CN107746880B - 一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于RT‑qPCR法检测胃癌的试剂盒及其制备方法，属于分子生物学技术领域。所述试剂盒采用两个通用逆转录通用引物、一个通用qPCR反向通用引物和两个通用探针进行所有检测人类胃癌特异表达的miRNA的反应。实验证明，所述试剂盒具有检测特异性非常高：不仅能区别miRNAs和Pre‑miRNA、能区别miRNAs和genomic DNA，还能区别同一miRNA家族的不同成员，此外还能能区别miRNAs和其它RNAs。与传统qPCR相比，本发明使用通用逆转录通用引物，通用探针和通用qPCR反向通用引物实现所有人类胃癌特异表达的miRNA的检测，所述试剂盒具有检测范围广，检测灵敏度高的特点。

Description

一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
胃癌是一种发病率很高的恶性肿瘤，会对患者造成十分严重的影响。诊断和治疗市场巨大，而诊断技术缺乏，即使单克隆抗体治疗肿瘤也是刚刚开始，远远没有饱和。为了防止胃癌严重危害人民的身体健康，除了发展有效的治疗方法外，癌症的诊断，尤其早期诊断，对癌症的预防和治疗具有重大的意义。人是遗传信息和环境因素相互作用的产物，故胃癌与遗传因素密不可分，又与环境因素息息相关。事实上，可遗传的胃癌只占少部分。大部分的胃癌是环境危险因素作用于遗传因素的结果。这就是只基于遗传信息的诊断方法受到很大限制的原因。微小RNA是新近发现的RNA的另一个大家族。它们既是遗传信息的携带者，又深受环境的影响，为遗传和环境因素间的最重要的桥梁。越来越多的研究表明微小RNA在肿瘤的发生发展过程中起着重要的调控作用，极有可能是窥视胃癌状况的最佳窗口，可作为肿瘤预测，病因，诊断，进展，复发和治疗结果的生物标志物。
江苏命码生物科技有限公司(以下简称“命码生物”)创新研发的胰腺癌体外诊断产品：微小核糖核酸(microRNA-25)定性检测试剂盒(荧光PCR法)得到国家食品药品监督管理总局于去年批准，获得了医疗器械注册证书，从而成为全球第一个在血清microRNA诊断领域获批的产品。虽然所述体外诊断产品的检测准确度高达88.0％，但是所述产品仅是基于一个微小RNA的检测方法，而微小RNA有几千多种，其诊断能力会受到一定限制。另外，它只是针对胰腺癌，且只能作为辅助诊断手段。
另一方面，虽然miRNA作为生物标志物较其他肿瘤标志物具有非常稳定，对温度，核酸酶和pH值不敏感等优点，但目前miRNA的作为生物标志物仍面临着巨大的困境，例如1)大多数研究结果还没有在其他研究人群中得到验证；2)微小RNA还没有成功地运用于癌症诊断中；3)由于缺乏精确检测微小RNA的技术，极大地限制了其在临床中的应用。事实上，miRNA检测面临困境主要是由miRNA的特性决定的：1.miRNA只有大约22碱基；2.同样的miRNA序列存在于其它核酸分子(premiRNA,pri-miRNA,genomic DNA and mRNA)中；3.同一家族的miRNA之间可能只有一个碱基的不同；4.不同miRNA的融化温度(Tm)差别很大(55℃到99℃)，因此现有技术中还没有研制克服上述问题的有效诊断胃癌的试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒，具有高精确度、高灵敏度和高通量地同时检测胃癌特异表达的miRNA，为胃癌的早期诊断奠定坚实的科学基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒，包括PCR板、qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、探针、逆转录通用引物、和内参miRNA，所述qPCR正向引物、qPCR反向通用引物和探针同时包被在PCR板中，逆转录引物盛装在引物试剂管中；
qPCR正向引物均以内参miRNA为模板设计得到；所述内参miRNA包括ArtRNA3；所述ArtRNA3具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述逆转录引物包括两种；一种逆转录通用引物是摩尔浓度为10μmol/L的检测胃癌样品的逆转录通用引物，另一种逆转录通用引物是摩尔浓度为10μmol/L检测健康组织样品用逆转录通用引物；所述检测胃癌样品用逆转录通用引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述检测健康组织样品用逆转录通用引物具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；
所述qPCR反向通用引物为通用qPCR反向通用引物，具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
所述探针包括两种探针，分别为摩尔浓度为10μmol/L的检测胃癌样品用通用探针和摩尔浓度为10μmol/L的检测健康组织样品用通用探针；所述检测胃癌样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述检测健康组织样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
