CN106148498A - Kras基因突变检测试剂盒及其应用 - Google Patents
Kras基因突变检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106148498A CN106148498A CN201510165672.2A CN201510165672A CN106148498A CN 106148498 A CN106148498 A CN 106148498A CN 201510165672 A CN201510165672 A CN 201510165672A CN 106148498 A CN106148498 A CN 106148498A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- μms
- kras gene
- probe
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101150105104 Kras gene Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 26
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 16
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 16
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 13
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 13
- 239000002585 base Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 102200006532 rs112445441 Human genes 0.000 description 2
- 102200006531 rs121913529 Human genes 0.000 description 2
- 102200006537 rs121913529 Human genes 0.000 description 2
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 description 2
- 102200006538 rs121913530 Human genes 0.000 description 2
- 102200006540 rs121913530 Human genes 0.000 description 2
- 102200006541 rs121913530 Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000034286 G proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- NZCHHEFOTMKOJX-UHFFFAOYSA-K [6-[[3-carboxy-4-(3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)phenyl]carbamothioylamino]hexoxy-oxidophosphoryl] [5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound O1C(COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OCCCCCCNC(=S)NC=2C=C(C(=CC=2)C2=C3C=CC(=O)C=C3OC3=CC([O-])=CC=C32)C(O)=O)C(O)C(O)C1N1C=CC(=O)NC1=O NZCHHEFOTMKOJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- -1 dNTP Proteins 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021014 regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于人KRAS基因突变检测试剂盒及其检测方法，所属的技术领域为B2D10当前优先发展的高新技术产业化重点领域指南/生物/新型医用精密诊断及治疗设备。其特征在于本试剂盒包含用于KRAS基因突变位点8对特异性扩增的引物、2条野生序列的高效封阻探针，2条KRAS基因特异性TaqMan荧光探针。该试剂盒可以检测突变拷贝数低至5～10拷贝，突变含量低至0.1％的标本。本发明可同时检测KRAS基因5种基因突变，灵敏度高，操作简单，检测廉价，临床应用范围广，样本可以为新鲜的病理组织，石蜡包埋组织、胸腔液、血清或血浆，检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种与肿瘤用药选择和诊断相关的KRAS基因突变的快速检测。
背景技术
世界卫生组织在2014年的世界癌症日到来之际发表《世界癌症报告》称，癌症已经成为全世界人类最大致死原因，发病率和死亡率均呈持续上升趋势。全球癌症发病率四年中升高11％，到2012年约有1410万病例，因癌症死亡人数高达820万。2012年的全球癌症新病例中有一半发生在亚洲，其中大部份发生在中国大陆。并预测未来20年内，世界癌症病例将增长75％，达到近2500万。中国肿瘤登记中心2013年初发布《2012中国肿瘤登记年报》显示，中国每年新发癌症病例约达312万，死亡病例超过200万，每分钟有6个人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有一人因癌症而死。肺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食管癌成为中国人患病最多的癌症，乳腺癌、结直肠癌等癌症患者亦呈明显上升趋势。随着环境恶化，水质污染、雾霾以及食品安全方面形势的逐步严峻，专家预测，中国每年的癌症新发病例总数到2020年将达到400万左右，每年病例总数将达到600万。
结直肠癌是世界第三大常见恶性肿瘤，每年导致近60万人死亡。中国近年来结直肠癌发病率及死亡率均快速上升，结直肠癌在肿瘤发病中排位第三，平均每1.5分钟就有1人被诊断为结直肠癌，随着城市化进程和人口老龄化，未来中国结直肠癌发病率预计还将继续升高。
KRAS属于RAS基因家族(KRAS、NRAS和HRAS)，编码一种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，是配体结合的表皮生长因子受体(EGFR)的重要效应分子，参与细胞生长的调节，在ras基因中，KRAS对人类癌症影响最大。KRAS可以通过与其催化亚基直接作用而激活PI3K。KRAS突变也发生于多种肿瘤细胞，例如结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、胰腺癌、胆管癌，其中20％非小细胞肺癌(NSCLC)、30-40％结直肠癌患者中存在KRAS基因突变。而85％-90％的突变发生在12或13位密码子，其余的发生在第61位(5％)及146位(5％)密码子上。这些突变使得GTP酶失活，导致肿瘤相关的KRAS蛋白积聚于活化的GTP结合构象中，KRAS的过度表达与扩增导致持续的细胞增殖，这是肿瘤发生的关键一步。
