CN112301132A - 一种多基因联合检测癌症的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学相关技术领域，具体涉及一种多基因联合检测癌症的试剂盒及其检测方法。其技术要点如下：包括盒体及盒体内单独存放的试剂，盒体内单独存放的试剂包括：酶切体系、非酶切体系、针对多个基因位点的PCR引物、第一轮PCR扩增混液、第二轮PCR扩增混液、碱性磷酸酶SAP体系和基因甲基化测试剂；其中，PCR引物用oligo设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm等于或高于60℃；基因甲基化测试剂包括：30μL 1mM PFP、5μL Pd@NH2‑SBA‑15、485μL二甲亚砜(DMSO)和485μL缓冲溶液C，终体积为1mL。本发明通过多个基因甲基化水平的测试，提高癌症的检测效率和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学相关技术领域，具体涉及一种多基因联合检测癌症的试剂盒及其检测方法。
背景技术
甲基化是基因组DNA在转录水平上进行调控的一种自然修饰方式，参与基因表达的调控，进而参与细胞的生长发育、逆境胁迫应答等过程。越来越多的研究表明，DNA甲基化异常及DNA甲基化模式的改变与癌症的发生、发展有着密切的关系。DNA甲基化已被作为一种有前景的癌症分子生物标志物，为癌症早期诊断、评估癌症风险、制定治疗方案以及预后判断等方面提供新的启示。有关基因启动子异常甲基化与癌症发生之间的研究，目前主要集中在以下4类基因：抑癌基因(包括Rb、VHL、p16IN K4a、p15INK4b、p14ARF、p73、BRCA1、APC、FHIT、RARB22、RASSF1A)、DNA修复基因(MGMT和hMLH1)、肿瘤分子侵袭转移相关基因(E2cadherin、DAPK、TIMP3)及代谢酶基因(GSTP1)。这些基因涉及细胞间信号转导、细胞周期调控、凋亡、DNA损伤修复及肿瘤的侵袭转移等过程。几乎所有的人类癌症中都存在癌症相关基因的异常甲基化。2001年M.Esteller等人对涵盖了肺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌等15种癌症的600个癌症标本进行分析，发现12个重要的癌症相关基因的启动子在癌组织中发生了甲基化模式的改变，表明每一类型的癌症中都同时存在着多种癌症相关基因的异常甲基化，而且不同部位的癌症组织中，各种基因的甲基化发生频率是不同的，存在着明显的基因-癌症类型相关性。但是现有的癌症检测试剂盒并没有将甲基化水平与癌症检测相结合，致使癌症检测结果精确度低。
鉴于上述现有的检测癌症的试剂盒检测技术中存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种多基因联合检测癌症的试剂盒及其检测方法，选用与特定癌症相关的多个基因进行检测，根据E值大小赋值分类，将癌症样本分为低甲基化样本、中甲基化样本和高甲基化样本，使癌症检测更加精确，有助于分析肿瘤患者预后、预测癌症复发，为肿瘤患者制定治疗计划。经过不断的研究、设计，并经反复试作样品及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种多基因联合检测癌症的试剂盒，选用与特定癌症相关的多个基因同时进行检测，根据甲基化E值大小赋值分类，达到准确、快速检测癌症的目的。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
本发明的作用原理是：由于HpaII限制性内切酶可以识别双链DNA中的5′-CCGG-3′序列，将未甲基化的DNA切断，而不改变甲基化的DNA序列。我们将基因组DNA分为两组：一组用于HpaII酶切，另一组不加HpaII。HpaII组中，非甲基化的基因组DNA被酶切，只有甲基化的基因组DNA可以作为PCR扩增的模板。在扩增过程中，将荧光标记的dNTPs结合到PCR产物上，在PFP存在的条件下，触发有效的FRET，此时得到的FRET比值(I530nm/I425nm)仅代表甲基化基因组DNA的产物量。对于非HpaII组，由于体系内未添加HpaII，非甲基化的基因组DNA不会被酶切，得到的FRET比值(I530nm/I425nm)代表甲基化和非甲基化基因组DNA产物的总量。由此可计算出该基因的甲基化比例，甲基化程度越高，E值越大。
