JP2020500551A - 検出方法 - Google Patents
検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020500551A JP2020500551A JP2019544790A JP2019544790A JP2020500551A JP 2020500551 A JP2020500551 A JP 2020500551A JP 2019544790 A JP2019544790 A JP 2019544790A JP 2019544790 A JP2019544790 A JP 2019544790A JP 2020500551 A JP2020500551 A JP 2020500551A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- genes
- colorectal
- biomarker
- eukaryotic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
- G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS
Abstract
Description
本出願は、2016年10月27日に出願された米国仮特許出願第62/413,708号、2017年6月22日に出願された米国仮特許出願第62/523,511号、および2017年8月17日に出願された米国仮特許出願第62/547,046号の優先権を主張し、それらの開示内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明は、糞便試料からの真核生物の核酸の抽出、ならびに腸疾患の診断および治療のための当該核酸の使用に関する。
胃腸障害、例えば、胃腸癌ならびに炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、およびクローン病などの他の消化器疾患が広まっている。米国では、胃腸障害は、年間6000万人〜7000万人が罹患していると推定されている。一部の疾患では、早期のスクリーニングおよび診断により、死亡率が低下し、患者の生活の質が向上した。しかしながら、結腸鏡検査などの標準的な診断方法は、侵襲的で、時間がかかり、かつ比較的高い費用を伴う。胃腸障害はまた、動物、例えば、ネコおよびイヌなどのペットとして飼われている動物にも影響を及ぼし得る。そのような障害についてスクリーニングする獣医学的方法も、同様に侵襲的であり、かつ費用がかかる。ヒトおよび動物の両方において胃腸障害を診断するための非侵襲的方法に対する継続的な必要性がある。
糞便試料から真核生物の核酸を単離するための材料および方法を本明細書に提供する。本方法は、懸濁物を形成するために、試料を緩衝液、界面活性剤、およびリボヌクレアーゼ阻害剤と混合する工程と、懸濁物を真核細胞に富む部分と細菌細胞に富む部分とに分離する工程および、真核細胞に富む部分を保持する工程と、溶解物を形成するために、真核細胞に富む部分にカオトロピック剤および任意選択的に界面活性剤を添加する工程と、溶解物を、細胞片層、真核生物の核酸を含む層、および脂質層に分画する工程と、真核生物の核酸を含む層および任意選択的に脂質層を回収する工程と、を含み得る。糞便試料は、ヒトまたは非ヒト動物の糞便試料であり得る。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の糞便試料は、イヌまたはネコから得られた試料であり得る。本方法は、回収された真核生物の核酸を含む層から真核生物の核酸を抽出する工程をさらに含み得る。核酸は、DNA、RNA、総RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、もしくはsnoRNA、またはDNA、RNA、総RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、もしくはsnoRNAのうちのいずれかの組み合わせを含み得る。
真核生物の核酸に富む生物学的試料、例えば糞便試料から核酸を単離するのに有用な方法を本明細書に提供する。本方法は、糞便試料を緩衝液で破砕することを含み得る。試料は、ボルテックス、振とう、撹拌、回転、または固形物および糞便細菌を分散させるのに十分な他の撹拌方法にかけることができる。撹拌および遠心分離工程が実行される温度は、例えば、約4℃〜約20℃に、約4℃〜約1℃に、約4℃〜約10℃に、約4℃〜約6℃に変化し得る。破砕後、試料を1回以上の遠心分離にかけることができる。いくつかの実施形態では、破砕工程および遠心分離は、さらに1回、2回、3回またはそれ以上繰り返され得る。市販の試薬、例えばNuclisens(登録商標)EasyMag(登録商標)試薬は、糞便の破砕、洗浄、および細胞溶解のために使用され得る。溶解緩衝液はまた、真核細胞を溶解するためのものであり得る。溶解物をさらに遠心分離し、上清を自動RNA単離機、例えばEasyMag(登録商標)機器へと投入するために使用することができる。いくつかの実施形態では、抽出された核酸をDNaseで処理して、DNAの溶液を除去することができる。機械的または酵素的細胞破砕、その後のカラムクロマトグラフィーもしくは有機溶媒による抽出などの固相法、例えば、フェノール−クロロホルムもしくはチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出を含む、他の方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸を官能化ビーズ上に抽出することができる。いくつかの実施形態では、官能化ビーズは、磁気コア(「磁気ビーズ」)をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、官能化ビーズは、荷電部分で官能化された表面を含み得る。荷電部分は、アミン、カルボン酸、カルボン酸塩、四級アミン、硫酸塩、スルホン酸塩、またはリン酸塩から選択することができる。
生物学的試料、例えば糞便試料中の選択された結腸直腸新生物バイオマーカーを検出および定量化するためのキットも提供する。したがって、包装された製品(例えば、本明細書に記載される組成物のうちの1つ以上を含み、かつ濃縮または使用準備の整った濃度で貯蔵、出荷、または販売用に包装されている滅菌容器)およびキットも、本発明の範囲内である。製品は、本発明の1つ以上の組成物を含有する容器(例えば、バイアル、ジャー、ボトル、バッグ、マイクロプレート、マイクロチップ、またはビーズ)を含み得る。加えて、製造品は、例えば、包装材料、使用説明書、注射器、送達デバイス、緩衝液、または他の制御試薬をさらに含み得る。
