CN116377062B - 检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子诊断技术领域，公开检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。本发明研究得到一个在胃癌组织中显著高表达的环状RNA hsa_circ_0033144，通过对hsa_circ_0033144的定量分析，能显著区分胃癌患者和健康人、胃癌早期患者和健康人以及胃癌患者和胃癌前病变患者，hsa_circ_0033144作为胃癌诊断生物标志物具有较高的灵敏度和特异度。本发明还提供环状RNA hsa_circ_0033144诊断系统，结合hsa_circ_0033144定量检测和分析，能够更加准确直观的输出诊断结果，方便快捷，对早期诊断胃癌患者、尽早进行有效的治疗和改善预后具有重大意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域。更具体地，涉及检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。
背景技术
分子诊断技术是以分子生物学如DNA、RNA和蛋白质等为材料，用分子生物学技术检测患者体内遗传物质结构或表达水平的变化而做出诊断，主要用于遗传病、传染性疾病、肿瘤等疾病的检测与诊断。分子诊断技术是体外诊断市场中增长最快的部分，因为它是唯一能够对疾病进行早期诊断、预防、定制治疗方案的体外诊断方法。对于癌症的防治具有重要意义。胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略。由于胃癌早期症状不明显，且多数患者缺乏普查意识，往往出现严重症状才到医院就诊，而此时多已是中晚期胃癌，即使对其进行了以手术治疗为主，放化疗为辅的综合治疗，患者的预后仍然较差。因此，早期筛查和发现胃癌是提高胃癌预后的重要手段。
癌症的早期检测和治疗能显著提高癌症患者的存活率。目前对于早期筛查和发现胃癌的诊断方法主要是进行问卷筛查和高危人群的胃镜检查。其中，进行问卷筛查容易造成漏诊而胃镜检查可以进行活体的病理学检查，其诊断可靠、安全性高，但检查结果的准确性很依赖于内镜科医生的经验，还存在有创、费用较高的问题。目前体液如血液、尿液、粪便提取物等在内的生物样本中的特异性癌症相关标记物的鉴定为癌症的早期诊断提供了更多方法，对早期治疗和改善预后有重大意义。
然而，对于许多癌症，可利用的标记物具有较低的灵敏度和特异度。例如，临床上现有的肿瘤标记物CA19-9、CA724和癌胚抗原(CEA)的灵敏度较低，对胃肿瘤的检测出率最高才达50％，所以很容易出现漏诊，丧失了治疗时机，而这些标记物还存在对非胃癌患者诊断出假阳性的可能，导致误诊。因此，开发新的诊断标志物用于胃癌患者的早期诊断是十分重要的，如现有技术公开了一种能够用于胃癌诊断的环状RNA分子标志物hsa_circ_0074362，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行胃癌诊断，但该标志物的灵敏度还有待提升。因此，研究和开发出更多的能用于胃癌诊断的分子标记物，对及时早期筛查和发现胃癌具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有分子标记物灵敏度低的缺陷和不足，提供检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。
本发明的目的是提供检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌产品中的应用。
本发明另一目的是提供一种诊断胃癌的产品。
本发明又一目的是提供一种环状RNA hsa_circ_0033144诊断系统。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究得到一个在胃癌血清外泌体中显著高表达的环状RNA hsa_circ_0033144，其cDNA序列如依次如SEQ ID NO：1所示，通过对hsa_circ_0033144的定量分析，能显著区分胃癌患者和健康人、胃癌早期患者和健康人以及胃癌患者和胃癌前病变患者；hsa_circ_0033144作为胃癌诊断生物标志物具有较高的灵敏度和特异度，还提高了通过胃癌患者血清标本进行诊断的准确性。
因此，环状RNA hsa_circ_0033144的以下应用均在本发明的保护范围内：
检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。
检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备检测胃癌和胃癌前病变试剂中的应用。
检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备用于区分胃癌早期患者和健康人的产品中的应用。进一步地，所述胃癌早期具体指胃癌病理分期为I或者II期患者。
优选地，上述试剂为检测环状RNA hsa_circ_0033144表达水平的引物对，所述引物对的序列依次如ID NO.2～3所示。
