CN108998536A - 一种人类微卫星不稳定性状态msi检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒及其检测方法；包括检测人类微卫星不稳定性状态MSI的引物、探针。该引物、探针能够检测人类微卫星不稳定性状态MSI，灵敏度高，特异性强；本发明还提供了一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人类微卫星不稳定性状态；此外，本发明提供了使用上述试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。

Description

一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及到人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
目前，肿瘤已经成为中国主要死亡原因且肿瘤负担仍在持续上升。据2018年中华医学会发布的《中国肿瘤防治进展》报告显示，中国平均每天约有1万人确诊癌症、7500名癌症患者死亡，因此肿瘤药物开发、治疗疗法的研究日趋重要。近几年，随着精准医疗与个体化医疗的发展，新的肿瘤靶向药物研发及不断深入研究，通过基因检测预测个体化用药也随之成为当前的发展趋势。
微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是一种由于基因复制错误而引起的简单重复序列发生改变。MSI的存在预示着细胞在错误修复的DNA序列方面存在缺陷，这与恶性肿瘤(尤其是消化系统恶性肿瘤及妇科肿瘤)的形成密切相关。MSI根据其改变程度分为高频MSI(MSI-H)、低频MSI(MSI-L)和微卫星稳定(MSS)，研究表明检测患者的MSI分型具有重要临床意义。据报道，MSI检测被认为可对结直肠癌以及直肠癌的辅助治疗提供依据，NCCN发布的结肠癌和直肠癌临床实践指南推荐所有具有结直肠癌与直肠癌患病史的病人进行MSI检测，以指导临床用药和免疫治疗、诊断林氏综合征(Lynch syndrome)。有大量的研究表明MSI状态对于决定结直肠癌患者是使用5-FU治疗还是伊立替康治疗很重要，MSI结直肠癌以及其他类型MSI癌症晚期患者利用PD-1单抗免疫治疗获益较大。NCCN推荐PD-1免疫治疗单抗pembrolizumab和nivolumab用于dMMR/MSI-H结直肠癌晚期治疗。由此可见，随着药物的研究机理的愈加明确化，MSI检测将具有很大市场前景。
目前检测肿瘤细胞中MSI时，既可以依赖分子水平(包括多重PCR-毛细管电泳以及NGS)来检测MSI现象，也可以通过免疫组化检测MMR基因缺陷。
发明内容
本发明提供了检测人类微卫星不稳定性状态MSI的引物、探针。该引物、探针能够检测人类微卫星不稳定性状态MSI，灵敏度高，特异性强。
本发明还提供了一种一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人类微卫星不稳定性状态。
本发明还提供了使用上述试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。
本发明包括如下内容：
一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括针对针对六个单核苷酸重复位点和三个对照位点检测的引物，所述的检测引物如下：
BAT-25-Fo：FAM-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT
BAT-25-Re：ctatggctctaaaatgctctgttc
BAT-26-Fo：TAMRA-TGACTACTTTTGACTTCAGCC
BAT-26-Re：AACCATTCAACATTTTTAACCC
NR-21-Fo：VIC-CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAA
NR-21-Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTC
NR-24-Fo：VIC-GCTGAATTTTACCTCCTGAC
NR-24-Re：GGAGATTGTGCCATTGCA
NR-27-Fo：FAM-AACCATGCTTGCAAACCACT
NR-27-Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACC
MONO-27-Fo：TAMRA-AAGGGTGGATCAAATTTCACTTG
MONO-27-Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTG
PentaC-Fo：VIC-gaacacactttgcacctgtcag
PentaC-Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCT
PentaD-Fo：TAMRA-atttgcctaacctatggtCATAACG
PentaD-Re：ACACTCCAGCCTAGGTGACAGA
Amel-Fo：FAM-ccctgggctctgtaaagaatag
Amel-Re：TTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA。
优选地，所述的人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒包括MSI引物混合液、PCR预混液、阴性对照品、阳性对照品；
所述的MSI引物混合液包含用于检测6个单核苷酸重复位点和2个五核苷酸重复位点及1个性别鉴定基因的引物，6个单核苷酸重复位点分别为BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27，2个五核苷酸重复位点为PentaC、PentaD，性别鉴定基因为Amel；