ヒト糞便回収:患者は、便座の上に適合するバケツ内に排便するように依頼され、得られた試料は、それらがハリコフ国立医学大学(ウクライナ国ハリコフ)に輸送されるまで冷凍庫に保存された。糞便を50mLコニカルチューブに分注し、−80℃で保存した。試料は、ドライアイス上でハリコフ国立医科大学からCapital Biosciences(米国メリーランド州ゲーサーズバーグ)に出荷され、すぐに−80°Cの冷凍庫に移された。そこから、試料は、それらが抽出まで−80°Cの冷凍庫に保存されたBioGenerator Labs(米国ミズーリ州セントルイス)にドライアイス上で出荷された。
総核酸抽出:各糞便試料を50mLコニカルチューブ内に置いた。各チューブに、約1,000〜25,000mgの糞便を添加した。追加の20〜40mLの溶液を各チューブに添加した。この溶液は、0.05%Tween−20(Sigma−Aldrich)および0.0002%RNAse阻害剤(Sigma−Aldrich)とハンクス平衡塩類溶液(HBSS)(Sigma−Aldrich)との混合物を含有した。糞便を溶液中に懸濁し、0〜10分間、約0〜10℃で回転させた。溶液を10分間4℃にて1000rpmで遠心分離し、上清を廃棄した。約4〜10mLのEasyMag(登録商標)溶解緩衝液(bioMerieux)をペレットに添加し、ペレットを溶液に再懸濁した。溶液を、10〜15分間20〜25℃にて2500〜3500rpmで遠心分離した。分画遠心分離の間に、溶液は3層に分離した。最下層は固体の細胞破片を含み、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。上部の2層は、新しい15mLコニカルチューブに移し、溶液を再び10分間20〜25℃にて2500rpmで遠心分離した。この遠心分離工程による結果は、3層への分離であった:最下層は固体の細胞破片であり、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。溶液から大きな破片をふるい分けるために、20μLピペットチップを1mLピペットチップ上に置き、2mLの親水性層を15mLチューブからピペットで移し、EasyMag(登録商標)使い捨てカートリッジ(bioMerieux)に移した。加えて、60μLのEasyMag(登録商標)磁性シリカ(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを0.5〜1分間溶液中に混合した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Specific A Protocolを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は70μLであった。この核酸溶液を1.5mLチューブにピペットで移し、氷上に置いた。次に、前の工程で使用されたものと同じEasyMag(登録商標)使い捨てカートリッジ(bioMerieux)に、同じ大きな破片をふるい落とす技術を使用して、前に使用された15mLチューブ中の同じ溶液からの2mLの追加の親水性層を再装填した。追加の20μLのEasyMag(登録商標)磁性シリカ(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを0.5〜1分間溶液中に混合した。上記に記載されるように、ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Specific A Protocolを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は70μLであった。この核酸溶液を、最初の70μLの溶出液を既に含有している元の1.5mLチューブにピペットで移し、合わせた溶液を氷上に置いた。
抽出結果:上記で抽出された試料を使用して、Agilent 2100 Bioanalyzerを使用して、総核酸およびRNA完全性について1μLを評価した。試料を定性的および定量的に分析した。電気泳動分析を使用して、抽出されたRNAの質を調べた。Bioanalyzerの出力の結果を、図1および図2に示されるように、ゲル電気泳動によって分析した。電気泳動ファイル(図1)は、各試料のバンドをRNAラダーのサイズマーカーで表されるバンド(電気泳動図の最初のレーンに示される)と比較し、かつ18Sおよび28SのリボソームRNAバンドを同定することによって読み取られた。リボソームRNA(rRNA)は、標準化ラダー上の2,000個のヌクレオチドマーカーの周りの2つの大きく目立つバンドである。定性的には、適切なバンド形成およびより暗いバンド強度は、十分な無傷の核酸が、マイクロアレイ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸配列決定、分子バーコード化、またはプローブ捕捉などのさらなる分析に利用可能であることを示した。図2は、電気泳動図の例を示す。電気泳動図は、総RNA質量、RIN、および総rRNA質量の定量化を伴う各電気泳動のグラフ表示である。ゲル電気泳動分析は、総核酸およびRNA完全性についての情報を提供した。試料が下流の分析に適格であるかどうかを判定するために、電気泳動ダイヤグラムおよび電気泳動図を各試料について分析した。一例では、本発明に記載される方法を使用して抽出された120個の試料を、分析された120個の試料のうちの110個がRNA完全性およびRNA質量に関して品質チェックに合格するようにRNA品質について分析した(図3)。
総RNA抽出に供された454個の試料のうち、これらの試料のうちの399個の試料は、Agilent Bioanalyzerを使用したリボソームRNAバンドの直接可視化に基づくトランスクリプトーム分析に適格であった。続いて、Affymetrix GeneChip(商標)Human Transcriptome Array 2.0(米国カリフォルニア州サンタクララ)を使用して全トランスクリプトーム分析を行うために、399個の利用可能な試料から342個の試料を無作為に選択した。これらの342個の試料のうち、4個の試料は増幅に失敗し、8人のポリープ患者は、その後の生検で過形成良性ポリープを有すると判定された。これら12個の試料を分析から除外し、最終分析用に330個の試料を得た。
糞便回収:試料は、ネコおよびイヌの飼い主によって米国ミズーリ州セントルイスの地元で回収された。ネコがトイレに排便後、ネコの所有者は、−20℃で50mLコニカルチューブ中に試料を移し、チューブを保存するように依頼された。イヌが屋外で排便後、イヌの所有者は、−20℃で50mLコニカルチューブ中に試料を移し、チューブを保存するように依頼された。回収の一週間以内に、試料を回収し、それらを抽出まで−80℃の冷凍庫に保存されたBioGenerator Labs(米国ミズーリ州セントルイス)に手動で移した。
