CN104059988A - 一种标志基因cst1及其应用 - Google Patents
一种标志基因cst1及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104059988A CN104059988A CN201410321628.1A CN201410321628A CN104059988A CN 104059988 A CN104059988 A CN 104059988A CN 201410321628 A CN201410321628 A CN 201410321628A CN 104059988 A CN104059988 A CN 104059988A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cst1
- test kit
- cholelithiasis
- gene
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101000884768 Homo sapiens Cystatin-SN Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 101100062319 Homo sapiens CST1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 4
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 claims description 51
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 claims description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 102100038387 Cystatin-SN Human genes 0.000 claims description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 18
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 11
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 abstract description 2
- 206010049704 Gallbladder polyp Diseases 0.000 abstract 4
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 abstract 4
- 208000013976 polyp of gallbladder Diseases 0.000 abstract 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010049025 Persistent generalised lymphadenopathy Diseases 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010026774 Salivary Cystatins Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 238000003012 network analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061695 Biliary tract infection Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053155 Epigastric discomfort Diseases 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 206010017624 Gallbladder cholesterolosis Diseases 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 206010023129 Jaundice cholestatic Diseases 0.000 description 1
- 206010024612 Lipoma Diseases 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004404 Neurofibroma Diseases 0.000 description 1
- 201000005267 Obstructive Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 208000018623 benign neoplasm of gallbladder Diseases 0.000 description 1
- 239000003809 bile pigment Substances 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000003167 cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002192 cholecystectomy Methods 0.000 description 1
- 238000009606 cholecystography Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 201000003350 gallbladder adenoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000007487 gallbladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012151 protein quantification reagent Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种标志基因CST1及其应用。本发明对胆囊息肉和胆囊结石组织进行高通量转录组深度测序及生物信息学分析，筛选到1个在胆囊息肉中下调、胆囊结石中上调的基因，进一步采用荧光定量PCR进行经典的分子生物学实验验证，结果显示筛选得到的CST1基因可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。本发明提供的标志基因可用于制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用，具有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种标志基因及其应用。具体地，本发明涉及一种标志基因CST1(cystatin SN)及其在制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用。
背景技术
胆囊结石(cholelithiasis)是我国的常见疾病之一，自然人群的患病率约10％以上，可导致严重的后果，如重症胆道感染、梗阻性黄疽、胆源性胰腺炎，与胆道肿瘤亦密切相关，威胁着人们的身体健康。胆囊结石的形成原因复杂，按成分主要可分为3种胆石：胆固醇类结石、胆色素结石、混合性结石。长期以来，许多学者致力于胆固醇性结石发病机理的研究。致石基因，遗传流行病学和动物模型的分子生物学研究显示，基因因素对胆囊结石的形成有重大影响；胆石病的遗传模式可能是多基因参与。
胆囊息肉样病变(polypoid lesions of the gallbladder，PLG)，并非是指某一单一的疾病，而是指向胆囊壁上向胆囊腔内突出或隆起的病变的统称，又称为胆囊隆起性病变(apophysis lesions of the gallbladder，ALG)。包括肿瘤性和非肿瘤性病变，肿瘤性息肉包括腺瘤、平滑肌瘤、脂肪瘤、血管瘤、神经纤维瘤等，而非肿瘤性病变包括胆固醇息肉、炎性息肉、胆囊腺肌增生症等。胆囊息肉样病变在临床表现上无特异性，往往无症状或症状轻微，只有少数人可能有右上腹或上腹部不适、隐痛，或伴有消化道症状，因此目前对PLG的诊断主要依靠影像学，包括B超、CT和胆囊造影术等。以B超为首选，但尚不能在术前明确病变的性质。由于本组疾病包含良、恶性病变20余种，术前明确病变的性质困难，如何对待和处理胆囊息肉样病变，对手术治疗的时机选择，都是十分重要的问题。
