CN110291197B - 检测方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于从人类或非人类动物粪便样品分离真核核酸的材料和方法。还提供了分析存在于人类或非人类动物粪便样品中的真核生物标志物的方法。

Description

检测方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月27日提交的美国临时申请第62/413,708号、2017年6月22日提交的美国临时申请第62/523,511号和2017年8月17日提交的美国临时申请第62/547,046号的优先权，所述临时申请的公开内容以全文引用的方式明确地并入本文中。
技术领域
本发明涉及从粪便样品提取真核核酸和使用所述核酸诊断和治疗肠疾病。
背景技术
胃肠病症，例如胃肠癌，和其它消化疾病，如炎性肠病、肠易激综合征和克罗恩病(Crohn's disease)，是普遍存在的。在美国，胃肠病症估计每年影响6000万至7000万人。对于一些病症，早期筛查和诊断已经使得患者的死亡率降低和生活品质提高。然而，标准诊断方法，如结肠镜检查，是侵入性的，耗时的，并且与相对高的成本相关。胃肠病症还可以影响动物，例如，作为宠物饲养的动物，如猫和狗。筛查此类病症的兽医学方法同样是侵入性的并且成本很高。一直需要在人类和动物中诊断胃肠病症的非侵入性方法。
发明内容
本文提供了用于从粪便样品分离真核核酸的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：将所述样品与缓冲剂、表面活性剂和核糖核酸酶抑制剂混合以形成悬浮液；将所述悬浮液分离成富含真核细胞的部分和富含细菌细胞的部分，并且保留所述富含真核细胞的部分；向所述富含真核细胞的部分添加离液剂和任选地表面活性剂以形成裂解物；将所述裂解物分级成细胞碎片层，包含真核核酸的层，和脂质层；和收集所述包含真核核酸的层和任选地所述脂质层。所述粪便样品可以是人类或非人类动物粪便样品。在一些实施例中，所述非人类动物粪便样品可以是从狗或猫获得的样品。所述方法可以进一步包括从所述收集的包含真核核酸的层提取所述真核核酸。所述核酸可以包括DNA、RNA、总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或sno RNA，或任何DNA、RNA、总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或snoRNA的组合。
还提供了用于检测粪便样品中的真核生物标志物的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：通过微阵列测序、分子条形码、探针捕获、聚合酶链反应(PCR)、ddPCR、RT-PCR、RT-qPCR或核酸测序分析所述提取的核酸。在一些实施例中，所述真核生物标志物选自图6(A组)或图13(B组)中列出的生物标志物。在一些实施例中，所述真核生物标志物可以是B细胞标志物、T细胞标志物或免疫球蛋白。
还提供了用于确定受试者是否有结肠直肠癌风险的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：测量来自所述受试者的生物样品中的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因选自图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因中的任一种；比较所述样品中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所述测量的表达水平与对照中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平，其中所述生物样品中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者有结肠直肠癌风险。在一些实施例中，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因可以含于图5A中所示的200个差异表达的转录物簇内并且含于图5B中所示的与结肠直肠癌相关的共同途径内。在一些实施例中，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因可以选自图6(A组)或图13(B组)中列出的所述生物标志物。
还提供了用于患有结肠直肠癌或有结肠直肠癌风险的受试者的临床计划的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：测量来自所述受试者的生物样品中的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因选自图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因中的任一种；比较所述样品中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所述测量的表达水平与对照中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平，其中所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者患有结肠直肠癌或有结肠直肠癌风险；和基于以下选择临床计划：所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者患有结肠直肠癌或有结肠直肠癌风险。
还提供了用于确定非人类动物是否有胃肠病症风险的方法和组合物。所述方法可以包括以下步骤：测量来自所述受试者的生物样品中的一种或多种B细胞、T细胞或免疫球蛋白基因的表达水平；比较所述样品中的所述一种或多种B细胞、T细胞或免疫球蛋白基因的所述测量的表达水平与对照中的一种或多种B细胞、T细胞或免疫球蛋白基因的所测量表达水平，其中所述生物样品中的所述一种或多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述一种或多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者有胃肠病症风险。所述胃肠病症可以是胃肠淋巴瘤或炎性肠病。所述非人类动物可以是猫或狗。所述生物样品可以是粪便样品。
附图说明
本发明的这些和其它特征和优势将在本发明的优选实施例的以下详细描述中更充分公开或显而易见，所述详细描述将与附图一起考虑，其中类似数字表示类似部分，并且此外其中：
图1是电泳文件运行。电泳分析用于检查提取的RNA的品质。
图2是电泳图。电泳图用于检查提取的RNA的品质。
图3是提取概述。这描绘了使用实例2中描述的提取方法评估的120个样品的品质检查的概述。
图4A是描绘比较总RNA提取方法的实验的结果的图。图4A展示了使用实例2中描述的提取方法通过品质检查的样品的总数目。
图4B描绘了来自各种提取方法的五次电泳运行
图5A是展示差异表达的转录物簇的热图。如所展示，使用200个转录物簇产生热图，所述转录物簇映射到187个不同基因，并且在训练集中分析265个样品。样品按组排序：癌症(红色)、癌前腺瘤(橙色)和正常(绿色)。
图5B展示了使用GAGE R-Package的差异表达的GO项和途径(p<0.05)。每个条的高度详述了每个途径内富集基因的集大小，并且蓝色线展示了每个途径的-log(p值)。红色虚线指示显著性(p＝0.05)。
图6展示了鉴定为在结肠直肠赘瘤中差异表达的基因的列表。
图7A描绘了电泳运行，展示4个个别猫样品和4个个别犬样品。
图7B展示了4个个别猫样品和4个个别犬样品的RNA完整性数(RIN)和所有八个样品的平均值。
图7C展示了4个个别猫样品和4个个别犬样品的从电泳运行估算的真核RNA浓度(ng/uL)和所有8个样品的平均质量。
图8A描绘了用于鉴定犬样品中淋巴细胞相关转录物的存在的IgM Cμ重链区的RT-qPCR结果。
图8B描绘了犬样品中的T细胞受体γ区的两次重组的RT-qPCR结果。
图9描绘了猫样品中的肌动蛋白-B的RT-qPCR结果。
图10A描绘了使用昂飞(Affymetrix)人类转录物组阵列的70,524个转录物簇表达水平的4个技术重复。
图10B描绘了使用昂飞人类转录物组阵列的70,524个转录物簇表达水平的4个生物重复。
图10C描绘了使用昂飞人类转录物组阵列分析70,524个转录物簇表达水平的间隔6个月测试的6个技术重复。
图11A描绘了使用昂飞人类转录物组阵列的5,149个转录物簇表达水平的4个技术重复。
图11B描绘了使用昂飞人类转录物组阵列的5,149个转录物簇表达水平的4个生物重复。
图11C描绘了使用昂飞人类转录物组阵列分析5,149个转录物簇表达水平的间隔6个月测试的6个技术重复。
图12A描绘了来自文献中的提取方法的比较电泳图和电泳文件运行。
图12B描绘了来自实例2中描述的提取方法的电泳图和电泳文件运行。
图13展示了鉴定为在结肠直肠赘瘤中差异表达的基因以及牵涉癌症、结肠直肠赘瘤和/或胃肠健康的基因的列表。
图14描绘了来源于4个个别猫的8个样品的电泳文件运行，证明了生物重复当中的真核和原核RNA特征的一致性。
图15A是展示用于犬样品的RT-qPCR分析的引物的表。
图15B是展示用于猫样品的RT-qPCR分析的引物的表。
图16A描绘了用于鉴定犬样品中淋巴细胞特异性转录物的存在的B细胞免疫球蛋白的两次重排的RT-qPCR结果。
图16B描绘了用于鉴定猫样品中淋巴细胞特异性转录物的存在的T细胞受体γ区的六次重排的RT-qPCR结果。
具体实施方式
对优选实施例的此类描述希望结合附图来阅读，附图被视为本发明的整个书面描述的一部分。图未必按比例绘制，并且为了清楚和简明起见，本发明的某些特征可能在比例上放大地示出或以某种程度上示意性形式示出。在说明书中，相对术语如“水平”、“垂直”、“向上”、“向下”、“顶部”和“底部”以及其衍生物(例如，“水平地”、“朝下”、“朝上”等)应被解释为指代所描述的方向或如所讨论的图中所示。这些相对术语是为了便于描述，并且通常并不意图要求特定的方向。包括“朝内”对“朝外”、“纵向”对“横向”等的术语适当时应当相对于彼此或相对于伸长轴或旋转轴或旋转中心来解释。关于附接、偶联等的术语(如“连接”和“互连”)是指其中结构彼此间直接地或经由插入结构间接地固定或附接的关系，以及可移动或刚性附接或关系两者，除非以其它方式明确地描述。术语“可操作地连接”是此类附接、偶联或连接，其使得相关结构凭借所述关系按预期操作。当仅说明单个机器时，术语“机器”还应被视为包括机器的任何集合，所述机器个别地或共同地执行一组(或多组)指令以执行本文中论述的方法中的任一个或多个。在权利要求书中，装置加功能条款(如果使用的话)旨在涵盖由用于执行所述功能的书面描述或图式所描述、建议或显而易见的结构，不仅包括结构等效物而且包括等效结构。
本发明部分基于本发明人开发的一种将粪便样品(例如从哺乳动物获得的粪便样品)中的真核细胞与细菌细胞分离的方法。在结肠内，每克肠内容物约有1012个细菌细胞。这种结肠微生物群可以包括300-1000个物种。粪便或大便样品是一种复杂的大分子混合物，不仅包括从胃肠道肠腔中脱落的真核细胞，而且包括微生物，包括细菌和任何胃肠寄生虫，难以消化的未被吸收的食物残渣、肠细胞分泌物、和排泄物如粘液和色素。正常粪便由约75％的水和25％的固体物质组成。细菌占粪便总干质量的约60％。高细菌负荷可导致用于检测来自粪便样品的真核生物标志物的信噪比不利。此外，真核信号可能会大幅衰减。此类真核核酸的提取和处理可能会促进或加速衰减，这会严重限制进一步分析。
本文公开的方法和材料包括从粪便样品分离真核核酸的方法。可以评估此类真核核酸的特定生物标志物的水平，其可以指示真核生物(例如哺乳动物)中的胃肠病症或疾病。哺乳动物可以是人类或非人类动物，例如人类、狗、猫、非人类灵长类动物、反刍动物、熊科动物、马科动物、猪、绵羊、山羊、骆驼、水牛、鹿、麋鹿、驼鹿、鼬科动物、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、厚皮动物、犀牛或灰鼠。