総核酸抽出:各糞便試料を50mLコニカルチューブ内に置いた。各チューブに、約1,000〜25,000mgの糞便を添加した。追加の20〜40mLの溶液を各チューブに添加した。この溶液は、0.05%Tween−20(Sigma−Aldrich)および0.0002%RNAse阻害剤(Sigma−Aldrich)とハンクス平衡塩類溶液(HBSS)(Sigma−Aldrich)との混合物を含有した。糞便を溶液中に懸濁し、0〜10分間、約0〜10℃で回転させた。溶液を10分間4℃にて1000rpmで遠心分離し、上清を廃棄した。約4〜10mLのEasyMag(登録商標)溶解緩衝液(bioMerieux)をペレットに添加し、ペレットを溶液に再懸濁した。溶液を、10〜15分間20〜25℃にて2500〜3500rpmで遠心分離した。分画遠心分離の間に、溶液は3層に分離した。最下層は固体の細胞破片を含み、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。上部の2層は、新しい15mLコニカルチューブに移し、溶液を再び10分間20〜25℃にて2500rpmで遠心分離した。この遠心分離工程による結果は、3層への分離であった:最下層は固体の細胞破片であり、中間層はヒト核酸に富む親水性層であり、最上層は疎水性脂質層であった。溶液から大きな破片をふるい分けるために、20μLピペットチップを1mLピペットチップ上に置き、2mLの親水性層を15mLチューブからピペットで移し、EasyMag(登録商標)使い捨てカートリッジ(bioMerieux)に移した。加えて、60μLのEasyMag(登録商標)磁性シリカ(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを0.5〜1分間溶液中に混合した。ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Specific A Protocolを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は70μLであった。この核酸溶液を1.5mLチューブにピペットで移し、氷上に置いた。次に、前の工程で使用されたものと同じEasyMag(登録商標)使い捨てカートリッジ(bioMerieux)に、同じ大きな破片をふるい落とす技術を使用して、前に使用された15mLチューブ中の同じ溶液からの2mLの追加の親水性層を再装填した。追加の20μLのEasyMag(登録商標)磁性シリカ(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ピペットを使用して、ビーズを0.5〜1分間溶液中に混合した。上記に記載されるように、ビーズに結合された核酸を、製造元の指示に従って、Specific A Protocolを使用して緩衝液中に溶出した。溶出された核酸の量は70μLであった。この核酸溶液を、最初の70μLの溶出液を既に含有している元の1.5mLチューブにピペットで移し、合わせた溶液を氷上に置いた。
抽出結果:上記で抽出された試料を使用して、Agilent 2100 Bioanalyzerを使用して、それぞれ1μLの総核酸およびRNA完全性について評価した。試料を定性的および定量的に分析した。Bioanalyzerの出力の結果を、図7に示されるように、ゲル電気泳動によって分析した。図7のパネルは、Agilent RNA 6000ナノキットを使用して実験された8つの試料からの1μLのRNAのBioanalyzerトレースを示す。ゲル電気泳動分析は、総核酸ならびにRNA完全性および質量に関する情報を提供した。電気泳動ファイルは、各試料のバンドをRNAラダー内のサイズマーカーによって表されるバンド(電気泳動図の最初のレーンに示される)と比較し、かつ18Sおよび28S真核生物リボソームRNAバンドを同定することによって読み取られた。定性的には、適切なバンド形成およびより暗いバンド強度は、十分な無傷の核酸が、マイクロアレイ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸配列決定、分子バーコード化、またはプローブ捕捉などのさらなる分析に利用可能であることを示した。試料の品質も、RNA完全性数を使用して定性的に分析した。図7Bは、Agilent RNA 6000ナノキットを使用して実験された同じ8つの試料それぞれのRNA完全性値を示す。試料質量も定量的に分析した。図7Cは、Agilent RNA 6000ナノキットを使用して実験された同じ8つの試料からの推定真核生物RNA濃度(μg/μL)を示す。真核生物のRNA濃度を、BioAnalyzerトレースの曲線下面積を使用して推定した。図7B〜Cに示されるように、すべての試料についての平均RINは4.2であり、すべての試料についての平均真核生物質量は61.4ng/μLであった。定量的および定性的測定は、すべての試料がバイオマーカー発現分析に適格である(n=8)ことを示した。
バイオマーカー発現分析に適格である(n=4)すべてのイヌ試料を、RT−qPCRを使用して評価した。これら4つのイヌ試料について、5つのプライマーを設計して、イヌゲノムの一部分を評価した。イヌT細胞上のIgMの重鎖を評価することによって陽性対照として作用するように2つのプライマーを設計した。3つの追加のプライマーを設計し、イヌリンパ球前駆体において起こり得る2つの別々の再配列を評価してT細胞特異的RNAを検出した。各RT−PCR反応は、10μLの2X Master Mix(New England Biolabs)、1μLの20X Enzyme Mix(New England BioLabs)、0.8μLの10μMフォワードプライマー(Eurofins Genomics)、0.8μLの10μMリバースプライマー(Eurofins Genomics)、1μLの20X SYBR Green I、2μLのRNA、および4.4μLの分子生物学グレードH2O(Thermo Scientific)を含んだ。Applied Biosystems QuantStudio5 qPCR装置を使用して、核酸を増幅させた。サーモサイクラープロトコルは以下のとおりであった:RNAをDNAに逆転写するために55℃で25分、95℃で1分間の逆転写酵素不活性化、増幅および信号回収のために95℃で10秒および60℃で45秒の60サイクル、ならびに次に、70℃〜95℃の融解曲線。総RNA抽出に供された4つのイヌ試料のうち、75%の試料が陽性対照(C−mu IgM)の増幅を示した(図8A)。陽性対照の増幅を示した個体のうち、100%(n=3)が両方のT細胞特異的RNA転写物の増幅を示した。T細胞特異的転写物の一方は35サイクルで増幅し、他方のT細胞特異的転写物は50サイクルで増幅した(図8B)。
