KR20220009970A - 위암 진단용 마이크로rna 마커 조합 및 진단 키트 - Google Patents

위암 진단용 마이크로rna 마커 조합 및 진단 키트 Download PDF

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KR20220009970A
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루이양 쩌우
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머크시즈 랩 피티이.엘티디.
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Abstract

본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 위암 진단용 miRNA 마커 조합 및 키트가 개시된다. 위암 진단용 miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 4개의 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p. 위암 진단용 마커 조합은 혈액 위암 환자의 혈청과 건강한 사람의 혈청을 구별하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 진단 키트는 쉽고, 효과적이며 비침습적으로 위암을 진단할 수 있다.

Description

위암 진단용 마이크로RNA 마커 조합 및 진단 키트
본 출원은 2019년 4월 30일에 중국 특허청에 제출된, 발명의 명칭이 "위암 진단용 miRNA 마커 조합 및 키트"인 특허 번호 201910392316.2의 중국 특허 출원의 우선권을 주장하며, 상기 특허 전체 내용은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 분자 생물학의 분야이며, 구체적으로 위암 진단용 miRNA 마커 조합 및 키트에 관한 것이다.
위암은 세계에서 가장 흔한 악성 종양 중 하나이며 사망률이 가장 높은 악성 종양 중 하나이다. 대부분의 위암 환자는 진단을 받았을 때 최적의 진단 및 치료 시기를 놓쳐, 질병 진행, 종양 전이, 심지어는 말기까지 진행된다. 위암의 TMN 병기 관점에서, 위암의 5년 생존률은 1기의 조기 단계에 97.6%, 1기의 말기 단계에 94.9%, 2기에 70.49%, 3기의 조기 단계에 56.7%, 3기의 말기 단계에 31.9%, 및 4기에 6.5%이다. 조기 위암의 진단이 필요한 것을 알 수 있다.
내시경 (위내시경)은 현재 위암 진단에 가장 유리한 도구이다. 조기 위암의 내시경 소견으로는 비정상적인 점막색, 점막 표면의 혈관 소실, 점막층의 돌출부의 함몰 또는 비후, 불규칙한 결절, 궤양 주변의 비정상적인 점막 주름 등이 있다. 필요한 경우, 생검을 위해 조직 일부가 절단될 수 있다. 혈액 내 단백질 마커의 검출이 위암의 진단을 위한 기준으로서 사용될 수 있다. 위암에 대해 일반적으로 사용되는 종양 단백질 마커는 다음을 포함한다: 예를 들어, 암배아 항원 (CEA), 탄수화물 항원 19-9 (CA19-9), 탄수화물 항원 72-4 (CA72-4) 및 탄수화물 항원 50 (CA50) 및 위장 프로테아제, 등.
내시경 후 생검은 위암 검출에 대한 최적 표준(gold standard)이다. 그러나, 이러한 방법은 침습적이며 환자에게 불편함과 두려움을 유발할 수 있다. 또한, 무증상 환자는 일반적으로 내시경 검사를 받지 않는다. 종래의 종양 단백질 마커가 위장관암 검출에 자주 사용되지만, 민감도 및/또는 특이도가 부족하여 위암 진단에는 권장되지 않는다.
현재, 조직, 혈청 또는 혈장에서의 miRNA 종양 마커의 검출이 위암 진단에 대한 기준으로서 사용된다. miRNA는 약 19-24 nt의 길이의 작은 비-코딩 단일 가닥 RNA 분자의 클래스이다. 대부분의 miRNA는 표적 유전자의 3'UTR 영역과 상보적으로 결합하고, 표적 유전자가 단백질로 번역되는 것을 억제하여, 세포, 조직 또는 개체 수준에서 유기체의 성장 및 발달에 영향을 미치고, 다양한 질병 과정에 참여할 수 있다. miRNA의 발현 프로파일은 명백한 조직 특이성을 가지며, 상이한 종양에서 특이적 발현 패턴을 가진다. 이러한 특성으로, miRNA가 종양 진단을 위한 새로운 생물학적 마커 및 치료적 표적이 될 수 있다. qPCR은 공지된 miRNA의 발현을 검출하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법으로, 빠르고 간단하며 재현성이 있으며, 매우 민감하고 정확한 방법으로 miRNA의 발현을 정량적으로 분석할 수 있고, 임상 응용 분야에서 가장 중요한 방법이다. 이는 종양에 대한 비침습적 진단 마커로서, 순환하는 miRNA에 대한 신뢰할 수 있는 기술적 보증을 제공한다.