本发明提供的一种多基因联合检测癌症的试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，盒体内单独存放的试剂包括：酶切体系、非酶切体系、针对多个基因位点的PCR引物、第一轮PCR扩增混液、第二轮PCR扩增混液、碱性磷酸酶SAP体系和基因甲基化测试剂；其中，所述PCR引物用oligo设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm等于或高于60℃；
基因甲基化测试剂包括：30μL 1mM PFP、5μL Pd@NH2-SBA-15、485μL二甲亚砜(DMSO)和485μL缓冲溶液C，终体积为1mL。Pd@NH2-SBA-15的加入，具有发光谱带宽、色纯度高、激发态寿命长、吸收激发能量强、转换效率高等优点，进而提高癌症的检测效率和准确度。
进一步的，第一轮PCR扩增混液包括：0.4μM正向引物、0.4μM反向引物、0.6mMMgCl2、50μM dNTPs、1×GoTaq Flexi缓冲液、0.02U GoTaq DNA聚合酶，反应体系用超纯水补足。
进一步的，第二轮PCR扩增混液包括：0.5μM正向引物、0.5μM反向引物、0.6mMMgCl2、4μM dCTP、4μM dATP、3.5μM dTTP、3.5μM dGTP、0.5μM Fl-dGTP、0.5μM Fl-dUTP、1×HotMasterTaq缓冲液、0.025U HotMasterTaq DNA聚合酶，反应体系用超纯水补足。
进一步的，酶切体系包含200ng基因组DNA，1×HPAII缓冲液，10mM MgCl2，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸pH 7.0和1mM二硫苏糖醇，20U HPAII酶，其余体积用超纯水补足。
进一步的，非酶切体系包含200ng基因组DNA，1×HPAII缓冲液10mM MgCl2，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸pH 7.0和1mM二硫苏糖醇，其余体积用超纯水补足。
进一步的，缓冲溶液C是10mM MgCl2，10mM三甲基咪唑-偏磷酸和1mM二硫苏糖醇的混合溶液，其中三甲基咪唑-偏磷酸的pH值是8.0。本发明提供的缓冲溶液C对基因无毒性，且三甲基咪唑-偏磷酸能够通过其咪唑的共轭大π键形成更加均匀的电子云，进而提高荧光的检测效率和精确度。
进一步的，化合物PFP的合成
PFP的具体结构为：
9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴:1,6-二溴己烷(97.6g，400mmol)加入100ml50％的氢氧化钾溶液中，加入1.28g相转移催化剂四丁基溴化铵(TBAB)，反应液温度升至75℃，然后加入2,7-二溴芴(12.96g，40mmol)搅拌15min。反应停止并冷却至室温后，二氯甲烷萃取(100ml×3)，合并有机相，并分别用1M盐酸溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷/石油醚(v/v＝1/9)，得白色固体产物9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴21.4g，产率82％。1H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm)δ:0.58(m,4H),1.08(m,4H),1.21(m,4H),1.66(m,4H),1.91(m,4H),3.29(m,4H),7.43(s,4H),7.53(s,2H)；13C-NMR:(100MHz,CDCl3,ppm)δ:23.53,27.80,29.00,32.67,33.92,40.06,55.06,121.30,126.17,130.38,139.09,152.23.EI(m/z):650(100％)[M+]Anal.Calcd forC25H30Br4(650.15):C,46.14,H,4.614.Found:C,45.95,H,4.61.