胆囊结石是胆囊癌重要的危险因素之一，但是结石是否胆囊腺瘤恶变的危险因素则存在争议。通过病理分析，发现胆囊息肉合并结石组比单纯息肉组的胆囊粘膜肠化生和不典型增生的发生率要高，前者为44％，后者为10.3％，胆囊结石是胆囊息肉恶变的高危险因素之一。此外，胆囊存在结石可能对术前息肉的超声检测产生影响。术前超声检测胆囊息肉的一般敏感度为36％-90％，如果不合并胆囊结石，敏感性可达99％。综上所述，胆囊结石可能是胆囊息肉恶变的危险因素之一，结石对术前超声检测也存在一定影响，造成恶变息肉的漏诊。在胆囊结石误诊为胆囊息肉12例病理分析(现代中西医结合杂志，2003年8月，1645-1646页)中也对误诊原因进行了分析，认为目前胆囊良性肿瘤术前鉴别诊断尚不完善，多靠影像学检查。B超检查时，其表现为在胆囊黏膜上出现强回声隆起性病变，不随患者体位变化而移位。病例由于结石较小，尚在早期形成阶段，无钙盐沉积，在声像学上不易和胆囊息肉鉴别。胆囊黏膜由于慢性炎症，黏液腺化生，分泌的黏液将小的结石牢固地黏附在黏膜上，不随体位变化而移动，是造成误诊的原因。由于结石多发造成临床上多发性息肉的错误诊断，因惧怕息肉恶变而行胆囊切除术，造成误治。
因此，寻找可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性分子标记，弥补影像学的不足，提高临床诊断水平，已成为目前临床急需解决的难题。
以高通量测序为核心的基因组学技术迅速发展，已广泛应用到生物医学的各个领域并取得突出进展，使我们对于疾病的分子与遗传学基础的认识达到了一个新的水平。这些研究成果对于阐明疾病的病因、解析疾病发生的分子机制、寻找疾病特异的生物标志物和药物靶点，进而提升疾病的预防、诊断和治疗水平具有重要意义。
故而，本发明对7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本进行了高通量转录组深度测序，随后进行了生物信息学分析，筛选到1个在胆囊息肉中下调、胆囊结石中上调的基因，进一步采用荧光定量PCR进行经典的分子生物学实验验证，结果显示筛选得到的CST1基因可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。本发明提供的标志基因可用于制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明目的是提供了一个可以区别胆囊息肉和胆囊结石的标记基因CST1。
本发明目的是提供了一种检测CST1基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒。
进一步，本发明还提供了一对检测CST1基因表达水平的荧光定量PCR引物。
进一步，本发明还提供了一种检测CST1基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒使用方法。
本发明目的是提供CST1基因在制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用。
本发明目的是提供了一种用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，所述试剂盒包括：a.提供CST1蛋白的平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定CST1蛋白的试剂。
进一步，所述试剂是能特异性结合CST1蛋白的抗体。
为实现上述目的，本发明对7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本进行了高通量转录组深度测序，高通量转录组深度测序后，为了更好的理解差异表达基因的功能，发现在胆囊结石与胆囊息肉组之间共有150个差异表达基因，其中143个差异表达基因在胆囊结石中上调，7个差异表达基因在胆囊息肉中上调。我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和KEGG通路的富集，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了1个在胆囊息肉中下调、在胆囊结石中上调的差异表达基因CST1。
本发明运用荧光定量PCR方法对筛选到的差异表达基因CST1进行功能分析。
为了实现上述目的，本发明分别提取了45例胆囊息肉组织和38例胆囊结石组织的总RNA的进行提取，设计了用于扩增CST1基因的2条引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，用于扩增内参基因GAPDH的2条引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。制备了含有CST1基因序列的标准DNA模板，并进行了敏感性实验。进而，采用qRT-PCR的方法比较CST1基因在胆囊息肉组织和胆囊结石组织中的表达水平。结果表明：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CST1在胆囊结石组织的表达水平明显低于胆囊息肉组织和对照质粒100copies，而在胆囊息肉组织中的CST1高表达，即生物信息学筛选得到的CST1基因能很好的区别胆囊息肉组织和胆囊结石组织，可作为检测胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。
本发明目的是提供了一种检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒及其使用方法。该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
本发明制备的一种检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。所述内参引物为GAPDH内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4。所述荧光定量PCR反应液包括2×UltralSYBR One Step RT-qPCRBuffer(With ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water。
本发明还公开了一种检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：上游引物；下游引物；样品RNA10pg-100ng；2×UltralSYBROne Step RT-qPCR Buffer(With ROX)，SuperEnzyme Mix，加RNase-Free Water至25μL。荧光定量PCR程序：45℃10min；95℃5min预变性，接30-40个循环：95℃10s，60℃45s。
所述的试剂盒应用于CST1基因的定量检测，制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。。
本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为107-102copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。
本发明优点：
(a)本发明提供的CST1能很好的区别胆囊息肉组织和胆囊结石组织，可作为检测胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。
(b)本发明提供的检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，有保证了结果的一致性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1研究样本的收集及RNA提取
收集7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本，进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
实施例2数据分析
