CN106755400A - 一种血液egfr基因t790m突变的检测方法 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体地说是一种血液EGFR基因T790M突变的检测方法，包括以下步骤：1)提供引物及探针；2)从待测样本中提取DNA模板；3)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系；4)将步骤2)提取的DNA模板加到步骤3)所得的PCR反应体系中，用步骤1)提供的引物扩增待测的基因序列，用步骤1)提供的探针所扩增的产物杂交，并检测反应体系的荧光基团的荧光信号，根据荧光信号结果分析，判断样本是否存在突变以及突变的比例；本发明同现有技术相比，灵敏度高，检测速度快，能够适用于高通量的样本检测，且检测结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。

Description

一种血液EGFR基因T790M突变的检测方法
[技术领域]
本发明属于生物医学技术领域，具体地说是一种血液EGFR基因T790M突变的检测方法。
[背景技术]
近年来，表皮生长因子受体.酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinaseinhibitors，EGFR—TKIs)等靶向药物已经成为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)重要的治疗方式之一。EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域的激活对癌细胞增殖、生长的相关信号传递具有重要意义。通过对患者EGFR基因的突变检测，可辅助临床医生筛选可受益于分子靶向抗肿瘤药物如易瑞沙、特罗凯和凯美纳等的肿瘤患者。但是，随着其在临床上的广泛应用，耐药问题日益突出。其中，EGFR-T790M突变约占临床耐药病人的60％以上。因此，对T790M的检测十分必要。临床上大都采用病理组织标本提取DNA进行EGFR检测，但晚期肺癌病人有时无法获取肿瘤标本。很多权威研究认为肿瘤组织存在异质性，肿瘤组织不同部位的体细胞基因突变谱并不相同，血清或血浆肿瘤基因突变检测方便在不同时间点获取样本，没有空间抽样偏差，已逐渐在临床上推广应用。
研究显示，大部分(并非全部)晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离DNA(cfDNA，cell free DNA)。cfDNA主要来源于凋亡或坏死的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞，如果来自肿瘤细胞称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。但是血液游离DNA片段通常较短，在晚期癌症患者血液中浓度极低，平均约为17μg/L。因此，对检测敏感性的要求非常高。目前已有很多血液EGFR基因突变检测的方法的报道，如高分辨熔点曲线分析法(HRM)、变性高效液相色谱技术(DHPLC)、二代测序、数字PCR方法等。数字PCR在血浆EGFR基因突变检测上具有较高的灵敏度和特异度，但目前报道的该方法检测EGFR基因突变位点相对有限(19外显子缺失，21号外显子L858R突变以及20号外显子T790M突变)，仍处在摸索、累积经验阶段；其对操作人员和环境均有较高的要求。而以二代测序技术(NGS)为代表的新技术拓展了基因突变检测的深度和广度，但其临床转化应用需要更多的数据积累。
[发明内容]
本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种血液EGFR基因T790M突变的检测方法，该检测方法灵敏度高，检测速度快，能够适用于高通量的样本检测，且有效地降低了PCR产物污染的风险。
为实现上述目的设计一种血液EGFR基因T790M突变的检测方法，包括以下步骤：1)提供引物及探针；2)从待测样本中提取DNA模板；3)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系；4)将步骤2)提取的DNA模板加到步骤3)所得的PCR反应体系中，用步骤1)提供的引物扩增待测的基因序列，用步骤1)提供的探针所扩增的产物杂交，并检测反应体系的荧光基团的荧光信号，根据荧光信号结果分析，判断样本是否存在突变以及突变的比例。
进一步地，步骤1)中，引物及探针为：
上游引物：5’-CCGAAGGGCATGAGCTGCG-3’；
下游引物：5’-TCCAGGAAGCCTACGTGATC-3’；
探针：FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATC-BHQ1。
进一步地，步骤2)中，待测样本为血浆游离DNA。
进一步地，步骤3)中，PCR反应体系包括酶、dNTP、PCR缓冲液、引物、探针。
进一步地，步骤3)中，PCR反应体系的反应液成分及用量为：
成分 用量
10*Buffer 250ul
25mM MgCl2 150ul
25mM AGCU 10ul
25mM dTTP 1.25ul
上游引物 5ul
下游引物 5ul
目标探针 7.5ul
H2O 696.25ul
其中，10*buffer以1ml体系计，其配方为：1M Tris 100ul、1M KCl 500ul、Triton/Tween10ul/5ul原液、TE 390ul/395ul。
进一步地，步骤4)中，PCR扩增与信号收集程序如下：第一阶段：94℃，2分钟；第二阶段：94℃，20秒，40个循环；第三阶段：55℃，10秒，40个循环；第四阶段：65℃，1分钟，40个循环；信号收集：第四阶段65℃时收集FAM和VIC信号。
进一步地，步骤4)中，若待检样本DNA的外控CT值>30，提示样本DNA浓度过低或降解严重，则需更换样本或重新提取DNA；若待检样本DNA的外控CT值≤30，则计算其ΔCT，ΔCT＝突变CT值－外控CT值；若ΔCT>8或者突变CT值无显示，则判断为野生型；若ΔCT≤8，则判断为突变型。