기존의 연구에서 위암의 조기 진단을 위한 많은 유망한 혈청 miRNA가 발견되었지만, 이러한 결과는 일관되지 않으며 상호 검증될 수 없다. 그 이유는 다양한 연구들 사이에서 샘플의 선택, 수집 및 보존 과정이 일관되지 않기 때문이다. 상이한 방법을 사용하여 분리 및 저장된 말초 혈액 샘플 내 바이오마커의 함량은 다양할 것이다. 개인 간의 체액 환경, 유전 및 기타 비암성 요인은 miRNA의 발현에 영향을 미치며, 이러한 영향을 제거하기 위해서는 많은 수의 집단 샘플이 필요하다. 게다가, miRNA의 검출에는 특정 어려움이 존재한다. 그러므로, 위암 검진에 궁극적으로 사용될 수 있는 혈청 miRNA 바이오마커 및 바이오마커 조합은 아직 제대로 확정되지 않았다.
이러한 관점에서, 본 발명의 목적은 위암 환자의 혈청과 건강한 사람의 혈청을 구별하고, 위암 환자의 혈청과 위염 환자의 혈청을 구별하여, 위암을 쉽고, 효과적이며 비침습적으로 검출할 수 있는, 조기 위암 진단용 마커의 조합 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음의 기술적 해결책을 채택한다:
본 출원인은 RT-qPCR 기술을 사용하여 위암 검출을 위한 바이오마커 및 조합으로서 12개의 miRNA를 선별하고 수득하였으며, 이는 구체적으로 hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR- 126-3p, hsa-miR-183-5p, 및 hsa-miR-340-5p이다. 본 발명에 따른 miRNA 마커 조합을 사용하여 4566명의 피험자에서 테스트한다. 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 테스트 및 펩시노겐(pepsinogen) 테스트와 비교한 결과, 내시경의 임상 최적 표준과 잘 일치하며 (AUC가 0.84), 펩시노겐 I/II 비율 및 헬리코박터 파일로리 테스트의 기존의 두 바이오마커보다 각각 훨씬 더 우수하다 (AUC가 0.62 및 0.64).
위암 진단용 miRNA 마커의 조합은, 다음으로부터 선택된 적어도 4개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 5개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 6개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 7개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 8개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 9개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 10개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 11개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 말초 혈액 샘플에서 위암 진단용 miRNA 마커 조합은 다음을 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 12개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 11개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 10개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 9개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 8개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 7개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 6개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 5개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, miRNA 마커 조합은 다음의 4개의 miRNA 마커로 구성된다: hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p 및 hsa-miR-340-5p.
본 발명은 또한 위암으로 고통받을 위험에 있는 피험자를 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a. 피험자의 말초 혈액 샘플에서, 다음으로부터 선택된 적어도 4개의 miRNA 마커의 발현 수준을 검출하는 단계: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p,
b. 기준으로서 비-암 대조군 샘플과 피험자의 위험 점수를 계산 및 보정하는 단계, 및
c. 위험 점수에 기초하여 피험자가 위암으로 고통받을 가능성을 결정하는 단계.
일부 구현예에서, miRNA 발현 수준의 결정 방법은 정량적 RT-PCR (예를 들어, SYBR-Green 또는 Tagman 기반 화학적 방법 사용), 칩(chip) 또는 시퀀싱의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 바이오마커는 바이오마커는 노던 블롯(Northern blot), 액적 디지털 PCR(droplet digital PCR), 질량 분광법, 전기화학발광, 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 검출될 수 있다.
방법의 일부 구현예에서, 선형 회귀 모델을 사용하여 위험 점수를 계산한다.
방법의 일부 구현예에서, 사용되는 선형 회귀 모델은 로지스틱 회귀이다.
방법의 일부 구현예에서, 선형 회귀 모델은 다음과 같다:
Figure pct00001
여기서 miRNA1, miRNA2, miRNA3... hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p으로부터 선택되고;
CT는 qPCR에 의해 검출된 각 miRNA의 상대적인 발현 수준이고;
K는 miRNA 마커의 계수이다.
본 발명은 또한 위암 진단용 키트를 제공하며, 이러한 키트는 miRNA 마커 조합을 특이적으로 검출하기 위한 시약을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트 내 시약은 qPCR 방법을 위한 검출 시약, 칩 방법을 위한 검출 시약 또는 시퀀싱 방법을 위한 검출 시약이다.
일부 구현예에서, 키트 내 miRNA 마커 조합을 특이적으로 검출하기 위한 시약은 includes 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드의 적어도 일부가 위암 진단용 상기 언급된 말초 혈액 miRNA 마커 조합의 miRNA 마커에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트 내 miRNA 마커 조합을 특이적으로 검출하기 위한 시약은 qPCR 방법을 위한 검출 시약이다.
추가적으로, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트에 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 miRNA 마커 조합의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다.
추가적으로, 일부 구현예에서, 키트는 위암 진단용 상기 언급된 말초 혈액 miRNA 마커 조합에 스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머 및/또는 miRNA 마커를 증혹시키기 위한 반중첩(semi-nested) qPCR 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 12개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 11개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 10개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 9개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 8개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 7개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 6개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 5개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p 및 hsa-miR-340-5p.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트의 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 다음의 4개의 miRNA 마커로 구성된 miRNA 마커 조합 내 각각의 miRNA의 역전사 프라이머 및/또는 qPCR 증폭 프라이머를 포함한다: hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p 및 hsa-miR-340-5p.