氮气保护下，将9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴(260mg，0.4mmol)与2′,2′-二甲基-1′,3′-丙二醇-1,4-苯二硼酸酯(120mg，0.4mmol)加入到6.4mL的THF中，溶解后加入1.6mL碳酸钾溶液(2M)与催化量的钯催化剂PdCl2(dppf)(20mg)，混合液升温至80℃反应2d。反应液冷却至室温后，将THF减压除去，加入氯仿，洗涤两次，将有机相浓缩，滴加到甲醇中沉淀，离心、干燥后得固体产物(115mg，52％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.83(m,6H),7.74-7.62(m,4H),3.30(m,4H),2.10(b,4H),1.81(m,4H),1.39-1.13(m,8H),0.79(b,4H)。
PFP：将上一步得到的固体产物(57mg，0.1mmol)溶解在5mL的二氯甲烷溶液中，加入过量的三甲胺的甲醇溶液，室温反应5h。将反应生成的沉淀过滤、洗涤，干燥后得目标产物(60mg，88％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-6)：δ(ppm)7.91-7.79(m,10H),3.18(b,4H),2.96(b,>15H),2.18-1.91(m,4H),1.47(b,4H),1.09(b,8H),0.67(b,4H)。
进一步的，碱性磷酸酶SAP体系中包含1×SAP缓冲液(10mM MgCl2，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸和1mM二硫苏糖醇的混合溶液，其中三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸的pH值是9.0)、1.5U SAP和12μL第二轮PCR产物，37℃孵育60min，然后85℃孵育30min将SAP酶失活。
本发明的第二个目的是提供一种多基因联合检测癌症的试剂盒的检测方法，具有同样的技术效果。
其技术效果是通过下述技术方案实现的。
本发明提供的一种多基因联合检测癌症的试剂盒的检测方法，包括如下操作步骤：
S1.提取n个与待测癌症样本相关的测试基因，分为A组和B组；
S2.针对测试基因制备PCR引物；
S3.将A组加入到酶切体系中进行酶切，将B组加入到非酶切体系中；
S4.采用PCR引物分别对A组和B组进行第一轮PCR扩增；
S5.分别对A组和B组进行第二轮PCR扩增；
S6.分别对A组和B组消化未反应dNTPs；
S7.对所述步骤S6后的A组和B组进行基于PFP的FRET检测；利用424nm和530nm处的荧光值计算各样品的FRET比值(I530nm/I424nm)，并按照公式1计算各基因启动子区域CCGG位点的甲基化水平E，其中，公
式1为：
其中，FRET比值HpaII代表经过HpaII酶切处理后的基因组DNA中，基因启动子区CCGG位点处I530nm与I424nm的比值；FRET比值non-HpaII代表不经过HpaII酶切处理的基因组DNA中，基因启动子区CCGG位点处I530nm与I424nm的比值；FRET比值Blank代表对照组的I530nm与I424nm的比值；n≥2。
作为上述技术方案的优选，对待测癌症样本基因组中与癌症具有关联性的n个测试基因启动子区CCGG位点的甲基化水平进行测试，得到甲基化水平E值，根据甲基化水平E值对待测癌症样本进行分类和赋值，根据分类赋值判断所述待测癌症样本的甲基化程度，通过所述待测癌症样本的甲基化程度鉴别肿瘤类型。
作为上述技术方案的优选，待测癌症样本是肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、淋巴癌、白血病、膀肤癌、卵巢癌或肾癌中的任意一种的癌细胞或癌组织。
作为上述技术方案的优选，n个测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平分类赋值标准如下：若待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值小于30％，则赋值为1；若待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值在30％-70％之间，则赋值为2；若待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值大于70％，则赋值为3；将一个待测癌症样本中各个基因的赋值相加，得到测评值M；当M<P时，所述待测癌症样本的甲基化水平为低甲基化；当P＜M＜Q时，所述待测癌症样本的甲基化水平为中甲基化；当M>Q时，所述待测癌症样本的甲基化水平为高甲基化；当n为奇数时，P的计算公式是：
Q的计算公式是：Q＝2n+1；当n为偶数时，P的计算公式是：