所述qPCR反向通用引物具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述qPCR正向引物的核苷酸序列同差异表达miRNA的核苷酸序列；所述差异表达miRNA包括URS000054A671_9606Homo sapiens(human)hsa-miR-5004-5p、TJU_CMC_MD2.ID01366.5p-miR、URS000038B599_9606Homo sapiens(human)hsa-miR-363-3p、TJU_CMC_MD2.ID00936.5p-miR、novel-miR-1373-3p和TJU_CMC_MD2.ID00928.5p-miR中的一个或多个。
优选的，两种探针采用两种不同的染料标记，分别为FAM荧光探针和VIC荧光探针。
优选的，所述组分还包括5×聚腺苷酸聚合酶、10mmol/LATP溶液、25mmol/LMnCl2溶液、10×反转录缓冲液、100mmol/LdNTP溶液、核酸酶阻断剂、2×Taq聚合酶和50×qPCR缓冲液。
本发明还提供了所述的试剂盒的制备方法，包括包被PCR板的制备方法和逆转录通用引物管的制备方法；
所述包被PCR板的制备方法包括以下步骤：
1)将qPCR正向引物、通用qPCR反向通用引物、检测胃癌样品用通用探针和检测健康组织样品用通用探针用稀释液分别稀释成浓度为10，100和100μmol/L的母液；
2)取1600μL的10μmol/L通用qPCR反向通用引物溶液、400μL的10μmol/L检测胃癌样品用通用探针溶液，400μL的10μmol/L检测健康组织样品用通用探针溶液和181.6mL超纯水混合，得到总体积为184mL的混合液；
1)向96深孔板中每孔中加入160μLqPCR正向引物和上述步骤2)得到的混合液1840μL混合，得到2000μL的反应体系；
2)将96深孔板分装到96孔PCR板中，每孔5μL；
在阳性对照孔中加入内参miRNA至PCR板中；在阴性对照孔中加入超纯水至PCR板中；
3)将所述PCR板进行真空干燥，在25～27℃条件下干燥18～24h，得到包被的PCR板；
逆转录通用引物的制备方法，包括以下步骤：
A.逆转录通用引物用稀释液分别稀释成10μmol/L的母液；
B.将所述步骤A的母液进行分装，分装体积为10μL；
C.将分装母液置于真空干燥环境中，25～27℃条件下干燥18～24h，得到干燥的逆转录通用引物。
优选的，所述稀释液为TE缓冲液；所述TE缓冲液包括以下含量组分：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；所述TE缓冲液的pH值优选为8.0。
本发明提供了所述试剂盒或所述方法制备的试剂盒在检测胃癌中的应用。
本发明提供了一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒，通过在3'端具有poly(T)的两种通用RT引物将多聚腺苷酸化的miRNA被逆转录成cDNA。这两种通用RT引物只是在探针结合位点的序列不一样，其余序列是一样的。然后，使用成熟miRNA序列作为正向引物和通用反向引物，通过qPCR扩增RT产物。使用双探针检测或定量扩增产物。由于PCR反应十分敏感，可以将DNA扩增10亿次以上，那么反应管与反应管之间的操作误差是一个问题。双荧光定量PCR技术实现了在同一反应管中同时检测两种样品(例如正常人和胃癌病人的样品)中的同一种miRNA，这样就消除了管间的误差，提高检测精确度。实验证明，所述试剂盒具有检测特异性非常高：不仅能区别miRNAs和Pre‐miRNA、能区别miRNAs和genomicDNA，还能区别同一miRNA家族的不同成员，此外还能能区别miRNAs和其它RNAs。
附图说明
图1为本发明中微小RNA试剂盒的组成；
图2为本发明中miRNA双荧光定量PCR技术原理；
图3为实施例2中自主创双荧光定量PCR新技术成功检测临床样品；图3-A代表一个384孔板的实时PCR反应扩增曲线；图3-B来源于图3-A中部分miRNA在癌症样品和健康对照样品中的相对表达量；图3-C为一个癌症特异的miRNA表达情况；图3-D为另一个miRNA的4个重复实时PCR扩增曲线；图3-E为来源于图3-C的统计结果；
图4为实施例2中双荧光定量PCR标准曲线；
图5为实施例2中双荧光定量PCR的检测精确度；图5-A为胃癌和健康对照外泌体miRNA的cDNA10倍系列稀释作为PCR模板；图5-B为胃癌和健康对照外泌体384个miRNA的实时PCR扩增检测；
图6为实施例3中胃癌和健康对照外泌体miRNA差异表达图；图6-A为57对胃癌病人和健康人的外周血中miRA的差异表达情况；图6-B为57对胃癌病人和健康人的外周血中miRB；图6-C为57对胃癌病人和健康人的外周血中miRC；图6-D为57对胃癌病人和健康人的外周血中miRD；图6-E为57对胃癌病人和健康人的外周血中miRE；图6-F为57对胃癌病人和健康人的外周血中miRF。
具体实施方式
本发明提供了一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒，包括PCR板、qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、探针、逆转录通用引物和内参miRNA，所述qPCR正向引物、qPCR反向通用引物和探针同时包被在PCR板中，逆转录引物盛装在引物试剂管中；
