CN107988364A - 一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，特别的，涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒，并进一步公开其用于检测胆囊癌的应用。本发明所述荧光定量PCR检测系统，包括对特定位点基因的检测试剂盒，并根据每个位点对胆囊癌风险的风险值来计算胆囊癌风险的得分，并根据现有的数据库去进行人群分级，通过个人得分得到个人的胆囊癌风险级别，从而评估受检者的患病风险，引导高风险者改善生活方式，并避免诱发因素及增加体检频率。与此同时，本发明通过对选定的2个基因多态性位点建立中国人群数据库，为建立中国人群特有的胆囊癌评估奠定了基础。

Description

一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别地，涉及一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统，并进一步公开了一种基于荧光定量PCR检测系统进行胆囊癌基因筛查的方法。

背景技术

随着科学研究的不断发展，人类基因组计划完成后，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在癌症研究领域的应用得到广泛的关注。目前运用遗传学的理论和方法进行肿瘤易感性研究已经有了初步进展。常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR，其中利用DNA分析仪直接测序是金标准，但是上述方法分别存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等问题。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time

Quantitative PCR Detecting System，qPCR)，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，荧光定量PCR(realtime PCR)检测在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，qPCR系统为三代的PCR检测技术，qPCR具有检测灵敏度高，检测线性范围宽，检测精度和重复性好等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。因此该技术可以高效、准确的用于运动基因检测。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP 在基因组中分布相当广泛，研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，通过对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

已有越来越多的文献对荧光定量PCR技术从各方面的应用角度进行阐述，大部分文献公开了多种单一片段通过荧光定量PCR技术进行检测的具体方式方法，但在发明人进行荧光定量PCR检测SNP位点的过程中，发现单一片段的检测不足以满足检测要求，对于具有两个或多个SNP位点的综合性检测，需要重复检测，步骤繁琐且操作时间长。

原发性胆囊癌是胆道系统肿瘤中居首位的恶性肿瘤，在消化道肿瘤中居第五位。胆囊癌早期诊断困难，多数患者就诊时已是晚期。早期胆囊癌术后5年生存率可达95％以上，而晚期只有5％左右。

据全国肿瘤预防办公室的流行病统计资料表明,上海市胆囊和肝外胆道恶性肿瘤的标化发病率,男性为2.0/10万人～3.2/10万人,女性为3.6/10万人～ 4.5/10万人。

胆囊癌最常见的病理组织类型为腺癌，占总体的98％，管状癌和微乳头状癌是其他最常见的类型。约有2/3的胆囊癌为中分化或者低分化。有研究表明，微乳头状癌在西方国家较少，在日本等国家较常见。世界卫生组织亦列出了其他少见的病理类型，如鳞癌、腺鳞癌、类癌、印戒细胞癌、小细胞癌等。

遗传因素是胆囊癌的常见危险因素，有胆囊癌家族史者，其发病风险增加。基因遗传背景占胆囊结石总发病风险的5％～25％，有胆囊结石家族史者，胆囊癌发病风险亦增加。

胆囊癌起源于胆囊或者胆囊管的粘膜上皮细胞。在胆囊恶变过程中，可以见到两种病理组织变化：假幽门腺化生和肠上皮化生，二者都被公认为是慢性炎症尤其是胆囊结石长期刺激的结果。胆囊癌的周边也伴随着这两种病理组织变化，肠上皮化生和胆囊癌的关系更加密切，并且患者年龄越大，肠上皮化生越明显。研究表明，在原位癌临近粘膜伴随着上皮发育不良，并且80％的侵袭性胆囊癌伴随着这种上皮发育不良。

胆囊癌的发生是一个多步骤分阶段的过程，首先是炎症等刺激使粘膜发生上皮化生，继而产生粘膜异常，继而逐渐发展为原位癌直至胆囊癌。

现有的胆囊癌相关的基因位点是基于欧洲人群大样本量GWAS研究得出的强关联位点，在应用于亚洲人群，尤其是我国人群时，位点关联性较弱，难以通过检测得到较为准确的结果，因此建立中国人群的评估系统是十分有必要的。

发明内容

本发明提供了一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统，并进一步公开其在胆囊癌基因筛查领域的应用。