所述的PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl2、dNTPs和dUTP；
所述的阴性对照品为灭菌超纯水；
所述的阳性对照品为细胞系HT-29基因组DNA。
一种人类微卫星不稳定性状态MSI的检测方法，所述的检测方法包括使用人类微卫星不稳定性状态MSI的引物或检测人类微卫星不稳定性状态MSI的试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的步骤；
所述检测方法采用多重荧光定量PCR技术结合毛细管电泳进行序列片段分析人类细胞中微卫星不稳定状态，具体步骤如下：
步骤一、提取待检的同一个体的肿瘤样本和对照样本DNA，作为检测模板；
步骤二、荧光PCR扩增
根据待检测样本数(含1个阳性对照和1个阴性对照)，计算并配制反应混合液，将配制好的检测反应液分别分装到八联PCR反应管；
步骤三、分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中；
步骤四、进行多重荧光定量PCR检测，多重PCR扩增程序为：37℃2分钟；94℃10分钟；94℃30秒，60℃1分钟，70℃1分钟，35个循环；60℃45分钟；4℃∞；
步骤五、荧光PCR产物毛细管电泳；
制备毛细管样品，以基因分析仪进行毛细管电泳检测；
步骤六、检测数据分析
检测数据使用分析软件进行数据分析，根据判定标准判定微卫星不稳定状态。
综上，本发明提供的一种检测人类微卫星不稳定性状态的特异性引物，所述引物分别为针对六个单核苷酸重复位点和三个对照位点检测的引物。检测引物如下：
BAT-25-Fo：FAM-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT
BAT-25-Re：ctatggctctaaaatgctctgttc
BAT-26-Fo：TAMRA-TGACTACTTTTGACTTCAGCC
BAT-26-Re：AACCATTCAACATTTTTAACCC
NR-21-Fo：VIC-CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAA
NR-21-Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTC
NR-24-Fo：VIC-GCTGAATTTTACCTCCTGAC
NR-24-Re：GGAGATTGTGCCATTGCA
NR-27-Fo：FAM-AACCATGCTTGCAAACCACT
NR-27-Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACC
MONO-27-Fo：TAMRA-AAGGGTGGATCAAATTTCACTTG
MONO-27-Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTG
PentaC-Fo：VIC-gaacacactttgcacctgtcag
PentaC-Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCT
PentaD-Fo：TAMRA-atttgcctaacctatggtCATAACG
PentaD-Re：ACACTCCAGCCTAGGTGACAGA
Amel-Fo：FAM-ccctgggctctgtaaagaatag
Amel-Re：TTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA
一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，组分见下表1，该试剂盒以多重荧光PCR技术为基础，结合毛细管电泳进行片段分析，检测人类细胞中微卫星不稳定性状态。本发明提供的试剂盒检测6个单核苷酸重复位点和2个五核苷酸重复位点及1个性别鉴定基因，具体检测位点见下表2。
表1：试剂盒组分
表2试剂盒检测位点
本发明还提供了一种人类微卫星不稳定性状态MSI的检测方法，该方法包括使用上述人类微卫星不稳定性状态MSI的引物或上述检测人类微卫星不稳定性状态MSI的试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的步骤。
本发明检测方法采用多重荧光定量PCR技术结合毛细管电泳进行序列片段分析人类细胞中微卫星不稳定状态，具体步骤如下：
(1)提取待检的同一个体的肿瘤样本和对照样本DNA，作为检测模板；
(2)荧光PCR扩增
根据待检测样本数(含1个阳性对照和1个阴性对照)，计算并配制反应混合液，将配制好的检测反应液分别分装到八联PCR反应管。
(3)分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中。
(4)进行多重荧光定量PCR检测，多重PCR扩增程序为：37℃2分钟；94℃10分钟；94℃30秒，60℃1分钟，70℃1分钟，35个循环；60℃45分钟；4℃∞。
(5)荧光PCR产物毛细管电泳
制备毛细管样品，以基因分析仪进行毛细管电泳检测。
(6)检测数据分析
检测数据使用分析软件进行数据分析，根据判定标准判定微卫星不稳定状态
2.3本发明技术方案带来的有益效果
与现有技术相比，本发明有以下优点：
(1)所需样本量少，使用多重荧光PCR技术进行检测，添加防污染系统和内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行检测，确保结果真实可信；
(2)含有2个五核苷酸重复序列的对照检测位点和1个性别鉴定对照位点，避免样本混淆错误。
(3)操作简单快速，并且结果判读简单客观，便于分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中癌旁正常对照组织峰图；