추가적으로, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트에서 qPCR 방법을 위한 검출 시약은 양성 품질 관리 제품, 음성 품질 관리 제품, 역전사효소, dNTP, 역전사 완충액, 뉴클레아제 미함유수(nuclease-free water), qPCR 완충액, 마그네슘 클로라이드, DNA 폴리머라제, 및 SYBR Green 형광 염료 중 적어도 하나를 추가적으로 포함한다.
본 발명은 또한 다음의 방법에 의해 피험자가 위암이 발병하거나 위암에 걸릴 가능성을 예측하기 위한 위암 진단 시약의 제조에 miRNA 마커 조합의 사용을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
피험자로부터 획득한 말초 혈액 샘플에서 miRNA 존재를 검출하는 단계;
말초 혈액 샘플에서 miRNA 마커 조합 중 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
이전에 측정된 miRNA의 발현 수준에 기초하여 점수를 사용하여 피험자가 위암이 발병하거나 걸릴 가능성을 예측하는 단계.
말초 혈액은 혈청 또는 혈장이다.
miRNA의 발현 수준은 선형 회귀 알고리즘을 사용하여 단순 선형 회귀 모델을 구성하여 점수를 매긴다. 선형 회귀 모델을 사용하여 위험 점수를 계산한다. 로지스틱 회귀는 상기 목적을 위해 사용될 수 있는 선형 회귀 방법 중 하나의 예시이다. 그러나, 임의의 관련 당업자라면 다른 형태의 선형 회귀 계산을 사용하여 점수를 계산하고 획득할 수 있음을 이해할 것이다. 위험 점수의 임계값은 임상적 필요에 따라 결정되며, 두개의 임계값을 사용하여 집단을 고위험 집단, 저위험 집단 및 불확실한 집단으로 정의한다.
피험자로는 중국인, 말레이시아인, 및 인도인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 기술적 해결책으로부터 본 발명이 위암 진단용 마커 조합 및 키트를 제공하는 것을 알 수 있다. 본 발명에 따른 위암 진단용 miRNA 마커 조합은 다음으로부터 선택된 적어도 4개의 miRNA 마커를 포함한다: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p. 위암 진단용 마커 조합을 사용하여 피험자 내 혈청의 검출은 위암 환자의 혈청과 건강한 사람의 혈청을 구별하고, 위암 환자의 혈청과 위염 환자의 혈청을 구별할 수 있다. 상기 언급된 본 발명에 따른 miRNA 마커 조합을 사용하여 피험자를 테스트한다. 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 테스트 및 펩시노겐(pepsinogen) 테스트와 비교한 결과, 내시경의 임상 최적 표준과 잘 일치하며, 펩시노겐 I/II 비율 및 헬리코박터 파일로리 테스트의 기존의 두 바이오마커보다 각각 훨씬 더 우수하다. 본 발명에 따른 위암 진단용 키트는 단순 조성을 가지며, 위암 단순하고, 효과적이며 비침습적으로 위암을 검출할 수 있다.
본 발명의 구현예 또는 선행 기술의 기술적 방안을 보다 명확하게 설명하기 위하여, 이하에서는 구현예 또는 선행 기술의 설명에 사용되어야 하는 도면을 간략하게 소개한다.
도 1은 위암에서 혈청 miRNA의 임상 검증을 위한 로드맵을 도시하고;
도 2는 상이한 혈액 마커의 ROC 특성을 도시하는 다이어그램이고;
도 3은 남성 및 여성의 ROC 특성을 도시하는 다이어그램이고;
도 4는 상기 키트에서 상이한 인종의 피험자의 ROC 특성을 나타내는 다이어그램이고;
도 5는 상기 키트에서 조기 위암 및 말기 위암인 피험자의 ROC 특성을 나타내는 다이어그램이고;
도 6은 선형 회귀 알고리즘 하에서 서로 다른 miRNA 개수를 가지는 조합의 ROC 특성을 나타내는 다이어그램이다
본 발명은 위암 진단용 miRNA 마커 조합 및 키트를 개시한다. 당업자는 본 명세서의 내용을 배우고 본 발명을 달성하기 위해 공정 파마리터를 적절하게 개선할 수 있다. 특히, 모든 유사한 치환 및 변형은 당업자에게 자명하며, 모두 본 발명에 포함되는 것으로 간주됨을 지적하여야 한다. 본 발명의 방법 및 생성물은 바람직한 구현예를 통해 기재되어 있다. 당업자는 본 발명의 기술을 구현하고 적용하기 위해 본 발명의 내용, 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 본 명세서에 기재된 방법을 변경하거나 적절하게 변경 및 조합할 수 있는 것은 자명하다.