本发明提供一种诊断胃癌的产品，所述产品含有用于检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂，通过检测样本中环状RNA hsa_circ_0033144的表达水平来诊断胃癌或区分胃癌早期患者和健康人或胃癌患者和胃癌前病变患者。
优选地，所述产品为试剂盒。
优选地，所述样本为血清外泌体。
优选地，所述试剂为实时荧光定量检测试剂，所述试剂包含荧光定量PCR所需试剂，该试剂中含用于检测样本中环状RNA hsa_circ_0033144的引物，所述引物序列依次如ID NO.2～3所示。
优选地，所述试剂包括2×GoTaq qPCR Master Mix和无酶水。
优选地，所述试剂盒的使用方法中，PCR反应程序为：95℃10min；95℃15sec，60℃，1min，重复循环50次；40℃，30s；4℃保存。
本发明还提供一种环状RNA hsa_circ_0033144诊断系统或诊断模型，包括如下模块：
S1样本hsa_circ_0033144检测模块，S2数据收集与存储模块，S3数据处理模块，S4结果输出显示模块；
具体每个模块的作用如下：
S1.样本hsa_circ_0033144检测模块：该模块通对样本中hsa_circ_0033144表达量进行检测，得到hsa_circ_0033144表达量值；
S2.数据收集与存储模块：该模块用于收集与存储样本的数据信息，将S1中表达量值传输给S3数据处理模块；
S3.数据分析处理模块：该模块用于对数据进行分析处理，通过单因素逻辑回归建模，模型计算公式logit P＝-0.52378+1.16659*has_circ_0033144(has_circ_0033144指S1模块中hsa_circ_0033144表达量值)，计算得logit P值，绘制ROC曲线，取截断值，结合判定标准将最终结果数据传输给S4结果输出模块；
该模块的判定标准为：当诊断胃癌时，取最佳截断值为0.444，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为健康；
当诊断早期胃癌时，取截断值为0.444，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为I/II期胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为健康；
当诊断胃癌前病变时，取最佳截断值为0.445，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变；
S4.结果输出显示模块：用于输出显示S3模块给出的诊断结果。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供环状RNA hsa_circ_0033144及其检测试剂在制备诊断胃癌产品中的应用。本发明通过circRNA分子的筛选、鉴定、验证及诊断模型的构建，得到一个在胃癌组织中显著高表达的环状RNA hsa_circ_0033144，其cDNA序列如依次如SEQ ID NO：1所示，通过对hsa_circ_0033144的定量分析，能显著区分胃癌患者和健康人、胃癌I/II期患者和健康人以及胃癌患者和胃癌前病变患者，可通过检测血清外泌体中环状RNA hsa_circ_0033144的表达量来对胃癌进行诊断。本发明提供的hsa_circ_0033144作为胃癌诊断生物标志物具有较高的灵敏度和特异度，提高了血清标本诊断的准确性。本发明还提供一种环状RNAhsa_circ_0033144模型诊断系统，结合hsa_circ_0033144定量检测和分析，能够更加准确直观地输出诊断结果，方便快捷，对诊断胃癌患者、尽早进行有效的治疗和改善预后具有重大意义。
附图说明
图1为胃癌患者和健康人血清外泌体中hsa_circ_0033144表达量(T为胃癌患者样本，N为健康人样本)。
图2为胃癌组织和癌旁组织中hsa_circ_0033144表达量对比(T为胃癌组织样本，N为癌旁组织样本)。
图3为诊断模型在建模集、内部测试集和外部测试集的ROC曲线及模型在建模集的最佳cut-off(其中Modeling set表示建模集，Internal testing set表示内部测试集，External testing set表示外部测试集，AUC表示曲线下面积)。
图4为诊断模型区分I/II期胃癌和健康人的效能结果图。
图5为诊断模型区分胃癌和胃癌前病变的效能结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中采用的除外部测试队列外，健康人、胃癌患者、胃癌前病变患者的血清样本，和胃癌患者的肿瘤组织、癌旁组织均来自于中山大学肿瘤防治中心。外部测试队列中的胃癌患者和健康人的血清样本来自中山大学附属第六医院。
实施例1胃癌分子标记物的筛选