所述逆转录通用引物和qPCR正向引物均以内参miRNA为模板设计得到；所述内参miRNA包括ArtRNA3；所述ArtRNA3具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述逆转录引物包括两个；一种逆转录通用引物是摩尔浓度为10μmol/L的检测胃癌样品的逆转录通用引物，另一种逆转录通用引物是摩尔浓度为10μmol/L检测健康组织样品用逆转录通用引物；所述检测胃癌样品用逆转录通用引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述检测健康组织样品用逆转录通用引物具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；
所述探针是针对不同内参miRNA检测的通用探针，包括摩尔浓度为10μmol/L的检测胃癌样品用通用探针和摩尔浓度为10μmol/L的检测健康组织样品用通用探针；所述检测胃癌样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述检测健康组织样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
所述qPCR反向通用引物具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
所述qPCR正向引物的核苷酸序列同差异表达miRNA的核苷酸序列；所述差异表达miRNA包括URS000054A671_9606Homo sapiens(human)hsa-miR-5004-5p、TJU_CMC_MD2.ID01366.5p-miR、URS000038B599_9606Homo sapiens(human)hsa-miR-363-3p、TJU_CMC_MD2.ID00936.5p-miR、novel-miR-1373-3p和TJU_CMC_MD2.ID00928.5p-miR中的一个或多个。
本发明中，所述检测胃癌样品用逆转录通用引物和检测健康组织样品用通用逆转录通用引物的来源委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明中，所述qPCR反向通用引物的设计原则包括以下原则：
1.引物长度一般在15～30碱基之间；
2.引物GC含量在40％～60％之间，Tm值接近72℃；
3.引物3′端不能选择A，最好选择T；
4.碱基要随机分布；
5.引物自身及引物之间不存在互补序列；
6.引物具有特异性；
7.通用引物和探针序列是特异的在人类基因组中没有同源序列或者相近序列；
8.引物5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低。
本发明中，所述qPCR反向通用引物的来源委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明中，所述探针包括摩尔浓度为10μmol/L的检测胃癌样品用通用探针和摩尔浓度为10μmol/L的检测健康组织样品用通用探针；所述检测胃癌样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述检测健康组织样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。所述检测胃癌样品用通用探针和所述检测健康组织样品用通用探针的来源委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述检测胃癌样品用通用探针和检测健康组织样品用通用探针标记不同颜色的染料。MGB探针是一个小分子三肽，能与dsDNA的双螺旋小沟形成非共价连接。这种探针选择性地结合富含AT的序列。MGB探针与靶标之间高度稳定的相互作用增加了探针的Tm，并阻止了非特异性产物的扩增。此外，在MGB探针中使用非荧光或暗猝灭剂(NFQ)可大大降低背景荧光。探针的设计参见网页(http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/taqman_mgb_primers probes_for_gene_expression.pdf)。
本发明中，所述试剂盒优选还包括5×聚腺苷酸聚合酶、10mmol/L ATP溶液、25mmol/L MnCl2溶液、10×反转录缓冲液、100mmol/LdNTP溶液、核酸酶阻断剂、2×Taq聚合酶、50×qPCR缓冲液。
本发明中，所述聚腺苷酸聚合酶的酶活力优选为2U/μL。本发明对聚腺苷酸聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的聚腺苷酸聚合酶即可。本发明实施例中，所述聚腺苷酸聚合酶购自Ambion(Austin,TX，USA)。
本发明中，所述ATP溶液的摩尔浓度为10mmol/L。所述ATP溶液的作用是提供聚合腺嘌呤提供原料。本发明对ATP溶液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的ATP溶液即可。本发明实施例中，所述ATP溶液购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，USA)。
本发明中，所述MnCl2溶液的摩尔浓度为25mmol/L。所述MnCl2溶液的能够提高聚腺苷酸聚合酶的聚合效率。如果选用MnCl2，优选在cDNA合成前，上述反应需要用苯酚-氯仿纯化提取和乙醇沉淀。本发明对MnCl2的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的MnCl2即可。本发明实施例中，所述MnCl2溶液购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，USA)。