본 발명을 보다 잘 이해하기 위하여, 본 발명의 실시예와 함께 본 발명의 실시예에 나타난 기술적 방안을 명확하고 완전하게 설명한다. 명백하게, 기재된 실시예는 본 발명의 모든 실시예가 아니라 일부 실시예이다. 본 발명의 실시예에 기초하여, 창의적인 작업 없이 당업자에 의해 수득된 다른 모든 실시예는 본 발명의 보호 범위 내에 속할 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시예에 속하는 시약은 모두 상업적으로 입수 가능한 제품이며, 모두 상업적인 경로를 통해 구입할 수 있다. 본 발명에 따른 miRNA의 역전사 프라이머 및 RT-qPCR 프라이머의 설계 방법은 미국 특허 US9850527B2 및 [Wan G, Lim Q', Too H P.의 High-performance quantification of mature microRNAs by real-time RT -PCR using deoxyuridine-incorporated oligonucleotides and hemi-nested primers [J]. Rna-a Publication of the Rna Society, 2010, 16(7):1436-45]에 기재된 방법에 따라 수행된다. 본 발명에 개시된 모든 miRNA 서열은 miRBase 데이터베이스에 저장되어 있다 (http://www.mirbase. org/).
실시예 2
개발 단계에서, RT-qPCR 기술을 사용하여 236명의 위암 환자 및 236명의 비-암 대조군 피험자의 혈청 miRNA를 검출하였다. 191개의 miRNA (발현 수준 ≥500 카피/ml)가 90% 초과의 피험자에서 검출될 수 있으며; 191 개 중 75개의 miRNA가 대조군 그룹과 암 환자 사이에서 상이하게 발현되었다 (FDR P 값 <0.01). 75개의 상이하게 발현된 miRNA 가운데, 51개는 위암 환자에서 상향 조절되었으며 24개는 하향 조절되었다.
검증 단계에서는, RT-qPCR 기술을 사용하여 94명의 위암 환자 및 116명의 비-암 대조군 피험자의 혈청 miRNA를 검출하였다. 개발 단계와 검증 단계에 대한 miRNA 발현의 배수 변화 사이에는 좋은 상관관계가 있었다. 마지막으로, 위암 검출용 바이오마커 및 조합으로서 12개의 miRNA, 구체적으로 hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p, 및 hsa-miR-340-5p를 추가적으로 선택하였다. 각 miRNA 서열 및 miRBase 데이터베이스 등록 번호가 표 1에 나타난다.
표 1 12 miRNA 서열 및 miRBase 데이터베이스 등록 번호
miRNA 등록 번호 서열 (5'→3')
hsa-miR-29c-3p MIMAT0000681 UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA
hsa-miR-424-5p MIMAT0001341 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA
hsa-miR-103a-3p MIMAT0000101 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA
hsa-miR-93-5p MIMAT0000093 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG
hsa-miR-181a-5p MIMAT0000256 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU
hsa-miR-21-5p MIMAT0000076 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
hsa-miR-140-5p MIMAT0000431 CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG
hsa-miR-30e-5p MIMAT0000692 UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG
hsa-miR-142-5p MIMAT0000433 CAUAAAGUAGAAAGCACUACU
hsa-miR-126-3p MIMAT0000445 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG
hsa-miR-183-5p MIMAT0000261 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU
hsa-miR-340-5p MIMAT0004692 UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU
스크리닝에서 얻은 12개의 miRNA 바이오마커와 비모수적 요인의 조합에 대해 200회의 이중 교차 검증을 수행하여 2~12개의 miRNA의 바이오마커 조합의 성능을 테스트하였다. 단순 선형 회귀 모델을 구성하기 위해 AUC를 최적화 지표로 사용하였다. 선형 회귀 모델을 사용하여 위험 점수를 계산하였다. 상기 실시예에서, 로지스틱 회귀 모델을 사용하였다. 위험 점수의 임계값은 임상적 필요에 따라 결정하였으며, 두개의 임계값을 사용하여 집단을 고위험 집단, 저위험 집단 및 불확실한 집단으로 정의하였다. 위암 집단의 로지스틱 점수는 건강한 집단의 점수보다 훨씬 더 높았다.선형 회귀 모델에 대한 계신식은 다음과 같고:
Figure pct00002
여기서, K는 각 miRNA 마커의 계수이고, 각 마커의 계수는 마커의 상이한 조합에 대해 상이하며, 가능한 구현은 표 2에 나와 있다.
CT는 각 miRNA 마커의 상대적인 발현 수준, 즉, qPCR에 의해 수득된 Ct 값이다.
