CN111172279B

CN111172279B - 外周血甲基化基因及idh1联合检测诊断肺癌模型

Info

Publication number: CN111172279B
Application number: CN201911298771.2A
Authority: CN
Inventors: 赫捷; 高树庚; 孙楠; 臧若川
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN111172279A

Abstract

本发明公开了一种外周血甲基化基因及IDH1联合检测诊断肺癌模型。本发明提供了甲基化SHOX2基因、甲基化PTGER4基因和IDH1蛋白作为标志物在制备用于诊断或者辅助诊断肺癌的产品中的应用，并构建三标志物联合诊断肺癌模型。实验证明，与纳入的单一因素相比，本发明的联合诊断模型的诊断效能显著增强。因此，可以通过联合检测血液标志物来提高肺癌的诊断效能。

Description

外周血甲基化基因及IDH1联合检测诊断肺癌模型

技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及外周血甲基化基因及IDH1联合检测诊断肺癌模型。

背景技术

随着医学技术的不断发展，人们在恶性肿瘤的诊断及治疗方面取得了很大的进展，但肺癌仍然是全世界男性和女性癌症死亡的主要原因。另一方面，虽然与普通X线检查相比低剂量计算机断层扫描(LDCT)在筛查肺癌方面的优势已被证实，但在高危人群中，每年进行筛查的患者占比仅为4％。此外，对于一些影像学表现不典型的肺部结节，LDCT的诊断特异性并不高，故而需要重复进行影像学检查以长期观察肺部结节变化，造成了国家医疗卫生费用的不断升高，加重了公共卫生系统的相关经济负担。

由于发现及诊断的不及时，晚期肺癌患者可选择的治疗手段有限，5年生存率不容乐观。因此，开发一种新的诊断标志物是改善肺癌患者诊疗方式和提高生存率的当务之急。目前，通过检测生物液体标志物组合进行肺癌鉴别诊断，治疗效果的监测及生存预判越来越得到青睐。

在癌症发展的早期阶段，异常表观遗传改变即可被检测到，使得DNA甲基化生物标记物可用于癌症的早期检测和监测。基于之前的研究，相比于肺腺癌患者和健康人群，人矮小同源盒基因2(SHOX2)甲基化水平在小细胞肺癌(SCLC)和鳞状细胞癌(SCC)较高，提示了其作为生物标志物用于肺癌诊断，评估肺癌分期及检测化疗反应的潜能。前列腺素E2受体4基因(PTGER4)产物EP4在前列腺素E2介导的肿瘤进展中起重要作用，并已被证实其在癌组织中的表达高于正常组织。尽管已有研究证实了SHOX2/PTGER4 DNA甲基化水平联合检测肺癌中的诊断能力。然而，该研究结论是在一个非腺癌比例相对较高(腺癌：非腺癌，1:1.5)的人群中得出的，与当前肺腺癌患者为主要患病人群的肺癌流行病学特征并不相符。

此外，基于我们以往研究已证实异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase1,IDH1)在促进非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤生长方面具有重要作用，并可作为诊断NSCLC的血液生物标志物，特别是对于肺腺癌患者的诊断特异性高于肺鳞癌患者。

发明内容

本发明的目的是提供外周血甲基化基因及IDH1联合检测诊断肺癌模型。

第一方面，本发明要求保护甲基化SHOX2基因(人矮小同源盒基因2)、甲基化PTGER4基因(前列腺素E2受体4基因)和IDH1蛋白(异柠檬酸脱氢酶1)作为标志物在制备用于诊断或者辅助诊断肺癌的产品中的应用。

第二方面，本发明要求保护用于检测SHOX2基因甲基化水平的物质、用于检测PTGER4基因甲基化水平的物质和用于检测IDH1蛋白的物质在制备用于诊断或者辅助诊断肺癌的产品中的应用。

进一步地，所述用于检测IDH1蛋白的物质为能够用于检测IDH1蛋白含量的物质。

在本发明的具体实施方式中，所述检测SHOX2基因甲基化水平为检测外周血中SHOX2基因甲基化水平；所述检测PTGER4基因甲基化水平为检测外周血中PTGER4基因甲基化水平。

第三方面，本发明要求保护用于检测SHOX2基因甲基化水平的物质、用于检测PTGER4基因甲基化水平的物质和用于检测IDH1蛋白含量的物质和记载有诊断方法的可读性载体在制备用于诊断或者辅助诊断肺癌的产品中的应用；