本发明人已经发现，他们可以有效地将真核生物粪便样品中的真核细胞与细菌细胞分离。本发明人还已经发现，他们可以检测从此类真核细胞分离的RNA中的真核生物标志物。此类生物标志物可以用于检测胃肠病症，例如结肠直肠癌、脂泻病、克罗恩病、胃炎、肠胃炎、胃癌、胃溃疡、坏死性小肠结肠炎、胃肠间质瘤、胃肠淋巴瘤、胃肠瘤形成、淋巴肉瘤、腺癌、炎性肠病、肠易激综合征、胰脏瘤形成、肝脏瘤形成、胆管癌、结肠炎、猫白血病病毒、牛病毒性腹泻、空肠出血综合征、肠胃炎、恶性卡他热(malignant catarrhal fever)、猫泛白细胞减少症、小肠纤维化、浸润性结肠疾病、隐孢子虫病、球虫病和其它动物性寄生虫感染，或冠状病毒、微小病毒、星状病毒、诺如病毒或轮状病毒感染。本文提供了用于确定受试者(例如人类、狗或猫)是否有胃肠疾病(例如结肠直肠癌、淋巴瘤或炎性肠病或其它疾病)风险的材料和方法。还提供了用于诊断疾病的材料和方法以及鉴定受试者的健康状态的方法。
本文公开的方法和组合物通常并且不同地用于检测、诊断和治疗胃肠健康。检测方法可以包括测量来自患有胃肠病症或疑似患有胃肠病症的受试者(例如患者)的样品中的一种、两种或更多种生物标志物在粪便样品中的表达水平，以及比较所述测量的表达水平与对照中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平。受试者样品中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平相对于对照中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平的差异是受试者患有胃肠病症的指示。在一些实施例中，受试者样品中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平相对于对照中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平的差异是受试者(例如患者)有胃肠病症风险的指示。
在另一实施例中，检测疾病的方法可以包括测量受试者的粪便样品中的一种、两种或更多种生物标志物的相对表达水平比例(例如相对比率)，和比较这些生物标志物的相对比例与对照中的一种、两种或更多种生物标志物的相对表达水平比例。受试者样品中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量相对表达水平比例相对于对照的差异是受试者患有胃肠疾病的指示。在一些实施例中，受试者样品中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平比例相对于对照中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平比例的差异是受试者有胃肠病症风险的指示。
所述方法可以包括测定从由患者获得的粪便样品分离的人类RNA中的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物的表达水平，确定两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的水平相对于对照中的相同两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的水平是否不同。示例性结肠直肠赘瘤生物标志物基因展示于图6(A组)和图13(B组)中。图6(A组)和图13(B组)中列出的一些或所有结肠直肠赘瘤生物标志物基因可以形成组。在一些实施例中，图6(A组)和图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因还可以包括结肠直肠赘瘤生物标志物基因的子集。所述组合物可以包括被配置成用于特异性检测本文公开的标志物组的基因阵列和探针集。所述组合物还可以包括试剂盒，其包含被配置成用于特异性检测本文公开的标志物组的基因阵列和探针集。
本文提供了用于诊断结肠直肠癌或癌前病变的结肠直肠赘瘤生物标志物基因和结肠直肠赘瘤生物标志物基因组。生物标志物通常是可以客观地测量和定量并用于评估生物过程(例如结肠直肠赘瘤发展、进展、缓解和复发)的特征。生物标志物可以采取多种形式，包括核酸、多肽、代谢物或物理或生理参数。
来自真核细胞的这些生物标志物可以包括：a)脱氧核糖核酸(DNA)序列，b)核糖核酸(RNA)序列，c)预测的氨基酸序列，其包含蛋白质的主链，d)核糖核酸生物标志物的表达水平，e)预测的氨基酸序列表达水平，或f)上述任何组合。在一些实施例中，生物标志物可以是T细胞标志物或B细胞标志物。在一些实施例中，生物标志物可以是可用于检测T细胞或B细胞的克隆扩增的生物标志物。示例性生物标志物可以包括IgA、IgM、IgG、IgE、IgD、T细胞γ受体、T细胞α受体、T细胞β受体、T细胞δ受体区或B细胞互补决定区。在一些实施例中，生物标志物可用于标准化，如GADPH。在一些实施例中，生物标志物可用于检测特定细胞类型，如使用肌动蛋白-B检测上皮细胞或使用IgM C-μ检测淋巴细胞。在一些实施例中，生物标志物可用于检测疾病特异性标志物，如检测T细胞受体γ以检测淋巴细胞的克隆扩增。在一些实施例中，生物标志物可以包含用于检测病毒和寄生虫的那些，包括用于衣壳、壳粒、复制酶和卵囊壁蛋白的那些。
生物样品可以是含有细胞或其它细胞物质的样品，可以从中获得核酸或其它分析物。生物样品可以是对照或实验样品。生物样品可以是粪便样品。生物样品可以在厕所、地面或收集装置中排便后立即获得。在一些实施例中，生物样品可以按照如灌肠或内窥镜检查的程序获得。生物样品可以立即进行测试。或者，生物样品可以在测试之前储存在缓冲液中，所述缓冲液例如水性缓冲液、基于甘油的缓冲液、基于极性溶剂的缓冲液、渗透平衡缓冲液或足以保存生物样品的其它缓冲液。另外或替代地，生物样品可以被收集并且在测试之前储存，例如在4℃冷藏，或例如在0℃、-20℃、-80℃、-140℃或更低冷冻。生物样品可以在测试之前储存1个月、2个月、4个月、6个月、1年、2年或更久。
生物样品可以来源于真核生物，例如哺乳动物。哺乳动物可以是人类或非人类动物，例如人类、狗、猫、非人类灵长类动物、反刍动物、熊科动物、马科动物、猪、绵羊、山羊、骆驼、水牛、鹿、麋鹿、驼鹿、鼬科动物、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、厚皮动物、犀牛或灰鼠。
方法
本文提供用于从富含真核核酸之生物样品(例如粪便样品)分离核酸的有用方法。所述方法可包括用缓冲液破坏粪便样品。可以对样品进行涡旋、摇晃、搅拌、旋转或其它足以分散固体和粪便细菌的搅动方法。进行搅动和离心步骤的温度可以改变，例如，从约4℃到约20℃，从约4℃到约1℃，从约4℃到约10℃，从约4℃到约6℃。破坏后可以对样品进行一轮或多轮离心。在一些实施例中，破坏步骤和离心可以重复一次、两次、三次或更多次。可商购的试剂，例如试剂可以用于粪便破坏、洗涤和细胞裂解。裂解缓冲液也可以裂解真核细胞。裂解物可以进一步离心且上清液用于输入到自动化RNA分离机器(例如/>仪器)中。在一些实施例中，可以用DNA酶处理提取的核酸以清理DNA溶液。可以使用其它方法，包括机械性或酶促细胞破坏然后是固相方法，例如柱色谱法或用有机溶剂萃取，例如苯酚-氯仿或硫氰酸酯-苯酚-氯仿萃取。在一些实施例中，可以将核酸提取到功能化珠粒上。在一些实施例中，功能化珠粒可以进一步包含磁芯(“磁珠”)。在一些实施例中，功能化珠粒可以包括用带电荷部分功能化的表面。带电荷部分可以选自：胺、羧酸、羧酸盐、季胺、硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐。
为了提取核酸，可以在一种或多种缓冲液、表面活性剂和核糖核酸酶抑制剂的存在下破坏粪便样品以形成悬浮液。缓冲液可以是生物相容的缓冲液，例如，汉克斯(Hanks)平衡盐溶液，阿氏(Alsever's)溶液，厄尔氏(Earle's)平衡盐溶液，盖伊氏(Gey's)平衡盐溶液，磷酸盐缓冲盐水，帕克氏(Puck's)平衡盐溶液，林格氏(Ringer's)平衡盐溶液，西姆氏(Simm's)平衡盐溶液，TRIS-缓冲盐水或台氏(Tyrode's)平衡盐溶液。表面活性剂可以是离子或非离子表面活性剂，例如Tween-20或Triton-X-100。核糖核酸酶抑制剂可以是溶剂基，蛋白质基或其它类型的防止RNA破坏的方法，包括例如Protector RNase Inhibitor(Roche)，(Promega)，SUPERase-InTM(Thermo Fisher Scientific)，RNAseOUTTM(Thermo Fisher Scientific)，抗RNA酶，重组RNA酶抑制剂或克隆的RNA酶抑制剂。可以以各种方式破坏粪便样品，例如通过涡旋、摇晃、搅拌、旋转或足以分散固体和粪便细菌的其它搅动方法。在一些实施例中，可以使用以下：经涂覆的珠粒；磁珠或搅拌工具，例如玻璃棒，金属棒，木棒或木制刀片来破坏粪便样品。
然后可以将悬浮液分离成液体部分和固体部分。分离可以例如通过离心，过滤，特异性结合真核细胞的靶向探针，抗体，基于柱的过滤，基于珠粒的过滤或色谱色谱方法来进行。液体部分富含细菌核酸并且可以丢弃。在存在或不存在表面活性剂和存在或不存在核糖核酸酶的情况下，可以将固体部分再悬浮于缓冲液中。分离步骤可以重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次或更多次。
进行破坏和分离步骤的温度可以改变，例如，从约4℃到约20℃，从约4℃到约15℃，从约4℃到约10℃，从约4℃到约6℃。
从分离步骤获得的所得丸粒可以悬浮在裂解缓冲液(例如包含离液剂和任选的表面活性剂的缓冲液)中以形成裂解物。在一些实施例中，离液剂可以是硫氰酸胍并且表面活性剂可以是Triton-X-100。在一些实施例中，裂解缓冲液可以包括或不包括Tris-HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)，十二烷基硫酸钠(SDS)、Nonidet P-40、脱氧胆酸钠或二硫苏糖醇。
裂解物可以分级分离成富含真核核酸的部分。分级分离可以例如通过离心、过滤、特异性结合真核核酸的靶向探针、抗体、基于柱的过滤、基于珠粒的过滤或色谱方法来进行。在一些实施例中，通过离心分级分离可以导致形成底层(丸粒)，其包含细胞碎片，包含真核核酸的亲水中间层和包含脂质和膜级分的疏水顶层。可以收集中间层。在一些实施例中，中间层和顶层可以一起收集。中间层可以通过窄孔口收集。窄孔口可以是移液器吸头或装有针头的注射器。移液器吸头可以是例如1、5、10、20μL或100μL移液器吸头。针可以是例如18号针或15号针。
可以对包含真核核酸的收集层进行进一步提取。进一步提取的方法可以改变。示例性方法包括基于磁性颗粒的方法，基于柱的方法，基于过滤器的方法，基于珠粒的方法或基于有机溶剂的方法。基于磁性颗粒的方法可以包括可商购试剂，例如试剂(生物梅里埃(bioMerieux))。
可以分析提取的核酸用于与胃肠病症或胃肠细胞相关的真核生物标志物。生物标志物可以提供关于个体(即受试者)健康状态的信息。来自真核细胞的这些生物标志物可以包括：a)脱氧核糖核酸(DNA)序列；b)核糖核酸(RNA)序列；c)预测的氨基酸序列，其包含蛋白质的主链；d)RNA生物标志物的表达水平或者表达水平比例；e)氨基酸序列的预测表达水平或预测表达水平比例；或f)上述的任何组合。从真核细胞中分离生物标志物可以考虑实验样品与对照之间的比较。从真核细胞中分离这些生物标志物可以提供检测实验样品中肠道疾病的方法。比较可以包括评估：a)DNA序列的变异；b)RNA序列的变异；c)预测的氨基酸序列的变异；d)RNA生物标志物的表达水平的变异或表达水平比例的变异；e)氨基酸序列的预测表达水平的变异或预测表达水平比例的变异；或f)构成上述任何组合的变异。当测量的实验样品的生物标志物与测量的对照中的生物标志物不同时，可以测定变异。
所述方法可以包括获得实验样品和对照，例如粪便样品。粪便样品含有脱落的真核细胞，可以评估其生物标志物。在一些实施例中，真核细胞可以是肠细胞、淋巴细胞、肠嗜铬样细胞、肠内分泌细胞、神经内分泌细胞、胰腺细胞、肝细胞、胃细胞或其它细胞。所述方法提供了一种方式，借此方式可以评估粪便样品中的真核细胞的真核生物标志物。生物标志物可以包括DNA序列，RNA序列，预测的氨基酸序列，RNA生物标志物的表达水平或表达水平的比例，氨基酸序列的预测的表达水平或预测表达水平比例或上述的任何组合。在一个方面，评估步骤包含任何类型的微阵列测序、聚合酶链反应(PCR)、核酸测序、分子条形码或探针捕获。
所述方法和组合物还可用于为患有肠道疾病的个体选择临床计划。通过这种方法，临床计划可以包括施用进一步诊断程序。在一些实施例中，临床计划可以包括治疗方法。