バイオマーカー発現分析に適格である(n=4)すべてのイヌ試料を、RT−qPCRを使用して評価した。これら4つのイヌ試料について、6つのプライマーセットを設計して、リンパ球に関連するイヌゲノムの一部分を評価した(図15A)。設計された6つのプライマーセットのうち、1つのプライマーセットを使用して、イヌリンパ球前駆体において起こり得る2つの別々の再配列を評価してB細胞特異的RNAを検出した。各反応は、10μLの2X Master Mix(New England Biolabs)、1μLの20X Enzyme Mix(New England BioLabs)、0.8μLの10μMフォワードプライマー(Eurofins Genomics)、0.8μLの10μMリバースプライマー(Eurofins Genomics)、1μLの20X SYBR Green I、2μLのRNA、および4.4μLの分子生物学グレードH2O(Thermo Scientific)を含んだ。Applied Biosystems QuantStudio5 qPCR装置を使用して、溶液を増幅させた。サーモサイクラープロトコルは以下のとおりであった:RNAをDNAに逆転写するために55℃で25分、95℃で1分間の逆転写酵素不活性化、増幅および信号回収のために95℃で10秒および60℃で45秒の60サイクル、ならびに次に70℃〜95℃の融解曲線。これらの増幅反応の例を図16Aに示す。各試料について2つのB細胞特異的RT−qPCR反応があり(n=8)、これらの反応のうち、87.5%(8つのうちの7つ)がB細胞関連転写物の増幅を示した。B細胞特異的転写物は、30〜35サイクルの間に増幅した(図16A)。
糞便回収:試料は、ネコの飼い主によってミズーリ州セントルイスの地元で回収された。ネコがトイレに排便後、ネコの所有者は、−20℃で50mLコニカルチューブ中に試料を移し、チューブを保存するように依頼された。産生の一週間以内に、試料を回収し、それらを抽出まで−80°Cの冷凍庫に保存されたBioGenerator Labs(米国ミズーリ州セントルイス)に手動で移した。
抽出結果:上記で抽出された試料を使用して、Agilent 2100 Bioanalyzerを使用して、それぞれ1μLの総核酸およびRNA完全性について評価した。試料を定性的および定量的に分析した。Bioanalyzerの出力の結果を、図14に示されるようにゲル電気泳動によって分析した。図14は、Agilent RNA 6000ナノキットを使用して実験された8つの試料からの1μLのRNA Bioanalyzerトレースを示す。これは4匹の個々のネコを含んだ。ゲル電気泳動分析は、総核酸ならびにRNA完全性および質量に関する情報を提供した。電気泳動ファイルは、各試料のバンドをRNAラダー内のサイズマーカーによって表されるバンド(電気泳動図の最初のレーンに示される)と比較し、かつ18Sおよび28S真核生物リボソームRNAバンドを同定することによって読み取られた。定性的には、適切なバンド形成およびより暗いバンド強度は、十分な無傷の核酸が、マイクロアレイ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸配列決定、分子バーコード化、またはプローブ捕捉などのさらなる分析に利用可能であることを示した。試料のうちの100%が、RNA完全性数および真核生物細胞質量の量に基づく分析に適格であった。真核生物の濃度は、Bioanalyzerトレースの18Sおよび28Sの真核生物のリボソームRNAバンド下の面積に基づいて推定された。図14は、4匹の個々のネコについての生物学的複製物を示す。生物学的複製物と個々のネコについての明確なバンド形成との間に同様のバンド形成があった(図14)。
バイオマーカー発現分析に適格であった(n=5)すべての個々のネコ試料を、RT−qPCRを使用して評価した。合計4つのプライマーセットを設計して、リンパ球関連転写物および上皮細胞関連対照を評価した(図15B)。1つのプライマーセットを設計し、ネコリンパ球前駆体において起こり得る再配列を評価してT細胞特異的RNAを検出した。各反応は、10μLの2X Master Mix(New England BioLabs)、1μLの20X Enzyme Mix(New England BioLabs)、0.8μLの10μMフォワードプライマー(Eurofins Genomics)、0.8μLの10μMのリバースプライマー(Eurofins Genomics)、1μLの20X SYBR Green I、2μLのRNA、および4.4μLの分子生物学グレードH2O(Thermo Scientific)を含んだ。Applied Biosystems QuantStudio5 qPCR装置を使用して、溶液を増幅させた。サーモサイクラープロトコルは以下のとおりであった:RNAをDNAに逆転写するために55℃で25分、95℃で1分間の逆転写酵素不活性化、増幅および信号回収のために95℃で10秒間および次に60℃で45秒間の60サイクル。これらの増幅事象の例を図16Bに示す。選択されたT細胞再配列について分析された5つのネコ試料のうち、合計12個の反応において、75%の反応がT細胞関連転写物の増幅を示した。試験されたすべてのT細胞再配列は、少なくとも1匹のネコにおいて増幅を示した(図16B)。
ヒト大腸癌および前癌性腺腫に関連する遺伝子をさらに分析するために、追加の70個のヒト試料を上記に記載されるRNA抽出法に供した。抽出されたRNAは、遺伝子発現の直接多重測定に基づくデジタルカラーコードバーコード技術を利用するナノストリングnCounter分析システムを使用して分析された。70個の試料のうち、48個を、MAPK、STAT、PI3K、RAS、細胞周期、アポトーシス、Hedgehog、Wnt、DNA Damage Control、転写調節、クロマチン修飾、およびTGF−βを含む13個の癌関連標準経路からの770個の遺伝子を含む、nCounter(登録商標)PanCancer経路パネルを使用して分析した。残りの22個の試料を、血管新生、細胞外マトリックスリモデリング(ECM)、上皮間葉転換(EMT)、および転移を含む癌進行プロセスの各段階からの770個の遺伝子を含む、nCounter(登録商標)PanCancer進行パネルを使用して分析した。これら22個の試料を、ACTB、B2M、BMP3、CD274、CD8A、GAPDH、HPRT1、N−BLR、NDRG4、およびRNU2−1を含む10個の「スパイクイン」遺伝子についても評価した。
Claims (37)
- 糞便試料から真核生物の核酸を単離する方法であって、
a)懸濁物を形成するために、前記試料を緩衝液、界面活性剤、およびリボヌクレアーゼ阻害剤と混合する工程と、
