CN111321224A - 一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其试剂盒 - Google Patents

一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其试剂盒，涉及胃癌检测技术领域。该miRNA生物标志物组合包括miR‑18a、miR‑93、miR‑146b、miR‑181a、miR‑181b以及miR‑335，其为早期胃癌筛查提供了一种新的方式，且检测的准确度和灵敏度优于现有的肿瘤标志物检测。

Description

一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其 试剂盒
技术领域
本发明涉及胃癌检测技术领域，具体而言，涉及一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其试剂盒。
背景技术
胃癌(gastric cancer)目前是世界上第五大发病率最高的恶性肿瘤，也是第三大恶性肿瘤相关的死亡原因。尽管近年来，包括外科手术、化疗、放疗等治疗手段不断进步，晚期胃癌患者的预后仍较差。而早期胃癌由于其症状隐匿，往往不易被发现，从而导致错失最佳治疗时间。
目前，临床上多应用CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、CA24-2、CA50 及AFP等用于诊断及检测胃癌，而它们的准确性有待提高。虽然临床上通过胃镜及活检病理来诊断胃癌，但其为一种有创操作，且诊断结果与设备、操作医生、病理医生的经验有很大关系，可能会出现漏诊。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合、检测样本中目的miRNA的试剂在制备用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒中的应用、用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒、定量检测样本中 miRNA的方法和胃癌风险分数的计算方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合，所述miRNA生物标志物组合包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335；
miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335的序列依次如SEQID No.1～6所示。
第二方面，实施例提供检测样本中目的miRNA的试剂在制备用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒中的应用，所述目的miRNA包括前述实施方式所述的miRNA生物标志物组合。
第三方面，实施例提供一种用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测目的miRNA的引物和/或探针；
所述目的miRNA包括所述miRNA生物标志物组合，所述miRNA生物标志物组合包括miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335，miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335 的序列依次如SEQ ID No.1～6所示。
第四方面，实施例提供一种定量检测样本中miRNA的方法，所述方法包括以下步骤：将获取所述样本中miRNA生物标志物的表达量减去所述样本中内参miRNA的表达量，以获得miRNA生物标志物的相对表达量；
所述miRNA生物标志物包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、 miR-181b和miR-335，miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b 以及miR-335的序列依次如SEQID No.1～6所示；
所述内参miRNA包括miR-16和/或miR-423-5p，miR-16和 miR-423-5p的序列依次如SEQ ID No.10～11所示。
第五方面，实施例提供一种胃癌风险分数的计算方法，应用于电子设备，所述计算方法包括：
获取待测样品中miRNA生物标志物的表达量，所述miRNA生物标志物包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335；
根据所述待测样品的miRNA生物标志物的表达量，计算所述待测样品的风险分数。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合，所述miRNA生物标志物组合包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、 miR-181a、miR-181b以及miR-335，该miRNA生物标志物组合检测的准确度和灵敏度优于现有的肿瘤标志物检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中10个miRNA组合的检测结果；
图2为本发明验证例1中风险模型对于胃癌患者的检测结果；
图3为本发明验证例2中风险模型对于不同时期的胃癌患者的检测效果；
图4为本发明验证例3中采用miR-16作为内参时的检测结果；
图5为本发明验证例3中采用miR-16和miR-423-5p的均值作为内参时的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合，所述miRNA生物标志物组合包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335。
miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335的序列依次如SEQID No.1～6所示。
在可选实施方式中，所述miRNA生物标志物组合还包括：miR-21、 miR-196a、miR196b中的至少一种，miR-21、miR-196a和miR196b的序列依次如SEQ ID No.7～9所示。
本发明实施例还提供了检测样本中目的miRNA的试剂在制备用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒中的应用，所述目的miRNA包括前述实施方式所述的miRNA生物标志物组合。
在可选实施方式中，所述目的miRNA包括内参miRNA，所述内参 miRNA包括miR-16和/或miR-423-5p，miR-16和miR-423-5p的序列依次如SEQ ID No.10～11所示。
在可选实施方式中，所述内参miRNA包括miR-16和miR-423-5p。采用miR-16和miR-423-5p的平均表达量作为内参，能够显著提高上述miRNA 生物标志物组合检测的灵敏度，增加检测的稳定性。
在可选实施方式中，所述检测样本中目的miRNA的试剂包括用于检测目的miRNA的引物和/或探针。
在可选实施方式中，所述引物包括：用于依次检测样本中的miR-18a、 miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p 的第1引物对～第8引物对中的至少一对。
在可选实施方式中，所述探针包括：用于依次检测样本中的miR-18a、 miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p 的第1探针～第8探针中的至少一种。
本发明实施例还提供了一种用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测目的miRNA的引物和/或探针；
所述目的miRNA包括所述miRNA生物标志物组合，所述miRNA生物标志物组合同前述实施方式所述，不再赘述。
在可选实施方式中，所述目的miRNA包括内参miRNA，所述内参 miRNA包括miR-16和/或miR-423-5p，miR-16和miR-423-5p的序列依次如SEQ ID No.10～11所示。
SEQ ID No.10：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG；
SEQ ID No.11：UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU。
在可选实施方式中，所述内参miRNA包括miR-16和miR-423-5p。
在可选实施方式中，所述引物包括用于依次检测样本中的miR-18a、 miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p 的第1引物对～第8引物对中的至少一对。
在可选实施方式中，所述探针包括用于依次检测样本中的miR-18a、 miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p 的第1探针～第8探针中的至少一种。
本发明实施例还提供了一种定量检测样本中miRNA的方法，所述方法包括以下步骤：
将获取所述样本中各miRNA生物标志物的表达量减去所述样本中内参miRNA的表达量，以获得各miRNA生物标志物的相对表达量；
所述miRNA生物标志物包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b和miR-335，miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b 以及miR-335的序列依次如SEQID No.1～6所示；
所述内参miRNA包括miR-16和/或miR-423-5p，miR-16和 miR-423-5p的序列依次如SEQ ID No.10～11所示。
在可选实施方式中，所述内参miRNA包括miR-16和miR-423-5p，所述内参miRNA的表达量为miR-16和miR-423-5p表达量的均值。
在可选实施方式中，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
此外，本发明实施例还提供了一种胃癌风险分数的计算方法，应用于电子设备，所述计算方法包括：
获取待测样品中miRNA生物标志物的表达量，所述miRNA生物标志物组合包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335；
根据所述待测样品的miRNA生物标志物的表达量，计算所述待测样品的风险分数；
在可选实施方式中，所述计算方法包括采用预测模型计算所述待测样品的风险分数，所述预测模型的公式为：logit(P)＝1.87×EmiR-18a﹣ 0.80×EmiR-93+1.38×EmiR-14b﹣0.46×EmiR181a﹣1.70×EmiR181b﹣0.56×EmiR335+0.08；
其中，logit(P)为风险分数值，EmiR为miRNA对应的相对表达量，以miR-16和/或miR-423-5p为内参，采用2-△△Ct方法进行计算miRNA的相对表达量；
在可选实施方式中，以miR-16和miR-423-5p的均值作为内参的表达量，采用2-△△Ct方法进行计算miRNA的相对表达量。
上述风险模型的Cut off值为0.27，大于该阈值的病例判定为罹患胃癌的可能性大，建议行系统的胃癌筛查；小于或等于该阈值的病例判定为罹患胃癌的可能性小。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