표 2 서로 다른 마커 조합에서 각 miRNA 마커의 계수
Figure pct00003
실시예 2
1) 테스트 샘플의 제조: 혈액 수집 및 혈청 분리;
두개의 일반 혈청 테스트 튜브에 전체 20ml의 공복 혈액 샘플을 수집하였다. 20 ℃에서 10 분간 혈청 테스트 튜브를 3000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 및 혈청 수집을 혈액 수집 후 4 시간 이내에 수행하였다. 혈청 샘플을 즉시 -80 ℃에서 저장하였다.
2) RNA 추출;
혈청/혈장 miRNA 추출 키트 (Qiagen GmbH, 독일)를 사용하여 200 μL의 혈청으로부터 전체 RNA를 단리하였다. RNA 추출 전, 인공적으로 합성된 3개의 miRNA 대조군 (고, 중, 저농도로 혼입) 세트를 샘플 용해 완충액에 추가하여, 상기 과정의 기술적 차이점을 모니터링하고 표준화하였다.
3) 역전사 실시간 정량적 PCR (RT-qPCR)
역전사 완충액, 역전사효소 및 역전사 프라이머를 특정 반응 조건 및 온도하에서 miRNA의 역전사에 사용하였다.
역전사 생성물 (cDNA)을 특정 반응 조건 및 온도하에서 qPCR 완충액, DNA 폴리머라제 및 miRNA 서열-특이적 프라이머를 함유하는 qPCR 플레이트를 사용하여 qPCR에 의해 증폭시켰다. 임계값을 설정하여 각 miRNA의 Ct 값을 획득하였다.
RT-qPCR 전, 인공적으로 합성된 miRNA (3) 대조군을 각각의 샘플에 첨가하여 상기 과정의 기술적 차이점을 모니터링하고 표준화하였다. RT-qPCR 동안, 각 miRNA에 6개의 대수 희석 및 인공 합성 템플릿, 음성 대조군 및 혼합 인간 혈청 RNA 기준 물질을 첨가하고, 각각의 단리된 혈청 RNA 샘플을 qPCR에 의해 역전사하고 정량화하였다. 이러한 품질 관리 조치는 RT, cDNA 증폭 및 qPCR 동안 피펫팅 및 측정 효율성의 기술적 차이를 모니터링하고 표준화하는데 도움이 되었다.
4) 검증 단계에서 12-miRNA를 검출하는 프로토콜 (실시예 3)
혈청 샘플을 페놀/구아니딘으로 용해시키고, 혈청 샘플 중 전체 RNA를 실리카 정제 컬럼으로 분리하였다. 역전사 단계에서, miRNA 역전사를 위한 해당 스템-루프 프라이머를 사용하여 각각의 샘플 내 12개의 miRNA를 cDNA으로 역전사하였다. 그 후에, 서열-특이적 정방향 PCR 프라이머 및 반중첩 서열-특이적 역방향 PCR 프라이머을 사용하여 qPCR을 수행하고, 검출하기 위해 SYBR 녹색 I 염료를 사용하였다.
5) 실시예 1에 기재된 선형 회귀 모델에 Ct 값을 불러와 통계적 분석을 수행하여 위암 발병 위험 값을 구하였다.
실시예 3
임상 테스트를 위해 싱가포르 국립 대학 병원 및 싱가포르의 탄톡셍 병원(Tan Tock Seng Hospital)으로부터 5282 명의 피험자를 선별하였다. 구체적인 검증 경로가 도 1에 도시되어 있다. 총 5282명의 피험자가 임상 검증에 들어갔다. 실시예 2에 기재된 방법에 따라, 실시예 1에 기재된 12개의 miRNA 바이오마커를 모든 피험자에 대한 miRNA 테스트, 헬리코박터 파일로리 테스트 및 펩시노겐 테스트, 뿐만 아니라 위내시경 및 병리학 테스트를 위해 선별하였다. 12-miR qPCR 분석은 ISO13485 의료 기기 품질 관리 시스템에 따라 개발 및 제작되었다. 내시경 및 조직병리학적 테스트 결과가 없는 상황에서, miRNA 테스트를 CAP/ISO 인증 실험실에서 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 혈청 샘플에서 헬리코박터 파일로리 항체를 결정하였다. 라텍스 응집 탁도 면역분석 키트를 사용하여 펩시노겐 I 및 II의 수준을 결정하였다. 두 결정 모두 임상 결과가 알려지지 않았을 때 수행하였다. 스크리닝 후, 4566명의 피험자를 최종적으로 데이터 분석에 사용하였으며, 125 명의 피험자를 위암으로 진단하였고, 4441 명의 피험자를 암이 걸리지 않은 건강한 사람으로 확인하였다. 표 3은 4566 명의 피험자의 임상 특성 테이터의 분석 결과를 도시한다.
표 3 4566 명의 피험자의 임상 특성 테이터의 분석.
Figure pct00004
본 발명에 따른 miRNA 마커 조합 테스트 방법, 헬리코박터 파일로리 테스트 및 펩시노겐 테스트를 비교하였으며, 결과가 도 2 및 표 4에 나와 있다.