图2为本发明实施例3中肿瘤组织峰图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明，以下实施例中如无特殊说明，所使用原料来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
实施例1：一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒
根据目标基因序列设计特异性引物，设计的引物和探针可以按照现有方法进行人工合成。具体引物如下所示：
BAT-25-Fo：FAM-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT
BAT-25-Re：ctatggctctaaaatgctctgttc
BAT-26-Fo：TAMRA-TGACTACTTTTGACTTCAGCC
BAT-26-Re：AACCATTCAACATTTTTAACCC
NR-21-Fo：VIC-CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAA
NR-21-Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTC
NR-24-Fo：VIC-GCTGAATTTTACCTCCTGAC
NR-24-Re：GGAGATTGTGCCATTGCA
NR-27-Fo：FAM-AACCATGCTTGCAAACCACT
NR-27-Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACC
MONO-27-Fo：TAMRA-AAGGGTGGATCAAATTTCACTTG
MONO-27-Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTG
PentaC-Fo：VIC-gaacacactttgcacctgtcag
PentaC-Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCT
PentaD-Fo：TAMRA-atttgcctaacctatggtCATAACG
PentaD-Re：ACACTCCAGCCTAGGTGACAGA
Amel-Fo：FAM-ccctgggctctgtaaagaatag
Amel-Re：TTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA
本发明的一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒包含以下三组分，分别为：
MSI引物混合液：包含用于检测6个单核苷酸重复位点和2个五核苷酸重复位点及1个性别鉴定基因的引物，6个单核苷酸重复位点分别为BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27，2个五核苷酸重复位点为PentaC、PentaD，性别鉴定基因为Amel。引物为如上所述序列。
PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl2、dNTPs和dUTP。
阳性对照品为细胞系HT-29基因组DNA；阴性对照品为灭菌超纯水。
实施例2：人类微卫星不稳定性状态检测方法
采用本发明实施例1的试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态，包括以下步骤：
(1)待测样本处理和模板提取；
同一个体肿瘤样本(石蜡包埋肿瘤组织)和对照样本(石蜡包埋癌旁组织)按照提取试剂盒说明书提取DNA。提取的DNA稀释到20ng-100ng/μL后作为PCR扩增模板。
(2)体系配制
将试剂盒中所有组分冰上融化，根据待检测样本数，计算并配制PCR反应混合液(见表3)。
表3 PCR反应液配制公式
将PCR反应工作液按20μL/孔加入到PCR反应管，进行PCR扩增。
(3)PCR扩增
PCR扩增程序见表4
表4PCR扩增程序
(4)毛细管电泳
按照表5配制毛细管电泳检测样本，以seqstudio基因分析仪进行毛细管电泳检测，根据基因分析仪操作说明进行选择“Fragment Analysis”检测。导出数据用GeneMapper软件分析。
表5毛细管电泳样本制备
组分 加入量(μL)
去离子甲酰胺HiDi 8.5
ROX500 0.3
PCR产物 1
(5)结果分析
分子内标ROX500片段大小标注准确，依次为70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490和500nt。
检测峰高没有出现超阈值现象，否则应稀释PCR产物进行毛细管电泳检测。
阴性对照品无产物扩增，阳性对照品9个生物标志物均有产物扩增，且片段大小在合理范围内。
同一个体肿瘤组织与对照组织的两个五核苷酸标志物Penta C与Penta D和性别鉴定基因Amel扩增片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，比较肿瘤组织6个单核苷酸标志物BAT-26、NR-21、BAT-25、MONO-27、NR-27和NR-24片段大小改变情况，产物片段变化超过2.5nt即判定该基因不稳定，反之稳定。根据同一组织肿瘤样本和对照样本不稳定单核苷酸重复位点的个数，确定该样本微卫星状态，微卫星不稳定判断标准件表6。
表6微卫星不稳定判断标准
实施例3检测方法的实际应用
采用本发明试剂盒和检测方法检测肿瘤患者微卫星不稳定性检测，方法如下：
(1)待检样本的处理
一例样本肿瘤与癌旁FFPE组织采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，按照试剂盒说明书操作提取样本DNA。将DNA浓度分别稀释至20ng/μL备用。