通过TCGA高通量miRNA表达数据库(n＝477)筛选出11个在胃癌组织中显著上调的miRNA，包括miR-21、miR-196a-1、miR-146b、miR-196b、 miR-135b、miR-181b-1、miR-181a-1miR-93、miR-335、miR-196a-2以及 miR-18a，经过跨平台验证后miRNA为10个，miR-21、miR-196a、miR-146b、 miR-196b、miR-135b、miR-181b-1、miR-181a-1miR-93、miR-335以及miR-18a，其中，miR-196a-1和miR-196a-2为同一序列(miR-196a)，具体序列请参照表1。
表1miRNA生物标志物组合的序列
Figure RE-GDA0002480880800000071
在两个独立的高通量数据集(数据集的筛选特征参照表5)上验证上述 10个miRNA的预测效果，结果请参照附图1，得到的ROC曲线下面积AUC 均大于0.93。
基于血清中miRNA的表达量与肿瘤组织中miRNA的含量，及其释放入血的含量以及肿瘤微环境等因素的关系，本实施例挑选了miRNA生物标志物组合，具体包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b 以及miR-335。
根据上述miRNA组合建立一个风险模型，风险模型的公式为：
logit(P)＝1.87×EmiR-18a﹣0.80×EmiR-93+1.38×EmiR-14b﹣0.46×EmiR181a﹣ 1.70×EmiR181b﹣0.56×EmiR335+0.08.其中，logit(P)为风险分数值，EmiR为miRNA 对应的相对表达量，比如“EmiR-18a”为miR-18a的相对表达量。
以miR-16和miR-423-5p表达量的均值作为内参的表达量，采用 2-△△Ct方法进行计算各miRNA的相对表达量。
实施例2
采用实施例1提供的miRNA生物标志物组合进行早期胃癌的筛查。
1.血清样本收集
全血收集在含有促凝剂的Sarstedt
Figure RE-GDA0002480880800000081
Serum-Gel 9ml tubes(cat.no.02.1388)(或者其他不含促凝剂或EDTA的收集管)。完全凝结，需要将含有促凝剂的试管放置于室温(15-25℃)10min～1h。需要注意的是，含有促凝剂的试管需放置10分钟，没有促凝剂的试管需放置至少30分钟；
将试管于1900×g(3000rpm)，4℃离心10min；将上清血清(黄色)移到新的锥形底的试管中(通常10ml的全血可以获得3～5ml血清)；将锥形底试管中的血浆于16,000×g，4℃离心10min；将上清移到新的试管中，于 2～8℃的条件储存，或将血清分装后于-80℃长期储存。使用前，将血清于室温(15～25℃)溶解。为了去除冷凝蛋白，离心融化的血清样本，5min，16,000 ×g，4℃，将上清移到新试管后开始核酸提取。
2.提取血清RNA
使用的试剂盒为：QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit(Cat No.ID: 217184)。
准备血清或融化血清，取1ml血清于无毒无酶的EP管中，加入5倍体积的QIAzolLysis Reagent，涡旋混匀；然后将装有混合液的试管于室温 (15-25℃)放置5分钟，加入3.5μl miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control (1.6x 108copies/μl工作液)，充分混匀；混匀后加入与原始血清等体积的氯仿，盖好盖子，涡旋15s(重要)；将试管于室温放置2～3min后，于12,000 ×g，4℃，离心15min。离心后，样品分为3层：上层为无色、水样相，含有RNA；中层为白色；下层为红色有机层。将上层水样层(600μl)转移到新的收集管中(需自备)，避免转移其他液相。加入1.5倍体积的100％乙醇 (900μl)，上下颠倒混匀得到混合液。
将混合液移到RNeasy MinElute spin column中，置于2ml的收集管中，每次至多700μl。室温8000×g(10,000rpm)，离心15s，去除过滤液，重复该步骤至用完样品。
在RNeasy MinElute spin column中加入700μl buffer RWT，关盖，8000×g (10,000rpm)，室温离心15s，去除过滤液；在RNeasy MinElute spin column 中加入500μlbuffer RPE，关盖，8000×g(10,000rpm)，室温离心15s，去除过滤液；在RNeasy MinElutespin column中加入500μl 80％乙醇，关盖，≥8000×g(≥10,000rpm)，室温离心2min，去除过滤液(80％乙醇需用100％乙醇和RNase-free water配置)。
将the RNeasy MinElute spin column置于新的2ml的收集管中。打开spincolumn的盖子，全速离心5min(为了弄干过滤膜)。去除过滤液和收集管。为了避免损坏盖子，离心时需间隔放置离心管。将the RNeasy MinElute spin column放入新的1.5ml的收集管中。在过滤膜中心直接加入14μRNase-free water。关盖，全速离心1min洗提RNA。
3.RNA逆转录以及RT-PCR
使用的试剂盒为：引物探针TaqMan MiRNA Assays(4427975)+逆转录试剂TaqManMiRNA Reverse Transcription Kit(4366596)+定量预混液 Taqman Universal PCRMaster Mix II(4440040)。
逆转录仪器：Light Gycler型Real-time PCR仪(Roche公司，美国)。
RT-PCR仪器：QuantStudioTM 7Flex Real-Time PCR System(AppliedBiosystems)。
对步骤2提取的RNA进行miRNA的逆转录以及RT-PCR。用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、 miR-181a、miR-181b以及miR-335的序列依次如SEQ ID No.1～6所示，