为实现上述目的，本发明提出了荧光定量PCR检测系统用于制备胆囊癌基因筛查系统的用途。

所述检测系统包括用于待测基因检测的荧光定量PCR检测试剂盒，以及检测结果对照评价系统；所述检测结果处理评价系统包括位点对应的检测结果处理系统及参考数据库。

进一步的，所述荧光定量PCR检测试剂盒至少包括两个位点的荧光定量 PCR检测试剂。

所述参考数据库是以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内。

所述检测结果对照评价系统是通过将待测基因的荧光定量PCR检测结果对应至风险级别中，其中，待测基因的风险值P为多个检测基因位点的乘积，平均风险值为Pa，平均方差为S，并以此判断待测基因的风险级别：

Pa+0.6S≤P为高风险级别；

Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为偏高风险级别；

Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2S为一般风险级别；

Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为偏低风险级别；

更进一步的，所述平均方差S的计算方式如下：

其中，i为待测基因的检测位点数量；

平均风险值Pa为通过东亚人群的基因组数据，Pa的计算公式为：

其中，人群总人数为N。

本发明还公开了一种所述荧光定量PCR检测系统对于胆囊癌基因检测的用途。

本发明还公开了一种利用荧光定量PCR检测系统检测胆囊癌基因的办法，包括所述的荧光定量PCR检测系统对待测基因进行荧光定量PCR检测的步骤。

更优的，所述荧光定量PCR检测的位点包括rs7504990及rs693位点。

更优的，所述的利用荧光定量PCR检测系统检测胆囊癌基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待测样本的扩增：采用单荧光标记探针，设计待测样本的引物及探针序列，进行PCR扩增；

(2)样本检测：通过熔解曲线峰型图检测已扩增的位点，得到对应位点的检测结果；

(3)根据检测结果进行处理，将各位点的风险积点统计后得出该待测基因的风险值，并对应所述参考数据库中的风险级别；

(4)根据检测结果的对应级别，综合得到基因风险及相关处理结果。

具体的，检测所述胆囊癌基因位点的引物和探针序列结构如下表所示：

本发明具有如下有益效果：

本发明所述荧光定量PCR检测系统，包括对特定位点基因的检测试剂盒，并根据每个位点对胆囊癌的风险值来计算胆囊癌风险的得分，并根据现有的数据库去进行人群分级，通过个人得分得到个人的胆囊癌风险级别，从而评估受检者的患癌风险，引导高风险者改善生活方式，并避免诱发因素及增加体检频率。与此同时，本发明通过对选定的5个基因多态性位点建立中国人群数据库，为建立中国人群特有的胆囊癌评估奠定了基础。

本发明所述的荧光定量PCR检测系统，可以对受检者的胆囊癌相关风险进行评估。本发明提供的检测试剂盒，具有特异性强、检出率高、效率高、成本低的优势，能够综合检测与分析受检人群是否携带“胆囊癌易感基因”，并评估其患癌风险，将易感人群从普通人群中筛选出来，给予个性化知道建议，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

附图说明

图1为具体实施方式所述的检测样品位点rs7504990实验结果；

图2为具体实施方式所述的检测样品位点rs7504990测序结果；

图3为具体实施方式所述的检测样品位点rs693实验结果；

图4为具体实施方式所述的检测样品位点rs693实验结果；

图5为根据检测样品实验结果进行评估的流程图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例中采用胆囊癌荧光定量PCR检测试剂盒进行胆囊癌相关基因的检测，其中对胆囊癌相关的两个基因上的2个多态性位点进行检测，包括rs7504990 和rs693位点，利用特异性设计的引物和探针，优化扩增体系和条件，在同一体系同时完成两个基因上的2个多态性位点的检测。