所述诊断方法为：检测待测者的SHOX2基因甲基化水平、PTGER4基因甲基化水平和外周血中IDH1蛋白的含量(即公式I中的IDH1、SHOX2和PTGER4)代入联合检测诊断预测模型，计算诊断模型预测值，当诊断模型预测值≤0.569时，则认为所述待测者不为或候选不为肺癌患者(即所述待测者为肺癌患者的可能性较低)；当模型预测值＞0.569时，则认为所述待测者为或候选为肺癌患者(即所述待测者为肺癌患者的可能性较高)。

所述联合检测诊断预测模型如公式I所示；

诊断模型预测值＝16.821+0.435×IDH1-0.147×SHOX2-0.28×PTGER4(公式I)；

式中，IDH1表示所述待测者的外周血中IDH1蛋白的浓度；SHOX2表示所述待测者的SHOX2基因的甲基化水平；PTGER4表示所述待测者的PTGER4基因的甲基化水平。

进一步地，所述待测者SHOX2基因的甲基化水平为来自于所述待测者的外周血中SHOX2基因的甲基化水平。所述待测者PTGER4基因的甲基化水平为来自于所述待测者的外周血中PTGER4基因的甲基化水平。

进一步地，所述待测者SHOX2基因的甲基化水平的高低以对所述待测者的SHOX2基因进行甲基化特异性Real-time PCR反应时的Ct值(cycle threshold)体现；所述待测者PTGER4基因的甲基化水平的高低以对所述待测者的PTGER4基因进行甲基化特异性Real-time PCR反应时的Ct值(cycle threshold)体现。实际操作中，将相应Ct值(cyclethreshold)直接带入上述公式I中。

其中，所述可读性载体可为记载有所述诊断方法的纸张、光盘等。

第四方面，本发明要求保护记载有前文所述诊断方法的可读性载体在制备用于诊断或者辅助诊断肺癌的产品中的应用。

第五方面，本发明要求保护用于诊断或者辅助诊断肺癌的试剂盒。

本发明所要求保护的用于诊断或者辅助诊断肺癌的试剂盒，含有用于检测SHOX2基因甲基化水平的物质、用于检测PTGER4基因甲基化水平的物质和用于检测IDH1蛋白的物质。

进一步地，所述试剂盒中还含有前文所述的可读性载体。

在上述各方面中，所述物质可为试剂和/或仪器。

在上述各方面中，所述用于检测IDH1蛋白的物质可为能够与IDH1蛋白特异性结合的物质。

进一步地，所述能够与IDH1蛋白特异性结合的物质可为抗IDH1蛋白的抗体。

在本发明的具体实施方式中，所述用于检测SHOX2基因甲基化水平的物质为能够基于甲基化特异性Real-time PCR检测SHOX2基因甲基化水平的成套试剂，其中正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，阻断剂序列如SEQ ID No.3所示，探针序列如SEQ ID No.4所示。所述用于检测PTGER4基因甲基化水平的物质为能够基于甲基化特异性Real-time PCR检测PTGER4基因甲基化水平的成套试剂，其中正向引物序列如SEQ ID No.5所示，反向引物序列如SEQ ID No.6所示，阻断剂序列如SEQ ID No.7所示，探针序列如SEQ ID No.8所示。

第六方面，本发明要求保护用于诊断或者辅助诊断肺癌的系统。

本发明所要求保护的用于诊断或者辅助诊断肺癌的系统，可包括：

1)用于检测SHOX2基因甲基化水平的试剂和/或仪器；

2)用于检测PTGER4基因甲基化水平的试剂和/或仪器；

3)用于检测IDH1蛋白的试剂和/或仪器；

4)装置，所述装置包括数据输入模块、数据运算模块、数据比较模块和结论输出模块。

所述数据输入模块用于输入1)-3)检测得到的待测者的SHOX2基因甲基化水平、PTGER4基因甲基化水平和外周血中IDH1蛋白含量的检测值。

所述数据运算模块用于将所述检测值代入联合检测诊断预测模型，计算诊断模型预测值；所述联合检测诊断预测模型如公式I所示；诊断模型预测值＝16.821+0.435×IDH1-0.147×SHOX2-0.28×PTGER4(公式I)；式中，IDH1表示所述待测者的外周血中IDH1蛋白的浓度；SHOX2表示所述待测者的SHOX2基因的甲基化水平；PTGER4表示所述待测者的PTGER4基因的甲基化水平。