本发明同现有技术相比，通过联合采用ARMS技术，建立了血液检测EGFR基因790密码子突变的实时PCR定量方法，该检测方法灵敏度高，可达万分之一，最低检测限仅为1-2拷贝，适合于如血清或血浆的检测；此外，本发明所述检测方法与传统的测序法相比，本发明方法的结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；因此，本发明方法检测速度快，能够适用于高通量的样本检测，值得推广应用。
[附图说明]
图1是显示本发明所述引物及探针的示例性设计；
图2是显示本发明血液阳性品的检测结果。
[具体实施方式]
本发明提供了一种血液EGFR基因T790M突变检测方法，该方法中，用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物及探针为：
上游引物5’-CCGAAGGGCATGAGCTGCG-3’；
下游引物5’-TCCAGGAAGCCTACGTGATC-3’；
目标探针FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATC-BHQ1；
PCR反应体系包括酶、dNTP、PCR缓冲液、引物、探针等。
检测时，先从待测样本中提取DNA，加到PCR反应体系中；然后，进行PCR反应程序和荧光信号检测，根据荧光信号结果分析，判断样本是否存在突变以及突变的比例。
本发明的检测EGFR基因790密码子突变的具体过程为：1)提供引物及探针；2)处理待测样品并提取模板，该待测样品为血浆游离DNA；3)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系；4)用步骤1)提供的引物扩增待测的基因序列，用步骤1)提供的探针所扩增的产物杂交，并检测反应体系的荧光基团的荧光信号。
下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：
1.样本提取：采用常规方法提取样本DNA，并进行定量。
2.反应液的配制
原料 50人份加样量(25μl)
10*Buffer 250
25mM MgCl2 150
25mM AGCU 10
25mM dTTP 1.25
上游引物 5
下游引物 5
目标探针 7.5
H2O 696.25
其中，10*buffer配方为(1ml体系)：
3.PCR反应体系：22.5ul反应液，0.5ulTaq酶，2ulDNA模板。
4.打开仪器设置窗口，按下面设置PCR扩增与信号收集程序。
a)第一阶段：94℃，2分钟
b)第二阶段：94℃，20秒，40个循环
c)第三阶段：55℃，10秒，40个循环
d)第四阶段：65℃，1分钟，40个循环
信号收集：第四阶段65℃时收集FAM和VIC信号。
5.检验结果的解释：
1)若待检样本DNA的CT(外控)>30，提示样本DNA浓度过低或降解严重，建议更换样本或重新提取DNA；
2)若待检样本DNA的CT(外控)≤30，则计算其ΔCT(CT(突变)-CT(外控))；若ΔCT>8(或者CT(突变)无显示)，判断为野生型；若ΔCT≤8，判断为突变型。
本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种血液EGFR基因T790M突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供引物及探针；
2)从待测样本中提取DNA模板；
3)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系；
4)将步骤2)提取的DNA模板加到步骤3)所得的PCR反应体系中，用步骤1)提供的引物扩增待测的基因序列，用步骤1)提供的探针所扩增的产物杂交，并检测反应体系的荧光基团的荧光信号，根据荧光信号结果分析，判断样本是否存在突变以及突变的比例。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，引物及探针为：
上游引物：5’-CCGAAGGGCATGAGCTGCG-3’；
下游引物：5’-TCCAGGAAGCCTACGTGATC-3’；
探针：FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATC-BHQ1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，待测样本为血浆游离DNA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，PCR反应体系包括酶、dNTP、PCR缓冲液、引物、探针。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，PCR反应体系的反应液成分及用量为：
成分 用量 10*Buffer 250ul 25mM MgCl2 150ul 25mM AGCU 10ul 25mM dTTP 1.25ul 上游引物 5ul 下游引物 5ul 目标探针 7.5ul H2O 696.25ul
其中，10*buffer以1ml体系计，其配方为：1M Tris 100ul、1M KCl 500ul、Triton/Tween 10ul/5ul原液、TE 390ul/395ul。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，PCR扩增与信号收集程序如下：
第一阶段：94℃，2分钟；
第二阶段：94℃，20秒，40个循环；
第三阶段：55℃，10秒，40个循环；
第四阶段：65℃，1分钟，40个循环；
信号收集：第四阶段65℃时收集FAM和VIC信号。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中，若待检样本DNA的外控CT值>30，提示样本DNA浓度过低或降解严重，则需更换样本或重新提取DNA；若待检样本DNA的外控CT值≤30，则计算其ΔCT，ΔCT＝突变CT值－外控CT值；若ΔCT>8或者突变CT值无显示，则判断为野生型；若ΔCT≤8，则判断为突变型。
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