표 4 상이한 혈액 마커의 AUC 결과
혈액 마커 AUC
본 발명에 따른 miRNA 마커 조합 테스트 0.84
PG12-펩시노겐 I/II 비율 0.62
HP-헬리코박터 파일로리 0.64
4566 명의 피험자의 결과로부터 본 발명에 따른 miRNA 마커 조합 테스트 방법이 내시경의 임상 최적 표준과 잘 일치하며 (AUC가 0.84), 펩시노겐 I/II 비율 및 헬리코박터 파일로리 테스트의 기존의 두 바이오마커보다 각각 훨씬 더 우수함을 알 수 있다 (AUC가 0.62 및 0.64). 4566 명 피험자의 AUC (0.84)는 알고리즘 개발 코호트의 AUC (0.89)에 근접하였으며, 이는 본 발명에 따른 miRNA 마커 조합을 위한 개발 코호트와 블라인드 테스트를 위한 임상 검증 코호트 사이의 실험 결과의 일관성을 입증하였다.임상 검증 데이터에서 성별 차이를 추가적으로 분석하였다. 본 발명에 따른 miRNA 마커 조합 테스트는 남성 및 여성 피험자에서 일치하는 AUC를 나타냈다 (도 3 and 표 5).
표 5 남성 및 여성 피험자의 AUC 결과
혈액 마커 AUC
전체 피험자 0.84
남성 피험자 0.85
여성 피험자 0.84
임상 검증 데이터를 추가적으로 분석하여 상이한 인종 집단에 대해 본 발명에 따른 miRNA 마커 조합 테스트의 성능이 상이한지 여부를 확인하였다. 일반적으로 싱가포르의 인구통계학적 데이터와 일치하여, 임상 시험에 참여하는 대부분의 피험자는 중국인 (76.43%), 및 말레이시아인, 인도인 및 기타 인종 그룹은약 8%를 차지한다 (표 3). 결과는 중국인 피험자의 AUC가 다른 인종보다 더 높은 것을 나타냈다 (도 4, 표 6).
표 6 상이한 인종의 피험자의 AUC 결과
혈액 마커 AUC
전체 피험자 0.84
중국인 피험자 0.86
다른 인종의 피험자 0.79
본 발명에 따른 miRNA 마커 조합 테스트의 성능을 암 병기에 의해 추가적으로 평가하였다. 본 발명에 따른 miRNA 마커 조합 테스트에서 조기 (단계 0, 1 및 2 기) 및 진행성 (3 및 4 기) 암의 AUC는 각각 0.83 및 0.85인 것을 나타냈다 (도 5, 표 7).
표 7 조기 위암 및 진행성 위암 피험자의 AUC 결과
혈액 마커 AUC
전체 피험자 0.84
조기 위암 피험자 0.83
진행성 위암 피험자 0.85
또한, 폐암, 유방암, 대장암, 간암, 식도암, 전립선암 및 방광암을 비롯한 7 가지 다른 일반암에 대한 miRNA 검출의 임상적 특이도가 입증되었다. 이러한 분석은 위장관암을 비롯한 다른 일반암과 교차 반응성을 거의 가지지 않았다 (표 8).
표 8 다른 일반암과 교차 반응성 테스트
# 암 유형 테스트 샘플 수 고위험 점수를 가지는 표본의 수
1 식도암 12 1
2 간암 6 1
3 대장암 12 3
4 폐암 12 1
5 유방암 12 0
6 전립선암 12 0
7 방광암 12 0
전체 78 6
실시예 4실시예 2에 기재된 방법에 따라, 실시예 1에 기재된 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 및 4개의 miRNA 조합을 miRNA의 중요한 순서에 따라 순차적으로 선별하고 실시예 3에 기재된 암 및 대조군 피험자 샘플을 사용하여 테스트하여 ROC 특성을 나타내는 다이어그램을 획득하였다 (도 6, 표 9).
표 9 로지스틱 알고리즘하에서 상이한 miRNA 수의 조합의 파라미터
Figure pct00005
Figure pct00006
로지스틱 알고리즘은 상이한 진단 성능을 나타냈으며, 상이한 점수가 암과 비-암사이의 구분선으로 사용되었을 때 상이한 진단 접근법에 적합하였음에 주목해야 한다 (표 8). 예를 들어, 40 점의 구분선이 사용되었을 때, 즉, 40 점 이상의 환자가 암 환자로 정의될 때, 50 점의 구분선보다 민감도가 훨씬 더 높고, 특이도 및 정확도는 50 점의 구분선보다 훨씬 더 낮다. 그러므로, 낮은 로지스틱 구분선이 집단에서 위암 스크리닝에 적합하였고, 높은 로지스틱 구분선은 보조 진단에 적합하였다.
