤压。

c.将乳头溢出的乳头溢液收集到无菌Eppendorf管(2管)中，将每管溢液量控制在20到100微升。

d.标本将会在收集后2小时内分别送至山东大学齐鲁医院检验科及齐鲁医院健康管理中心实验室。

e.若收集标本不能及时检测，则将标本放入-20℃冰箱冷冻保存，检测时解冻使用。

1.2.2血液样本采集：

EDTA-K2抗凝管收集2ml空腹外周血，离心后收集上清，分离血浆用于检测HSP90α；

充满凝胶的凝血管收集4ml空腹外周血，离心后用血清上清检测CEA和CA153。

2.实验方法

2.1乳头溢液及血浆中Hsp90α检测

乳头溢液及血浆中Hsp90α定量检测试剂盒购自烟台普罗吉生物科技发展有限公司，采用酶联免疫法(Elisa)，用无锡华卫德朗有限公司生产的DR-200Bn酶标分析仪测量Hsp90α浓度。操作方法及注意事项均参照血浆Hsp90α定量检测说明书。

2.1.1试剂组成：

固相板：包被有Hsp90α单克隆抗体E7(鼠源)，使用铝箔袋真空密封，内含干燥剂；

校准品：Hsp90α蛋白冻干品(重组表达)，蛋白保护剂，使用前需将0.4ml分析物稀释液加入瓶中，溶解、振荡器充分混匀；

分析物稀释液：含10％新生牛血清的磷酸盐缓冲液；

标记物：辣根过氧化物酶标记Hsp90α单克隆抗体F6(鼠源)；

显色剂A液：过氧化物；

显色剂B液：TMB；

终止液：硫酸；

浓缩洗涤液：磷酸盐缓冲液，含2.5％表面活性剂。

2.1.2实验步骤：

a.准备：试剂盒在37℃平衡30分钟，液体在使用前要充分混匀并避免产生泡沫，将浓缩洗涤液加入475ml去离子水混匀后待用；

b.样本制备：将校准品加入0.4ml分析物稀释溶液，用稀释液对待测乳头溢液标本进行20倍稀释，离心取上清液。

c.加样：将所需数目的板条置于板架上，设置校准品孔和样本孔，分别加入50μl校准品和稀释后样本；

d.加标记物液：在每个微孔中各加入50ul测热休克蛋白90α用标记物液，轻轻振荡混匀；

e.温育：封板膜覆盖微孔板，37℃下温育60分钟；

f.洗板：甩掉反应液，每孔加300ul洗液洗板，或使用洗板机进行洗板，共洗板6次，最后在吸水纸上扣干；

g.显色：每孔中依次加入显色剂A、B液各50μl，轻轻振荡混匀，37℃温育20分钟；

h.终止：每孔中加入50μl终止液终止显色；

i.测量：加入反应终止液后10分钟内，在450nm波长下读取OD值；

j.计算：使用仪器自带软件，以校准品1-5的浓度对效为X轴，校准品的光吸收值对数为Y轴，画出标准曲线，将样本吸光度的对数值代入回归方程，计算样本Hsp90a含量。推荐使用双对数拟合曲线，要求标准曲线相关系数(R2)应大于0.980。

2.2血液及乳头溢液中CEA、CA153检测

所有患者血液及乳头溢液中CEA、CA153的检测均在山东大学齐鲁医院中心实验室，由自动化检测系统定量测定完成。采用三明治电化学发光分析法(ECLIA)测量，CEA定量检测试剂盒与CA153测定试剂盒均购自上海罗氏诊断产品有限公司(Roche cobase601分析仪，罗氏制药，印第安纳波利斯，美国)。所有操作均由专业检验技师严格参照血清，按照仪器操作说明书和试剂盒的操作方法完成，实验室每日定时做质控，定期做质评，在一定程度上保证检测结果真实可靠。纳入研究的所有患者的CEA、CA153检测数据均由临床病案资料中回顾性获得。

3.统计学方法

使用统计软件GraphPad Prism 5进行分析。两组间差异比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。Hsp90α在乳头溢液中表达和ki67的相关性使用Spearman相关分析。使用受试者工作特征(ROC)曲线分析Hsp90α、CEA对乳腺癌的诊断价值。临界值(cutoff值)是在ROC曲线基础上，根据约登指数(灵敏度加特异度减1)为最大值时所决定的拐点。P＜0.05认为有统计学意义。

结果

1.Hsp90α在恶性溢液中相比于良性溢液中表达上调

本研究共纳入伴有乳头溢液的110例患者，其中18例患者伴有双侧溢液，共得到128例乳头溢液样本。所有患者均有明确病理诊断。128例样本，其中32例诊断为乳腺癌(浸润性导管癌15例，原位癌17例)，96例诊断为乳腺良性病变(纤维腺瘤7例，导管内乳头状瘤72例，导管扩张11例，乳腺增生6例)。病例信息概览及本研究主要思路如下图(图1)。

我们还检测了乳头溢液中Hsp90α、CEA、CA153表达水平，并按良恶性分组进行统计学分析。结果显示，相比于良性溢液，Hsp90α在恶性溢液中表达上调(图2A，P<0.0001)；CEA在恶性溢液表达水平升高(图2B，P＝0.0005)，而CA153在良恶性溢液中表达水平无显著差异(图2C，P＝0.1928)。

2.乳头溢液中Hsp90α诊断价值优于CEA，两者联合后优于单个指标

ROC曲线也就是受试者工作曲线，即通过临界值(cutoff value的移动，获得多对灵敏度(sensitivity)和误判率(1-Specificity(特异度))，以灵敏度为纵轴，以误判率为横轴，连接各点绘制曲线，然后计算曲线下的面积，面积越大，判断价值越高。约登指数(Youden index)：也称正确指数，是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。当P值小于0.05时，我们认为统计学上有意义，此时的肿瘤标记物的临界值(cut off值)是基于灵敏度与特异度之和最大时所计算出来的。

ROC曲线分析显示，Hsp90α用以区分良恶性乳头溢液的曲线下面积是0.8268(图2D，P<0.0001)基于约登指数，找到诊断临界值281.7ng/ml，此时Hsp90α诊断乳腺癌的敏感度为84.38％，特异度也为84.38％。CEA区分良恶性乳头溢液的曲线下面积为0.7086(图2E，P＝0.0005)，小于Hsp90α。基于约登指数，找到诊断临界值494.5ng/ml，此时CEA诊断乳腺癌的敏感度为51.61％，特异度为90.22％。可见，乳头溢液中Hsp90α诊断价值优于CEA。

为进一步提高诊断效力，我们将Hsp90α与CEA联合，即Hsp90α和CEA均高于临界值(高风险)；Hsp90α或CEA高于临界值(中风险)；Hsp90α与CEA均低于临界值(低风险)。两者结合诊断乳腺癌的ROC曲线下面积为0.857(图2F，P<0.0001)，高于Hsp90α及CEA。具体来说，低风险组76人，其中72人(94.7％)为良性，仅有4人(5.3％)为乳腺癌；中风险组32人，20人(62.5％)为良性，12人(37.5％)为乳腺癌；高风险组20人，仅有4人(20％)为良性，16人(80％)为乳腺癌。综上结果显示，当Hsp90α与CEA均呈现高表达时，高度提示为乳腺癌。提示两者结合后诊断价值优于单个指标。

ROC曲线分析显示，Hsp90α曲线下面积大于CEA，两者结合时曲线下面积大于Hsp90α。可见，乳头溢液中Hsp90α诊断价值优于CEA，两者结合优于单个指标。

3.乳头溢液中Hsp90α与患者临床病理参数的关系

128例研究样本涉及的年龄跨度自26岁到76岁，以50岁为界分为两组，其中<50岁者共92例，≥50者36例，样本数据进行组间比较，结果未见统计学差异(图3A，P＝0.4114)。以体重指数(BMI)24kg/m²为界分为两组，其中BMI≤24kg/m²者共66例，BMI>24kg/m²者共62例，进行组间分析，结果未见统计学差异(图3B，P＝0.4241)

为探讨Hsp90α的临床意义，我们将32例乳腺癌样本按照临床病理参数分别进行分组，如表1。

我们按照病理类型，将乳腺癌患者分为原位癌(17例)与浸润性导管癌(15例)，结果显示，从良性病变到乳腺原位癌，再到浸润性导管癌，Hsp90α表达呈递增趋势，差异具有统计学意义(图3C，P<0.0001)。基于乳腺癌分期系统AJCC癌症分期手册第8版2017年更新，我们根据病理结果，将32例乳腺癌样本分为0期、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期，样本数量分别为17例，8例，4例，3例，0例，早期(0期和Ⅰ期)病人占了78％(25/32)，可见乳头溢液相关乳腺癌患者多数为早期患者。我们将四组数据之间进行方差分析，结果显示随着分期越晚，Hsp90α表达呈上升趋势，但不具有显著差异(图3D，P＝0.3289)。即从良性病变到乳腺原位癌，再到浸润性导管癌，Hsp90α表达显著上调，且随恶性程度增高，Hsp90α表达呈上升趋势。

我们将32例乳腺癌样本按照常规免疫组化指标(ER、PR、HER-2、ki67)表达情况分组进行分析。结果显示Hsp90α倾向于在ER、PR阴性的患者中高表达，但均不具有统计学意义(图3E，P＝0.0556；图3F，P＝0.0584)。Hsp90α在Her-2阳性与阴性组乳腺癌患者乳头溢液中表达水平无显著差异(图3G，P＝0.1643)。由于Ki67是连续变量，利用Sperman相关分析得到结果显示：Hsp90α与Ki67表达正相关(图3H，r＝0.3639，P＝0.0480)。即Hsp90α与常规免疫组化指标之间的关系：Hsp90α表达水平在ER、PR、HER-2阳性及阴性组之间不具有统计学差异，但在ER、PR阴性组中呈升高趋势。Hsp90α与Ki67表达呈正相关。

基于2011年St.Gallen专家共识，我们根据免疫组化指标ER、PR、HER-2及Ki-67表达情况可将乳腺癌划分为4类分子亚型：LuminalA型、LuminalB型、HER-2过表达型、三阴型。有3例样本因为未行荧光原位杂交(FISH)检测，未能明确乳腺癌组织中Her-2基因的表达情况，导致无法进行分型。根据分子分型我们将剩余29例乳腺癌样本分为四组，将样本数据进行组间比较，结果显示Hsp90α表达不具有显著差异(图3I，P＝0.2286)

另外，我们按照肿瘤直径大小及淋巴结转移情况分别进行分组，统计结果显示Hsp90α与肿瘤直径、T分期、淋巴结转移、N分期均无明显相关性(图3J-3M，P值均>0.05)。

4.乳头溢液中Hsp90α表达水平明显高于血液中Hsp90α

我们共有43例患者同时检测了血液及乳头溢液中Hsp90α的表达，其中有4例患者双侧溢液，共形成47对配对样本，我们发现乳头溢液中Hsp90α的表达水平显著高于血液中Hsp90α(图4A，P＝0.0003)。具体来说，47对样本中，有29对(61.7％)样本的乳头溢液中Hsp90α高于对应血液中Hsp90α(图4B)。

二、乳头溢液中Hsp90α蛋白质组学鉴定

材料与方法

1.标本收集

本研究共收集自2019年1月至2021年3月在山东大学齐鲁医院乳腺外科住院手术的35例患者乳头溢液标本。其中包括15例乳腺癌和20例乳腺导管内乳头状瘤患者。本研究中所有入组患者的最终病理结果由两名以上我院病理科医生进行专业诊断。所有研究都是按照《赫尔辛基宣言》的原则和人体实验负责委员会的道德标准进行的。本研究获得山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2.实验方法

与上海百趣公司合作，将收集样本分成乳腺癌组和导管内乳头状瘤组，进行蛋白质组学分析，寻找差异蛋白。离心，去除样品上清，提取35例乳头溢液中的总蛋白，进行胰酶消化，得到标记的多肽样品，各样品均采用nano-HPLC液相系统EASY-nLC1200进行反相色谱，分离后联用配备纳升离子源的质谱仪(Q-Exactive HFX)进行质谱分析，质谱结果原始数据文件使用Linux(debian-9)版的Maxquant(版本号1.6.15.0)3,4软件进行搜库和定量分析。定量方式为基于MS1色谱峰积分面积和maxLFQ校正算法的非标记定量(LFQ)，允许最少1对比值(min ratio count)用于样品间LFQ值计算。其它参数使用软件默认值。搜库完成后，过滤掉匹配至decoy数据库的多肽和蛋白，剩余数据用于后续分析。

结果

将乳腺癌组及导管内乳头状瘤组乳头溢液样本蛋白定量结果标准化后进行统计分析，以乳腺癌组倍数变化>2倍(上调>2倍，或下调>50％)，且p值<0.05的标准，共筛选得出859个差异蛋白，其中包括Hsp90α，其在乳腺癌组乳头溢液中上调13.74倍，P值<0.01。

乳头溢液在临床上非常常见，约占到乳腺外科门诊就诊患者的5-10％，是继乳房疼痛和乳房肿块之后的乳腺疾病第三大症状。乳头溢液的原因有很多，除哺乳期外，还有生理性和病理性之分。生理性乳头溢液多发生于双侧，累及多个乳管，多为白色、黄色或绿色。病理性乳头溢液多发生于单侧，累及单个乳管，多为清亮浆液性，或者血性红色或暗褐色。在大多数情况下，病理性乳头溢液是由良性病变引起的，其中导管扩张占到约6-59％，乳头状瘤大约35–56％。但是潜在恶性肿瘤的风险不容忽视。

我们的研究发现，相比于良性乳头溢液，Hsp90α在恶性乳头溢液中表达明显上调，这与我们蛋白质组学分析结果一致。我们通过蛋白质组学分析，在良恶性乳头溢液中共筛选出859个差异蛋白(p>0.05)，其中Hsp90α在恶性乳头溢液中比良性溢液中上调13.74倍(p<0.01)。研究提示Hsp90α在乳头溢液中高表达，可以作为乳腺恶性病变的重要提示。同时也说明，乳头溢液在早期乳腺癌诊断中的价值大大被低估。另外，我们的研究也再次验证了乳头溢液中CEA的表达对于早期乳腺癌的鉴别诊断具有临床价值。而Hsp90α与CEA的ROC曲线下面积分别为0.8268，0.7086，曲线下面积越大，诊断效力越强，可见乳头溢液中Hsp90α诊断效力优于CEA。而将Hsp90α与CEA联合后，诊断乳腺癌的AUC为0.857，均高于Hsp90α及CEA单个指标。以上结果说明，乳头溢液中Hsp90α与CEA表达均是良恶性病变的有效区分手段，而两者均呈现高表达时，高度提示乳腺癌风险，两者结合要优于单项检测。提示我们可在临床应用将二者作为一组标记物联合应用，提高诊断准确率。

发明人研究发现，乳头溢液相关乳腺癌一般存在于乳管中，直接与乳头溢液接触，过表达的Hsp90α可直接进入乳头溢液，从而被检测到。可见乳头溢液中的Hsp90α表达水平较直观的反映了乳腺癌细胞向胞外分泌Hsp90α的能力，可以在病变早期即出现变化。

同时，我们研究发现，Hsp90α在乳腺癌组及良性乳腺疾病的血液中表达水平不具有统计学差异，但在乳腺癌发生远处侵袭、转移时可表达上调。血液中Hsp90α不适合作为肿瘤标记物应用于乳腺癌鉴别诊断(如图6-9所示，CEA、CA153在乳腺癌患者血液中表达显著上调，Hsp90α在乳腺良恶性病变患者血液中表达无统计学差异；同时，从0期到Ⅲ期，Hsp90α表达呈递增趋势，但并不具有统计学差异。Ⅳ期乳腺癌患者血液中，Hsp90α表达显著升高(尤其与0、Ⅰ、Ⅱ期相比具有统计学差异；另外，分析了血液中Hsp90α表达水平与临床病理参数之间的关系，结果发现：其表达水平仅与PR表达存在负相关，即在PR阴性乳腺癌患者较PR阳性者血液中Hsp90α表达显著升高；但血液中Hsp90α水平与患者年龄、体重指数、ER表达、HER-2表达、ki67表达、淋巴结转移、分子分型、肿瘤直径均无明显相关性)。可见肿瘤恶性程度越高者，Hsp90α在其血液中的表达水平越高，在四期转移病人中尤其明显)，但可以用于提示预后，监测复发转移等。而且，Hsp90α在乳腺癌及导管内乳头状瘤组织中表达无显著差异，与其在乳头溢液中的表达水平并不一致。Hsp90α乳头溢液中的表达水平并不直接反映组织内的表达水平。这也反映了机体中相关物质表达的极端复杂性。

综上，Hsp90α在乳腺癌患者的乳头溢液中表达上调，可能与肿瘤发生、进展相关。乳头溢液中Hsp90α联合CEA检测可以作为乳腺癌潜在的诊断标记物。

应注意的是、以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明、但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换、而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.Hsp90α作为标志物在制备乳腺癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述Hsp90α选自受试者血液或乳头溢液，优选为乳头溢液。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述乳腺癌诊断或辅助诊断产品具体作用为：用于区分乳腺相关疾病的病情程度；即用于区分良性病变、非浸润性癌和浸润癌。

4.一种产品，其特征在于，所述产品包含用于检测Hsp90α的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断乳腺癌；

优选的，所述产品还包括目前适于诊断或辅助诊断乳腺癌的其他标志物及其组合的物质，所述其他标志物包括但不限于CEA和CA153；

优选的，检测上述蛋白的物质是采用ELISA、胶体金试纸条或蛋白芯片检测蛋白表达情况的物质；

优选的，所述产品是试剂盒。

5.一种用于诊断或辅助诊断乳腺癌的系统，其特征在于，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述标志物表达水平的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述标志物表达水平判断所述受试者患病情况；

所述待测样品包括受试者的血液、乳头溢液；优选为乳头溢液；

优选的，所述标志物包括Hsp90α、CEA和CA153中的任意一个或多个；进一步优选为Hsp90α和CEA。

6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述评估单元中，根据乳头溢液中的Hsp90α的表达情况，区分受试者良性病变、非浸润性癌和浸润癌。

7.一种诊断或辅助诊断乳腺癌的方法，其特征在于，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述标志物的表达水平并判断所述受试者患病情况。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括受试者的血液、乳头溢液；优选为乳头溢液。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标志物包括Hsp90α、CEA和CA153中的任意一个或多个，优选为Hsp90α和CEA。

10.标志物作为靶点在乳腺癌治疗和/或筛选乳腺癌药物中的应用；

所述乳腺癌药物为预防和/或治疗乳腺癌的药物；

所述标志物包括Hsp90α、CEA和CA153中的任意一个或多个，优选为Hsp90α和CEA。

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