(2)体系配制
将试剂盒中所有组分冰上融化，根据待检测样本数，计算并配制PCR反应混合液(见表7)。
表7 PCR反应液配制表
序号 组分 加入量(μL)
1 MSI引物混合液 3×4
2 PCR预混液 12.5×4
3 无核酸酶纯水 4.5×4
4 模板 2.5μL
将PCR反应工作液按20μL/孔加入到PCR反应管，进行PCR扩增。
(3)PCR扩增
PCR扩增程序见表4
表4PCR扩增程序
(5)毛细管电泳
按照表5配制毛细管电泳检测样本，以seqstudio基因分析仪进行毛细管电泳检测，根据基因分析仪操作说明进行选择“Fragment Analysis”检测。导出数据用GeneMapper软件分析。
表5毛细管电泳样本制备
组分 加入量(μL)
去离子甲酰胺HiDi 8.5
ROX500 0.3
PCR产物 1
(6)结果分析
毛细管电泳图中，图1为癌旁正常对照组织峰图，图2为肿瘤组织峰图，横坐标代表扩增产物片段大小，纵坐标代表扩增产物量(荧光强度)。阴性对照品无产物扩增出，阳性对照品的9个生物标志物均有产物扩增出，且片段大小在合理的范围内。肿瘤组织与正常组织的两个五核苷酸标志物Penta C与Penta D和性别鉴定基因扩增Amle片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，肿瘤组织2个单核苷酸标志物NR-21发生5bp片段大小改变，NR-25发生8bp片段大小改变，，样本的微卫星不稳定性MSI状态为微卫星高不稳定性(MSI-H)。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其原料试剂名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括针对六个单核苷酸重复位点和三个对照位点检测的引物，所述的检测引物如下：
BAT-25-Fo：FAM-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT
BAT-25-Re：ctatggctctaaaatgctctgttc
BAT-26-Fo：TAMRA-TGACTACTTTTGACTTCAGCC
BAT-26-Re：AACCATTCAACATTTTTAACCC
NR-21-Fo：VIC-CTTTCTGGTCACTCGCGTTTACAA
NR-21-Re：AAGGGGAGGTAAAGGCAGTCTC
NR-24-Fo：VIC-GCTGAATTTTACCTCCTGAC
NR-24-Re：GGAGATTGTGCCATTGCA
NR-27-Fo：FAM-AACCATGCTTGCAAACCACT
NR-27-Re：TGAGTCGATAATACTAGCAATGACC
MONO-27-Fo：TAMRA-AAGGGTGGATCAAATTTCACTTG
MONO-27-Re：TGGGAGACAGAGCAAGACTCTG
PentaC-Fo：VIC-gaacacactttgcacctgtcag
PentaC-Re：CTGAGCGCTTCTAGGGACTTCT
PentaD-Fo：TAMRA-atttgcctaacctatggtCATAACG
PentaD-Re：ACACTCCAGCCTAGGTGACAGA
Amel-Fo：FAM-ccctgggctctgtaaagaatag
Amel-Re：TTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA。
2.根据权利要求1所述的人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒包括MSI引物混合液、PCR预混液、阴性对照品、阳性对照品；
所述的MSI引物混合液包含用于检测6个单核苷酸重复位点和2个五核苷酸重复位点及1个性别鉴定基因的引物，6个单核苷酸重复位点分别为BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27，2个五核苷酸重复位点为PentaC、PentaD，性别鉴定基因为Amel；
所述的PCR预混液包括UDG酶、DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl2、dNTPs和dUTP；
所述的阴性对照品为灭菌超纯水；
所述的阳性对照品为细胞系HT-29基因组DNA。
3.一种人类微卫星不稳定性状态MSI的检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括使用人类微卫星不稳定性状态MSI的引物或检测人类微卫星不稳定性状态MSI的试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的步骤；
所述检测方法采用多重荧光定量PCR技术结合毛细管电泳进行序列片段分析人类细胞中微卫星不稳定状态，具体步骤如下：
步骤一、提取待检的同一个体的肿瘤样本和对照样本DNA，作为检测模板；
步骤二、荧光PCR扩增
根据待检测样本数，计算并配制反应混合液，将配制好的检测反应液分别分装到八联PCR反应管；
步骤三、分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应PCR反应管中；
步骤四、进行多重荧光定量PCR检测，多重PCR扩增程序为：37℃2分钟；94℃10分钟；94℃30秒，60℃1分钟，70℃1分钟，35个循环；60℃45分钟；4℃∞；
步骤五、荧光PCR产物毛细管电泳；
制备毛细管样品，以基因分析仪进行毛细管电泳检测；
步骤六、检测数据分析
检测数据使用分析软件进行数据分析，根据判定标准判定微卫星不稳定状态。
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