Q的计算公式是：Q＝2n+1；n为测试基因品种，n≥2。
作为上述技术方案的优选，步骤2中，所选基因的启动子区在正常样本中是低甲基化甚至非甲基化的，癌症样本中是高甲基化的。寻找并确定上述基因中富含HpaII限制性内切酶的酶切位点序列，选择的扩增区域应含有2-5个5′-CCGG-3′位点，而且不能在引物位置。PCR引物用oligo设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm接近或高于60℃。
作为上述技术方案的优选，步骤3中酶切体系37℃孵育12h，然后80℃孵育20min失活HpaII。酶切后的DNA用于PCR扩增或者分装储存在-20℃。
作为上述技术方案的优选，步骤4中，向第一轮PCR扩增混液中加1μL酶切或非酶切DNA，进行PCR循环：95℃、4min热启动，之后进行15个循环，每个循环程序为95℃、60s，62℃、30s，72℃、40s。
作为上技术方案的优选，步骤5中，向第二轮PCR扩增混液中加1μL稀释后的第一轮PCR产物，进行PCR循环：95℃、4min热启动，之后进行25～40个循环，每个循环程序为95℃、30s，62℃、60s，65℃、60s，最后进行65℃、7min延伸。
作为上述技术方案的优选，步骤6中，采用碱性磷酸酶SAP除去未反应的Fl-dGTP、Fl-dUTP和dNTPs，避免其对后续FRET效率影响。酶切体系中包含1×SAP缓冲液、1.5U SAP和12μL第二轮PCR产物，37℃孵育60min，然后85℃孵育30min将SAP酶失活。
作为上述技术方案的优选，步骤7中，采用90μL PFP工作液和10μL SAP消化产物在96孔板中混合。然后将96孔板放入酶标仪中检测，选激发波长为380nm，发射波长424nm和530nm。利用424nm和530nm处的荧光值计算各样品的FRET比值(I530nm/I424nm)计算各基因启动子区域CCGG位点的甲基化水平E。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种多基因联合检测癌症的试剂盒及检测方法，选用与特定癌症相关的多个基因同时进行检测，根据甲基化E值大小赋值分类，达到准确、快速检测癌症的目的。
附图说明
图1为RASSF1A基因低甲基化水平的荧光光谱图；
图2为RASSF1A基因中甲基化水平的荧光光谱图；
图3为RASSF1A基因高甲基化水平的荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例：一种多基因联合检测癌症的试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，盒体内单独存放的试剂包括：酶切体系、非酶切体系、针对多个基因位点的PCR引物、第一轮PCR扩增混液、第二轮PCR扩增混液、碱性磷酸酶SAP体系和基因甲基化测试剂；其中，所述PCR引物用oligo设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm等于或高于60℃；基因甲基化测试剂包括：30μL 1mM PFP、5μL Pd@NH2-SBA-15、485μL二甲亚砜(DMSO)和485μL缓冲溶液C，终体积为1mL。
化合物PFP的合成，PFP的具体结构为：
9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴:1,6-二溴己烷(97.6g，400mmol)加入100ml50％的氢氧化钾溶液中，加入1.28g相转移催化剂四丁基溴化铵(TBAB)，反应液温度升至75℃，然后加入2,7-二溴芴(12.96g，40mmol)搅拌15min。反应停止并冷却至室温后，二氯甲烷萃取(100ml×3)，合并有机相，并分别用1M盐酸溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷/石油醚(v/v＝1/9)，得白色固体产物9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴21.4g，产率82％。1H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm)δ:0.58(m,4H),1.08(m,4H),1.21(m,4H),1.66(m,4H),1.91(m,4H),3.29(m,4H),7.43(s,4H),7.53(s,2H)；13C-NMR:(100MHz,CDCl3,ppm)δ:23.53,27.80,29.00,32.67,33.92,40.06,55.06,121.30,126.17,130.38,139.09,152.23.EI(m/z):650(100％)[M+]Anal.Calcd forC25H30Br4(650.15):C,46.14,H,4.614.Found:C,45.95,H,4.61.