测序平台：Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台
高通量转录组深度测序后，为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和KEGG通路的富集，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了1个在胆囊息肉中下调、在胆囊结石中上调的差异表达基因CST1。
实施例3胆囊息肉及胆囊结石组织CST1基因表达情况
一材料和方法
1、材料
胆囊息肉及胆囊结石组织取自于2005年-2010年住院病例，分别取了45例和38例。
2、方法
2.1胆囊息肉及胆囊结石组织总RNA的提取
按康为世纪超纯RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit(DNase I)，货号CW0597)说明书提取胆囊组织及瘤旁组织的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。
采用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取，主要操作步骤如下：
1.样品处理，30-50mg组织在液氮中充分研磨后加入1ml Buffer RLT，或在组织样品中加入1ml Buffer RLT后匀浆处理。
2.样品中加入Buffer RLT后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3.以每1ml Buffer RLT加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。
4.4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。
5.在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase的水配制)，颠倒混匀。
6.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱(Spin Column RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8.配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。
9.向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。
10.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
11.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
12.重复步骤11。
13.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
14.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(Collection Tube1.5ml)中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
15.总RNA完整性鉴定：取2μl RNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。
16.用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。
2.2CST1检测引物设计与合成
根据PCR引物设计原则，应用Premier5.0和增强版的OligoArchitectTM软件进行引物设计。
CST1的上、下游引物序列分别为：
上游引物：5’-GAGGAGGATAGGATAATC-3’；SEQ ID NO.1
下游引物：5’-GTCTGTAGTAGTCATCTT-3’；SEQ ID NO.2
产物长度为124bp。
内参基因GAPDH的上、下游引物序列分别为
上游引物：5’-TAAGGTGGTGGCTGTGAAT-3’；SEQ ID NO.3
下游引物：5’-CCGTGGGTGGAGTCATAC-3’；SEQ ID NO.4
产物长度为78bp。
2.3定量标准曲线的建立
标准DNA模板的制备
按照说明书，从胆囊组织中，利用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA，接着用康为世纪SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(货号CW0741)进行逆转录反应，具体步骤如下：1.将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.配置反应体系，总体积为20μl：终浓度为50pg-5μg的RNA模板、2μlPrimer Mix、4μl dNTP Mix、4μl RT Buffer、1μlSuperRT，加RNase-Free Water补平到20μl。
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4.42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2×Taq MasterMix(货号CW0682)进行常规PCR，反应体系和条件如下：2×Taq MasterMix25μl、上下游引物各2μl、cDNA0.5μg、补平至50μl。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；最后72℃延伸2min。取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在108-102copies/μl)。
2.3敏感性实验
取重组质粒按比例稀释为108、107、106、105、104、103、102个拷贝/μL，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为108-102copies/μL，最小检出浓度为100copies/μL。
2.4qRT-PCR检测CST1基因表达量
取上述胆囊结石组织和胆囊息肉组织用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA，进而用UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)进行RT-PCR。具体步骤：
1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(WithROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg-100ng)、RNase-Free Water补平至25μl。
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4.将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应：反转录：45℃10min；95℃5min预变性，接35个循环：95℃10s，60℃45s。
对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows11.5软件，相关数据采用χ2检验和Fisher确切概率法进行处理，P＜0.05有统计学意义；qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软件来计算。
根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较CST1基因在胆囊息肉和胆囊结石中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CST1在胆囊息肉中的表达水平在0.000-0.001之间，明显低于胆囊结石和对照质粒100copies，而胆囊结石中的CST1的表达量在0.002-0.150之间，以上结果说明CST1在胆囊结石中高表达，在胆囊息肉中低表达。
实施例4一种检测胆囊中CST1基因的检测试剂盒及使用方法
RNA提取试剂：超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)