所述数据比较模块用于将所述诊断模型预测值与阈值进行比较；所述阈值为0.569。

所述结论输出模块用于输出结论，当所述诊断模型预测值≤0.569时，则输出“所述待测者不为或候选不为肺癌患者(即所述待测者为肺癌患者的可能性较低)”的结论；当所述模型预测值＞0.569时，则输出“所述待测者为或候选为肺癌患者(即所述待测者为肺癌患者的可能性较高)”的结论。

进一步地，所述用于检测IDH1蛋白的试剂和/或仪器为能够用于检测IDH1蛋白含量的试剂和/或仪器。

在上述各方面中，所述诊断或者辅助诊断肺癌为诊断或者辅助诊断人类肺癌。

在上述各方面中，所述肺癌为肺腺癌或非腺癌。所述肺癌为T1-2期肺癌(肿瘤大小≤5cm)或T3-4期肺癌(肿瘤大小＞5cm)。

在上述各方面中，所述待测者为肺癌患者或者健康人。其中所述肺癌如肺腺癌或非腺癌，再如T1-2期肺癌(肿瘤大小≤5cm)或T3-4期肺癌(肿瘤大小＞5cm)。所述健康人为经胸部X光或薄层计算机断层扫描证实无肺结节，无恶性肿瘤病史。

本发明将SHOX2和PTGER4这两个甲基化DNA标记物作为候选标记物，在一个符合肺癌流行病学特征即主要含有肺腺癌的人群中进行分析，同时联合IDH1蛋白，以建立肺癌诊断效率高、覆盖面广的联合诊断标志物为目的，对外周血中蛋白水平和DNA甲基化水平进行了测定和分析。研究证实本发明提供了具有良好疾病分期特异性和病理组织学类型特异性的联合生物标志物，与纳入的单一因素相比，本发明的联合诊断模型的诊断效能显著增强。因此，可以通过联合检测外周血标志物来提高肺癌的诊断效能。

附图说明

图1为建模组及验证组中3个指标在健康人群及癌症患者中的水平比较。H表示为健康人群，C表示肺癌患者。

图2为单个检测指标及联合检测诊断模型ROC比较。A为建模组；B为验证组；C为全组；D为T1-2期；E为T3-4期；F为非腺癌；G为腺癌。各图中，shox2表示人同源矮小盒基因2；ep4表示前列腺素E2受体基因4；idh1表示异柠檬酸脱氢酶1；3-marker model表示3指标联合检测模型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、甲基化基因及IDH1联合检测诊断肺癌模型的建立及应用

一、研究人群

在健康对照和肺癌患者的样本中测量和统计分析外周血样本DNA中SHOX2和PTGER4基因的甲基化水平，检测血清中IDH1蛋白的含量。从2017年1月到2018年12月，中国医学科学院肿瘤医院的221名受试者被纳入本发明研究，并随机分为建模组和验证组。

收集符合下列标准的肺癌患者的血样：(a)无其他特异性恶性疾病史：(b)在采血过程之前不进行抗癌治疗。

对照组健康人群同期从体检中心选取；经胸部X光或薄层计算机断层扫描证实，这些患者无肺结节，无恶性肿瘤病史。

本研究遵循国家机构伦理政策，经中国医学科学院机构审查委员会批准。

二、实验方法

1、血浆样本中游离DNA的SHOX2和PTGER4基因的甲基化水平测定

为了确保客观性，实验室工作人员对样品的信息未知。使用10ml BD真空EDTA采血管(BD Biosciences,San Jose,CA)进行血液采集，每个受试者采集10ml血液。采血管在1350g(±150g)离心力下室温离心12分钟，然后转移血浆至一个干净的15ml的锥形底离心管中。再次以1350g(±150g)离心12分钟，将血浆转移至干净的15ml锥形底离心管中，置于-20℃保存。如果不立即进行检测，血浆可以在-20℃下保存两周。

(1)游离DNA的提取及亚硫酸盐转化

游离DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司磁珠法血清游离DNA提取试剂盒，货号为：DP340。亚硫酸盐转化使用ZYMO RESEARCH生物公司的EZ DNA Methylation-DirectTM Kit，货号为：D5020。DNA使用60μl有一定缓冲能力的洗脱液进行洗脱。得到的DNA如果不立即使用，可以在-20℃下保存3天。