논의
miRNA가 암 및 기타 질병을 진단하기 위한 마커로 사용될 수 있음을 증명하는 많은 문헌이 있지만, 특정 질병에 대한 특정 miRNA 발현 프로파일에 대한 의견 일치는 없다. 진단 또는 예후 마커로서 miRNA를 사용하면 특정 문제에 직면할 수 있다 (Tiberio et al, 2015). 동일한 질병에 대해서도, 상이한 연구에서 스크리닝된 miRNA 마커는 매우 상이할 수 있다 (Leidner et al, 2013). 연구 피험자 선별의 일관성 부족으로 인해, 종래 문헌의 샘플 수집, 가공 단계, 및 검출 방법은 진단 또는 예후에 대한 miRNA 바이오마커에 대한 최적이 아닌 선택을 야기할 수 있다. 또한, 상기 문헌의 대부분의 연구 결과는 대규모 연구 코호트에서 검증되지 않았다.
피험자의 건강 및 치료 조건 뿐만 아니라 환경 및 유전적 요인은 모두 miRNA 발현 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. miRNA 분석이 단일 연구 코호트 또는 동일한 위치의 샘플만을 기반으로 하는 경우 결과에 편향이 발생할 수 있다. 따라서 대규모 집단에 적용할 수 있는 miRNA 마커를 스크리닝하기 위해서는 충분히 많은 집단에서 샘플을 채취하고 잘 설계되고 제어 가능한 데이터 분석 작업 흐름(workflow)을 설계해야 한다. 본 발명은 현재 선별된 12개의 miRNA 바이오마커를 완전히 검증했으며, 이러한 검증은 상이한 연구 위치로부터 상이한 환자 코호트에서 수행된다. 초기 개발 단계로부터 시작하여, miRNA 바이오마커는 상이한 코호트에서 스크리닝 및 검증된다. 선별된 12개의 miRNA를 이후 5282 명의 피험자를 포함하는 대규모 전향적 임상 연구에서 추가적으로 검증하였다. 다수의 독립적인 연구 코호트로부터의 다수의 피험자에서 스크리닝 및 검증된 12 개 miRNA는 바이오마커로서 완건성(robustness)을 보장하며 위암의 위험에 있는 피험자를 식별하기 위해 광범위한 집단에 적용될 수 있다.
miRNA 프로파일은 또한 샘플 수집, 가공 단계, 및 샘플에서 miRNA 발현 수준 검출 방법과 같은 기술적인 측면에서 영향을 받을 수 있다. miRNA 발현의 변화를 검출하기 위한 민감도 및 특이도는 상이한 검출 방법으로 인해 크게 다를 수 있다. 대부분의 출판된 연구에서, 샘플 수집 및 처리 방법은 상당히 다를 수 있다. 또한, 연구에서 사용되는 시약 및 방법에도 차이가 있다. 본 명세서의 반중첩 프라이머는 [Wan et al, 2010]의 원리에 기반하여 매우 민감하고 특이적인 RT-qPCR 방법과 최적화된 miRNA 발현 프로파일 및 데이터 분석 작업흐름을 채택하도록 설계되며, 내부 기준은 miRNA 추출, 역전사, qPCR 및 다른 단계의 효율성 차이를 모니터링 및 제어하는데 사용된다. 또한, 5282명의 피험자에서의 임상 검증 연구는 의학적 진단 테스트의 임상 검증보다 더욱 까다로운 방법을 채택한다 (Wilson et al, 2008; Mattocks et al, 2010). 테스트 키트는 임상 연구에서 일반적이지 않은 엄격한 품질 관리 요구 사항에 따라 생산 및 실행된다. 본 발명에 따른 기술적 방법은 위암의 위험을 식별하기 위해 사용되는 12개의 miRNA 마커의 효율성 및 완건성을 추가적으로 보장한다.
5282 명의 피험자가 참여한 12개의 miRNA 바이오마커를 검증하기 위한 전향적 연구에서, 상기 피험자는 헬리코박터 파일로리, 펩시노겐 I/II 테스트, 및 위내시경과 같은 위암과 관련된 다른 위험 인자에 대해서도 또한 테스트한다. 그 결과 12-miRNA 조합의 검출이 위암 환자를 식별하는 측면에서 위암의 고위험 인자, 예컨대 헬리코박터 파일로리 및 펩시노겐 I/II에 대한 일부 종래의 임상 테스트보다 현저히 우수함을 보여준다. 4-miRNA 그룹은, 펩시노겐 1/2 테스트 (AUC=0.62) 및 헬리코박터 파일로리 (AUC=0.64)와 비교하여, 더 근접한 AUC를 가졌다. 5개 이상 miRNA를 가지는 miRNA 조합은 위암의 진단에 대해 더욱 우수한 AUC를 가진다 (5-miRNA 그룹의 AUC는 0.8029이고, 12-miRNA 그룹의 AUC는 0.8423). 5 개 이상의 miRNA로 구성된 miRNA 검출의 AUC는 위암 진단에 대해 현재 최적 표준이 되는 위내시경의 AUC에 매우 근접하다 (AUC는 0.84).