本发明中，所述10×反转录缓冲液优选括以下含量组分：250mM Tris-HCl(pH8.3)，375mM KCl,15mmol/L MgCl2。最终反应还含有5mmol/L DTT，0.5mmol/L的dNTPs和2U/μl的重组RNase抑制剂，其余参照厂家使用说明书。本发明实施例中，10×反转录缓冲液购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA，USA)。
本发明中，所述dNTP溶液的摩尔浓度优选为100mmol/L。所述dNTP溶液为qPCR反应提供必要的原料。本发明对dNTP的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的dNTP即可。本发明实施例中，所述dNTP购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA，USA)。
本发明中，所述核酸酶阻断剂的最终浓度优选为2U/μL。所述核酸酶阻断剂为使qPCR反应过程中抑制核酸酶的活性，防止核酸的合成。本发明对核酸酶阻断剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的核酸酶阻断剂即可。本发明实施例中，所述核酸酶阻断剂购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA，USA)。
本发明中，所述2×Taq聚合酶的酶活力优选为100mmol/L。所述2×Taq聚合酶为酶催化形成PCR产物。本发明对2×Taq聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的2×Taq聚合酶即可。本发明实施例中，所述2×Taq聚合酶购自Clontech Laboratories(Mountain View,CA,USA)。
本发明中，所述50×qPCR缓冲液包括以下含量组分包括TaKaRa Ex Taq HS,dNTPMixture,Mg2+and Tli RNase H。本发明所述50×qPCR缓冲液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的50×qPCR缓冲液即可。本发明实施例中，50×qPCR缓冲液购自Clontech Laboratories(Mountain View,CA,USA)。所述50×qPCR缓冲液为PCR产物的形成提供必要的环境。本发明对形成的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的形成即可。本发明实施例中，所述50×qPCR缓冲液购自Clontech Laboratories(MountainView,CA,USA)。
本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒的制备方法，包括PCR板的制备方法和逆转录通用引物管的制备方法；
所述PCR板的制备方法包括以下步骤：
1)将qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、检测胃癌样品用通用探针和检测健康组织样品用通用探针用稀释液分别稀释成10，100和100μmol/L的母液；
2)取1600μL10μM的qPCR反向通用引物溶液，400μL的10μM的检测胃癌样品用通用探针溶液、400μL的10μM的检测健康组织样品用通用探针溶液和181.6mL超纯水混合，得到总体积为184mL的混合液；
3)向96深孔板中每孔中加入160μLqPCR正向引物和所述步骤2)得到的混合液混合，得到2000μL的反应体系；
4)将96深孔板分装到96孔PCR板中，每孔5μL；
5)在阳性对照孔中加入内参miRNA至PCR板中；
6)将所述PCR板进行真空干燥，在25～27℃条件下干燥18～24h，得到包被的PCR板；
逆转录通用引物的制备方法，包括以下步骤：
A.将逆转录通用引物用稀释液稀释成10μmol/L的母液；
B.将所述步骤A的母液进行分装，分装体积为10μL；
C.将分装母液置于真空干燥环境中，25～27℃干燥18～24h，得到干燥的逆转录通用引物。
本发明中，所述PCR板的制备方法和逆转录通用引物的制备方法如图1所示。
本发明中，所述稀释液优选为TE缓冲液；所述TE缓冲液优选包括以下含量组分：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA；所述TE缓冲液的pH值优选为8.0。
本发明中，所述将96深孔板分装到96孔PCR板的方法优选采用自动分装系统进行。
本发明中，所述真空干燥的真空度优选为-0.08～-0.1Mpa，更优选为-0.09Mpa。
本发明提供了所述试剂盒或所述方法制备的试剂盒在检测胃癌中的应用。
本发明中，所述应用是基于miRNA双荧光定量PCR技术原理进行。所述miRNA双荧光定量PCR技术原理如图2所示。用于分析微小RNA双荧光定量逆转录实时qRT-PCR包括三步法：首先，使用poly(A)聚合酶分别将来源于癌症病人的样品和健康对照的miRNA聚腺苷酸化。多聚腺苷酸化的miRNA通过在3'端具有poly(T)的两种通用RT引物被逆转录成cDNA。这两种通用RT引物只是在探针结合位点的序列不一样，其余序列是一样的。然后，使用成熟miRNA序列作为正向引物和通用反向引物，通过qPCR扩增miRNA产物。使用双标记的FAM荧光探针和VIC荧光探针检测或定量扩增产物。由于PCR很敏感，可以将DNA扩增10亿次以上，因此反应管之间的误差会对分析造成很大影响。本发明中，双荧光定量PCR技术实现在同一反应管中同时检测两种样品(例如正常人和胃癌病人的样品)中的同一种miRNA进行检测，这样就消除了管间的误差，提高检测精确度。
本发明中，所述试剂盒的使用方法，包括依次进行聚腺苷酸化反应、cDNA合成和实时荧光定量PCR；
Ⅰ.所述聚腺苷酸化反应包括以下步骤：配制20μl聚腺苷酸化反应体系；向所述聚腺苷酸化反应体系中加入1μl聚腺苷酸聚合酶混合，于37℃下孵育30min，再在95℃下孵育5min，进行冰浴后，得到多聚腺苷酸化反应物；
所述聚腺苷酸化反应体系包括以下含量组分：4.0μl5×聚腺苷酸聚合酶缓冲液、1.0μl的摩尔浓度为10mmol/L的ATP、1.0μl的25mmol/L的MnCl2、30ng～1μg的总RNA，用超纯水补足20μl，形成聚腺苷酸化反应体系；
Ⅱ.所述cDNA合成包括以下步骤：配置cDNA的反应体系；将所述cDNA的反应体系于55℃孵育5min；再在25℃条件下，孵育15min；再在42℃，孵育30min以进行逆转录；95℃孵育反应5min以终止逆转录，得到cDNA溶液；
所述cDNA的反应体系包括以下含量组分：2.0μl10×反转录缓冲液、4μl所述多聚腺苷酸化反应物、0.8μl100mmol/L dNTP混合物、1.0μl的10μmol/L逆转录通用引物、1.0μl逆转录/核酸酶阻断剂，用超纯水补足20μl；
Ⅲ.所述实时荧光定量PCR包括以下步骤：按照qPCR反应体系配制得到混合物；将所述混合物在qPCR反应程序条件下扩增得到qPCR反应结果；
所述qPCR反应体系如下：2×Taq10μl、10μM的qPCR正向引物0.4μl、10μM的qPCR反向通用引物0.4μl、探针0.8μl、50×qPCR缓冲液0.4μl、模板2μl、超纯水补足至20μl；
所述qPCR反应程序如下：阶段195℃30s；阶段2：PCR循环数为40次，每个循环包括95℃5s，60℃31s～34s。
本发明中，所述qPCR所用的仪器没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的荧光定量PCR仪即可。本发明实施例中，所用的荧光定量PCR仪购自Thermofisher公司，型号为QuantStudioTM5Real-Time PCR System和7500Fast&7500Real-Time PCR System。
本发明中，所述总RNA的提取原料优选包括血浆或外分泌物。
本发明中，所述血浆的获得方法包括以下步骤：
①将EDTA管(即EDTA喷雾包被的采血管)，置于冰上5分钟；
②用上述在冰上预冷却的EDTA管收集6～8ml静脉血，置于冰上或4℃冰箱内，并尽快(在血液取样后2小时内)进行下列处理；
③将离心机的温度降到摄氏温度4℃；
④将上述采血管放入离心机中在400g下离心15min，分离血浆和血细胞；
⑤将血浆(上清液)从采血管转移(注意：移液管不要接触到或者搅动到底部的血细胞)到混合管中，盖好后，上下倒置10次混匀；
⑥将所得血浆在-80℃冷冻储存。
本发明中，所述外泌体的分离方法包括以下步骤：
血浆用17,000g37℃离心15分钟，去除全细胞，大片段碎片和其他碎屑。
在室温下，将上清液转移到干净的超速离心管中；
1)200,000g，在37℃离心2小时。将沉淀重悬于1×PBS中。
本发明中，所述总RNA的提取方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的Trizol法或试剂盒法提取获得。本发明中，使用的总RNA样品不需要用DNase处理或进行微小RNA分离或纯化。这些方法不仅费力费时，而且可导致miRNA的显着损失和人为误差。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.96孔PCR板的制备
1.1.聚合酶链式反应(PCR)引物和探针的稀释。购买的反应中的正向引物，反向引物和荧光探针用TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)分别稀释到10，100和100μM母液。
1.2.配制通用反向引物和探针混合液。取1600微升反向引物，800微升探针和181.6毫升无菌去离子过滤水(18MΩ)加入一个塑料杯中，混匀。总体积为184毫升。
1.3.在96深孔板每孔中加入160微升不同的正向引物，1840微升反向引物和探针液，混匀。总体积为2000微升。
1.4.将上述96深孔板放置于自动分装系统中分装到96孔PCR板中。每孔5微升。每次可以自动分装480个96孔板。每天产量可达6000个96孔板。
1.5.在阳性对照孔中加入合成的内参微小RNAPCR模板。
1.6.将上述PCR板放入真空干燥箱中，室温干燥18～24h。
1.7.板子干燥后，应及时装入自封袋，按照每块板1袋干燥剂的量装入，袋子外面写好板子制备日期，放入本成品库冷藏环境保存备用。
2.逆转录通用引物管的制备
2.1.逆转录通用引物的稀释。购买的逆转录通用引物，用TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)分别稀释到10μM母液。
2.2.取10微升上述母液(两块96孔PCR板的量，若顾客订量增加，则应相应增加)，加入1.5毫升螺旋盖微管中。
2.3.将上述微管(不要盖死)放入真空干燥箱中，室温干燥18～24h。
2.4.微管干燥，盖上盖子后，应及时与制备好的96孔PCR板装入自封袋，按照每块板1袋干燥剂的量装入，袋子外面写好板子制备日期，放入本成品库冷藏环境保存备用。
实施例2
本发明是以630个癌症样品和387个健康对照样品为实验样品，其中630个癌症样品由北京大学肿瘤医院和北京医院提供，387个健康对照样品是由北京医科院提供。
(一)获得肺癌患者的血浆的实验步骤：
1.将EDTA管(即EDTA喷雾包被的采血管)，置于冰上5分钟。
2.用上述在冰上预冷却的EDTA管收集6～8毫升静脉血，置于冰上或4℃冰箱内，并尽快(在血液取样后2小时内)进行下列处理。
3.将离心机的温度降到摄氏温度4℃。
4.将上述采血管放入离心机中在400g下离心15分钟，分离血浆和血细胞。
5.将血浆(上清液)从采血管转移(注意：移液管不要接触到或者搅动到底部的血细胞)到混合管中，盖好后，上下倒置10次混匀。
6.将所得血浆在-80℃冷冻储存。
miRNA的分离纯化
使用常规的Trizol法提取血浆中总RNA本发明中使用的总RNA样品不需要用DNase处理或进行微小RNA分离或纯化。这些方法不仅费力费时，而且可导致miRNA的显着损失和人为误差。
(二)聚腺苷酸化反应
1.在一个0.5ml微量离心管添加以下组分：
无RNase的水，使最终体积达到20μl(含聚合酶，在步骤2中加入)
4.0μl 5×聚A聚合酶缓冲液
1.0μl的ATP(10mM)
1.0μl的25mM MnCl2(任选项)
1μl总RNA(30ng～1μg)
2.加入1μl大肠杆菌聚A聚合酶，并轻轻混合(不要旋涡)，离心片刻。
3. 37℃下孵育30分钟。
4. 95℃下孵育5分钟以终止腺苷酸化，然后立即将管转移到冰上。
(三)cDNA合成
1.在一个不含RNase的0.5-ml微量离心管添加以下组分：
无RNase的水，使最终体积达到20μl；
2.0μl10×RT缓冲液；
4μl多聚腺苷酸化反应物；
0.8μl100mM dNTP混合物；
1.0μl逆转录引物(10μM)；
1.0μl AffinityScript逆转录/核酸酶阻断剂。
2.轻轻混合反应(不要涡旋)，并在55℃孵育5分钟。
3. 25℃，孵育15分钟。
4. 42℃，孵育30分钟以进行逆转录。
5. 95℃孵育反应5分钟以终止逆转录。
6.加入280μl无RNase的水。继续qPCR或-20℃储存。
(四)实时PCR
1.准备PCR反应混合物。
Premix Ex Taq(2×)10μl；
PCR正向引物(10μM)0.4μl；
PCR反向引物(10μM)0.4μl；
探针0.8μl；
ROX(50×)0.4μl；
模板2μl；
无菌净化水6μl；
总计20μl。
实时PCR反应条件：
阶段1：初始变性；循环数：1；95℃30秒
阶段2：PCR，循环数：40；95℃5秒；60℃31～34秒。
实时PCR检测结果见图3。
图3是双荧光定量PCR新技术成功检测临床样品。其中图3-A代表一个384孔板的实时PCR反应扩增曲线。该扩增曲线为典型的PCR扩增曲线，指数扩增部分基本上是平行的，说明不同miRNA扩增的均一性较好。本发明从630个癌症样品和387个健康对照样品中得到7923种人类miRNA。PCR模板来源于混合样品。图3-B为来源于图3-A中部分miRNA在癌症样品和健康对照样品中的相对表达量。从该图能够得到在癌症样品和健康对照样品中，存在miRNA差异表达。图3-C为一个癌症特异的miRNA表达情况，所述miRNA在健康对照样品中没有表达。图3-D为另一个miRNA的4个重复实时PCR扩增曲线。每个反应包括癌症(红色曲线)和健康对照(蓝色曲线)的实时PCR反应。图示癌症的4个扩增曲线几乎是完全重叠的，健康对照的4个扩增曲线也是几乎完全重叠的。这表明本专利技术检测miRNA各个反应孔之间具有高度可重复性。图3-E为来源于图3-C的统计结果，显示这个miRNA在癌症样品和健康对照样品中的表达具有显著区别(p＜0.00002)。这表明由于本发明技术高度重复性，可检测比较小的差别，灵敏度高。
得到的双荧光定量PCR标准曲线见图4。
根据图4能够得到双荧光定量PCR检测miRNA的重复性。胃癌和健康对照外泌体miRNA的cDNA一系列10倍稀释作为PCR模板。分别相当于外泌体总RNA的10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，1pg和0.1pg。每个稀释度四个重复。每个孔里有胃癌和健康对照外泌体miRNA的cDNA。上面两图为FAM标记的，下面两图是VIC标记的。图4-A为PCR扩增曲线，图4-B为标准曲线。根据标准曲线计算的扩增效率分别为98.6％(FAM)和97.2％(VIC)(90～110％是可接受的范围)。R2值接近1。这两个标准曲线充分说明，双荧光定量PCR具有很高的可重复性和特异性。
标准曲线是衡量定量PCR的金标准。从cDNA模板10倍系列稀释后的定量PCR得到到标准曲线可以看出，模板稀释十万倍(0.1pgRNA)仍然可以检测得到，说明灵敏度很高。本发明的每个PCR反应的cDNA模板是从相等于0.4微升的细胞浆得到的。双荧光定量PCR检测miRNA的检测精确度和重复性可以从标准曲线相关系数(R2)看出。两个探针的R2值都大于0.99，表明miRNA浓度与相应的miRNA定量PCR反应测得的表达值之间具有良好的线性可靠性。另外每个弧度的4条扩增曲线几乎是重叠的，表明本发明提供的方法检测miRNA各个反应孔之间具有高度可重复性(图4)。
为了验证双荧光定量PCR在检测过程中反应体系是否会相互影响，在同一个反应管中用两种探针来检测两种模板，结果见图5。
图5为双荧光定量PCR的检测精确度。图5-A为胃癌和健康对照外泌体miRNA的cDNA10倍系列稀释作为PCR模板。每个稀释度四个重复。每个孔里有胃癌和健康对照外泌体miRNA的cDNA。图5-B为胃癌和健康对照外泌体384个miRNA的实时PCR扩增检测。PCR模板来源于汇集(pooled)样品。结果表明许多外泌体miRNA在胃癌和健康对照中的表达没有区别，只有少数miRNA在这两种人群中显著差别表达。这也可以从R2值看出：R2值达到最大(R2＝1)说明双荧光定量PCR技术精确度高和重复性好。这些在胃癌和健康对照差别表达的miRNA，进一步用单个胃癌样品的PCR验证得到证实。标准曲线实验结果证明，这两个PCR反应虽然在一个管子里，但并不相互干扰(图5-A)。这两个标准曲线所表明的双荧光定量PCR的高重复性和高特异性是本发明用miRNAs高精确度诊断胃癌的坚实基础。临床样品检测证明双荧光定量PCR能精确检测miRNA(图5-B)。
实施例3
外泌体(Exosomes)的分离
1.胃癌癌患者血浆用17,000g37℃离心15分钟，去除全细胞，大片段碎片和其他碎屑。
在室温下，将上清液转移到干净的超速离心管中。
2. 200,000g，在37℃离心2小时。将沉淀重悬于1×PBS中。
采用实施例2的试剂和检测方法进行检测。检测结果见表1。
表1外周血外泌体miRNA在胃癌病人和健康人中的差异表达
图6为胃癌和健康对照外泌体miRNA差异表达图。外泌体miRNA来源于57对胃癌病人和健康人的外周血。图中每条线相连的每对胃癌/健康人的每种miRNA是在一个PCR里检测的。每孔重复一次。图6-A表示57对胃癌病人和健康人的外周血的miRA表达情况，miRA的学名为URS000054A671_9606Homo sapiens(human)hsa-miR-5004-5p；图6-B.表示57对胃癌病人和健康人的外周血的miRB表达情况，miRB的学名为TJU_CMC_MD2.ID01366.5p-miR；图6-C表示57对胃癌病人和健康人的外周血的miRC表达情况，miRC的学名为URS000038B599_9606Homo sapiens(human)hsa-miR-363-3p；图6-D表示57对胃癌病人和健康人的外周血的miRD表达情况，miRD的学名为TJU_CMC_MD2.ID00936.5p-miR；图6-E表示57对胃癌病人和健康人的外周血的miRE表达情况，miRE的学名为novel-miR-1373-3p；图6-F表示57对胃癌病人和健康人的外周血的miRF表达情况，miRF的学名为TJU_CMC_MD2.ID00928.5p-miR。统计结果显示这六个miRNA在癌症样品和健康对照样品中的表达具有显著区别(p＜4.1E-5—2.8E-3)。
基于RT-qPCR法检测辅助胃癌的判断方法：通过筛选630个癌症样品和387个健康对照样品的7923种人类miRNA(图3-A)，获得了6个外泌体miRNA在胃癌和健康对照外周血中显著差异表达(图6和表1)。本试剂盒将用这六个miRNA辅助检测胃癌。由于与健康对照相比，每个miRNA在大部分胃癌病人中显著差异表达(表1)，这六个miRNA的组合运用，将大大提高检测精确度，例如如果六个miRNA都差异表达，也就是都不差异表达的概率是六个胃癌样品中的阴性率相乘，得到不被检测出胃癌的概率是0.006％(包括没有胃癌和有胃癌但检测不出来)，那么被检测出胃癌的概率就高达99.94％。当然临床检验时，除了可能六个miRNA同时差异表达，也可能只有一个，两个，三个，四个、五个miRNA差异表达或者六个miRNA都不差异表达的情况，例如一个待检样品中只有miRA、miRE和miRF差异表达时，不被检出胃癌的概率为2.9％，被检出胃癌的概率为97.1％。根据表1中的阳性率百分数，可以得到发生相应的患胃癌的概率。可以看出本发明提供的试剂盒根据上述六种差异表达的miRNA的表达情况确定，但是样品是否患有癌症不能确定只能根据每个差异表达的miRNA的阳性率进行计算，因此应用本发明提供的试剂盒检测胃癌只能用于辅助胃癌的诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 健生生物技术有限公司
<120> 一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
guuucucgcu uccguaugcu auc 23
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcatcgcat ccctcgtaag acccaatcac tgcctaccga ccagttcgct agtttgtttt 60
tttttttttt ttttvn 76
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcatcgcat ccctcgtaag acccaatcgt cggcctcggt agtcttcgta ggacttcttt 60
tttttttttt tttttvn 77
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaactagcg aactggtcgg taggc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagtcctac gaagactacc gaggc 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcatcgcat ccctcgtaag acccaatc 28