(2)Real-time PCR检测

a.引物探针及阻断剂的订购

设计的SHOX2、PTGER4及ACTB的引物探针及阻断剂序列如表1所示，引物探针及阻断剂的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 SHOX2/PTGER4甲基化荧光定量PCR反应中的引物探针

b.PCR检测

每个样本进行3次重复PCR反应，每个反应体系总体积为30μl，其中添加14.28μlPCR预反应液、0.72μl聚合酶以及前期经亚硫酸盐转化的DNA 15μl。其中PCR预反应液包含两部分，1)提供一般PCR反应所必需的原料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，镁离子等；2)引物探针及阻断剂：用于扩增甲基化的SHOX2基因的正向引物、反向引物、阻断剂、探针，用于扩增甲基化PTGER4基因的正向引物、反向引物、阻断剂、探针，用于扩增甲基化的ACTB基因的正向引物、反向引物、探针。详细配比见表2。

在一个PCR反应中同时进行SHOX2基因、PTGER4基因与内参β-actin(ACTB)基因(内参用于评估血浆处理过程中DNA是否足量及PCR反应是否有效，即内参无效则整个PCR反应判定为无效，内参有效，则可以评判SHOX2及PTGER4基因的甲基化水平)的三重PCR检测。PCR反应体系如表2所示，

表2 PCR反应体系

荧光定量PCR反应在ABI 7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,CA)上进行，PCR反应程序如表3所示。

表3荧光定量PCR反应程序

PCR反应结束后，使用ABI7500荧光定量PCR仪适配的ABI 7500SDS软件V2.0.5进行分析，分析可设定基线为10-22，各靶标的阈值依次为ACTB阈值25000，SHOX2阈值25000，PTGER4阈值25000，即可得到每个样本3个基因的检测Ct值。

在荧光定量PCR反应中，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。理论上只要获得未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。因此说当一个样本检测出SHOX2 Ct值的大小，反映了血浆中游离DNA中甲基化SHOX2基因的模板量的多少，即SHOX2基因甲基化的水平。

2、血清中IDH1蛋白浓度的测定

遵照国家WS/T224-2002技术规范，使用一次性真空分离胶采血器。用BD真空器乙二胺四乙酸管(BD Biosciences,San Jose,CA)缓慢抽取受检者5ml静脉血，避免在采血管内部产生红色血泡。轻轻颠倒180°，摇匀5-8次。将采血管立即放入4℃冰盒或2～8℃冰箱，在4h-8h内按3000rpm离心5min完成血清分离。采用ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，货号：SEH839Hu)检测血清中IDH1水平，具体操作步骤如下：

测定前，将血清样品和试剂盒平衡至室温条件，同时将浓缩洗液(30×)用蒸馏水或去离子水30倍稀释备用。留1孔作空白对照，暂不加任何液体。按要求配制7个浓度标准品，各加100μL标准品，在其它反应孔中按加样顺序各加入待检样本100μL。反应板上加盖封板膜，置37℃温箱或水浴锅中，反应2小时。弃去反应液，甩干。每孔加入100μL检测溶液A(空白对照孔不加入，临用前配制)，反应板上覆封板膜，置37℃温箱或水浴锅中，反应1小时。每孔加入稀释后的洗液350μL，浸泡1-2分钟，甩弃洗液，连续洗板3次并拍干。每孔加入100μL检测溶液B(空白对照孔不加入，临用前配制)，反应板上覆封板膜，置37℃温箱或水浴锅中，反应30分钟。洗板3次(操作同上)。每孔加入底物液90μL，反应板上覆封板膜，轻微振荡混匀，37℃避光显色(反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟)。每孔加入终止液50μL，轻微振荡混匀终止反应。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图(七点图)，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标)，OD值为横坐标(或对数坐标)，绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算的R²值来定，以R²值越趋近于1为好)。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert1.30，根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

三、实验数据的统计分析

数据统计分析采用Mann-Whitney U检验或t检验对正常对照组与肺癌患者的生物标志物水平进行统计分析。为了建立肺癌鉴别的预测模型，采用正向逻辑回归方法筛选变量。应用95％置信区间(CI)的受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)，比较单标记物与模型的诊断性能。另外，利用训练组的约登指数确定预测模型的cut-off值。通过比较ROC曲线的AUC来分析我们的模型在不同亚组中的诊断性能。其他描述性统计，如敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、标准差(SD)。采用SPSS 24.0、GraphPad Prism 5.0、MedCalc(版本11.4.2.0)、Microsoft Excel等软件进行统计分析。P值是双尾的。差异有统计学意义，p值小于0.05。