b)前記懸濁物を真核細胞に富む部分と細菌細胞に富む部分とに分離する工程および前記真核細胞に富む部分を保持する工程と、
c)溶解物を形成するために、前記真核細胞に富む部分にカオトロピック剤および任意選択的に界面活性剤を添加する工程と、
d)前記溶解物を、細胞片層、真核生物の核酸を含む層、および脂質層に分画する工程と、
e)前記真核生物の核酸を含む層および任意選択的に前記脂質層を回収する工程と
を含む、方法。 - 糞便試料を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記糞便試料がヒトの糞便試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記糞便試料が非ヒト動物の糞便試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記非ヒト動物が、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、反すう動物、クマ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、水牛、シカ、エルク、ムース、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、厚皮動物、サイ、およびチンチラからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記非ヒト動物がイヌである、請求項5に記載の方法。
- 前記非ヒト動物がネコである、請求項5に記載の方法。
- 前記分離工程が遠心分離を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分離工程がカラムベースの方法を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分離工程が、真核細胞に結合する標的指向化プローブを利用する、請求項1に記載の方法。
- 前記分離工程が示差的濾過を利用する、請求項1に記載の方法。
- 工程aおよびbが、1、2、3、4回またはそれ以上繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 前記分画工程が遠心分離を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分画工程が、真核生物の核酸に特異的に結合する標的指向化プローブを利用する、請求項1に記載の方法。
- 前記分画工程が示差的濾過を利用する、請求項1に記載の方法。
- 工程dおよびeが2回以上繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 前記真核生物の核酸を含む層が小口径チップを使用して回収される、請求項1に記載の方法。
- 回収された前記真核生物の核酸を含む層から前記真核生物の核酸を抽出する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抽出方法が、磁性粒子ベース、カラムベース、フィルタベース、ビーズベース、または有機溶媒ベースの方法である、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸が、DNA、RNA、総RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、もしくはsnoRNA、またはDNA、RNA、総RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、もしくはsnoRNAのうちのいずれかの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 糞便試料中の真核生物バイオマーカーを検出する方法であって、請求項1に記載の抽出された核酸をマイクロアレイ配列決定、分子バーコード化、プローブ捕捉、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ddPCR、RT−PCR、RT−qPCR、または核酸配列決定によって分析する工程を含む、方法。
- 前記真核生物バイオマーカーが、図6(パネルA)または図13(パネルB)に列挙されたバイオマーカーから選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記真核生物バイオマーカーが、B細胞マーカー、T細胞マーカー、または免疫グロブリンである、請求項21に記載の方法。
- 対象に大腸癌の危険性があるかどうかを判定する方法であって、
a)前記対象由来の生物学的試料中の、図6(パネルA)または図13(パネルB)に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいずれかから選択される2つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
b)前記生物学的試料中の前記2つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の前記測定された発現レベルを、対照中の前記2つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、前記対照中の前記2つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルに対する前記生物学的試料中の前記2つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルにおける差は、前記対象に大腸癌の危険性があることを示す、工程と
を含む、方法。 - 前記生物学的試料が、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法に従って単離されたヒト核酸を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図5Aに示される200個の示差的に発現される転写物クラスター内に含まれ、かつ図5Bに示される大腸癌に関連する共通経路内に含まれる、請求項24に記載の方法。
- 前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図6(パネルA)または図13(パネルB)に列挙されたバイオマーカーから選択される、請求項24に記載の方法。
- 大腸癌を有するかまたはその危険性がある対象についての臨床計画を選択する方法であって、
a)前記対象由来の生物学的試料中の、図6(パネルA)または図13(パネルB)に列挙された結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子のうちのいずれかから選択される2つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