氮气保护下，将9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴(260mg，0.4mmol)与2′,2′-二甲基-1′,3′-丙二醇-1,4-苯二硼酸酯(120mg，0.4mmol)加入到6.4mL的THF中，溶解后加入1.6mL碳酸钾溶液(2M)与催化量的钯催化剂PdCl2(dppf)(20mg)，混合液升温至80℃反应2d。反应液冷却至室温后，将THF减压除去，加入氯仿，洗涤两次，将有机相浓缩，滴加到甲醇中沉淀，离心、干燥后得固体产物(115mg，52％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.83(m,6H),7.74-7.62(m,4H),3.30(m,4H),2.10(b,4H),1.81(m,4H),1.39-1.13(m,8H),0.79(b,4H)。
PFP：将上一步得到的固体产物(57mg，0.1mmol)溶解在5mL的二氯甲烷溶液中，加入过量的三甲胺的甲醇溶液，室温反应5h。将反应生成的沉淀过滤、洗涤，干燥后得目标产物(60mg，88％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-6):δ(ppm)7.91-7.79(m,10H),3.18(b,4H),2.96(b,>15H),2.18-1.91(m,4H),1.47(b,4H),1.09(b,8H),0.67(b,4H)。
一种多基因联合检测癌症的试剂盒的检测方法，以肺癌为例，包括如下操作步骤：
S1.候选基因的选择和引物设计：候选基因的启动子区应该在正常样本中是低甲基化甚至非甲基化的，癌症样本中是高甲基化的。最终选定与肺癌相关的甲基化发生频率较高的以下四个基因，RASSF1A、TMEFF2、p16和APC，其中，
APC；GenBank accession number NM_001127511
TMEFF2；GenBank accession number NM_016192
P16；GenBank accession number NM_058195
RASSF1A；GenBank accession number NM_170712.3；寻找并确定上述基因中富含HpaII限制性内切酶的酶切位点序列，选择的扩增区域应含有2-5个5′-CCGG-3′位点，而且不能在引物位置。PCR引物用oligo设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm接近或高于60℃，引物序列见表1。
表1为肺癌相关基因PCR扩增所需引物序列
| Gene | 正向引物(5′-3′) | 反向引物(5′-3′) |
| RASSF1A | GGAGGCGCTGAAGTCGG | GCCCAGCGGGTGCCA |
| APC | GACAGAACAGCGAAGCAGTG | AGGTGGGAAGACTACAATGC |
| TMEFF2 | GTTAGACCTTCTCTCGTCGC | GAAAGGCTCCTCTGCATACG |
| p16 | TCCTTCCTTGCCAACGCT | GCCCCTCCTCTTTCTTCCTC |
S2.组织样品和基因组DNA的制备：收集2011年8月至2012年7月在中国医学科学院肿瘤医院治疗的原发性非小细胞肺癌患者159例。所有样本的获取均已获得知情同意。选取肿瘤含量合适(30％以上)的代表性肿瘤块在10％中性缓冲福尔马林中固定24-48小时，石蜡包埋。福尔马林固定和石蜡包埋的组织样本用QIAamp基因提取试剂盒提取。DNA浓度用NanoDrop光度计根据260nm处的吸光度定量。组织学诊断由两名病理学家例行诊断和复查。临床病理参数在病历中得到。
S3.DNA酶切：选用可以识别5′-CCGG-3′回文序列的HpaII限制性内切酶区别甲基化和非甲基化DNA。将上述获得的基因组DNA平分成A组和B组，A组用于HpaII酶切，B组作为对照不加HpaII。酶切体系包含200ng基因组DNA，1×HPAII缓冲液(10mM MgCl2，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH 7.0)和1mM二硫苏糖醇)，20U HPAII酶，其余体积用超纯水补足。非酶切体系包含200ng基因组DNA，1×HPAII缓冲液(10mM MgCl2，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH 7.0)和1mM二硫苏糖醇)，其余体积用超纯水补足。上述反应体系37℃孵育12h，然后80℃孵育20min失活HpaII。酶切后的DNA用于PCR扩增或者分装储存在-20℃。