四、实验结果

在本发明研究中，将所有的入组人群随机分为训练组和验证组。训练组有170名候选人(55名健康对照组和115名肺癌患者)，其余16名健康对照组和35名肺癌患者被随机选择作为验证队列。在两组中，健康对照组与患者的比例接近1:2。在训练组和验证组中，大多数患者(分别为78.3％和62.9％)诊断为肺腺癌。根据肿瘤大小和病理类型对入组人群进行分组，如表4所示，分析亚组的诊断表现。其他基本信息见表4。

表4基本信息表

如图1所示，我们分别在建模组和验证组两个队列中评估了肺癌患者和健康对照组中单个生物标志物的水平。建模组肿瘤患者SHOX2基因和PTGER4基因的甲基化水平显著高于健康对照组(p<0.05)，肺癌患者血清中IDH1水平显著高于健康人群对照组(p<0.05)。验证组的情况类似，即与健康对照组相比，肺癌患者PTGER4甲基化水平及IDH1水平显著升高(p<0.05)。与健康人群差异虽然并不显著(p>0.05)，但肺癌患者中SHOX2的甲基化水平仍高于健康对照组。

通过同时检测三个生物标记物的水平，根据logistic回归分析的结果建立预测模型(表5)。结果显示，所有三个测量的生物标志物都被纳入，最终获得联合检测诊断预测模型如下：

诊断模型预测值＝16.821+0.435×IDH1-0.147×SHOX2-0.28×PTGER4。

式中，IDH1表示待测者的血清中IDH1蛋白的浓度；SHOX2表示待测者外周血中的SHOX2基因的甲基化水平(带入值为对待测者的SHOX2基因进行甲基化特异性Real-timePCR反应时的Ct值)；PTGER4表示待测者外周血中的PTGER4基因的甲基化水平(带入值为对待测者的PTGER4基因进行甲基化特异性Real-time PCR反应时的Ct值)。

以建模组(即训练组)中的预测值绘制ROC曲线，并根据约登指数值(0.534)确定诊断的cut-off值0.569。即当诊断模型预测值≤0.569时，则认为所述待测者不为或候选不对肺癌患者(待测者为肺癌患者的可能性较低)；当模型预测值＞0.569时，则认为所述待测者为或候选为肺癌患者(待测者为肺癌患者的可能性较高)。

表5多因素回归分析

简写:shox2＝人同源矮小盒基因2；ep4＝前列腺素E2受体基因4；idh1＝异柠檬酸脱氢酶1。

单个生物标志物的诊断能力和小组分别分析了三组(表4)。在三个生物标志物中，IDH1检测指标的受试者工作特征曲线面积值(AUC)在建模组、验证组和整个研究组中分别为0.781(95％CI，0.711-0.841)、0.755(95％CI，0.615-0.865)和0.78(95％CI,0.719-0.833)(图2中A、B和C)。然而，建模组中联合诊断模型的受试者工作特征曲线面积值(AUC)为最高即0.835(95％CI，0.770-0.887)，与任何单个诊断标志物相比，差异有统计学意义(p<0.05)。此外，验证组和整个研究组中，联合诊断模型的受试者工作特征曲线面积值(AUC)分别为0.905(95％CI，0.790-0.969)和0.856(95％CI，0.803-0.899)。分析证实，与任何单个生物标志物相比，联合检测模型的诊断价值获得了显著性提高(p<0.05，表6)。

表6不同组别中联合诊断模型与单个指标比较结果

简写：shox2＝人同源矮小盒基因2；ep4＝前列腺素E2受体基因4；idh1＝异柠檬酸脱氢酶1。

在这项研究中，通过选择Youden指数0.534确定诊断的cut-off值0.569。基于此cut-off值，联合诊断模型在建模组和验证组人群中的敏感度分别为86.1％和80.0％。在验证组的特异性高达87.5％；而训练组相对较低为67.3％。此外，在建模组和验证组中，分别有80.0％和82.4％的诊断准确性，表明了其在鉴别肺癌和健康对照中优于任何单一生物标志物的临床优势(表7)。

表7联合诊断模型在建模组及验证组中的诊断能力评估

各诊断指标具体含义如表8所示：

表8诊断实验四格表

1.灵敏度(sensitivity,Sen)也叫敏感度和真阳性率；是衡量待评价诊断方法发现病人的能力，换句话说，是待评价诊断方法是否能从真正的病人中发现病人的能力。结合上面的四格表就是：

灵敏度＝A/(A+C)

2.特异度(specificity,Sep)也叫真阴性率，是衡量待评价诊断方法正确判断为无病者的能力，也就是说，是将没病的人里待评价诊断方法能诊断为无病的比例。根据四格表：

特异度＝D/(B+D)

3.阳性预测值(Positive Predictive Value,PPV)，指待评价诊断方法判断为有病的人中，真正“有病”的例数(真阳性)所占的比例。反映待评价诊断方法结果为阳性者中患病的可能性。根据上面四格表：

阳性预测值＝A/(A+B)

4.阴性预测值(negative predictive value,NPV)，指待评价诊断方法判断为没病的人中，真正未患病的比例。反映待评价诊断方法结果为阴性者中未患病的可能性。根据上面四格表：

阴性预测值＝D/(C+D)

5.诊断准确率(diagnosticaccuracy)，指待评价诊断方法判断为没病的人中，真正未患病患者数量(A)，以及诊断为有病的人群中，真正有病的患者的数量(D)。反映待评价诊断方法结果为阴性者中未患病的可能性。根据上面四格表：

阴性预测值＝(A+D)/N

将全组研究人群根据不同组织学亚型和T分期进行亚组区分，探讨联合诊断模型在不同肺癌病理类型和不同肿瘤大小的诊断能力。首先，根据第8期TNM分期系统，选择肿瘤大小为5cm的患者分为早期(T1-2期)和晚期(T3-4期)亚组。早期肺癌患者中，联合诊断模型显示出了比两个DNA甲基化生物标志物明显更好的性能，受试者工作特征曲线面积值(AUC)为0.832(95％CI，0.771-0.881)(p<0.05，表9)。此外，在肿瘤直径大于5厘米的亚组中，联合诊断模型的AUC为0.967(95％CI，0.909-0.992)明显高于IDH1和PTGER4基因(p<0.0001和p＝0.0038，表9)。与其他两种甲基化生物标志物相比，IDH1在早期肺癌组中具有最高的AUC值(图2中D，表10)。然而，在T3-4期组中，两组入组的甲基化标志物的AUC值均高于0.92(图2中E)，与IDH1相比，具有更加显著的诊断能力(AUC：0.731，95％CI，0.732-0.815，表10)。

此外，我们还评估了联合诊断模型对不同病理类型肺癌的诊断能力。由于在该研究人群中肺腺癌患者的比例高于其他病理亚型(符合现阶段肺癌流行病学病理分布特征)，故将患者分为肺腺癌组和非腺癌型肺癌两组。从表9可以看出，与PTGER4和IDH1相比，联合诊断模型对非腺癌患者的诊断能力(AUC：0.963，95％CI，0.909-0.990)明显更强，p＝0.0034，p<0.0001(图2中F)。肺腺癌组IDH1的AUC值(AUC：0.791，95％CI，0.724-0.847)低于建立的三个指标检测组合(AUC：0.819，95％CI，0.756-0.872)，但不显著(p＝0.2415，图2中G)。在非腺癌患者组中，单个指标间比较结果显示，IDH1对肺鳞癌或者肺小细胞癌患者的鉴别效能明显低于SHOX2基因的DNA甲基化(p＝0.0106，表10)。

表9联合检测模型在不同亚组的诊断效能比较

简写：shox2＝人同源矮小盒基因2；ep4＝前列腺素E2受体基因4；idh1＝异柠檬酸脱氢酶1；*＝无显著性差异。

表10单个检测指标在不同亚组中的诊断效能比较.

简写：shox2＝人同源矮小盒基因2；ep4＝前列腺素E2受体基因4；idh1＝异柠檬酸脱氢酶1^△＝显著性差异。

五、结论

与单个检测指标相比，本发明的研究证实通过联合检测具有分期特异性和病理特异性的生物标志物，所构建的诊断模型的肺癌诊断能力获得显著性的提升。因此，可以通过联合检测血液标志物来提高肺癌的诊断效能。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> 外周血甲基化基因及IDH1联合检测诊断肺癌模型

<130> GNCLN1192265

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ggttttgagt aattaataga aat 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ctctttctat tctctcttc 19

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

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<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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Claims

1.甲基化SHOX2基因、甲基化PTGER4基因和IDH1蛋白组合作为标志物在制备用于诊断或者辅助诊断肺癌的产品中的应用；

在所述应用中，按照如下诊断或者辅助诊断肺癌：检测待测者的SHOX2基因甲基化水平、PTGER4基因甲基化水平和外周血中IDH1蛋白的含量；然后将检测值代入联合检测诊断预测模型，计算诊断模型预测值，当诊断模型预测值≤0.569时，则认为所述待测者不为或候选不为肺癌患者；当模型预测值＞0.569时，则认为所述待测者为或候选为肺癌患者；

所述联合检测诊断预测模型如以下公式所示；

诊断模型预测值= 16.821+0.435×IDH1-0.147×SHOX2-0.28×PTGER4；

2.用于检测SHOX2基因甲基化水平的物质、用于检测PTGER4基因甲基化水平的物质和用于检测IDH1蛋白含量的物质和记载有诊断方法的可读性载体在制备用于诊断或者辅助诊断肺癌的产品中的应用；

所述诊断方法为：检测待测者的SHOX2基因甲基化水平、PTGER4基因甲基化水平和外周血中IDH1蛋白的含量；然后将检测值代入联合检测诊断预测模型，计算诊断模型预测值，当诊断模型预测值≤0.569时，则认为所述待测者不为或候选不为肺癌患者；当模型预测值＞0.569时，则认为所述待测者为或候选为肺癌患者；

所述联合检测诊断预测模型如以下公式所示；

诊断模型预测值= 16.821+0.435×IDH1-0.147×SHOX2-0.28×PTGER4；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述待测者的SHOX2基因的甲基化水平的高低以对所述待测者的SHOX2基因进行甲基化特异性Real-time PCR反应时的Ct值体现；所述待测者的PTGER4基因的甲基化水平的高低以对所述待测者的PTGER4基因进行甲基化特异性Real-time PCR反应时的Ct值体现。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述诊断或者辅助诊断肺癌为诊断或者辅助诊断人类肺癌。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肺癌为肺腺癌或非腺癌。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肺癌为T1-2期肺癌或T3-4期肺癌。

7.用于诊断或者辅助诊断肺癌的系统，包括：

1）用于检测SHOX2基因甲基化水平的试剂和/或仪器；

2）用于检测PTGER4基因甲基化水平的试剂和/或仪器；

3）用于检测IDH1蛋白的试剂和/或仪器；

4）装置，所述装置包括数据输入模块、数据运算模块、数据比较模块和结论输出模块；

所述数据输入模块用于输入1）-3）检测得到的待测者的SHOX2基因甲基化水平、PTGER4基因甲基化水平和外周血中IDH1蛋白含量的检测值；

所述数据运算模块用于将所述检测值代入联合检测诊断预测模型，计算诊断模型预测值；所述联合检测诊断预测模型如以下公式所示；诊断模型预测值=16.821+0.435×IDH1-0.147×SHOX2-0.28×PTGER4；式中，IDH1表示所述待测者的外周血中IDH1蛋白的浓度；SHOX2表示所述待测者的SHOX2基因的甲基化水平；PTGER4表示所述待测者的PTGER4基因的甲基化水平；

所述数据比较模块用于将所述诊断模型预测值与阈值进行比较；所述阈值为0.569；

所述结论输出模块用于输出结论，当所述诊断模型预测值≤0.569时，则输出“所述待测者不为或候选不为肺癌患者”的结论；当所述模型预测值＞0.569时，则输出“所述待测者为或候选为肺癌患者”的结论。

8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述用于检测IDH1蛋白的试剂和/或仪器为能够用于检测IDH1蛋白含量的试剂和/或仪器。

9.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述待测者的SHOX2基因的甲基化水平的高低以对所述待测者的SHOX2基因进行甲基化特异性Real-time PCR反应时的Ct值体现；所述待测者的PTGER4基因的甲基化水平的高低以对所述待测者的PTGER4基因进行甲基化特异性Real-time PCR反应时的Ct值体现。

10.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述诊断或者辅助诊断肺癌为诊断或者辅助诊断人类肺癌。

11.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述肺癌为肺腺癌或非腺癌。

12.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述肺癌为T1-2期肺癌或T3-4期肺癌。