위암의 위험에 있는 것으로 결정된 피험자는 추가적인 검사, 예를 들어 위내시경, 생검, 또는 진단 영상 검사, 예컨대 자기 공명 영상 (MRI) 또는 컴퓨터 단층촬영 (CT)가 필요할 수 있다. 위암으로 진단된 환자는 적절한 치료를 받을 것이다. 위암의 치료는 일반적으로 다음의 중재 중 하나 이상을 포함한다: 수술, 방사선 요법, 화학 요법 또는 면역 요법, 또는 표적 요법 예컨대 트라스트주맙(trastuzumab) 및 라무시루맙(ramucirumab)의 사용. 위암 치료를 위한 잠재적인 약물로는 소분자, 항체, 백신, 또는 펩타이드를 포함한다. 위암 치료를 위한 화학요법제로는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 도세탁셀(docetaxel), 에피루비신(epirubicin), 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 트리플루리딘(trifluridine), 티피라실(tipiracil) 등울 포함한다. 위암 치료를 위한 면역요법제로는 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 펨브롤리주맙(pembrolizumab)을 포함한다. 조기 위암에 대한 치료 옵션은 일반적으로 수술이다. 조기에 발견된 암의 경우, 내시경 절제가 또한 가능하다. 일반적으로 조기 위암 환자에서 치료 효과가 진행성 위암 환자에서의 효과보다 훨씬 더 우수한 것으로 여겨진다 (Lello et al, 2007). 따라서, 위암 환자의 조기 진단에 있어 신뢰할 수 있고 사용하기 쉬운 검출 방법이 매우 중요하다.
그러므로, 본 발명은 12 개 miRNA 바이오마커로의 조합으로 대규모 임상 연구의 검증 데이터를 상세하게 제공한다. 위암의 위험을 평가하는 종래의 검출 방법과 비교하여, miRNA 마커 조합은 위암 진단에 대해 위내시경과 동등한 AUC를 제공할 수 있지만, 위내시경의 침습성 및 관련 합병증의 위험이 없다. 집단 암 검진의 핵심 원리는 암의 조기 검출을 용이하게 하기 위해 정기적인 검진을 지속하는 것이다. 이와 관련하여, 침습적 검사에 비해 단 한 번의 채혈만으로 신뢰할 수 있는 결론을 도출하는 혈액 기반 검사가 더 유망한 발전 방향이 될 것이다.

Claims (16)

  1. 위암 진단용 말초 혈액 miRNA 마커 조합으로서, 다음으로부터 선택된 적어도 5개의 miRNA 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합: hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p.
  2. 제1항에 있어서, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  3. 제1항에 있어서, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  4. 제1항에 있어서, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  5. 제1항에 있어서, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-183-5p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  6. 제1항에 있어서, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-126-3p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  7. 제1항에 있어서, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30e-5p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  8. 제1항에 있어서, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  9. 제1항에 있어서, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-140-5p 및 hsa-miR-340-5p로 구성되는 것을 특징으로 하는 miRNA 마커 조합.
  10. 다음의 단계를 포함하는, 위암으로 고통받을 위험에 있는 피험자를 식별하는 방법:
    a. 피험자의 말초 혈액 샘플에서 제1항에 따른 miRNA 마커 조합의 발현 수준을 검출하는 단계,
    b. 기준으로서 비-암 대조군 샘플과 피험자의 위험 점수를 계산 및 보정하는 단계, 및
    c. 위험 점수에 기초하여 피험자가 위암으로 고통받을 가능성을 결정하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 선형 회귀 모델을 사용하여 위험 점수를 계산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 선형 회귀 모델은 다음과 같이 계산되는 것을 특징으로 하는 방법으로서:
    Figure pct00007

    여기서 miRNA1, miRNA2, miRNA3... 은 제1항에 따른 miRNA 마커로부터 선택되고; Ct는 qPCR에 의해 검출된 각 miRNA의 상대적인 발현 수준이고; K는 각 miRNA 마커의 계수인 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 방법은 miRNA 마커를 검출하기 위해 qPCR 방법, 칩(chip) 방법 또는 시퀀싱 방법을 포함하는 것인 방법.
  14. 위암 진단용 키트로서, 제1항에 따른 miRNA 마커 조합을 특이적으로 검출하기 위한 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제14항에 있어서, 시약은 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드의 적어도 일부가 제1항에 따른 miRNA 마커에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 것인 키트.
  16. 제15항에 있어서, 키트는 제1항에 따른 miRNA 마커를 증폭시키기 위해 스템-루프(stem-loop) 역전사 프라이머 및/또는 반중첩(semi-nested) qPCR 프라이머를 포함하는 것인 키트.
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