Claims (6)

1.一种基于RT-qPCR法检测胃癌的试剂盒，包括PCR板、qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、探针、逆转录通用引物和内参miRNA，其特征在于，所述qPCR正向引物、qPCR反向通用引物和探针同时包被在PCR板中，所述逆转录通用引物盛装在引物试剂管中；
所述内参miRNA包括ArtRNA3；所述ArtRNA3具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述逆转录通用引物包括两种；一种逆转录通用引物是摩尔浓度为10μmol/L的检测胃癌样品用逆转录通用引物，另一种逆转录通用引物是摩尔浓度为10μmol/L检测健康组织样品用逆转录通用引物；所述检测胃癌样品用逆转录通用引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述检测健康组织样品用逆转录通用引物具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；
所述探针包括两种探针，分别为摩尔浓度为10μmol/L的检测胃癌样品用通用探针和摩尔浓度为10μmol/L的检测健康组织样品用通用探针；所述检测胃癌样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述检测健康组织样品用通用探针具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
所述qPCR反向通用引物具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述qPCR正向引物的核苷酸序列同差异表达miRNA的核苷酸序列；所述差异表达miRNA包括URS000054A671_9606Homo sapiens hsa-miR-5004-5p、TJU_CMC_MD2.ID01366.5p-miR、TJU_CMC_MD2.ID00936.5p-miR、novel-miR-1373-3p和TJU_CMC_MD2.ID00928.5p-miR中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述两种探针采用两种不同的染料标记，分别为FAM荧光探针和VIC荧光探针。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组分还包括5×聚腺苷酸聚合酶、10mmol/L ATP溶液、25mmol/L MnCl2溶液、10×反转录缓冲液、100mmol/L dNTP溶液、核酸酶阻断剂、2×Taq聚合酶、50×qPCR缓冲液。
4.权利要求1～3任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括包被PCR板的制备方法和逆转录通用引物试剂管的制备方法；
所述包被PCR板的制备方法包括以下步骤：
1)将qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、检测胃癌样品用探针和检测健康组织样品用探针用稀释液分别稀释成浓度为10、100和100μmol/L的母液；
2)将1600μL的10μmol/LqPCR反向通用引物溶液、400μL的10μmol/L检测胃癌样品用探针溶液，400μL的10μmol/L检测健康组织样品用探针溶液和181.6mL超纯水混合，得到总体积为184mL的混合液；
3)向96深孔板的每孔中加入160μL qPCR正向引物和所述步骤2)得到的混合液1840μl，混合，得到2000μL的反应体系；
4)将96深孔板分装到96孔PCR板中，每孔5μL；
5)在阳性对照孔中加入内参miRNA至PCR板中；在阴性对照孔中加入超纯水至PCR板中；
6)将所述PCR板进行真空干燥，在25～27℃条件下干燥18～24h，得到包被的PCR板；
所述逆转录通用引物试剂的制备方法，包括以下步骤：
A.将逆转录通用引物用稀释液稀释成10μmol/L的母液；
B.将所述步骤A的母液进行分装，分装体积为10μL；
C.将分装母液置于真空干燥环境中，25～27℃条件下干燥18～24h，得到干燥的逆转录通用引物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤A中的稀释液为TE缓冲液；所述TE缓冲液包括以下含量的组分：10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA；所述TE缓冲液的pH值为8.0。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，得到包被PCR板和逆转录通用引物后还包括：将所述制备得到的包被PCR板和逆转录通用引物分别真空包装后装入自封袋中。
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Denomination of invention: A kind of kit and its preparation method and application based on RT-qPCR method detection gastric cancer

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