S4.第一轮PCR扩增：用表1中各基因的PCR引物分别对上述A组和B组的基因组DNA进行第一轮PCR扩增。PCR扩增混液包含0.4μM正向引物、0.4μM反向引物、0.6mM MgCl2、50μMdNTPs、1×GoTaq Flexi缓冲液、0.02U GoTaqDNA聚合酶，反应体系用超纯水补足。向混液中加1μL A组或B组的DNA，进行PCR循环：95℃、4min热启动，之后进行15个循环，每个循环程序为95℃、60s，62℃、30s，72℃、40s。
S5.第二轮PCR扩增：第二轮PCR扩增是为了使各基因的PCR产物带有荧光标记，便于后续FRET检测。扩增混液包含0.5μM正向引物、0.5μM反向引物、0.6mM MgCl2、4μM dCTP、4μM dATP、3.5μM dTTP、3.5μM dGTP、0.5μM Fl-dGTP、0.5μM Fl-dUTP、1×HotMasterTaq缓冲液、0.025U HotMasterTaq DNA聚合酶，反应体系用超纯水补足。向上述混液中加1μL稀释后的第一轮PCR产物，进行PCR循环：95℃、4min热启动，之后进行33(RASSF1A和APC)或35(p16和TMEFF2)个循环，每个循环程序为95℃、30s，62℃、60s，65℃、60s，最后进行65℃、7min延伸。
S6.消化未反应dNTPs：采用碱性磷酸酶SAP除去未反应的Fl-dGTP、Fl-dUTP和dNTPs，避免其对后续FRET效率影响。酶切体系中包含1×SAP缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH 9.0)，5mM MgCl2)、1.5U SAP和12μL第二轮PCR产物，37℃孵育60min，然后85℃孵育30min将SAP酶失活。
S7.基于PFP进行FRET检测：阳离子共轭聚合物选用PFP，其工作液的配置如下：30μL 1mM PFP、5μL Pd@NH2-SBA-15、485μL二甲亚砜(DMSO)、485μL缓冲液(10mM MgCl2，10mM三甲基咪唑-偏磷酸和1mM二硫苏糖醇的混合溶液，其中三甲基咪唑-偏磷酸的pH值是8.0，终体积1mL)，90μL PFP工作液和10μL SAP消化产物在96孔板中混合。然后将96孔板放入酶标仪中检测，选激发波长为380nm，发射波长424nm和530nm。利用424nm和530nm处的荧光值计算各样品的FRET比值(I530 nm/I424 nm)，并按照公式1计算各基因启动子区域CCGG位点的甲基化水平E。
公式1为：
其中，FRET比值HpaII代表经过HpaII酶切处理后的基因组DNA中，基因启动子区CCGG位点处I530nm与I424nm的比值；FRET比值non-HpaII代表不经过HpaII酶切处理的基因组DNA中，基因启动子区CCGG位点处I530nm与I424nm的比值；FRET比值Blank代表对照组的I530nm与I424nm的比值；甲基化水平分类赋值标准如下：若待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值小于30％，则赋值为1；若待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值在30％-70％之间，则赋值为2；若待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值大于70％，则赋值为3；将一个待测癌症样本中各个基因的赋值相加，得到测评值M；当M<P时，所述待测癌症样本的甲基化水平为低甲基化；当P＜M＜Q时，所述待测癌症样本的甲基化水平为中甲基化；当M>Q时，所述待测癌症样本的甲基化水平为高甲基化；当n为奇数时，P的计算公式是：
Q的计算公式是：Q＝2n+1；当n为偶数时，P的计算公式是：