荧光定量试剂：UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)
荧光定量PCR反应体系及方法：
RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(WithROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg-100ng)、RNase-Free Water补平至25μl。
反应调节：反转录：45℃10min；95℃5min预变性，接30-40个循环：95℃10s，60℃45s。
实施例5一种检测CST1蛋白的试剂盒及使用方法
该试剂盒含有：a.提供CST1蛋白的平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定CST1蛋白的试剂。所述试剂包括针对人CST1蛋白的特异性抗体(如SinoBiological Inc的抗体Cystatin SN/CST1 Antibody，货号11568-RP02-50，或者Abnova公司的抗体CST1 monoclonal antibody，货号H00001469-M等；或者用标准的杂交瘤技术产生的抗CST1蛋白的单克隆抗体)。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在CST1蛋白及蛋白的含量。此外，试剂盒还可以进一步包括组织蛋白抽提试剂，蛋白定量试剂以及蛋白marker等。
本发明采用生物信息学方法成功的对已知的基因芯片结果进行二次分析，筛选出区别胆囊息肉和胆囊结石的标记基因CST1，并提供了检测CST1表达水平的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，又保证了结果的一致性，具有很好的临床应用前景。
Claims (10)
1.CST1基因作为特异性标记分子在制备区别胆囊息肉和胆囊结石的诊断剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CST1基因在胆囊息肉组织中低表达，在胆囊结石组织中高表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断剂为能特异且定量鉴定CST1基因mRNA和/或CST1蛋白的试剂。
4.用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：a.提供CST1蛋白的平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定CST1蛋白的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂是能特异性结合CST1蛋白的抗体。
6.用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：a.提供CST1基因mRNA平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定CST1基因mRNA的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂是能与所述的CST1mRNA杂交的多核苷酸探针和/或能在扩增反应中特异性扩增部分或全长CST1基因片段的两条寡核苷酸引物。
8.根据权利要求6或7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性寡核苷酸引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。
9.根据权利要求7-8任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的寡核苷酸引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
10.根据权利要求4-9任意一项所述的试剂盒，其特征在于，PCR体系包括：上游引物、下游引物、样品RNA；2×UltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer、SuperEnzyme Mix、RNase-Free Water；荧光定量PCR程序：45℃10min；95℃5min预变性，接30-40个循环：95℃10s，60℃45s。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410321628.1A CN104059988B (zh) | 2014-07-08 | 2014-07-08 | 一种标志基因cst1及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410321628.1A CN104059988B (zh) | 2014-07-08 | 2014-07-08 | 一种标志基因cst1及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104059988A true CN104059988A (zh) | 2014-09-24 |
| CN104059988B CN104059988B (zh) | 2015-12-30 |
Family
ID=51547918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410321628.1A Active CN104059988B (zh) | 2014-07-08 | 2014-07-08 | 一种标志基因cst1及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104059988B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107988364A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-05-04 | 深圳美因医学检验实验室 | 一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用 |
| CN108913762A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-11-30 | 张罗 | 用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及cst1基因作为生物标志物的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103898205A (zh) * | 2013-05-07 | 2014-07-02 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn的应用 |
-
2014
- 2014-07-08 CN CN201410321628.1A patent/CN104059988B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103898205A (zh) * | 2013-05-07 | 2014-07-02 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DANIEL KEPPLER ET AL: "Novel Expression of CST1 as Candidate Senescence Marker", 《JOURNAL OF GERONTOLOGY》, vol. 66, no. 7, 30 August 2011 (2011-08-30) * |
| 王亚东等: "CST1基因在膀胱移行细胞癌中表达及临床意义", 《中华临床医师杂志》, vol. 6, no. 14, 30 July 2012 (2012-07-30) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107988364A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-05-04 | 深圳美因医学检验实验室 | 一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用 |