TaqMan MiRNA Assays ID(Thermo Fisher)如表2所示。
表2TaqMan MiRNA Assays ID
Figure RE-GDA0002480880800000091
Figure RE-GDA0002480880800000101
RNA逆转录体系如表3所示。
表3逆转录体系
样本(μl)
100mM dNTPs 0.06
MultiScribe<sup>TM</sup>逆转录酶 0.42
10×RT缓冲液 0.6
RNA酶抑制剂 0.06
20×RT引物 0.11
无核酸酶水 3.55
RNA 1.2
总体积 6
RNA逆转录反应条件为：16℃，30min；42℃，30min；85℃，5min； 4℃，反应结束。
Taqman qPCR体系如表4所示。
表4Taqman qPCR体系
Figure RE-GDA0002480880800000102
Taqman qPCR反应条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s，变性～延伸进行40个循环。
验证例1
验证实施例1提供的风险模型对早期胃癌患者的检测效果。
采用实施例1提供的风险模型，根据实施例2提供的检测方法，对两个随机分组(数据集和训练集)的前瞻性胃癌病人样本(参照表5)进行检测，同时采用现有血清肿瘤标志物CEA和CA19-9对相同样本检测，并建立ROC曲线。
表5miRNA筛选和验证的TCGA数据集的特征以及前瞻性病人队列的特征
Figure RE-GDA0002480880800000111
Figure RE-GDA0002480880800000121
备注：miRNA筛选的数据集特征对应的是tissue cohort-discovery cohort；miRNA筛选的验证集特征对应的是tissue cohort-validation cohort；前瞻性病人特性对应的是serum cohort(prospective)。
检测结果请参照附图2。
由图2可知，实施例1提供的风险模型的AUC值达到了0.86，显著高于血清肿瘤标志物CEA和CA19-9检测的灵敏度和特异性。
验证例2
验证实施例1提供的风险模型对于不同时期的胃癌患者的检测效果。
采用实施例1提供的风险模型，根据实施例2提供的检测方法，对胃癌I期(StageI)患者进行检测，同时采用血清肿瘤标志物CEA和CA19-9 对相同样本进行检测，并建立ROC曲线，检测结果请参照附图3中A。
由图3中A可知，实施例1提供的风险模型检测胃癌早期患者的灵敏度和特异性显著优于现有血清肿瘤标志物CEA和CA19-9，其AUC值达到了0.82。
采用实施例1提供的风险模型，根据实施例2提供的检测方法，对不同时期的胃癌患者进行检测，不同时期包括I期、II期、III期和IV期，检测结果请参照附图3中B。
验证例3
验证不同内参miRNA对于miRNA生物标志物组合检测胃癌效果的影响。
设置2组试验组，试验组1采用miR-16作为内参，试验组2采用miR-16 和miR-423-5p的均值作为内参，根据实施例2提供的检测方法，对同一批病例样本进行检测，计算实施例1提供的6个miRNA生物标志物在胃癌患者和健康人中的相对表达量。
试验组1的检测结果请参照附图4，试验组2的检测结果请参照附图5。
由图4～5可知，当单独使用miR-16做内参时，6个miRNA中只有1 个(miR-146b)上调；当采用miR-16和miR-423-5p的均值作为内参时，6 个miRNA中，miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a以及miR-335均显著上调，能显著提高检测的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈锦飞
深圳市安可位元医学科技有限公司
<120> 一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其试剂盒
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
uaaggugcau cuagugcaga uag 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ugagaacuga auuccauagg cu 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacauucaac gcugucggug agu 23
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
aacauucauu gcugucggug gg 22
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
caacaccagu cgaugggcug u 21
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
cggcaacaag aaacugccug ag 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
uagguaguuu ccuguuguug gg 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
uagcagcacg uaaauauugg cg 22
<210> 11
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
ugaggggcag agagcgagac uuu 23

Claims (10)

1.一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合，其特征在于，所述miRNA生物标志物组合包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335；
miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335的序列依次如SEQ IDNo.1～6所示；
优选地，所述miRNA生物标志物组合还包括：miR-21、miR-196a和miR196b中的至少一种，miR-21、miR-196a和miR196b的序列依次如SEQ ID No.7～9所示。
2.检测样本中目的miRNA的试剂在制备用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述目的miRNA包括权利要求1所述的miRNA生物标志物组合。
3.根据权利要求2所述的检测样本中目的miRNA的试剂在制备用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述目的miRNA包括内参miRNA，所述内参miRNA包括miR-16和/或miR-423-5p，miR-16和miR-423-5p的序列依次如SEQ ID No.10～11所示；
优选地，所述内参miRNA包括miR-16和miR-423-5p。
4.根据权利要求2或3所述的检测样本中目的miRNA的试剂在制备用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测样本中目的miRNA的试剂包括用于检测目的miRNA的引物和/或探针；
优选地，所述引物包括：用于依次检测样本中的miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p的第1引物对～第8引物对中的至少一对；
优选地，所述探针包括：用于依次检测样本中的miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p的第1探针～第8探针中的至少一种。
5.一种用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测目的miRNA的引物和/或探针；
所述目的miRNA包括miRNA生物标志物组合，所述miRNA生物标志物组合包括miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335，miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335的序列依次如SEQ ID No.1～6所示；
优选地，所述目的miRNA包括内参miRNA，所述内参miRNA包括miR-16和/或miR-423-5p，miR-16和miR-423-5p的序列依次如SEQ ID No.7～8所示。
6.根据权利要求5所述的用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒，其特征在于，优选地，所述miRNA生物标志物组合还包括：miR-21、miR-196a和miR196b中的至少一种，miR-21、miR-196a和miR196b的序列如SEQ ID No.7～9所示；
优选地，所述引物包括：用于依次检测样本中的miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p的第1引物对～第8引物对中的至少1对；
优选地，所述探针包括：用于依次检测样本中的miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-335、miR-16以及miR-423-5p的第1探针～第8探针中的至少一种。
7.一种定量检测样本中miRNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将获取所述样本中各miRNA生物标志物的表达量减去所述样本中内参miRNA的表达量，以获得各miRNA生物标志物的相对表达量；
所述miRNA生物标志物包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b和miR-335，miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335的序列依次如SEQ IDNo.1～6所示；
所述内参miRNA包括miR-16和/或miR-423-5p，miR-16和miR-423-5p的序列依次如SEQID No.10～11所示。
8.根据权利要求7所述的定量检测样本中miRNA的方法，其特征在于，所述内参miRNA包括miR-16和miR-423-5p，所述内参miRNA的表达量为miR-16和miR-423-5p表达量的均值。
9.根据权利要求7所述的定量检测样本中miRNA的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
10.一种胃癌风险分数的计算方法，其特征在于，应用于电子设备，所述计算方法包括：
获取待测样品中miRNA生物标志物的表达量，所述miRNA生物标志物组合包括：miR-18a、miR-93、miR-146b、miR-181a、miR-181b以及miR-335；
根据所述待测样品的miRNA生物标志物的表达量，计算所述待测样品的风险分数；
优选地，所述计算方法包括采用预测模型计算所述待测样品的风险分数，所述预测模型的公式为：logit(P)＝1.87×EmiR-18a﹣0.80×EmiR-93+1.38×EmiR-14b﹣0.46×EmiR181a﹣1.70×EmiR181b﹣0.56×EmiR335+0.08；
其中，logit(P)为风险分数值，EmiR为miRNA对应的相对表达量，以miR-16和/或miR-423-5p为内参，采用
Figure FDA0002342106820000031
方法进行计算miRNA的相对表达量；
优选地，以miR-16和miR-423-5p的均值作为内参的表达量。
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