Q的计算公式是：Q＝2n+1；n为测试基因品种，n≥2；将所得肺癌样本中各基因甲基化比例分为三类：第一类为E值小于30％，为低甲基化，赋值为1，以RASSF1A基因低甲基化水平的荧光光谱图为例，如图1所示，计算所得甲基化水平值为22.21％；第二类为E值大于30％但小于70％，为中甲基化，赋值为2，以RASSF1A基因中甲基化水平的荧光光谱图如图2所示，计算所得甲基化水平值为55.79％；第三类为E值大于70％，为高甲基化，赋值为3，以RASSF1A基因高甲基化水平的荧光光谱图如图3所示，计算所得甲基化水平值为95.76％。
多基因DNA甲基化联合分析法对肺癌样本分析：
首先分析DNA甲基化与肿瘤分化程度之间的关系。159例肺癌标本中分化程度高的有14例，分化程度中等的73例，分化程度较差的72例。分别对所测159个肺癌样本中四个基因的甲基化水平赋值相加，若加和低于6，则此肺癌样本为低甲基化(L)；若加和在6和9之间，则此肺癌样本为中甲基化(M)；若加和高于9，则此肺癌样本为高甲基化(L)。利用SPSS软件(IBM SPSS Statistics 22)将分类后的肺癌样本与分化程度进行分析，结果见表2，当用四种基因联合分析时，甲基化状态与肿瘤分化程度之间的差异有统计学意义(p＝0.020)。在高分化和中度分化中，甲基化频率随甲基化水平的增加而降低。分化程度越低，甲基化程度越高。这些结果说明，通过多个基因的联合测试能够获得更加准确的结果。
表2为联合检测模式下的分化程度与甲基化水平的相关性分析
为进一步验证肺癌患者甲基化状态与临床病理特征的关系，我们分析了肺癌患者的性别、年龄、吸烟情况、肿瘤淋巴转移等因素与甲基化情况之间的关系，结果见表3。甲基化频率与性别、年龄无显著差异。将50岁以下的肺癌患者和50岁以上的肺癌患者分成两组。我们可以发现无论甲基化水平低、中等或高，大多数患者年龄都超过50岁(甲基化频率≥72.0％)。基于吸烟年限，我们检测吸烟是否影响肺癌患者DNA甲基化状态。那些缺乏吸烟数据的患者被排除在外。吸烟年限分为吸烟年限不超过30年和吸烟年限超过30年两组。不同甲基化水平肺癌患者的吸烟年限长短的出现频率虽无显著差异，但仍有一定的趋势。吸烟年限超过30年的肺癌患者甲基频率水平明显高于吸烟年限少于30年的肺癌患者。而对于淋巴转移，淋巴有转移的肺癌患者的甲基化频率明显高于无转移患者，但差异不显著。这些结果显示本发明提供的肺癌检测方法的检测准确度高于现有技术。
表3为肺癌患者的性别、年龄、吸烟情况、肿瘤淋巴转移等因素与甲基化水平的相关性分析
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种多基因联合检测癌症的试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征在于，所述盒体内单独存放的试剂包括：酶切体系、非酶切体系、针对多个基因位点的PCR引物、第一轮PCR扩增混液、第二轮PCR扩增混液、碱性磷酸酶SAP体系和基因甲基化测试剂；其中，所述PCR引物用oligo设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm等于或高于60℃；
所述基因甲基化测试剂包括：30μL 1mM PFP、5μL Pd@NH2-SBA-15、485μL二甲亚砜(DMSO)和485μL缓冲溶液C，终体积为1mL。
2.根据权利要求1所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒，其特征在于，所述第一轮PCR扩增混液包括：0.4μM正向引物、0.4μM反向引物、0.6mM MgCl2、50μM dNTPs、1×GoTaqFlexi缓冲液、0.02U GoTaqDNA聚合酶，反应体系总体积为20μL余量用超纯水补足。
3.根据权利要求2所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒，其特征在于，所述第二轮PCR扩增混液包括：0.5μM正向引物、0.5μM反向引物、0.6mM MgCl2、4μM dCTP、4μM dATP、3.5μM dTTP、3.5μM dGTP、0.5μM Fl-dGTP、0.5μM Fl-dUTP、1×HotMasterTaq缓冲液、0.025UHotMasterTaq DNA聚合酶，反应体系总体积为20μL余量用超纯水补足。
4.根据权利要求1或2所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒，其特征在于，所述酶切体系包含200ng基因组DNA，1×HPAII缓冲液，10mM MgCl2，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸pH 7.0和1mM二硫苏糖醇，20U HPAII酶，，反应体系总体积为20μL，余量用超纯水补足。