b)前記生物学的試料中の前記2つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の前記測定された発現レベルを、対照中の前記2つ以上の結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、前記対照中の前記2つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルに対する前記生物学的試料中の前記2つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルにおける差は、前記対象が大腸癌を有するかまたはその危険性があることを示す、工程と、
c)工程bに基づいて臨床計画を選択する工程と
を含む、方法。 - 前記生物学的試料が、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法に従って単離されたヒト核酸を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図5Aに示される200個の示差的に発現される転写物クラスター内に含まれ、かつ図5Bに示される大腸癌に関連する共通経路内に含まれる、請求項28に記載の方法。
- 前記結腸直腸新生物バイオマーカー遺伝子が、図6(パネルA)または図13(パネルB)に列挙されたバイオマーカーから選択される、請求項28に記載の方法。
- 非ヒト動物に胃腸障害の危険性があるかどうかを判定する方法であって、
a)対象由来の生物学的試料中の1つ以上のB細胞、T細胞、または免疫グロブリン遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
b)前記試料中の前記1つ以上のB細胞、T細胞、または免疫グロブリン遺伝子の前記測定された発現レベルを、対照中の1つ以上のB細胞、T細胞、または免疫グロブリン遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、前記対照中の前記1つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルに対する前記生物学的試料中の前記1つ以上の遺伝子の前記測定された発現レベルにおける差は、前記対象に胃腸障害の危険性があることを示す、工程と
を含む、方法。 - 前記生物学的試料が、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法に従って単離された非ヒト動物核酸を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記胃腸障害が、胃腸リンパ腫または炎症性腸疾患を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記非ヒト動物がネコである、請求項32に記載の方法。
- 前記非ヒト動物がイヌである、請求項32に記載の方法。
- 前記生物学的試料が糞便試料を含む、請求項32に記載の方法。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662413708P | 2016-10-27 | 2016-10-27 | |
US62/413,708 | 2016-10-27 | ||
US201762523511P | 2017-06-22 | 2017-06-22 | |
US62/523,511 | 2017-06-22 | ||
US201762547046P | 2017-08-17 | 2017-08-17 | |
US62/547,046 | 2017-08-17 | ||
PCT/US2017/058789 WO2018081580A1 (en) | 2016-10-27 | 2017-10-27 | Detection method |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020500551A true JP2020500551A (ja) | 2020-01-16 |
JP2020500551A5 JP2020500551A5 (ja) | 2020-07-02 |
JP7109462B2 JP7109462B2 (ja) | 2022-07-29 |
Family
ID=62024023
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019544790A Active JP7109462B2 (ja) | 2016-10-27 | 2017-10-27 | 検出方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11479820B2 (ja) |
EP (1) | EP3532637A4 (ja) |
JP (1) | JP7109462B2 (ja) |
CN (1) | CN110291197B (ja) |
AU (1) | AU2017348369B2 (ja) |
CA (1) | CA3077798A1 (ja) |
WO (1) | WO2018081580A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3532637A4 (en) | 2016-10-27 | 2020-10-14 | Geneoscopy, LLC | PROOF PROCEDURE |
CA3136405A1 (en) | 2018-06-01 | 2019-12-05 | Geneoscopy, Inc. | Detection method for cancer using rna biomarkers |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008093530A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Yoshikawa:Kk | 凝集剤溶解装置 |
JP2010010914A (ja) * | 2008-06-25 | 2010-01-14 | Sony Corp | 画像処理装置および方法、並びにプログラム |
WO2010134246A1 (ja) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | オリンパス株式会社 | 核酸含有試料の調製方法 |