可以使用各种方法评估真核生物标志物的水平。表达水平可以在核酸水平(例如RNA水平)或在多肽水平测定。RNA表达可以包涵总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、miRNA和snoRNA的表达。可以通过测量对应于相关RNA的cDNA水平直接或间接测量在RNA水平上的表达。或者或另外，还可以分析由RNA编码的多肽、编码相关转录因子的基因的RNA调节剂和转录因子多肽的水平。在mRNA水平测定基因表达的方法包括例如微阵列分析，基因表达的系列分析(SAGE)，RT-PCR，印迹，基于数字条形码定量分析的杂交，多重RT-PCR，数字下降PCR(ddPCR)，NanoDrop分光光度计，RT-qPCR，qPCR，UV光谱，RNA测序，下一代测序，利用分支链DNA信号扩增的基于裂解物的杂交分析(例如QuantiGene 2.0 SingleΡlex)和分支链DNA分析方法。数字条形码定量分析可以包括珠粒阵列(BeadArray)(启迪(Illumina))，xMAP系统(路明克斯(Luminex))，nCounter(Nanostring)，高通量基因组学(HTG)分子，BioMark(富鲁达(Fluidigm))或Wafergen微阵列。分析可以包括DASL(启迪)、RNA-Seq(启迪)、TruSeq(启迪)、SureSelect(安捷伦(Agilent))、生物分析仪(Bioanalyzer)(安捷伦)和TaqMan(赛默飞(ThermoFisher))。
我们可以互换地使用术语“核酸”和“多核苷酸”来指代RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和含有核酸类似物的DNA(或RNA)，其中任何一种都可以编码本发明的多肽并且其全部都包涵在本发明中。多核苷酸基本上可以具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链的(即有义链或反义链)。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)和其部分、转移RNA、微RNA、核糖体RNA、siRNA、微RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质体、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引子以及核酸类似物。在本发明的上下文中，核酸可以编码生物标志物，例如B细胞或T细胞克隆扩增的生物标志物；或其生物活性变体的片段。
“经分离”核酸可以是例如DNA分子或其片段，条件是通常紧密侧接基因组中的DNA分子的核酸序列中的至少一个已移除或不存在。因此，经分离核酸包括但不限于作为单独分子、独立于其它序列存在的DNA分子(例如化学合成核酸，或通过聚合酶链反应(PCR)或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。经分离核酸还指并入载体、自主复制质体、病毒或原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。另外，经分离核酸可以包括经工程改造的核酸，如DNA分子，其为杂交或融合核酸的一部分。存在于例如cDNA库或基因组库内的多个(例如几十个或数百个到数百万个)其它核酸或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片中的核酸并非经分离核酸。
经分离核酸分子可以以各种方式产生。举例来说，聚合酶链反应(PCR)技术可用于获得含有本文所述核苷酸序列(包括编码本文所述多肽的核苷酸序列)的经分离核酸。PCR可用于扩增来自DNA以及RNA的特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。通常，使用来自关注或远端区域的末端的序列信息设计寡核苷酸引物，其序列与待扩增的模板的相反链相同或类似。还可以使用各种PCR策略，通过其可以将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中。
经分离核酸也可以化学合成，作为单个核酸分子(例如在3'至5'方向使用自动化DNA合成使用亚磷酰胺技术)或作为一系列寡核苷酸。举例来说，可合成一对或多对含有所需序列的长寡核苷酸(例如>50-100个核苷酸)，每对含有互补性短片段(例如约15个核苷酸)从而在寡核苷酸对退火时形成双链体。DNA聚合酶用于扩展寡核苷酸，每个寡核苷酸对产生单个双链核酸分子，其接着可连接到载体中。
可以将两种核酸或其编码的多肽描述为彼此具有一定程度的同一性。举例来说，选自图6(A组)或图13(B组)的结肠直肠赘瘤生物标志物基因和其生物活性变体可以被描述为展现一定程度的同一性。可以通过在蛋白质信息研究(PIR)站点(http://pir.georgetown.edu)中定位短序列然后用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)上的“短的几乎相同的序列”基本局部比对搜索工具(BLAST)算法分析来组装比对。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”是指任何给定查询序列与主题序列之间的同一性程度。举例来说，图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因序列可以是查询序列，且图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因序列的片段可以是主题序列。类似地，图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因序列的片段可以是查询序列，且其生物活性变体可以是主题序列。
为了测定序列同一性，可以使用计算机程序(例如ClustalW(1.83版，默认参数))将查询核酸或氨基酸序列分别与一个或多个目标核酸或氨基酸序列比对，其允许核酸或蛋白质序列比对在其整个长度中进行(全局比对)。
本文所述的核酸和多肽可称为“外源的”。术语“外源的”表示核酸或多肽是重组核酸构筑体的一部分或由重组核酸构筑体编码，或不在其天然环境中。举例来说，外源核酸可以是来自被引入到另一物种中的一种物种的序列，即异源核酸。通常，通过重组核酸构筑体将此类外源核酸引入到其它物种中。外源核酸还可以是生物体原生并且被重新引入所述生物体的细胞中的序列。往往可通过连接到外源核酸的非天然序列(例如侧接重组核酸构筑体中的原生序列的非原生调节序列)的存在来区分包括原生序列的外源核酸与原生序列。另外，稳定转型的外源核酸通常在除发现原生序列的位置以外的位置整合。
本发明的核酸可以包括具有图6(A组)或图13(B组)中列出的任何一种结肠直肠赘瘤生物标志物的核苷酸序列或与图6(A组)或图13(B组)中列出的核酸至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％相同的核酸序列的核酸。
核酸，例如对靶核酸具有特异性的寡核苷酸(例如探针或引物)将在合适的条件下与靶核酸杂交。我们可以将杂交称为寡核苷酸单链在限定的杂交条件下通过碱基配对与互补链退火的过程。其是两个互补多核苷酸之间的特异性(即非随机的)相互作用。杂交和杂交强度(即核酸之间缔合的强度)受如核酸之间的互补程度，所涉及的条件的严格度和所形成的杂交体的解链温度(Tm)等因素的影响。杂交产物可以是在溶液中或在固体支撑物上与标靶形成的双螺旋体或三螺旋体。
在一些实施例中，核酸可以包括适用于在图6或13中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因的分析和定量的短核酸序列。.此类经分离核酸可以是寡核苷酸引物。一般来说，寡核苷酸引物是与靶核苷酸序列互补的寡核苷酸，例如图6或13中列出的任何结肠直肠赘瘤生物标志物基因的核苷酸序列，其可以充当通过在DNA或RNA聚合酶存在下向引物的3'末端添加核苷酸来合成DNA的起点。引物的3'核苷酸通常应与相应核苷酸位置处的靶序列相同以进行最佳延伸和/或扩增。引物可以采取多种形式，包括例如肽核酸引物，锁核酸引物，解锁核酸引物和/或硫代磷酸酯修饰的引物。在一些实施例中，正向引物可以是与dsDNA的反义链互补的引物，且反向引物可以是与dsDNA的有义链互补的引物。我们也可以参考引物对。在一些实施例中，5'靶引物对可以是包括至少一个正向引物和至少一个反向引物的引物对，其扩增靶核苷酸序列的5'区域。在一些实施例中，3'靶引物对可以是包括至少一个正向引物和至少一个反向引物的引物对，其扩增靶核苷酸序列的3'区域。在一些实施例中，引物可以包括可检测标记，如下文所论述。在一些实施例中，可检测标记可以是可定量标记。
本文所提供的寡核苷酸引物对图6(A组)或图13(B组)中列出的任何结肠直肠赘瘤生物标志物基因序列的扩增是有用的。在一些实施例中，寡核苷酸引物可与两个或更多个本文公开的结肠直肠赘瘤生物标志物基因互补，例如图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因。引物长度可以根据探针的特定核酸序列的核苷酸碱基序列和组成以及使用探针的具体方法而改变。一般来说，有用的引物长度可以是约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸碱基。有用的引物长度范围可以是8个核苷酸碱基到约60个核苷酸碱基；约12个核苷酸碱基到约50个核苷酸碱基；约12个核苷酸碱基到约45个核苷酸碱基；约12个核苷酸碱基到约40个核苷酸碱基；约12个核苷酸碱基到约35个核苷酸碱基；约15个核苷酸碱基到约40个核苷酸碱基；约15个核苷酸碱基到约35个核苷酸碱基；约18个核苷酸碱基到约50个核苷酸碱基；约18个核苷酸碱基到约40个核苷酸碱基；约18个核苷酸碱基到约35个核苷酸碱基；约18个核苷酸碱基到约30个核苷酸碱基；；约20个核苷酸碱基到约30个核苷酸碱基；约20个核苷酸碱基到约25个核苷酸碱基。
还提供了探针，即经分离核酸片段，其选择性结合并与图6(A组)和图13(B组)中列出的任何结肠直肠赘瘤生物标志物基因序列互补。探针可以是核苷酸碱基或主链中的寡核苷酸或多核苷酸，DNA或RNA，单链或双链以及天然的或经修饰的。探针可以通过各种方法产生，包括化学或酶促合成。
探针长度可以根据探针的特定核酸序列的核苷酸碱基序列和组成以及使用探针的具体方法而改变。一般来说，有用的探针长度可以是大约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、140、150、175或200个核苷酸碱基。一般来说，有用的探针长度范围是长度为约8到约200个核苷酸碱基；约12到约175个核苷酸碱基；约15到约150个核苷酸碱基；约15到约100个核苷酸碱基，约15到约75个核苷酸碱基；约15到约60个核苷酸碱基；约20到约100个核苷酸碱基；约20到约75个核苷酸碱基；约20到约60个核苷酸碱基；约20到约50个核苷酸碱基。在一些实施例中，探针组可包含针对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575种或更多种或所有图6(A组)和图13(B组)中的结肠直肠赘瘤生物标志物基因的探针。
本文公开的引物和探针可以被可检测地标记。标记可以是可检测的或导致可检测响应的分子部分或化合物，其可以直接或间接连接至核酸。直接标记可以使用键或相互作用来连接标记和探针，其包括共价键、非共价相互作用(氢键，疏水和离子相互作用)或螯合物或配位络合物。间接标记可以使用直接或间接标记的桥接部分或连接子(例如抗体、寡聚物或其它化合物)，其可以扩增信号。标记包括任何可检测部分，例如放射性核素；配体，如生物素或抗生物素蛋白；酶；酶底物；反应性基团；发色团(可检测的染料，颗粒或珠粒)；荧光团或发光化合物(生物发光、磷光或化学发光标记)。标记可以在均相分析中检测，其中混合物中的结合标记探针与未结合标记探针相比展现可检测的变化，例如稳定性或差异性降解，而不需要从未结合形式的物理分离结合。
合适的可检测标记可包括本身可检测的分子(例如荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)以及可通过产生可检测反应产物(例如酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过本身可检测的特异性结合分子(例如生物素、洋地黄毒苷、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)可间接检测的分子。如上文所论述，一个或多个配体基元和/或配体与可检测标记的偶联可以是直接的或间接的。检测可以是原位，活体内，活体外在组织切片上或在溶液中等。