本实施例中采用单荧光标记探针，落实480平台，最后通过熔解曲线峰型图检测rs7504990和rs693位点。

具体的，rs7504990和rs693位点的双重荧光定量PCR检测方法中，对于 rs7504990和rs693位点的引物及探针设计如下表1所示。

表1引物及探针设计

对于上述rs7504990和rs693位点分别设计如下表2所示的试剂反应体系：

表2位点rs7504990和rs693的双重试剂体系

对上述rs7504990和rs693位点进行PCR扩增，并设计PCR反应程序(循环)设置参数如下表3所示。

表3PCR反应参数设定

按照上述设计的引物、试剂盒PCR参数，对上述rs7504990和rs693位点进行PCR扩增，且对扩增结果进行检测，检测结果分别如图1-5所示。

如图1-5所示的检测结果中：

检测样品点位rs7504990实验结果为CC，反应链为GG；

检测样品位点rs7504990测序结果为GG；

检测样品位点rs693实验结果为GG；

检测样品位点rs693测序结果为GG；

通过测序进行复检，证明本实验方法具有准确性和可靠性。

实施例2

实施例1中的2个位点分别来自Cha PC等和Gong Y等发表的文章，文章通过GWAS研究得出了与胆囊癌直接相关的两个易感位点，并计算出了两个位点的风险等位基因型风险值，即OR值。

Cha PC等对41个胆囊癌病人和866个对照样本进行了GWAS研究，同时对可能与胆囊癌有关联snp进一步在30个病人及898个对照样本中进行验证。发现DDC基因上的snp位点rs7504990在日本人群中表现出全基因组范围内与胆囊癌易感性明显的关联(PCombined＝7.46×10^-8；OR＝6.95；95％CI＝3.43-14.08)， DCC被证明在缺乏纺锤蛋白-1配体时诱导细胞凋亡；另外，在小鼠消化道内增强纺锤蛋白-1的表达诱导增生性肿瘤病变的自发形成，表明了DCC作为抑癌基因的潜在角色。另外Gong Y等利用meta-analysis阐明了ApoB-100基因多态性对于胆结石和胆囊瘤的影响，结果显示出在中国人群众ApoB-100基因rs693位点与胆囊瘤具有明显的关联性(X+vs.X-,OR＝2.37,95％CI 1.52-3.70；X+X+/X+X- vs.X+X+,OR＝2.47,95％CI 1.55-3.92)，ApoB-100X+等位基因可能会增加中国人群患胆囊瘤的风险，但不会影响其他人群。

评估上述2个位点，不同基因型及其风险值(OR)为：DDC基因rs7504990， TT-CT-CC基因型的OR值分别为48.30-6.95-1；ApoB-100基因rs693，AA- AG-GG基因型的OR值分别为6.10-2.47-1。由于胆囊癌的发病率小于10％，所以OR值近似于RR值，即风险值。每个位点的风险值则按照基因型来计算，即纯合风险等位基因型的风险值为OR值的平方，杂合风险等位基因型的风险值为OR值，纯合非风险等位基因型为1，对于一个受检者，每个SNP位点根据检测得到的基因型，都有一个易感值，我们定义这个分值为S，那么受检者的个人胆囊癌易感值为P，P值为两项基因型的OR值乘积：

根据基因检测结果，对个人的胆囊癌风险进行评估，并建立中国人群的胆囊癌易感数据库。

以千人基因组中东亚人群的基因组数据为普通人群水平，总人数定义为N。以千人基因组中东亚人群的基因型平均分设定为人群的平均分：

并计算出平均方差，

根据Pa与S，将东亚人群的胆囊癌风险值进行分级，将受检者的个人胆囊癌风险值P对应到人群分级中去，人群分级共四级，分别为高-略高-一般-略低四个风险级别，具体为：

Pa+0.6S≤P为高风险级别；

Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为略高风险级别；

Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2SC为一般风险级别；

Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为略低风险级别。

基于东亚人群划分的胆囊癌风险级别，P值≥6.94为高风险级别,4.42≤P值＜6.94为偏高风险,1.90≤P值＜4.42为一般风险,0≤P值＜1.90为偏低风险。

如图5所示，根据基因检测结果，将两项OR值相乘得出个人的胆囊癌易感值，也就是风险值。对应到由分级方法得到个人的胆囊癌风险级别，根据受检者的P值对应的级别，综合得到受检者的胆囊癌的风险，从而给出个体健康管理方案。

实施例3

本发明所述方法通过采集受检者的基因样本然后提取DNA，用罗氏 LightCycler480实时定量仪进行检测，得到的结果如图1，3。

如下一个受检者的检测结果如下表4所示。

某个受检者DDC基因rs7504990基因型为CC，对应OR值为1；ApoB-100 基因rs693基因型为AG，对应OR值为2.47；上述OR值来自于NCBI的文献研究。