WO2010134245A1 (ja) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | オリンパス株式会社 | 哺乳細胞由来核酸の回収方法、核酸解析方法、及び採便用キット |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1287165B1 (en) | 2000-06-02 | 2007-06-13 | Bayer Corporation | Method for detection and localization of genes in situ using branched-DNA hybridisation |
JP4033820B2 (ja) * | 2003-07-29 | 2008-01-16 | 株式会社日立製作所 | 細胞回収方法 |
JP2007175021A (ja) | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Sysmex Corp | 大腸がんのリンパ節転移マーカー |
EP1862803A1 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-05 | Atlas Antibodies AB | Use of protein SATB2 as a marker for colorectal cancer |
JP2009539404A (ja) | 2006-06-12 | 2009-11-19 | オンコメチローム サイエンシズ エス.エイ. | 大腸癌の早期検出および予後のためのメチル化マーカー |
US20100196889A1 (en) | 2006-11-13 | 2010-08-05 | Bankaitis-Davis Danute M | Gene Expression Profiling for Identification, Monitoring and Treatment of Colorectal Cancer |
WO2008093530A1 (ja) | 2007-01-30 | 2008-08-07 | National University Corporation, Hamamatsu University School Of Medicine | 大腸癌病期検出方法 |
WO2009042676A1 (en) | 2007-09-24 | 2009-04-02 | University Of South Florida | Method for early detection of cancers |
JP5616786B2 (ja) * | 2008-05-12 | 2014-10-29 | オリンパス株式会社 | 糞便処理容器 |
EP2314677A4 (en) | 2008-07-23 | 2011-12-14 | Olympus Corp | METHOD OF TAKING NUCLEIC ACID FROM A CHAIR SAMPLE, NUCLEIC ACID ANALYSIS METHOD AND DEVICE FOR TREATING CHAIR SAMPLES |
WO2010042903A1 (en) * | 2008-10-09 | 2010-04-15 | Alfagene Bioscience, Inc | Use and identification of biomarkers for gastrointestinal diseases |
US20100112713A1 (en) | 2008-11-05 | 2010-05-06 | The Texas A&M University System | Methods For Detecting Colorectal Diseases And Disorders |
WO2012087144A2 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Agendia N.V. | Methods and means for molecular classification of colorectal cancers |
KR20140057354A (ko) | 2011-08-31 | 2014-05-12 | 온코사이트 코포레이션 | 결장직장암의 치료 및 진단을 위한 방법 및 조성물 |
RU2015145610A (ru) | 2013-03-27 | 2017-05-04 | Дженентек, Инк. | Применение биомаркеров для оценки лечения желудочно-кишечных воспалительных расстройств антагонистами бета7 интегрина |
WO2015017537A2 (en) | 2013-07-30 | 2015-02-05 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Colorectal cancer recurrence gene expression signature |
US20180282815A1 (en) | 2015-04-29 | 2018-10-04 | Geneoscopy, Llc | Colorectal cancer screening method and device |
EP3532637A4 (en) | 2016-10-27 | 2020-10-14 | Geneoscopy, LLC | PROOF PROCEDURE |
CA3136405A1 (en) | 2018-06-01 | 2019-12-05 | Geneoscopy, Inc. | Detection method for cancer using rna biomarkers |
-
2017
- 2017-10-27 EP EP17863995.1A patent/EP3532637A4/en active Pending
- 2017-10-27 JP JP2019544790A patent/JP7109462B2/ja active Active
- 2017-10-27 CA CA3077798A patent/CA3077798A1/en active Pending
- 2017-10-27 WO PCT/US2017/058789 patent/WO2018081580A1/en unknown
- 2017-10-27 US US16/345,437 patent/US11479820B2/en active Active
- 2017-10-27 CN CN201780080634.4A patent/CN110291197B/zh active Active
- 2017-10-27 AU AU2017348369A patent/AU2017348369B2/en active Active