| CN108913762A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-11-30 | 张罗 | 用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及cst1基因作为生物标志物的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104059988B (zh) | 2015-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2696403C (en) | Methods of using mirna for detection of in vivo cell death | |
| CN110484624B (zh) | 一种基于外周血的胃癌生物标志物及其检测方法和应用 | |
| CN109097477A (zh) | 一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其应用 | |
| CN107475440A (zh) | 一种血浆外泌体生物标志物在乳腺癌诊断中的应用 | |
| CN109055555A (zh) | 一种肺癌早期转移诊断标志物及其试剂盒和应用 | |
| CN107312865B (zh) | Loc100130111在制备骨肉瘤诊断产品、治疗药物中的用途 | |
| CN105154541A (zh) | miRNA在急性髓系白血病诊断和治疗中的应用 | |
| CN104059988B (zh) | 一种标志基因cst1及其应用 | |
| CN111321224B (zh) | 一种用于诊断或辅助诊断胃癌的miRNA生物标志物组合及其试剂盒 | |
| CN107475441A (zh) | 一种预测乳腺癌患者对at方案新辅助化疗的反应性的生物标记物 | |
| JP2020500551A (ja) | 検出方法 | |
| CN105063052B (zh) | 急性髓系白血病miRNA标记物 | |
| CN109536502B (zh) | 一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参 | |
| CN107164531A (zh) | 一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物及其应用 | |
| CN104059983B (zh) | 一种标志基因fdcsp及其应用 | |
| CN107583052A (zh) | miR‑6734‑5p在制备Luminal型乳腺癌诊断工具中的应用 | |
| CN104059982A (zh) | 口腔癌致病基因bpifb2及其应用 | |
| CN105177149B (zh) | miRNA在肝硬化诊断和治疗中的应用 | |
| US11685950B2 (en) | Method of diagnosing and treating acute rejection in kidney transplant patients | |
| CN107326076A (zh) | 一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒及其应用 | |
| CN108998528B (zh) | 肺癌诊断分子标记物lncRNA LINC00516和试剂盒及其应用 | |
| CN106435004A (zh) | 血清外泌体miRNAs标志物在地方性砷中毒早期诊断中的应用 | |
| CN105779612A (zh) | 一种Lynch综合征基因检测试剂盒及其应用 | |
| CN112553342B (zh) | 一种肺腺癌诊断的生物标志物及其应用 | |
| CN108384848B (zh) | 血清中circ_0021132作为深静脉血栓形成诊断标志物的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING YANGSHEN BIOLOGICAL INFORMATION TECHNOLOGY Free format text: FORMER OWNER: YANG CHENGGANG Effective date: 20150203 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150203 Address after: 100080, Haidian District, Suzhou Street, No. 1, 857, Beijing Applicant after: Beijing Yang Shen biology information technology company limited Address before: 100080 Beijing city Haidian District Zhongguancun Shan Street Court building 3010 cubic Applicant before: Yang Chenggang |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Marker gene CST1 and application thereof Effective date of registration: 20171212 Granted publication date: 20151230 Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited Registration number: 2017990001155 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20181206 Granted publication date: 20151230 Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited Registration number: 2017990001155 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Marker gene CST1 and application thereof Effective date of registration: 20181225 Granted publication date: 20151230 Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited Registration number: 2018990001252 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20191206 Granted publication date: 20151230 Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited Registration number: 2018990001252 |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200226 Address after: Room 2503, Qianshan building, building D2, Qingdao International Innovation Park Phase II, No. 1, Keyuan Weiyi Road, Laoshan District, Qingdao, Shandong Province Patentee after: Qingdao Yangshen biomedical Co., Ltd Address before: 100080, Haidian District, Suzhou Street, No. 1, 857, Beijing Patentee before: Beijing Yang Shen biology information technology company limited |