计算该受检者的个人胆囊癌易感值P＝1*2.47＝2.47。

表4受检者的基因检测结果

	rs7504990	rs693
			受检者	CC	AG
HG00403	CC	AG
			HG00404	TC	AA
HG00406	CC	GG

千人基因组数据库中有504个东亚人，比如HG00403这个人P＝1*2.47＝2.47，其余人同样可以计算得出，则东亚人群位点的基因型平均分P_a＝6.99，平均方差＝13.91。

此受检者P<P_a-0.2S＝6.99-0.2*13.91，所以胆囊癌风险等级为偏低，所以该受检者的胆囊癌风险等级均低于或等于一般风险等级，但不代表受检者一定不会患此类疾病，因此，提示受检者继续保持乐观心态，以及健康的生活方式，每年例行体检。

以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 深圳美因临床检验所有限公司

<120> 一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其应用

<130> MY17017P

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<230> rs7504990 F端引物

<400> 1

ccaagttatgttggacagagaa

22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<230> rs7504990 R端引物

<400> 2

gcagaagttcagcctaagag

20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<230> rs7504990探针序列

<400> 3

ctaatacgcccttcgatctgccaat

25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<230> rs693 F端引物

<400> 4

ggttacaggaggctttaagttc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<230> rs693 R端引物

<400> 5

ccagagacaggtatcgttgaa

21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<230> rs693探针序列

<400> 6

tccgagagaccctagaagatacac

24

Claims (10)

1.荧光定量PCR检测系统用于制备胆囊癌基因筛查系统的用途。

2.一种用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述检测系统包括用于待测基因检测的荧光定量PCR检测试剂盒，以及检测结果对照评价系统；所述检测结果处理评价系统包括位点对应的检测结果处理部分及参考数据库。

所述荧光定量PCR检测试剂盒包括至少两个胆囊癌相关基因位点检测的荧光定量PCR检测试剂。

3.根据权利要求2所述的用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的相关位点包括rs7504990及rs693位点。

4.根据权利要求3所述的用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统其特征在于，检测所述胆囊癌基因位点的引物和探针序列结构如下表所示：

5.根据权利要求2-4任一项所述的用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述参考数据库是以千人基因组中的东亚人群基因组数据作为普通人群水平，并将检测结果实时收入数据库内。

6.根据权利要求2-4任一项所述的用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于，所述检测结果对照评价系统是通过将待测基因的荧光定量PCR检测结果对应至风险级别中，其中，待测基因的风险值P为多个检测基因位点的乘积，平均风险值为P_a，平均方差为S，并以此判断待测基因的风险级别：

Pa+0.6S≤P为高风险级别；

Pa+0.2S≤P＜Pa+0.6S为偏高风险级别；

Pa-0.2S≤P＜Pa+0.2S为一般风险级别；

Pa-0.6S≤P＜Pa-0.2S为偏低风险级别。

7.根据权利要求6所述的用于胆囊癌基因筛查的荧光定量PCR检测系统，其特征在于：

所述平均方差S的计算方式如下：

其中，i为待测基因的检测位点数量；

平均风险值Pa为通过东亚人群的基因组数据，Pa的计算公式为：

其中，人群总人数为N。

8.权利要求2-7任一项所述的荧光定量PCR检测系统在胆囊癌基因筛查领域中的应用。

9.一种利用荧光定量PCR法筛查胆囊癌基因的方法，其特征在于，包括利用权利要求2-7任一项所述的荧光定量PCR检测系统对胆囊癌相关基因进行荧光定量PCR检测的步骤，所述荧光定量PCR检测的位点包括rs7504990和rs693位点。

10.根据权利要求9所述的基于荧光定量PCR法检测胆囊癌基因的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)待测样本的扩增：根据待测基因位点的结构，采用单荧光标记探针，设计待测样本的引物及探针序列，进行PCR扩增；

(2)样本检测：通过熔解曲线峰型图检测已扩增的位点，得到对应位点的检测结果；

(3)根据检测结果进行处理，将各位点的风险积点统计后得出该待测基因的风险值，并对应所述参考数据库中的风险级别；

(4)根据检测结果的对应级别，综合得到基因风险及相关处理结果。