-
2022
- 2022-08-15 US US17/887,752 patent/US20230203591A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008093530A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Yoshikawa:Kk | 凝集剤溶解装置 |
JP2010010914A (ja) * | 2008-06-25 | 2010-01-14 | Sony Corp | 画像処理装置および方法、並びにプログラム |
WO2010134246A1 (ja) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | オリンパス株式会社 | 核酸含有試料の調製方法 |
WO2010134245A1 (ja) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | オリンパス株式会社 | 哺乳細胞由来核酸の回収方法、核酸解析方法、及び採便用キット |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
"NucliSENS Lysis Buffer", BIOMERIEUX, vol. REF.200292, JPN6021035697, January 2015 (2015-01-01), ISSN: 0004591118 * |
MAEDA S. ET AL., J VET INTERN MED, vol. 27, JPN6021035696, 2013, pages 47 - 55, ISSN: 0004591117 * |
STAUBER J. ET AL., CELLULAR IMMUNOLOGY, vol. 303, JPN6021035699, 6 April 2016 (2016-04-06), pages 43 - 49, ISSN: 0004591119 * |
YU J. ET AL., CELLULAR AND MOLECULAR GASTROENTEROLOGY AND HEPATOLOGY, vol. 2, no. 2, JPN6021035700, March 2016 (2016-03-01), pages 158 - 174, ISSN: 0004591116 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110291197B (zh) | 2024-01-12 |
CN110291197A (zh) | 2019-09-27 |
US20190271046A1 (en) | 2019-09-05 |
EP3532637A1 (en) | 2019-09-04 |
AU2017348369A1 (en) | 2019-06-13 |
US11479820B2 (en) | 2022-10-25 |
JP7109462B2 (ja) | 2022-07-29 |
AU2017348369B2 (en) | 2023-09-28 |
WO2018081580A1 (en) | 2018-05-03 |
CA3077798A1 (en) | 2018-05-03 |
EP3532637A4 (en) | 2020-10-14 |
US20230203591A1 (en) | 2023-06-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11597966B2 (en) | Non-invasive diagnosis of graft rejection in organ transplant patients | |
US20220177976A1 (en) | Colorectal cancer screening method and device | |
US20230203591A1 (en) | Detection method using eukaryotic cells | |
US20220119881A1 (en) | Systems and methods for sample preparation, sample sequencing, and sequencing data bias correction and quality control | |
CN109477145A (zh) | 炎症性肠病的生物标志物 | |
US20240093312A1 (en) | Detection method | |
Campbell et al. | Chromosomal alterations in oligodendroglial tumours over multiple surgeries: is tumour progression associated with change in 1p/19q status? |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190807 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200410 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201022 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210421 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210805 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210909 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211206 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220404 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220624 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220711 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220719 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7109462 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |