CN107641649A - 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测微卫星NR27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法，其是分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对进行荧光定量PCR反应，收集荧光信号，绘制熔解曲线；比较结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线。本发明的检测方法与金标准方法相比，结果准确可靠，具有高敏感性、高特异性，且耗时短，成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种肿瘤细胞检测微卫星NR27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，在我国发病率位居第六，其致死率排名第五位。在世界范围内的恶性肿瘤疾病当中，发病率高居第4，死亡率在恶性肿瘤行列高居第2位，严重威胁着人类的健康与生存。微卫星不稳定性(MSI)是结直肠癌发病的重要原因，在预测肠癌患者预后及化疗反应方面也有重要作用，同时对Lynch综合征的诊断具有重要意义。
近年来，微卫星不稳定性(MSI)的相关临床和基础方面研究取得较好的进展，对MSI与CRC的关系取得深入认识。2016年，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)在《结直肠癌临床实践指南》(2016.V2)指出：Lynch综合征应行MSI(微卫星不稳定性)或MMR(错配修复)检测：1)70岁及以下诊断结直肠癌患者以及符合Bethesda指南的大于70岁患者均应行Lynch综合征肿瘤检测。2)所有Ⅱ期患者均应行MSI或MMR检测，因为MSI-H的Ⅱ期患者预后较好，且不会从5-氟尿嘧啶单药辅助治疗获益。对于具有MSI-H特征的Ⅱ期结肠癌，组织分化差不再认为是高危因素。目前，检测微卫星不稳定性的方法包括MMR蛋白免疫组化法、DNA测序、片段分析法、高效液相色谱技术、HRM法等。片段分析法是目前公认的金标准方法，但该方法成本较高，检测时间较长，并且必须在价格昂贵的测序仪上进行分析，大部分实验室无法开展检测。HRM法完全是基于核酸的物理性质进行分析，只需在常规PCR基础上增加一些饱和染料，熔解曲线的形状取决于GC含量、片段长度和产物序列，通过熔解曲线的差异即可分辨。样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，具有快速、低成本、灵敏性高等优点，同时只需在荧光定量PCR仪上即可进行分析。但HRM法对引物设计的要求很高：引物既要有很好的特异性，又要求其扩增出的片段足够短，才能获得较好的检测灵敏度。
NR27是结直肠癌微卫星不稳定性检测的重要位点之一，当发生不稳定时单核苷酸重复数会出现改变。因此，有必要筛选一种准确、快速且廉价的检测NR27位点稳定性的方法。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种针对检测结直肠癌微卫星位点-NR27位点稳定性的引物对、试剂盒及HRM检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测微卫星NR27位点稳定性的方法，包括以下步骤：
(1)、分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，采用如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对进行荧光定量PCR反应及HRM分析，收集荧光信号；
(2)、比较结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线，若肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示该患者NR27位点不稳定性，从而判断该患者为微卫星不稳定(MSI)型患者，反之，则表示该患者NR27位点稳定。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应体系为：DNA模板1-5μL、10×Buffer 2-2.5μL、dNTP 2-2.5μL、Eva Green 1-1.25μL、SEQ ID NO:1引物1-1.25μL、SEQID NO:2引物1-1.25μL、Taq酶0.2-0.25μL、无酶水加至20-25μL。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min→95℃20s、62℃20s、72℃20s，40cycles→熔解温度74-84℃。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述收集荧光信号的频率为12次/℃。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述模板的浓度为50-100ng/μL。
本发明还提供了一种检测微卫星位点-NR27位点稳定性的试剂盒，所述试剂盒包括具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括饱和荧光染料。
在其中一些实施例中，所述饱和荧光染料为Eva Green。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括Buffer、dNTP和Taq酶。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒由如下体积比的组分组成：10×Buffer：dNTP：Eva Green：SEQ ID NO:1引物：SEQ ID NO:2引物：Taq酶：无酶水＝2-2.5：2-2.5：1-1.25：1-1.25：1-1.25：0.2-0.25：12-15。
本发明还提供了一种检测微卫星位点-NR27位点稳定性的引物对，所述引物对具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的碱基序列。
本发明还提供了一种检测微卫星位点-NR27位点稳定性的反应体系，所述反应体系包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对。
在其中一些实施例中，所述反应体系还包括Eva Green、dNTP和Taq酶。
在其中一些实施例中，所述反应体系由如下体积的组分组成：DNA模板1-5μL、10×Buffer 2-2.5μL、dNTP 2-2.5μL、Eva Green 1-1.25μL、SEQ ID NO:1引物1-1.25μL、SEQ IDNO:2引物1-1.25μL、Taq酶0.2-0.25μL、无酶水加至20-25μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的发明人经过多次探索发现，采用本发明的引物进行HRM法检测NR27位点的稳定性，与北京阅微基因技术有限公司MSI检测试剂盒(金标准方法)相比，本发明方法灵敏度为93.48％，特异性达100％，基本能满足临床需求，且对设备的要求也大大降低，无需使用基因分析仪，只需一台带有HRM功能的荧光定量PCR即可；
2、本发明的检测方法操作程序大大简化，每检测一个样本的时间相较金标准方法缩短了约1小时，且成本降低了80％。
附图说明
图1为样品1的NR27位点的分析图；其是使用引物对1进行检测的，肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均只显示出一个熔解峰的结果，表明NR27位点为稳定型；
图2为样品2的NR27位点的分析图；其是使用引物对1进行检测的，肿瘤组织显示两个熔解峰，正常显示一个熔解峰的结果，表明NR27位点为不稳定型；
图3为样品2的NR27位点的分析图；其是使用引物对2进行检测的，肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均显示出一个熔解峰的结果，错误判读NR27位点为稳定型；
图4为样品2使用引物对4进行检测的结果图，其中NR27位点无扩增。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使用的原料，均来源于市售。
实施例1检测微卫星位点-NR27位点的稳定性的方法
1、引物
本发明的一种检测微卫星位点-NR27位点的稳定性的引物，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的碱基序列。
上游引物SEQ ID NO.1:CAACGTCTGTGAGATCCAGGAAACC
下游引物SEQ ID NO.2:TACTAGCAATGACCAATAAGCAAGT
反应体系
使用Blend Taq Plus酶(Toyobo，CAT NO.BTQ-201)配制如下反应体系：
3、检测方法
(1)、样品来源及基因组DNA提取：所有结直肠癌患者肿瘤样品及正常样品均来自中山大学附属第六医院病理科，收集组织，使用石蜡样品提取试剂盒对基因组DNA进行提取。和正常组织的DNA模板浓度分别调整至50-100ng/ul。在上述反应体系中分别加入1ul的DNA模板。涡旋混匀后，使用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪进行检测，程序如下：95℃10min→(95℃20s→62℃20s→72℃20s)40cycles→熔解温度74-84℃，收集荧光信号的频率为12次/℃。
(2)、将肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线进行对比，判读待测标本NR27位点的稳定性。若肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而该病人正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示该患者NR27位点不稳定性，从而判断该患者为微卫星不稳定(MSI)型患者。反之，若肿瘤组织和正常组织的熔解曲线均为单峰，则判断两者的峰型一致，表示该患者NR27位点稳定。
实施例2检测微卫星位点-NR27位点的稳定性的试剂盒
本实施例的检测试剂盒包括以下组分：10×Buffer、dNTP、Eva Green、SEQ ID NO:1引物、SEQ ID NO:2引物、Taq酶。
试验例1采用不同引物对检测微卫星位点-NR27位点的稳定性的结果对比
发明人摸索了多组引物对，研究HRM法(实施例1的方法)对检测上述结直肠癌患者肿瘤NR27位点的实验结果的影响。表1为采用多组示例性引物，按实施例1的方法进行实验所得的结果。HRM法结果与片段分析法商品化试剂盒(北京阅微基因技术有限公司MSI检测试剂盒)结果进行比对。商品化试剂盒工作步骤参照产品说明书，此处不赘述)。实验证明，引物的最终选择关乎方法的可行性。
表1采用5对引物对和峰型、判读结果比较
注：上表采用HRM检测法，其PCR程序总共设置40个循环。样品扩增CT值以18-25为佳，若样品扩增CT值不在该范围内，则判读为该次PCR反应扩增效果不好或无法扩增，最后有可能会影响扩增产物的量和后续的HRM分析。
表1结果显示，样本2使用商品化试剂盒检测判读为NR27位点不稳定型，使用上述五对引物，分别按本发明实施例1所述HRM法进行检测。发现只有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示引物(即上列表中引物对1)可以准确判读样本2的NR27位点为不稳定型，其余四对引物(即上列表中引物对2-5)均无法准确判读。
试验例2本发明的方法与片段分析法试剂盒的检出率比较
1、样本
102对(即肿瘤组织及其对应正常组织，编号1-102)结直肠癌患者样品均来自于中山大学附属第六医院病理科。按照实施例1中所述方法分别提取基因组DNA。
2、方法
本发明方法
步骤如实施例1，采用的引物为：F:CAACGTCTGTGAGATCCAGGAAACC(SEQ ID NO:1)R:TACTAGCAATGACCAATAAGCAAGT(SEQ ID NO:2)，对102对样品一一进行检测。
片段分析商品化试剂盒方法
选用片段分析法商品化试剂盒北京阅微基因技术有限公司MSI检测试剂盒，其工作原理是以荧光PCR为基础结合毛细管电泳来检测微卫星不稳定性。工作步骤参照产品说明书，此处不赘述。该方法是目前现有技术中较受认可的方法，被称为金标准方法。
3、检测结果
对待测标本均进行了两种方法的检测，其中本发明所述HRM方法与商品化试剂盒有99例结果一致，3例样品结果不符，结果比对如表2所示。
由表2结果可知：102对标本中，本发明方法灵敏度＝43/(43+3)×100％＝93.48％，特异性＝56/(56+0)×100％＝100％，本发明方法与金标准方法相比特异性为100％，敏感度也较高，基本能满足临床需求。
试验例3本发明方法检测与毛细管电泳法试剂盒检测的时间及成本对比
计算方法：针对试验例2中使用两种方法均有检测结果的102对待测标本进行核算，结果如表3所示。
表3本发明方法与毛细管电泳法试剂盒的检测时间和成本的比较
由表3结果可知，使用本发明方法进行微卫星不稳定性-NR27位点的检测，每个标本的检测时间比商品化试剂盒片段分析法缩短了33.3％，同时每个标本的检测成本降低了80％。使用本发明的所述方法进行微卫星不稳定性-NR27位点检测，可以大大节约检测时间和成本，更好的服务临床病人。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种检测微卫星NR27位点稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对进行荧光定量PCR反应，收集荧光信号，绘制熔解曲线；
(2)、分析结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线。
2.根据权利要求1所述的检测微卫星NR27位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应体系为：DNA模板1-5μL、10×Buffer2-2.5μL、dNTP 2-2.5μL、EvaGreen 1-1.25μL、SEQ ID NO:1引物1-1.25μL、SEQ ID NO:2引物1-1.25μL、Taq酶0.2-0.25μL、无酶水加至20-25μL。
3.根据权利要求1所述的检测微卫星NR27位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min→95℃20s、62℃20s、72℃20s，40cycles→熔解温度74-84℃。
4.根据权利要求1所述的检测微卫星NR27位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)中收集荧光频率为12次/℃。
5.根据权利要求1所述的微检测卫星NR27位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述模板的浓度为50-100ng/μL。
6.一种检测微卫星NR27位点稳定性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括具有如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对。
7.根据权利要求6所述的检测微卫星NR27位点稳定性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括饱和荧光染料。
8.根据权利要求7所述的检测微卫星NR27位点稳定性的试剂盒，其特征在于，所述饱和荧光染料为Eva Green。
9.一种检测微卫星NR27位点稳定性的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的碱基序列。
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2016
- 2016-07-22 CN CN201610587140.2A patent/CN107641649B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
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| CN107641649B (zh) | 2021-03-19 |
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