(1)选取20例健康人、37例胃癌患者的血清样本，和20例胃癌患者的肿瘤组织、癌旁组织(本实施例采用的胃癌组织均经过病理鉴定)，采用血清外泌体抽提试剂盒(厂家：锐博生物，货号：C10110-2)提取血清样本的外泌体后，采用TRIzolTM试剂(厂家：ThermoFisher；货号：15596018；)提取血清外泌体样本和组织样本RNA，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit(厂家：TAKARA；货号：RR037A)将RNA逆转录成cDNA，逆转录条件为：37℃，15min；85℃，5sec；4℃，∞，逆转录体系见下表：
注：*1：Random 6mers适用于反转录circRNA；
*2：用于反转录血清外泌体RNA时每10μL体系需额外再加入0.1ngλpolyA；
*3：反应体系可按需求相应放大，10μL反应体系可最大使用500ng的Total RNA；
(2)将步骤(1)提取的样本RNA通过RNA-seq的高深度测序方法检测其表达，鉴定已有以及新发现的circRNA，筛选在胃癌患者血清外泌体中相比健康人血清外泌体中高表达的circRNA，以及胃癌肿瘤组织比癌旁组织高表达的circRNA，取两种高表达的circRNA的交集，得到候选的circRNA标记物；
(3)根据步骤(2)候选得到的circRNA标记物，设计其相应的特异性荧光定量PCR引物；
(4)另外再选取36例胃癌血清和作为对照的健康人血清，以及24例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织，使用Random 6mers引物对提取的血清外泌体RNA和组织RNA进行逆转录，得到cDNA(方法同步骤(1))；采用步骤(3)的特异性引物，通过荧光定量PCR的方法，对步骤(2)中筛选出的circRNA进行验证，进一步筛选出胃癌血清外泌体和胃癌组织一致性升高的circRNA分子。
其中，荧光定量PCR使用Promega的荧光定量PCR的试剂盒(qPCR MasterMix，货号：A6001)，定量PCR反应检测体系为10μL，反应体系如下表所示：
荧光定量PCR扩增反应体系程序为：将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于95℃预加热10min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持15秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(60℃)，保持1min，使引物与模板充分退火并延伸，完成一个循环。重复循环50次。再在40℃，保持30秒进行冷却；最后，在4℃保存。
最终筛选得到has_circ_0033144在胃癌血清外泌体和胃癌组织中表达量一致性升高，其序列如SEQ ID.1所示，has_circ_0033144的详细信息如表1所示。
SEQ ID.1：CTGCAATGTTCTCCTGCTTGGGACAGATGCCTTTCGTGGGTGAGAGC AGGTGGTCATCTTCGTCGGGGGTGACTTGGATCCCGATCTCCACCGGCTCGGACACTTTCCTGAGCTCGGAGCGTGAGGAGGGTGGCGGGCTGTCCTTGTCCAGGGCCTTGTCATAGCAGGCACCCAAGCTGCCGCCACACTGCTTCCTTTTGTGCTCTATAAAAACCAGGATGTCCCCCAAGGGGAAGTTCATTTGACACTGGCCACAGGTGAGCAGGTCAGGGTCGGGGCCACCCACCATCAGCCCCAGGCCACTTGGCTCCTCTATCTCCAGACCCTCGTCTTCTTCGAGGATGGCGGCCTCCACATGGTCAGCCTCTG。
表1circRNA分子hsa_circ_0033144的信息表
用于检测hsa_circ_0033144的引物如下所示：
Forward(SEQ ID NO：2)：GAACATTGCAGCAGAGGCTGA；
Reverse(SEQ ID NO：3)：GTCCCCCAAGGGGAAGTTCA。
综上，本发明筛选鉴定得到1个环状RNA组成的分子标签hsa_circ_0033144，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，该circRNA分子同时在胃癌患者血清外泌体以及胃癌肿瘤组织中高表达。
实施例2hsa_circ_0033144的表达水平分析
基于实施例1中鉴定得到的hsa_circ_0033144进行验证分析，取36例胃癌患者血清样本和36例健康人血清样品，以及24例胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织(与实施例1中步骤(4)为相同样本，本例所有的胃癌取材来源的病人均经过病理鉴定确诊为胃癌，癌旁组织为距离肿瘤边缘5cm以上的正常组织)，采用血清外泌体抽提试剂盒提取上述样本的外泌体，再用TRIzol试剂提取外泌体中的RNA，用定量反转录试剂盒qPCR Master Mix将RNA逆转录成cDNA，进行实时荧光PCR定量检测hsa_circ_0033144的表达量，其中，定量检测的引物如SEQ ID NO：2～3所示，检测体系和反应程序同实施例1。
定量检测结果显示，在胃癌患者血清外泌体中hsa_circ_0033144的表达量是显著高于健康人的，如图1所示。且在胃癌组织中hsa_circ_0033144的表达量比癌旁组织高，如图2所示。
实施例3胃癌血清分子标记物的模型的建立与诊断分析
1、分子标记物的建模
从中山大学肿瘤防治中心收集522例胃癌患者和460例健康人的血清样本按照7：3的比例分为建模队列和内部测试队列，从中山大学附属第六医院收集153例胃癌和103例正常人的血清样本作为外部测试队列。检测这三个队列样本外泌体中hsa_circ_0033144的表达量，数据分别生成三个数据集，分别是建模集、内部测试集、外部测试集。
在建模集采用单因素逻辑回归的方法构建模型，模型的公式为logit P＝-0.52378+1.16659*hsa_circ_0033144(hsa_circ_0033144表示样本中hsa_circ_0033144表达量值)。
2、综合诊断模型的诊断效能
模型在选取不同的截断值(cut-off)时判断样本是胃癌或者健康人的灵敏度和特异度不同。因此，根据在不同cut-off时模型的灵敏度和特异度绘制出ROC曲线，如图3所示，模型在建模集、内部测试集、外部测试集的ROC曲线下面积AUC分别为0.83、0.87和0.672。此外，模型的最佳截断值(best cut-off，此时模型判断样本的灵敏度和特异度之和最大)为0.444，在此条件下，模型的灵敏度为69.3％，特异度为84.2％。
具体地，判断样本的过程为：将样本的hsa_circ_0033144表达量代入公式计算得到logit P值，该值与cut-off对比，当logit P大于cut-off时，判定样本为胃癌；当logit P小于cut-off时，判定样本为健康。
综上，血清外泌体分子标记物hsa_circ_0033144可用于胃癌的诊断，提高胃癌诊断的简便性和准确性，对患者的进一步诊治具有重大意义。
实施例4hsa_circ_0033144在胃癌诊断中的应用
选取实施例1中采用的根据胃癌AJCC第8版pTNM分期确定为胃癌I、II期的患者(病例数分别为47和141)以及全部健康人样本，提取血清外泌体中的RNA，并逆转录成cDNA；再利用hsa_circ_0033144的引物(SEQ ID NO：2～3)对样本cDNA进行荧光定量PCR扩增反应(方法步骤同实施例1)，再根据实施例3构建的模型公式计算logit P值，判断样本为I/II期胃癌还是健康人。
结果如图4所示，用hsa_circ_0033144对样本进行判断，ROC曲线下面积为0.842，选取0.444为cut-off值，样本logit P值大于0.444时判定为I/II期胃癌，样本logit P值小于0.444时判定为健康人，此时诊断的灵敏度为71.6％，特异度为85.2％。因此，has_circ_0033144模型能区分I/II期的胃癌患者和健康人，有助于胃癌的早期诊断。
另外选取144例胃癌患者和73例胃癌前病变(precancerous lesions in thestomach，PLS)患者的血清样本(本研究病例中胃癌前病变包括胃溃疡、肠上皮化生、胃息肉、慢性萎缩性胃炎、非典型增生，这些诊断均为美国消化内镜委员会于2015年发表的《胃镜检查在胃的恶性前和恶性状态管理中的作用》定义的胃癌前病变)，提取样本外泌体中的RNA，逆转录成cDNA，进行荧光定量PCR扩增反应，测出hsa_circ_0033144分子的表达量(方法同实施例1)，再根据模型公式计算logit P值，根据logit P值与截断值的对比，判断样本为胃癌还是胃癌前病变。
结果如图5所示，模型在本批样本的ROC曲线下面积AUC为0.614，模型在本批样本的最佳截断值为0.445，在此条件下，样本logit P值大于0.445时判定为胃癌，样本logit P值小于0.445时判定为胃癌前病变，此时诊断的灵敏度为81.6％，特异度为54.8％。因此，本发明构建的has_circ_0033144模型能区分胃癌患者和胃癌前病变患者，有助于胃癌的诊断。
实施例5环状RNA hsa_circ_0033144在制备诊断胃癌产品中的应用
本发明提供一种检测hsa_circ_0033144的试剂盒，能够应用于胃癌体外诊断(包括胃癌的早期诊断)，试剂盒中含有用于检测环状RNA hsa_circ_0033144表达水平的荧光定量PCR引物(SEQ ID NO：2～3)和荧光定量PCR反应所需试剂。
荧光定量PCR反应的扩增程序为：在PCR仪上于95℃预加热10min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持15秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(60℃)，保持1min，使引物与模板充分退火并延伸，完成一个循环，重复循环50次；在40℃保持40秒冷却，最后，在4℃保存。其反应体系如下表所示：
具体地，上述试剂盒的使用方法为：
S1.提取样本血清外泌体中的RNA，逆转录成cDNA；
S2.利用hsa_circ_0033144的检测引物(SEQ ID NO：2～3)S1的样本cDNA进行荧光定量PCR扩增反应，根据荧光定量PCR结果测得hsa_circ_0033144分子的表达量，再根据模型公式logit P＝-0.52378+1.16659*hsa_circ_0033144(hsa_circ_0033144表示样本中该circRNA的表达量)进一步判断样本为胃癌还是健康人、或判断样本为胃癌早期(I/II期胃癌)还是健康人、或判断样本为胃癌还是胃癌前病变。