在一些实施例中，方法包括使用碱性磷酸酶缀合的多核苷酸探针。当使用碱性磷酸酶(AP)-缀合的多核苷酸探针时，在依序添加适当的底物(例如固蓝或固红底物)后，AP分解底物以形成沉淀物，其允许原位检测特异性靶RNA分子。碱性磷酸酶可与许多底物一起使用，例如固蓝、固红或5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)。参见例如US 5,780,277和US 7,033,758中一般性描述的。
在一些实施例中，荧光团-缀合物探针可以是荧光染料缀合的标记探针，或利用除碱性磷酸酶之外的其它酶促途径用于产色检测途径，例如使用辣根过氧化物酶缀合的探针与如3,3'-二氨基联苯胺(DAB)的底物。
缀合标记探针中使用的荧光染料通常可分为多个家族，例如荧光素和其衍生物；罗丹明和其衍生物；花青和其衍生物；香豆素和其衍生物；Cascade BlueTM和其衍生物；萤黄(Lucifer Yellow)和其衍生物；BODIPY和其衍生物等等。示例性荧光团包括吲哚羰花青(C3)、吲哚二羰花青(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红(Texas Red)、太平洋蓝(Pacific Blue)、俄勒冈绿(Oregon Green)488、-355、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor-555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、JOE、丽丝胺(Lissamine)、罗丹明绿、BODIPY、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明(dRhodamineTM)、羧基四甲基罗丹明(TAMRATM)、羧基-X-罗丹明(ROXTM)、LIZTM、VICTM、NEDTM、PETTM、SYBR、PicoGreen、RiboGreen等等。荧光团及其用途的描述可以在其它地方，在R.Haugland，《荧光探针和研究产物手册》(Handbook of Fluorescent Probes andResearch Products)，第9版(2002)，Molecular Probes,Eugene,Oreg.；M.Schena,微阵列分析(Microarray Analysis)(2003),John Wiley&Sons,Hoboken,N.J.；合成药物化学2003/2004目录(Synthetic Medicinal Chemistry 2003/2004 Catalog),Berry andAssociates,Ann Arbor,Mich.；G.Hermanson,生物缀合技术(Bioconjugate Techniques),Academic Press(1996)；及格伦研究2002目录(Glen Research 2002 Catalog),Sterling,Va中找到。近红外染料明确地在术语荧光团和荧光报道基团的预期含义内。
在一些实施例中，可以在基因阵列上分析真核生物标志物的水平。可以在定制的基因阵列上进行微阵列分析。或者或另外，可以根据制造商的说明书和方案使用可商购的系统进行微阵列分析。示例性商购系统包括昂飞技术(昂飞，加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara,CA))、安捷伦微阵列技术、/>分析系统(技术)和珠粒阵列微阵列技术(启迪)。从粪便样品中提取的核酸可以与基因阵列上的探针杂交。可以通过化学发光检测探针-靶杂交以测定特定序列的相对丰度。
在一些实施例中，探针和探针组可以配置为基因阵列。基因阵列(也称为微阵列或基因芯片)是有序的核酸阵列，其允许平行分析复杂的生物样品。通常，基因阵列包括附接于固体底物(例如微芯片、玻璃载片或珠粒)的探针。附接通常涉及产生底物与探针之间的共价键的化学偶联。阵列中探针的数量可以改变，但每个探针固定在阵列或微芯片上的特定可寻址位置。在一些实施例中，探针的长度可以是约18个核苷酸碱基、约20个核苷酸碱基、约25个核苷酸碱基、约30个核苷酸碱基、约35个核苷酸碱基或约40个核苷酸碱基。在一些实施例中，探针组包含针对至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150种或更多种或所有图6(A组)和图13(B组)中的结肠直肠赘瘤生物标志物基因的探针。探针组可并入到包含5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000个更多个不同探针的高密度阵列中。
基因阵列合成的方法可以改变。示例性方法包括合成探针，然后通过“点样”、原位合成(在微电极阵列上使用例如光刻或电化学)沉积到阵列表面上。
可以使用各种方法评估真核标志物的水平。表达水平可以在核酸(例如RNA水平)或在多肽水平测定。RNA表达可以包涵总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA、miRNA和snoRNA的表达。可以通过测量对应于相关RNA的cDNA水平直接或间接测量在RNA水平上的表达。或者或另外，还可以分析由RNA编码的多肽、编码相关转录因子的基因的RNA调节剂和转录因子多肽的水平。在mRNA水平测定基因表达的方法包括例如微阵列分析，基因表达的系列分析(SAGE)，RT-PCR，印迹，基于数字条形码定量分析的杂交，多重RT-PCR，数字下降PCR(ddPCR)，NanoDrop分光光度计，qRT-qPCR，qPCR，UV光谱，RNA测序，下一代测序，利用分支链DNA信号扩增的基于裂解物的杂交分析(例如QuantiGene 2.0 SingleΡlex)和分支链DNA分析方法。数字条形码定量分析可以包括珠粒阵列(启迪)，xMAP系统(路明克斯)，nCounter(Nanostring)，高通量基因组学(HTG)分子，BioMark(Fluidigm)或Wafergen微阵列。分析可以包括DASL(启迪)、RNA-Seq(启迪)、TruSeq(启迪)、SureSelect(安捷伦)、生物分析仪(安捷伦)和TaqMan(赛默飞)。
还可以通过DNA测序分析真核生物标志物的水平。DNA测序可以通过测序方法执行，例如靶向测序、全基因组测序或外显子组测序。测序方法可包括：Sanger测序或高通量测序。高通量测序可涉及合成测序、焦磷酸测序、连接测序、实时测序、纳米孔测序和Sanger测序。在一些实施例中，经分离RNA可用于生成对应的cDNA并且可对cDNA测序。
本文所述的测序方法可以以多重形式进行，使得同时操作多种不同的靶核酸。在一些实施例中，可以在共同的反应容器中或在特定底物的表面上处理不同的靶核酸，使得能够方便地递送测序试剂，移除未反应的试剂并以多重方式检测并入事件。在涉及表面结合靶核酸的一些实施例中，靶核酸可以是阵列形式。在阵列形式中，靶核酸通常可以以空间可区分的方式与表面偶联。举例来说，靶核酸可以通过直接共价附接、附接于珠粒或其它颗粒或与附接于表面的聚合酶或其它分子缔合来结合。阵列可以包括每个位点(也称为特征部)处的靶核酸的单拷贝或者具有相同序列的多拷贝可以存在于每个位点或特征部处。通过扩增方法产生多拷贝，例如桥式扩增、PCR或乳液PCR。
在一些实施例中，标准化步骤可用于控制核酸回收和样品之间的变异。在一些实施例中，可以将限定量的外源对照核酸添加(“掺入”)至提取的真核核酸。外源对照核酸可以是具有对应于一个或多个真核序列的序列的核酸。或者或另外，外源对照核酸可具有对应于在另一物种中发现的序列的序列，例如细菌序列，如枯草芽孢杆菌(Bacilissubtilis)序列。在一些实施例中，方法可以包括测定一种或多种管家基因的水平。在一些实施例中，方法可以包括将生物标志物的表达水平归一化至管家基因的水平。
方法包括测定步骤，不管实验样品中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平是否不同于对照中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平。在另一实施例中，方法包括测定步骤，不管实验样品中的一种、两种或更多种生物标志物的表达水平比例是否不同于对照中的一种、两种或更多种生物标志物的所测量表达水平比例。表达水平或表达水平比例的差异可以是增加或减少。
本文公开的组合物通常且以各种方式可用于结肠直肠癌的检测、诊断和治疗。检测的方法可以包括测量选自图6(A组)或图13(B组)中任一个中列出的生物标志物的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物的粪便样品中的表达水平，并比较的样品中两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平与在对照中两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平。患者样品中两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平相对于对照中两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平的差异指示患者患有结肠直肠癌。在一些实施例中，患者样品中两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平相对于对照中两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平的差异指示患者具有癌前病变和/或有结肠直肠癌的风险。这些方法可以进一步包括鉴定患有结肠直肠赘瘤(例如结肠直肠癌或癌前病变)或有罹患结肠直肠赘瘤风险的受试者(例如患者且更具体地说人类患者)的步骤。
结肠直肠赘瘤可以包括任何形式的结肠直肠癌。结肠直肠赘瘤还可以包括息肉，例如癌前病变。结肠直肠癌通常在结肠或直肠的腔衬里中以生长(称为息肉)开始。结肠直肠息肉一般分为两类：腺瘤性息肉，也称为腺瘤；和增生性和炎性息肉。腺瘤性息肉可引起结肠直肠癌。最常见的结肠直肠癌形式——腺癌，起源于排列在结肠和/或直肠内部的肠腺细胞。腺癌可以包括管状腺癌，其是有蒂茎上的腺癌；和绒毛腺癌，其是平坦地位于结肠表面的腺癌。其它结肠直肠癌通过其起源组织区分。这些包括胃肠间质瘤(GIST)，其源自Cajal的间质细胞；原发性结肠直肠淋巴瘤，其源自血液细胞；平滑肌肉瘤，其是由结缔组织或平滑肌引起的肉瘤；黑色素瘤，其源自黑色素细胞；鳞状细胞癌，其源自分层鳞状上皮组织且限制于直肠；和粘液性癌，其是通常与不良预后相关的上皮癌，。
结肠直肠癌的症状可包括但不限于排便习惯的变化，包括腹泻或便秘或粪便稠度变化持续超过四周；直肠出血或便血；持续性腹部不适，如痉挛，胀气或疼痛；感觉肠道不能完全排空；虚弱或疲劳以及无法解释的体重减轻。疑似患有结肠直肠癌的患者可接受外周血试验，包括全血细胞计数(CBC)；粪便隐血试验(FOBT)；肝功能分析；粪便免疫化学试验(FIT)和/或某些肿瘤标志物的其它分析，例如癌胚抗原(CEA)和CA19-9。结肠直肠癌往往基于结肠镜检查诊断。在结肠镜检查期间，将所指出的任何息肉移除、活组织检查并分析以确定息肉是否含有结肠直肠癌细胞或经受癌前变化的细胞。当通过内窥镜检视时，上文所列的每种特定癌症可能看起来不同。绒毛腺瘤黑色素瘤和鳞状细胞癌通常是扁平的或无蒂的，而管状腺瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤和GIST肿瘤通常是有蒂的。然而，胃肠病医生在结肠镜检查期间可能会遗漏扁平和无蒂腺瘤。可以基于特定基因的基因变化或微卫星不稳定性对活组织检查样品进行进一步分析。
其它诊断方法可包括乙状结肠镜检查；成像试验，例如算机断层摄影(CT或CAT)扫描；超声，例如腹部、直肠内或手术中超声；磁共振成像(MRI)扫描，例如直肠内MRI。可以进行其它试验(例如血管造影和胸部X射线)以确定结肠直肠癌是否已经转移。
已经研发了各种用于分期结肠直肠癌的方法。最常用的系统——TNM系统基于三个因素：1)原发肿瘤(T)生长到肠壁和附近区域的距离；2)肿瘤是否已扩散到附近区域淋巴结(N)；3)癌症是否已转移至其它器官(M)。其它分期方法包括Dukes分期和Astler-Coller分级。
TNM系统提供结肠直肠癌的四阶段分级。在阶段1(T1)结肠直肠癌中，肿瘤已经生长到结肠壁的层中，但是没有扩散到结肠壁外或扩散到淋巴结中。如果癌症是管状腺瘤息肉的一部分，则进行简单的切除并且患者可以继续接受针对未来癌症发展的常规试验。如果癌症是高级别或扁平/无蒂息肉的一部分，则可能需要更多手术并且将截取更大的余量；这可能包括切除一部分结肠的部分结肠切除术。在阶段2(T2)结肠直肠癌中，肿瘤已经生长到结肠壁中并可能生长到附近组织中但尚未扩散到附近的淋巴结。通常进行肿瘤的手术移除和部分结肠切除术。可以施用辅助疗法，例如用如5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸或卡培他滨(capecitabine)的药剂化疗。此类肿瘤不大可能复发，但通常需要增加对患者的筛查。在阶段3(T3)结肠直肠癌中，肿瘤已扩散到附近的淋巴结但未扩散到身体的其它部位。将需要手术移除结肠部分和所有受感染的淋巴结。通常建议用如5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂(oxaliplatin)或卡培他滨与奥沙利铂组合的药剂化疗。根据患者的年龄和肿瘤的侵袭性，还可使用放疗。在阶段4(T4)结肠直肠癌中，肿瘤通过血液从结肠扩散到远处器官。结肠直肠癌最常转移至肝、肺和/或腹膜。手术不大可能治愈这些癌症，并且通常需要化疗和/或放疗来提高存活率。
本文公开的方法通常可用于结肠直肠癌的诊断和治疗。在生物样品中测量两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的水平，所述生物样品是来自受试者的样品。受试者可以是具有一种或多种上述指示患者有结肠直肠癌的风险的症状的患者。受试者也可以是没有症状但是基于与结肠直肠癌较高风险相关的年龄(例如50岁以上)；家族病史；肥胖；饮食；饮酒；吸烟；结肠直肠息肉的先前诊断；种族和种族背景；炎性肠病以及遗传综合征，如家族性腺瘤性息肉病、加德纳(Gardner)综合征、林奇(Lynch)综合征、透克(Turcot)综合征、普-杰二氏(Peutz-Jeghers)综合征和MUTYH相关息肉病可能有患结肠直肠癌的风险的患者。本文公开的方法还可用于监测先前已被诊断和治疗结肠直肠癌的患者以监测缓解和检测癌症复发。
在一些实施例中，通过病理学评估确定受试者(即人类或非人类动物患者)的疾病状态。举例来说，在一种类型的疾病(例如结肠直肠癌)中，疾病的程度被分级为阶段1(T1)、阶段2(T2)、阶段3(T3)和阶段4(T4)。结肠直肠癌可以是管状腺癌、绒毛腺癌、胃肠间质瘤、原发性结肠直肠淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑色素瘤、鳞状细胞癌或粘液癌。在另一类型的疾病中(如炎性肠病)，通过疾病沿肠道的位置和组织学特征如肉芽肿、白细胞浸润和/或隐窝脓肿确定疾病状态。用于确定疾病状态的其它方法，如医师确定、生理症状、粪便隐血试验、粪便免疫化学试验、乙状结肠镜检查、FIT-DNA、CT结肠成像或结肠镜检查也可以与本文公开的方法结合使用。
还提供了确定受试者是否有肠道疾病风险的方法。肠道疾病可包括肠癌、结肠直肠癌、指示癌前变化的腺瘤性息肉、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病或其它肠道疾病。确定受试者是否有肠道疾病风险的方法可以是通过使用本发明来检测以下来确定：a)脱氧核糖核酸(DNA)序列；b)核糖核酸(RNA)序列；c)预测的氨基酸序列，其包含蛋白质的主链；d)核糖核酸生物标志物的表达水平；e)预测氨基酸中序列的变异或f)上述任何组合，其中对照和实验样品之间的差异可以指示受试者有患肠病的风险。
所述方法和组合物还可用于为患有肠道疾病的受试者选择临床计划。通过这种方法，临床计划可以包括施用进一步诊断程序。在一些实施例中，临床计划可以包括治疗方法。
可以在有结肠直肠癌风险或患有结肠直肠癌的受试者中分析选自图6(A组)或图13(B组)的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的水平。在一些实施例中，可以在有结肠直肠癌风险或患有结肠直肠癌的受试者中分析选自图6(A组)或图13(B组)的一种、两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的水平。图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因可以形成组。在一些实施例中，两种或更多种生物标志物可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180种更多种图6(A组)或图13(B组)中的标志物的组合。在一些实施例中，标志物可以含在差异表达的转录物簇和/或与结肠直肠癌相关的常见途径中。示例性途径包括微卫星不稳定性(MSI)、染色体不稳定性(CIN)和CpG岛甲基化表型(CIMP)。在一些实施例中，途径可以是细胞组分途径，应力的细胞反应，应力和RNA结合途径。
例如，用于确定诊断、状态或对治疗的反应的算法可以确定特定临床病况。本文所提供的方法中使用的算法可以是并入多个参数的数学函数，其可不受限制地定量使用医疗设备、临床评估分数或生物样品的生物/化学/物理试验。每个数学函数可以是确定为与所选临床病况相关的参数水平(例如测量水平)的权重调整表达。由于技术涉及加权和评估多个标志物组，具有合理计算能力的计算机可用于分析数据。
因此，诊断方法可以包括从有结肠直肠癌风险或疑似患有结肠直肠癌的患者获得粪便样品；测定选自图6(A组)或图13(B组)中的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达并通过并入选自结肠直肠赘瘤生物标志物基因组中任一个的多个结肠直肠赘瘤生物标志物基因的机器学习算法提供带有预定义系数的测试值。示例性机器学习算法包括Support Vector Machine、Gradient Boosting、Adaptive Boosting、Random Forest、Naive Bayes、Decision Tree和k-Nearest Neighbors。多个结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达相对于对照(例如健康个体群体)的显著变化指示患者患有结肠直肠癌和/或癌前病变的可能性增加。在一些实施例中，样品中测量的表达水平用于推导或计算概率或置信度分数。这个数值从表达水平导出。或者或另外，值可以从表达值与其它因素(例如患者的病史、年龄和遗传背景)的组合导出。在一些实施例中，方法可进一步包含将试验值传达给患者的步骤。
可以(例如适当地经编程)使用和实施标准计算设备和系统以执行本文所描述的方法，例如执行测定本文所述值所需的计算。计算设备包括各种形式的数字计算机，如笔记本电脑、台式机、移动设备、工作站、个人数字助理、服务器、刀片式服务器、大型机和其它适当的计算机。在一些实施例中，计算设备是移动设备，如个人数字助理、蜂窝式电话、智能电话、平板电脑或其它类似的计算设备。
在一些实施例中，计算机可用于将信息传达给例如医疗保健专业人员。可以通过使信息电子化(例如以安全的方式)将信息传达给专业人员。举例来说，可以将信息放在计算机数据库上，使得医疗保健专业人员可以访问所述信息。另外，可以将信息传达给专业人员代理的医院，诊所或研究机构。通过开放网络(例如互联网或电子邮件)传输的信息可以被加密。患者的基因表达数据和分析可以通过加密存储在云中。具有篡改保护的256位AES方法可用于磁盘加密；SSL协议优选地可以确保数据传输中的保护，并且密钥管理技术SHA2-HMAC可以允许对数据进行认证访问。也可以使用其它安全数据存储装置。
上文此类分析的结果可以作为主治临床医生的随访和治疗的基础。如果选自图6(A组)或图13(B组)的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平并非显著不同于对照中相同的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物的表达水平，临床医生可以确定患者目前没有结肠直肠癌或癌前病变的风险。可以鼓励此类患者将来返回进行重新筛查。本文公开的方法可用于监测结肠直肠赘瘤标志物水平随时间的任何变化。在初始筛查和/或诊断后，可以监测受试者任何时间长度。举例来说，可以监测受试者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月或更长时间或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年。
本文公开的方法和组合物可用于为有结肠直肠赘瘤风险或患有结肠直肠赘瘤的受试者选择临床计划。临床计划可包括施用进一步的诊断程序，例如粪便隐血试验、粪便免疫化学试验或结肠镜检查以移除息肉或癌前病变。在一些实施例中，临床计划可以包括治疗方法。在一些实施例中，方法包括为患有结肠直肠癌的受试者选择治疗的方法。如果选自图6(A组)或图13(B组)的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平显著不同于对照中相同的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平，则患者可能患有结肠直肠癌。在这些情况下，可以建议进一步筛查，例如使用本文公开的方法提高筛查频率以及胎儿隐血试验、粪便免疫化学试验和/或结肠镜检查。在一些实施例中，可以建议治疗，包括例如结肠镜检查结合移除息肉、化疗或手术(如肠切除术)。因此，所述方法可用于测定两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平，然后确定治疗过程。只要发生临床上有益的结果，就可以有效地治疗受试者(即患者)。这可能意味着，例如疾病症状的完全消退，疾病症状严重程度的降低，或疾病进展的减缓。这些方法可以进一步包括以下步骤：a)鉴定患有结肠直肠癌的受试者(例如患者，且更具体地说人类患者)；及b)向受试者提供抗癌治疗，例如治疗剂、手术或放疗。提供给受试者的引起疾病症状完全消退、疾病症状严重度降低或疾病进展减缓的一定量的治疗剂被视为治疗有效量。本发明方法还可以包括监测步骤以帮助最优化给药和日程安排以及预测结果。监测还可以用于检测抗药性的发作，以快速区分有反应患者和无反应患者或评估癌症的复发。当存在抗性或非反应性迹象时，临床医生可在肿瘤产生额外的逃避机制之前选择替代性或辅助性药剂。
本文公开的方法还可以与用于诊断和治疗结肠直肠癌的常规方法组合使用。因此，诊断方法可以与结肠直肠癌的标准诊断方法一起使用。举例来说，所述方法可以与粪便隐血试验、粪便免疫化学试验或结肠镜检查组合使用。所述方法还可以与其它结肠直肠癌标志物一起使用，例如KRAS、NRAS、BRAF、CEA、CA 19-9、p53、MSL、DCC和MMR。
本文公开的诊断方法还可以与结肠直肠癌治疗组合使用。结肠直肠癌治疗方法一般分为几类：手术、化疗、放疗、靶向疗法和免疫疗法。手术可以包括结肠切除术，结肠造口术连同部分肝切除或直肠切除术。化疗可以是全身化疗或局部化疗，其中化疗剂直接放置在受感染器官附近。示例性化疗剂可包括5-氟尿嘧啶、奥沙利铂或其衍生物、伊立替康(irinotecan)或其衍生物、甲酰四氢叶酸或卡培他滨、丝裂霉素C、顺铂和多柔比星(doxorubicin)。放疗可以是外部放疗(使用机器将放射线引向癌症)，或者内部放疗，其中放射性物质直接放置在结肠直肠癌中或附近。靶向药剂可包括抗血管生成剂(如贝伐单抗(bevacizumab))或EGFR抑制剂单克隆抗体(西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab))，雷莫芦单抗(ramuciramab)(抗VEGFR2)，阿柏西普(aflibercept)，瑞格非尼(regorafenib)，三氟尿苷-提普来昔(tripfluridine-tipiracil)或其组合。靶向药剂也可以与标准化疗剂组合。免疫疗法可包括投予特异性抗体，例如抗PD-1抗体、抗PD-L-1抗体和时间-CTLA-4抗体、抗-CD 27抗体；癌症疫苗、过继细胞疗法、溶瘤病毒疗法、辅助免疫疗法和基于细胞因子的疗法。其它治疗方法包括干细胞移植、热疗、光动力疗法、血液制品捐赠和输血或激光治疗。
我们可以使用术语“增加的(increased)”、“增加(increase)”或“上调的(up-regulated)”来通常意指生物标志物水平的统计学上显著量的增加。在一些实施例中，与对照相比，增加可以是至少10％的增加，例如至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至多且包括100％增加的增加，或与对照相比在10％与100％之间的任何增加、或至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或最少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍、或与对照相比在1.0倍与10倍或更大增加之间的任何增加。
我们可以使用术语“减少(decrease)”、“减少的(decreased)”、“减小(reduced)”、“减小(reduction)”或“下调的(down-regulated)”来指真核生物标志物水平的统计学上显著量的降低。在一些实施例中，与对照相比，减少可以是至少10％的减少，例如至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至多且包括100％减少(即与对照相比不存在)的减少，或与对照相比在10％与100％之间的任何减少、或至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或最少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍、或与对照相比在1.0倍与10倍或更大减少之间的任何减少。
真核生物标志物的增加或真核生物标志物的减少的统计显著性可以表示为p值。根据特定的真核生物标志物，p值可小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.002、小于0.001或小于0.0005。
对照可以是从患者或一组患者获得的生物样品。在一些实施例中，对照可以是参考值。可以从已被诊断为健康的个体或个体群体获得对照。健康个体可包括例如在上一年内的粪便寄生虫试验、粪便细菌试验或内窥镜检查中检测为阴性的个体。可以从已被诊断为患病的个体或个体群体获得对照。患病个体可包括例如在上一年内的粪便寄生虫试验、粪便细菌试验或内窥镜检查中检测为阳性的个体。对照可以从先前已被诊断患有疾病但目前处于缓解或目前未患所述疾病的个体或个体群体中获得。可以在一个、两个或更多个时间点从个体获得对照。举例来说，对照可以是在较早时间点从受试者获得的生物样品。对照可以是特定生物标志物的标准参考值。可以基于评估具有相似年龄、性别(sex)、性别(gender)、体型、品种，种族背景或一般健康状况的个体来推导标准参考值。
实验样品可以是从受试者获得的生物样品。可以从具有已知或未知健康状态的受试者获得实验样品。在一些实施例中，可以例如通过分析实验样品、活组织检查、身体检查、实验室研究、目视检查或遗传分析来确定受试者的健康状况。可以通过实验样品确定的受试者的健康状况可以是患病的、有疾病风险的或健康的。
制品
还提供了用于检测和定量生物样品(例如粪便样品)中的所选结肠直肠赘瘤生物标志物的试剂盒。因此，包装产品(例如，含有一种或多种本文所述组合物并且以浓缩或即用浓度包装用于储存、运输或销售的无菌容器)和试剂盒也在本发明的范围内。产品可以包括含有一种或多种本发明组合物的容器(例如，小瓶、广口瓶、瓶、袋、微量板、微芯片或珠粒)。另外，制品可以进一步包括例如包装材料、使用说明书、注射器、递送装置、缓冲剂或其它控制试剂。
试剂盒可以包括能够检测生物样品中对应于选自图6(A组)或图13(B组)的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的RNA的化合物或药剂；和标准品；和任选地执行检测、定量或扩增所必需的一种或多种试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包括能够检测生物样品中对应于B细胞标志物、T细胞标志物或免疫球蛋白中的两种或更多种的RNA的化合物或药剂；和标准品；和任选地执行检测、定量或扩增所必需的一种或多种试剂。化合物、药剂和/或试剂可以包装在合适的容器中。试剂盒可以进一步包含使用试剂盒检测和定量核酸的说明书。举例来说，试剂盒可以包括：(1)与对应于选自选自图6(A组)或图13(B组)的结肠直肠生物标志物基因、或B细胞标志物、T细胞标志物或免疫球蛋白中的两种或更多种的核酸序列杂交的探针，例如寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，或(2)可用于扩增对应于选自选自图6(A组)或图13(B组)的结肠直肠生物标志物基因、或B细胞标志物、T细胞标志物或免疫球蛋白中的两种或更多种的核酸分子的一对引物。试剂盒可以进一步包括可用于扩增一种或多种管家基因的探针和引物。试剂盒还可以包括缓冲剂、防腐剂和/或核酸或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包括检测可检测药剂(例如酶或底物)所必需的组分。试剂盒还可以含有一对照或一系列对照，可以对其进行分析并且与所含有的测试样品进行比较。试剂盒的每种组分可以密封在个别容器内并且所有各种容器可以连同用于解释使用所述试剂盒进行的分析的结果的说明书一起在单一包装内。在一些实施例中，试剂盒可以包括对一种或多种对照标志物具有特异性的引物或寡核苷酸探针。在一些实施例中，试剂盒包括特异性用于定量选自选自图6(A组)或图13(B组)的结肠直肠生物标志物、或B细胞标志物、T细胞标志物或免疫球蛋白中的两种或更多种的试剂。
在一些实施例中，试剂盒可以包括特异性用于从患者粪便样品将人类细胞与细菌细胞和其它粪便组分分离和提取人类mRNA的试剂。因此，试剂盒可以包括缓冲液、乳液珠粒、二氧化硅珠粒、稳定试剂和各种用于离心的过滤器和容器。试剂盒还可以包括用于粪便处理，以最小化样品的污染并确保粪便样品中人类mRNA的稳定性的说明。试剂盒还可以包括确保样品保存的物品，例如冷却剂或加热包。在一些实施例中，试剂盒可以包括粪便收集装置。
产品还可以包括图例(例如，印刷标签或插入物或描述产品使用的其它介质(例如，音频或录像带或计算机可读介质))。图例可以与容器相关联(例如，附着到容器)并且可以描述可以使用试剂的方式。试剂可以准备好使用(例如，存在于适当单位中)，并且可以包括一种或多种另外的佐剂、载体或其它稀释剂。或者，试剂可以用稀释剂并且根据对稀释度的说明以浓缩形式提供。
实例
实例1：人类粪便样品采集
人类粪便收集：要求患者排便到套在马桶座上的桶中，并将所得样品储存在冷冻柜中，直到所述样品被运送到哈尔科夫国立医科大学(Kharkiv National MedicalUniversity)(乌克兰哈尔科夫(Kharkiv,Ukraine))。将粪便等分到50mL锥形管中并储存在-80℃。将样品在干冰上从哈尔科夫国立医科大学装运到Capital Biosciences(马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD))，并立即转移到-80℃冷冻柜。将样品在干冰上从那里装运到BioGenerator Labs(密苏里州圣路易斯(Saint Louis,MO))，所述样品在那里储存在-80℃冷冻柜中直到进行提取。
人类样品类型：从195例结肠直肠癌(I-IV期)患者、126例癌前腺瘤患者、125例结肠镜检查结果阴性患者和8例良性息肉患者获得粪便样品，产生总计454个样品。健康个体是没有结肠直肠癌、炎性肠病、脂泻病、肠易激综合征、最近20天内腹泻或任何其它胃肠疾病史的患者。患病的个体是被诊断患有结肠直肠癌和癌前息肉的患者。结肠直肠癌患者在过去一个月内通过结肠镜检查和随后的活组织检查被诊断为I期-IV期结肠直肠癌，并且尚未接受任何活组织检查后治疗，所述治疗可以包括化疗、放射和/或手术。息肉患者在进行结肠镜检查之前提供粪便样品，其中医生通过随后的活组织检查和组织学评估检测到被认为是癌前的息肉。基于性别和年龄段(50-60岁、60-70岁、70-80岁和80-90岁)，健康个体与息肉和癌症患者匹配。本研究使用的患者都获得Capital Biosciences的同意。舒尔曼内部审查委员会(Schulman Internal Review Board)为本研究提供了道德监督。
实例2：人类核酸提取
总核酸提取：将每个粪便样品放到50mL锥形管中。添加约1,000-25,000mg粪便到每个管。添加另外的20-40mL溶液到每个管。这种溶液含有汉克斯平衡盐溶液(HanksBalanced Salt Solution，HBSS)(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))与0.05％Tween-20(西格玛-奥德里奇)和0.0002％RNA酶抑制剂(西格玛-奥德里奇)的混合物。将粪便悬浮到溶液中并且在约0-10℃下旋转0-10分钟。将溶液在4℃以1000rpm离心10分钟并且丢弃上清液。添加约4-10mL裂解缓冲液(bioMerieux)到球粒并且将球粒再悬浮到溶液中。将溶液在20-25℃下以2500-3500rpm离心10-15分钟。在差速离心期间，溶液分成三层。底层包括固体细胞碎片，中间层是富含人类核酸的亲水层，并且顶层是疏水脂质层。将顶部的两个层转移到新的15毫升锥形管中，并将溶液在20-25℃下以2500rpm再次离心10分钟。这个离心步骤的结果是分成三层：底层是固体细胞碎片，中间层是富含人类核酸的亲水层，并且顶层是疏水脂质层。为了从溶液中筛选大的碎片，将20μL移液器吸头放到1mL移液器吸头上，并从15mL管中移取2mL亲水层并转移到/>一次性料筒(Disposablecartridge)(bioMerieux)。另外，添加60μL/>磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器将珠粒混合到溶液中0.5-1分钟。根据制造商的说明，使用特异性A方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是70μL。将这个核酸溶液移取到1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技术向前一步骤中使用的相同/>一次性料筒(bioMerieux)再装载来自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外的2mL亲水层以筛选出大的碎片。添加另外的20μL/>磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器将珠粒混合到溶液中0.5-1分钟。如上文所描述，根据制造商的说明，使用特异性A方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是70μL。将这个核酸溶液移取到已经含有第一个70μL洗脱液的原始1.5mL管中，并将合并的溶液放在冰上。
DNA酶处理：将140μL溶液用Baseline-Zero-DNase(Epicentre)在35-40℃处理20-40分钟。将1-2mL等分的裂解缓冲液添加到DNA酶处理的溶液中，并将样品转移到新的/>一次性料筒中。将整个溶液与60μL/>磁性二氧化硅一起添加到新料筒中。根据制造商的说明，使用/>通用方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是25μL。将这个核酸溶液移取到1.5mL管中并储存在0-6℃下。
实例3：人类粪便样品中的人类核酸水平的测量
提取结果：使用以上提取的样品，使用安捷伦2100生物分析仪(Bioanalyzer)评估1μL的总核酸和RNA完整性。定性和定量分析样品。电泳分析用于检查提取的RNA的品质。通过凝胶电泳分析生物分析仪输出的结果，如图1和图2所示。通过比较每个样品的条带与RNA梯中的大小标志物所代表的条带(展示在电泳图的第一泳道中)并鉴定18S和28S核糖体RNA条带来读取电泳文件(图1)。核糖体RNA(rRNA)是标准化梯上2,000个核苷酸标志物周围的两个大而突出的条带。定性地，足够的条带化和较暗的条带强度表明足够的完整核酸可用于进一步分析，如微阵列测序、聚合酶链反应(PCR)、核酸测序、分子条形码或探针捕获。图2展示了电泳图的一实例。电泳图是每个电泳的图形表示，其中定量了总RNA质量、RIN和总rRNA质量。凝胶电泳分析提供了关于总核酸和RNA完整性的信息。分析每个样品的电泳图式和电泳图以确定样品是否符合下游分析的条件。在一个实例中，分析使用本发明中描述的方法提取的120个样品的RNA品质，使得在分析的120个样品中，110个通过RNA完整性和RNA质量的品质检查(图3)。
电泳图和电泳迹线用于比较通过品质检查的样品，使用本发明中描述的RNA提取方法与文献中描述的RNA提取方法相比较。与文献中描述的方案相比，上文所描述的核酸提取方法将平均RIN增加到4.88(n＝168)。另外，完成方案所需的总时间从3天减少到5小时。总RNA提取方法使符合转录物组分析条件的样品数从如文献中所述的50％显著增加到所描述方案中的98.2％(n＝168；p<0.0001)，如通过核糖体RNA完整性和质量测量(图4)。
实例4：RNA转录物的分析
在进行总RNA提取的454个样品中，使用安捷伦生物分析仪基于直接观察核糖体RNA条带，这些样品中的399个符合转录物组分析的条件。随后，从399个可用样品中随机选择342个样品使用昂飞GeneChipTM人类转录物组阵列(Human Transcriptome Array)2.0(加利福尼亚州圣克拉拉)进行全转录物组分析。在这342个样品中，4个样品扩增失败，8个具有息肉的患者通过随后的活组织检查确定为具有增生性良性息肉。从分析中去除这12个样品，得到330个样品用于最终分析。
用Ambio WT-pico试剂盒扩增约100ng不含DNA酶的粪便RNA，随后按照制造商的方案与昂飞GeneChipTM人类转录物组阵列2.0杂交。使用信号空间变换-稳健多阵列分析(Signal Space Transformation-Robust Multiarray Analysis，SST-RMA)与昂飞Expression ConsoleTM对所有样品进行标准化。
在昂飞微阵列中的70,523个转录物簇中，预选择对应于3,977个基因的5,149个转录物簇的子集以评估差异表达。这种初始选择降低了错误发现率并过滤出在癌症发展和进展中没有已知功能的基因。我们探索了七种机器学习分类器(支持向量机、梯度增强、自适应增强、随机森林、朴素贝叶斯、决策树和k-最近邻居)用于结肠直肠赘瘤检测。
将330个个体分成265个个体的训练集和65个个体的测试集。训练集用于鉴定差异表达的基因并构建计算模型，而测试集用于确定计算模型的检测准确性。标准LIMMA包用于鉴定RNA转录物簇的子集，其在具有癌前腺瘤或CRC的个体与结肠镜检查结果为无的个体之间差异表达。根据对数几率分数将所有生物标志物排列，并且200个排名最高的生物标志物(p<0.05)充当构建机器学习模型的特征(图4)。描述这些基因的分级聚簇的热图概述于图5A中，并且与差异表达的基因相关的显著途径概述于图5B中。有五个基因簇与三个群体中的差异表达的转录物相关联，以将患有结肠直肠赘瘤的个体与健康个体分离。差异表达的途径展示22种共同GeneGO经典途径的富集，其中绝大多数(77.7％)是细胞组分途径的上调。最值得注意的是细胞对应力的反应、对应力的反应和RNA结合的上调。通过用GAGE软件分析前200个差异表达的转录物簇来鉴定与疾病相关的共同途径。与疾病相关的途径展示于图5B中。选择具有RBF内核的支持向量机模型(v-SVM)用于模型开发。核函数允许通过将特征扩展到未明确计算的更高维空间来计算个体之间的距离。SVM找到分隔标签组的最大边距超平面。参数v限定用于确定最大边距的个体的分数的下限。使用来自训练集中所有265个个体的200个转录物的表达水平训练SVM模型。这种多靶RNA生物标志物算法用于测试集内的65个个体，并且筛选结肠镜检查结果阳性的所有个体中检测到79％(43个当中的34个)。算法正确预测了95％的具有5mm至12mm大小范围内的癌前腺瘤的个体、57％的患有I期结肠直肠癌的个体、75％的患有II期结肠直肠癌的个体、66％的患有II期结肠直肠癌的个体、以及83％的患有IV期结肠直肠癌的个体。模型对结肠直肠癌的灵敏度与大小直接相关，使得60％的≤3.5cm的肿瘤被准确检测到，而83％的大小≥5.0cm的肿瘤被准确检测到。模型获得59％的特异性，其中22个结肠镜检查结果阴性的个体中的13个被模型正确鉴定。总的来说，模型对结肠直肠赘瘤的灵敏度为79％，对癌前腺瘤的灵敏度为95％并且特异性为59％。
技术和生物重复显示所有基因的发光水平高度一致(图10)。完美的技术重复，其中RNA在同一天被分离和评估，显示出最高水平的一致性(R2>0.990)(图10A)。由时间分隔的技术重复也显示出高水平的一致性(R2>0.989)。通过在同一天提取两个重复的RNA来获得这些重复，然而在第0天分析一个重复，并在6个月后分析第二个重复(图10B)。最后，生物重复也显示出高水平的一致性(R2>0.986)。通过从来源于同一个体的粪便的不同区段获取样品来产生这些生物重复(图10C)。在不同日期分别提取RNA并分析。
当仅分析与结肠直肠癌发展或进展有关的5,149个基因(全转录物组的一子集)时，调整后的R平方值对于所有三个重复群组都得到改善。这些重复显示出如上所述的相当水平的一致性(图11A-C)。
实例5：动物粪便样品采集
粪便收集：样品在密苏里州圣路易斯当地由猫和狗主人收集。在猫排便到猫砂箱中时，要求猫主人将样品转移到50mL锥形管中并将管储存在-20℃下。在狗在户外排便时，要求狗主人将样品转移到50mL锥形管中并将管储存在-20℃下。在收集的一周内，将样品收集并且人工地转移到BioGenerator Labs(密苏里州圣路易斯)，所述样品在那里储存在-80℃冷冻柜中直到进行提取。
样品类型：粪便样品都从不同年龄、品种和性别的健康动物获得。从4只不同的猫收集4个样品，从4只不同的狗收集另外的4个样品，产生总计8个样品。最近有一只猫被诊断出患有癣，但所有其它动物都没有症状，并且在过去30天内没有展现出任何肠胃不适的迹象。
实例6：动物核酸提取
总核酸提取：将每个粪便样品放到50mL锥形管中。添加约1,000-25,000mg粪便到每个管。添加另外的20-40mL溶液到每个管。这种溶液含有汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(西格玛-奥德里奇)与0.05％Tween-20(西格玛-奥德里奇)和0.0002％RNA酶抑制剂(西格玛-奥德里奇)的混合物。将粪便悬浮到溶液中并且在约0-10℃下旋转0-10分钟。将溶液在4℃以1000rpm离心10分钟并且丢弃上清液。添加约4-10mL裂解缓冲液(bioMerieux)到球粒并且将球粒再悬浮到溶液中。将溶液在20-25℃下以2500-3500rpm离心10-15分钟。在差速离心期间，溶液分成三层。底层包括固体细胞碎片，中间层是富含人类核酸的亲水层，并且顶层是疏水脂质层。将顶部的两个层转移到新的15毫升锥形管中，并将溶液在20-25℃下以2500rpm再次离心10分钟。这个离心步骤的结果是分成三层：底层是固体细胞碎片，中间层是富含人类核酸的亲水层，并且顶层是疏水脂质层。为了从溶液中筛选大的碎片，将20μL移液器吸头放到1mL移液器吸头上，并从15mL管中移取2mL亲水层并转移到一次性料筒(bioMerieux)。另外，添加60μL/>磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器将珠粒混合到溶液中0.5-1分钟。根据制造商的说明，使用特异性A方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是70μL。将这个核酸溶液移取到1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技术向前一步骤中使用的相同一次性料筒(bioMerieux)再装载来自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外的2mL亲水层以筛选出大的碎片。添加另外的20μL/>磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器将珠粒混合到溶液中0.5-1分钟。如上文所描述，根据制造商的说明，使用特异性A方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是70μL。将这个核酸溶液移取到已经含有第一个70μL洗脱液的原始1.5mL管中，并将合并的溶液放在冰上。
DNA酶处理：将140μL溶液用Baseline-Zero-DNase(Epicentre)在35-40℃处理20-40分钟。将1-2mL等分的裂解缓冲液添加到DNA酶处理的溶液中，并将样品转移到新的/>一次性料筒中。将整个溶液与60μL/>磁性二氧化硅一起添加到新料筒中。根据制造商的说明，使用/>通用方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是25μL。将这个核酸溶液移取到1.5mL管中并储存在0-6℃下。
实例7：动物粪便样品中的核酸水平的测量
提取结果：使用以上提取的样品，使用安捷伦2100生物分析仪评估1μL每个样品的总核酸和RNA完整性。定性和定量分析样品。通过凝胶电泳分析生物分析仪输出的结果，如图7中所示。图7中的图展示来自使用安捷伦RNA6000 Nano Kits运行的8个样品的1μL的RNA生物分析仪迹线。凝胶电泳分析提供了关于总核酸和RNA完整性和质量的信息。通过比较每个样品的条带与RNA梯中的大小标志物所代表的条带(展示在电泳图的第一泳道中)并鉴定18S和28S真核核糖体RNA条带来读取电泳文件。定性地，足够的条带化和较暗的条带强度表明足够的完整核酸可用于进一步分析，如微阵列测序、聚合酶链反应(PCR)、核酸测序、分子条形码或探针捕获。还使用RNA完整性数定性分析样品品质。图7B展示了使用安捷伦RNA6000 Nano Kits运行的相同8个样品中的每一个的RNA完整性值。还定量分析样品质量。图7C展示了使用安捷伦RNA 6000 Nano Kits运行的相同8个样品的估算真核RNA浓度(μg/μL)。使用生物分析仪迹线的曲线下面积估算真核RNA浓度。如图7B-C中所示，所有样品的平均RIN是4.2并且所有样品的平均真核质量是61.4ng/μL。定量和定性测量表明，所有样品都符合生物标志物表达分析条件(n＝8)。
实例8：动物粪便样品中的RNA转录物的分析
使用RT-qPCR评估符合生物标志物表达分析条件的所有犬样品(n＝4)。对于这四个犬样品，设计了5个引物以评估犬基因组的部分。通过评估犬T细胞上IgM的重链，设计两个引物充当阳性对照。设计三个另外的引物以评估可以在犬淋巴前体中发生的两次单独重排以检测T细胞特异性RNA。每个RT-PCR反应含有10μL 2×主混合物(Master Mix)(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、1μL 20×酶混合物(新英格兰生物实验室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins Genomics)、1μL20×SYBR Green I、2μL RNA和4.4μL分子生物学级H2O(赛默科技(Thermo Scientific))。使用应用生物系统(Applied Biosystems)QuantStudio5qPCR机器扩增核酸。热循环仪方案如下：°°在55℃下25分钟以将RNA反转录为DNA，在95℃下反转录酶失活1分钟，在95℃下10秒和在60℃下45秒的60个循环以用于扩增和信号收集，并且然后是70℃-95℃的熔融曲线°。在进行总RNA提取的4个犬样品中，75％的样品显示阳性对照(C-μIgM)的扩增(图8A)。在显示阳性对照扩增的个体中，100％(n＝3)显示两种T细胞特异性RNA转录物的扩增。一种T细胞特异性转录物以35个循环扩增，并且另一T细胞特异性转录物以50个循环扩增(图8B)。
使用RT-qPCR评估符合生物标志物表达分析条件的所有猫样品(n＝5)。对于这四个猫样品，设计两种引物充当阳性对照。这些探针评估猫肌动蛋白-B，以确定核酸提取物中是否存在猫RNA。每个反应含有：10μL 2×主混合物(新英格兰生物实验室)、1μL 20×酶混合物(新英格兰生物实验室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins Genomics)、1μL 20×SYBR Green I、2μL RNA和4.4μL分子生物学级H2O(赛默科技)。使用应用生物系统QuantStudio5 qPCR机器扩增溶液。热循环仪方案如下：°°在55℃下25分钟以将RNA反转录为DNA，在95℃下反转录酶失活1分钟，在95℃下10秒并且然后在60℃下45秒的60个循环以用于扩增和信号收集°。在进行总RNA提取的4个猫样品中，75％的样品(n＝4)显示阳性对照(猫肌动蛋白-B)的扩增(图9)。
实例9：犬B细胞转录物的分析
使用RT-qPCR评估符合生物标志物表达分析条件的所有犬样品(n＝4)。对于这4个犬样品，设计了6个引物集以评估与淋巴细胞相关的犬基因组的部分(图15A)。在设计的6个引物集中，使用一个引物集来评估可以在犬淋巴前体中发生的两次单独重排以检测B细胞特异性RNA。每个反应含有10μL 2×主混合物(新英格兰生物实验室)、1μL 20×酶混合物(新英格兰生物实验室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins Genomics)、1μL 20×SYBR Green I、2μL RNA和4.4μL分子生物学级H2O(赛默科技)。使用应用生物系统QuantStudio5 qPCR机器扩增溶液。热循环仪方案如下：°°在55℃下25分钟以将RNA反转录为DNA，在95℃下反转录酶失活1分钟，在95℃下10秒和在60℃下45秒的60个循环以用于扩增和信号收集，并且然后是70℃-95℃的熔融曲线°。这些扩增反应的实例展示于图16A中。对于每个样品存在2个B细胞特异性RT-qPCR反应(n＝8)，并且在这些反应中，87.5％(8个中的7个)显示B细胞相关转录物的扩增。B细胞特异性转录物在循环30与35之间扩增(图16A)。
实例10：猫样品重复的提取
粪便收集：样品在密苏里州圣路易斯当地由猫主人收集。在猫排便到猫砂箱中时，要求猫主人将样品转移到50mL锥形管中并将管储存在-20℃下。在产生的一周内，将样品收集并且人工地转移到BioGenerator Labs(密苏里州圣路易斯)，所述样品在那里储存在-80℃冷冻柜中直到进行提取。
样品类型：粪便样品都从不同年龄、品种和性别的健康动物获得。从4只不同的猫收集8个样品。对于一些猫，收集了多达三个生物重复。我们将生物重复称为从单独排便收集的同一只猫的粪便样品。最近有一只猫被诊断出患有癣，但所有其它动物都没有症状，并且在过去30天内没有展现出任何肠胃不适的迹象。
总核酸提取：将每个粪便样品放到50mL锥形管中。添加约1,000-25,000mg粪便到每个管。添加另外的20-40mL溶液到每个管。这种溶液含有汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(西格玛-奥德里奇)与0.05％Tween-20(西格玛-奥德里奇)和0.0002％RNA酶抑制剂(西格玛-奥德里奇)的混合物。将粪便悬浮到溶液中并且在约0-10℃下旋转0-10分钟。将溶液在4℃以1000rpm离心10分钟并且丢弃上清液。添加约4-10mL裂解缓冲液(bioMerieux)到球粒并且将球粒再悬浮到溶液中。将溶液在20-25℃下以2500-3500rpm离心10-15分钟。在差速离心期间，溶液分成三层。底层包括固体细胞碎片，中间层是富含人类核酸的亲水层，并且顶层是疏水脂质层。将顶部的两个层转移到新的15毫升锥形管中，并将溶液在20-25℃下以2500rpm再次离心10分钟。这个离心步骤的结果是分成三层：底层是固体细胞碎片，中间层是富含人类核酸的亲水层，并且顶层是疏水脂质层。为了从溶液中筛选大的碎片，将20μL移液器吸头放到1mL移液器吸头上，并从15mL管中移取2mL亲水层并转移到一次性料筒(bioMerieux)。另外，添加60μL/>磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器将珠粒混合到溶液中0.5-1分钟。根据制造商的说明，使用特异性A方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是70μL。将这个核酸溶液移取到1.5mL管中并放在冰上。然后使用相同技术向前一步骤中使用的相同一次性料筒(bioMerieux)再装载来自先前使用的15mL管中的相同溶液的另外的2mL亲水层以筛选出大的碎片。添加另外的20μL/>磁性二氧化硅(bioMerieux)到料筒。使用移液器将珠粒混合到溶液中0.5-1分钟。如上文所描述，根据制造商的说明，使用特异性A方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是70μL。将这个核酸溶液移取到已经含有第一个70μL洗脱液的原始1.5mL管中，并将合并的溶液放在冰上。
DNA酶处理：将140μL溶液用Baseline-Zero-DNase(Epicentre)在35-40℃处理20-40分钟。将1-2mL等分的裂解缓冲液添加到DNA酶处理的溶液中，并将样品转移到新的/>一次性料筒中。将整个溶液与60μL/>磁性二氧化硅一起添加到新料筒中。根据制造商的说明，使用/>通用方案将与珠粒结合的核酸洗脱到缓冲溶液中。洗脱的核酸的体积是25μL。将这个核酸溶液移取到1.5mL管中并储存在0-6℃下。
实例11：猫样品重复中的核酸水平的测量
提取结果：使用以上提取的样品，使用安捷伦2100生物分析仪评估1μL每个样品的总核酸和RNA完整性。定性和定量分析样品。通过凝胶电泳分析生物分析仪输出的结果，如图14中所示。图14展示来自使用安捷伦RNA 6000Nano Kits运行的8个样品的1μL的RNA生物分析仪迹线。这包括4只个别猫。凝胶电泳分析提供了关于总核酸和RNA完整性和质量的信息。通过比较每个样品的条带与RNA梯中的大小标志物所代表的条带(展示在电泳图的第一泳道中)并鉴定18S和28S真核核糖体RNA条带来读取电泳文件。定性地，足够的条带化和较暗的条带强度表明足够的完整核酸可用于进一步分析，如微阵列测序、聚合酶链反应(PCR)、核酸测序、分子条形码或探针捕获。基于RNA完整性数和真核物质的量，100％的样品符合分析条件。基于生物分析仪迹线的18S和28S真核核糖体RNA条带下的面积估算真核浓度。图14展示了4只个别猫的生物重复。生物重复之间存在类似条带化并且对于个别猫存在独特条带化(图14)。
实例12：猫样品重复中的RNA转录物的分析
使用RT-qPCR评估符合生物标志物表达分析条件的所有个别猫样品(n＝5)。设计总共4个引物集以评估淋巴细胞相关转录物和上皮细胞相关对照(图15B)。设计一个引物集以评估可以在猫淋巴前体中发生的重排以检测T细胞特异性RNA。每个反应含有10μL 2×主混合物(新英格兰生物实验室)、1μL 20×酶混合物(新英格兰生物实验室)、0.8μL的10μM正向引物(Eurofins Genomics)、0.8μL的10μM反向引物(Eurofins Genomics)、1μL 20×SYBRGreen I、2μL RNA和4.4μL分子生物学级H2O(赛默科技)。使用应用生物系统QuantStudio5qPCR机器扩增溶液。热循环仪方案如下：°°在55℃下25分钟以将RNA反转录为DNA，在95℃下反转录酶失活1分钟，在95℃下10秒并且然后在60℃下45秒的60个循环以用于扩增和信号收集°。这些扩增事件的实例展示于图16B中。在分析用于选择T细胞重排的五个猫样品中，在总共12个反应中，75％的反应显示T细胞相关转录物的扩增。测试的所有T细胞重排都显示至少一只猫的扩增(图16B)。
实例13：NanoString分析
为了进一步分析与人类结肠直肠癌和癌前腺瘤相关的基因，对另外70个人类样品进行上文所描述的RNA提取方法。使用NanoString nCounter分析系统分析提取的RNA，所述系统利用基于基因表达的直接多重测量的数字彩色编码条形码技术。在70个样品中，使用PanCancer途径组(Pathways Panel)分析48个，所述途径组包括来自13个癌症相关经典途径的770个基因，所述途径包括：MAPK、STAT、PI3K、RAS、细胞周期、细胞凋亡、Hedgehog、Wnt、DNA损伤控制、转录调节、染色质修饰和TGF-β。使用/>PanCancer进展组(Progression Panel)分析剩余的22个样品，所述进展组包括来自癌症进展过程中的每个步骤的770个基因，所述过程包括：血管生成、细胞外基质重塑(ECM)、上皮细胞向间叶细胞转化(EMT)和转移。还评估了这22个样品的10个“加标”基因，包括ACTB、B2M、BMP3、CD274、CD8A、GAPDH、HPRT1、N-BLR、NDRG4和RNU2-1。
除了在图6(A组)中鉴定的基因(前200种差异表达的基因)的列表之外，我们还分析了与结肠直肠癌和癌前腺瘤相关的另外的基因。我们还分析了在NanoString nCounter分析系统中鉴定为高表达或差异表达的所有基因。这种分析包括使用PanCancer途径组、/>PanCancer进展组和“加标”基因。我们使用这个信息来开发用于结肠直肠癌和癌前腺瘤的400基因RNA生物标志物标签(图13(B组))。/>

Claims (24)

1.一种从粪便样品分离真核核酸的方法，所述方法包含：
a)将所述样品与缓冲剂、表面活性剂和核糖核酸酶抑制剂混合以形成悬浮液；
b)将所述悬浮液分离成富含真核细胞的部分和富含细菌细胞的部分，并且保留所述富含真核细胞的部分；
c)向所述富含真核细胞的部分添加离液剂和任选地表面活性剂以形成裂解物；
d)将所述裂解物分级成细胞碎片层，包含真核核酸的层，和脂质层；和
e)收集所述包含真核核酸的层。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含提供粪便样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述粪便样品是人类粪便样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述粪便样品是非人类动物粪便样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非人类动物选自由以下组成的群组：狗、猫、非人类灵长类动物、反刍动物、熊科动物、马科动物、猪、绵羊、山羊、骆驼、水牛、鹿、鼬科动物、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、厚皮动物和灰鼠。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述非人类动物是狗。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述非人类动物是猫。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述鹿为麋鹿或驼鹿。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述厚皮动物为犀牛。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包含离心。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包含基于柱的方法。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤利用结合真核细胞的靶向探针。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤利用差异过滤。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a和b重复一次、两次、三次、四次或更多次。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级步骤包含离心。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级步骤利用特异性结合真核核酸的靶向探针。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级步骤利用差异过滤。
18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d和e重复两次或更多次。
19.根据权利要求1所述的方法，其中使用小孔尖端收集所述包含真核核酸的层。
20.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含从所述收集的包含真核核酸的层提取所述真核核酸。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是基于磁性颗粒、基于柱、基于过滤器、基于珠粒或基于有机溶剂的方法。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含DNA和/或RNA。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述RNA包含总RNA。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述RNA包含mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或sno RNA或其任意组合。
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