5.根据权利要求4所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒，其特征在于，所述非酶切体系包含200ng基因组DNA，1×HPAII缓冲液10mM MgCl2，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸pH7.0和1mM二硫苏糖醇，，反应体系总体积为20μL余量用超纯水补足。
6.根据权利要求1所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液C是10mM MgCl2，10mM三甲基咪唑-偏磷酸和1mM二硫苏糖醇的混合溶液，其中三甲基咪唑-偏磷酸的pH值是8.0。
7.一种多基因联合检测癌症的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
S1.提取n个与待测癌症样本相关的测试基因，每个待测癌症样本基因均分为A组和B组；
S2.针对所述测试基因制备PCR引物；
S3.将A组加入到酶切体系中进行酶切，将B组加入到非酶切体系中；
S4.采用所述PCR引物分别对A组和B组进行第一轮PCR扩增；
S5.分别对A组和B组进行第二轮PCR扩增；
S6.分别对A组和B组消化未反应dNTPs；
S7.对所述步骤S6后的A组和B组进行基于PFP的FRET检测；利用424nm和530nm处的荧光值计算各样品的FRET比值(I530nm/I424nm)，并按照公式1计算各基因启动子区域CCGG位点的甲基化水平E，其中，公式1为：
其中，FRET比值HpaII代表经过HpaII酶切处理后的基因组DNA中，基因启动子区CCGG位点处I530nm与I424nm的比值；FRET比值non-HpaII代表不经过HpaII酶切处理的基因组DNA中，基因启动子区CCGG位点处I530nm与I424nm的比值；FRET比值Blank代表对照组的I530nm与I424nm的比值；n≥2。
8.根据权利要求7所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒的检测方法，其特征在于，对待测癌症样本基因组中与癌症具有关联性的n个测试基因启动子区CCGG位点的甲基化水平进行测试，得到甲基化水平E值，根据所述甲基化水平E值对待测癌症样本进行分类和赋值，根据所述分类赋值判断所述待测癌症样本的甲基化程度，通过所述待测癌症样本的甲基化程度鉴别肿瘤类型。
9.根据权利要求1所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述待测癌症样本是肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、淋巴癌、白血病、膀肤癌、卵巢癌或肾癌中的任意一种的癌细胞或癌组织。
10.根据权利要求7所述的一种多基因联合检测癌症的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述n个测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平分类赋值标准如下：若所述待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值小于30％，则赋值为1；若所述待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值在30％-70％之间，则赋值为2；若所述待测癌症样本的测试基因启动子区CCGG位点甲基化水平E值大于70％，则赋值为3；将一个所述待测癌症样本中各个基因的赋值相加，得到测评值M；当M<P时，所述待测癌症样本的甲基化水平为低甲基化；当P＜M＜Q时，所述待测癌症样本的甲基化水平为中甲基化；当M>Q时，所述待测癌症样本的甲基化水平为高甲基化；当n为奇数时，P的计算公式是：
Q的计算公式是：Q＝2n+1；当n为偶数时，P的计算公式是：
Q的计算公式是：Q＝2n+1；n为所述测试基因品种，n≥2。
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