本实施例还提供一种环状RNA hsa_circ_0033144诊断系统或诊断模型，包括如下模块：
S1样本hsa_circ_0033144检测模块，S2数据收集与存储模块，S3数据处理模块，S4结果输出显示模块；
具体每个模块的作用如下：
S1.样本hsa_circ_0033144检测模块：该模块对样本中hsa_circ_0033144表达量进行检测，得到hsa_circ_0033144表达量值；
S2.数据收集与存储模块：该模块用于收集与存储样本的数据信息，将S1中表达量值传输给S3数据处理模块；
S3.数据分析处理模块：该模块用于对接收的数据进行分析处理，通过单因素逻辑回归建模，模型计算公式logit P＝-0.52378+1.16659*has_circ_0033144(has_circ_0033144指S1模块中hsa_circ_0033144表达量值)，计算得logit P值，取不同的截断值(cut-off)时，模型判断样本的灵敏度和特异度会变化，根据不同截断值时模型的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，结合判定标准将最终结果数据传输给S4结果输出模块；
该模块的判定标准为：
当诊断胃癌时，取最佳截断值为0.444，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为健康；
当诊断胃癌I/II患者或健康人时，取截断值为0.444，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为I/II期胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为健康；
当诊断胃癌或胃癌前病变时，取最佳截断值为0.445，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变；
S4.结果输出显示模块：用于输出显示S3模块给出的诊断结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.定量检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为血清外泌体。
2.定量检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备检测胃癌和胃癌前病变试剂中的应用，其特征在于，所述试剂的检测样本为血清外泌体。
3.定量检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备用于区分胃癌早期患者和健康人的产品中的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为血清外泌体。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述胃癌早期具体指胃癌病理分期为I或者II期患者。
5.一种环状RNA hsa_circ_0033144诊断系统，其特征在于，包括如下模块：
S1样本hsa_circ_0033144检测模块，S2数据收集与存储模块，S3数据处理模块，S4结果输出显示模块；
具体每个模块的作用如下：
S1.样本hsa_circ_0033144检测模块：该模块采用荧光定量PCR方法，对样本中hsa_circ_0033144相对表达量进行检测，得到hsa_circ_0033144表达量值；检测样本为血清外泌体；
S2.数据收集与存储模块：该模块用于收集与存储样本的数据信息，将S1中表达量值传输给S3数据处理模块；
S3.数据分析处理模块：该模块用于对数据进行分析处理，通过单因素逻辑回归建模，模型计算公式为logit P＝-0.52378+1.16659*has_circ_0033144，has_circ_0033144指S1模块中hsa_circ_0033144表达量值，计算得logit P值，绘制ROC曲线，取截断值，结合判定标准将最终结果数据传输给S4结果输出模块；
该模块的判定标准为：当诊断胃癌时，取最佳截断值为0.444，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为健康；
当诊断早期胃癌时，取截断值为0.444，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为胃癌I/II期；若logit P值低于截断值，则诊断结果为健康；
当诊断胃癌前病变时，取最佳截断值为0 .445，计算所得logit P值高于截断值，则诊断结果为胃癌；若logit P值低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变；
S4.结果输出显示模块：用于输出显示S3模块给出的诊断结果。
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