西妥昔单抗和帕尼单抗是以EGFR为靶点的治疗结直肠癌的靶向药物，通过与细胞外表面EGFR区域结合阻断EGFR信号转导，来抑制细胞生长、增殖、转移和血管生成。在2008年第44届美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上，与会专家公布了肿瘤靶向治疗的一些最新进展，其中一项重要的结果就是西妥昔单抗对于k-ras基因“野生型”转移性结直肠癌患者显示出卓越的疗效。并且k-ras表达状况的检测使结直肠癌个体化的靶向治疗成为可能。
美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；(2)只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗；(3)如果KRAS无突变，应考虑检测KRAS基因状态。我国卫生部颁布的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》也明确指出：确定为复发或转移性结直肠癌时，检测肿瘤组织KRAS基因状态，以确定合适的治疗方案。
另外，K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致，而且，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。
目前肿瘤相关基因突变检测方法主要有直接测序法(DNA sequencing)、实时荧光定量法(qPCR，包括Scorptions ARMS qPCR、PNA-LNA clamp qPCR等)、高分辨率熔解曲线(HRM)、PCR与质谱(mass spectrometry)及高效液相色谱法(high performance liquidchromatography，HPLC)联合检测法等。肿瘤相关基因表达水平的检测主要依赖于qPCR及基因芯片技术。直接测序法一直以来被认为是检测基因突变的金标准，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到20％以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR，qPCR)作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。肿瘤的异质性决定了肿瘤标本绝大多数为混合标本，通常情况下，微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时，此时大量野生型模板优势扩增，导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此目前的qPCR和HRM技术最高也只能检测到1％的突变体。
随着近年来肿瘤基因组测序方面研究的发展，人们发现，几乎所有的癌症患者的肿瘤组织中都存在某些体细胞的变异，而这些变异在正常人中检测不到。有些基因突变不仅仅可以作为癌症早期检测的分子指标，还可以为分子靶向治疗提供用药指导，如EGFR、KRAS、KRAS基因等。
肿瘤细胞会向血液中释放基因组DNA，这些变异DNA也随之释放到外周血中，被称为循环肿瘤DNA(circμLating tμMor DNAs)。研究发现，ctDNAs在早期原位癌(primary cancer)患者血液中就已经开始出现。由于外周血循环DNA的半衰期短，因此循环肿瘤DNA能够真实反映患者病变组织基因突变的真实情况。
但是，由于外周血循环DNA含量很少，其中肿瘤特异性的突变DNA含量更是少之又少，尤其是早期癌症患者，在常规的核酸扩增体系中，微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时，大量野生型模板优势扩增，导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此在本领域需要一种可以高效快速准确全面地检测出KRAS基因突变的产品及方法，以便及时准确地获得KRAS基因突变的信息。
本发明拟公开一种人KRAS基因突变检测试剂盒的制备方法及其应用。所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大KRAS基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型KRAS基因模板，进一步提高突变模板选择性放大的特异性。该试剂盒检测特异性高，灵敏度高，检测低丰度KRAS突变的敏感性可达0.01％～0.1％。本检测试剂盒用于辅助临床医生筛选出病患KRAS基因突变情况，为临床医生用药提供指导和依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、高灵敏的KRAS基因突变检测试剂盒。所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大KRAS基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型KRAS基因模板，进一步提高突变模板选择性放大的特异性。其优势主要体现在将突变检测敏感度由目前市场上同类试剂盒检测KRAS基因突变的1％提高到0.01％～0.1％，检测特异性高，灵敏度高，可应用于除组织标本外的血清、血浆等标本的非创伤性检测。
本发明提供了一套用于检测KRAS基因突变的引物、探针及检测试剂盒，发明相关内容表述如下：
KRAS基因突变检测试剂盒，包括引物探针混合液(引物2.5μM，荧光探针1μM，封阻探针4μM。含用于突变特异性扩增KRAS基因靶向序列的上游突变特异性引物8条，可检测KRAS基因发生在第12、13和61号密码子的8种基因突变，包括G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D、61，涵盖了KRAS基因97％以上的突变，下游通用引物1条、野生序列封阻探针2条，TaqMan荧光探针2条)，2×PCR反应液(含DNA聚合酶，dNTP，dUTP，UNG酶，Mg2+等)，阳性参比品、阴性参比品和无RNA酶和DNA酶的无菌水。
所述的引物包含KRAS基因包括与G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D、61在内的8种基因突变特异的上游突变引物8条、下游通用引物2条。
所述的上游突变引物特征是3’末端为突变碱基。引物的Tm值在40℃～57℃，低于PCR反应复性温度5℃～10℃，以提高突变检测的特异性。
上游突变特异性引物：
KF1：5’-acttgtggtagttggagcta-3’ Seq ID No.1
KF2：5’-acttgtggtagttggagctt-3’ Seq ID No.2
KF3：5’-acttgtggtagttggagctc-3’ Seq ID No.3
KF4：5’-ttgtggtagttggagctga-3’ Seq ID No.4
KF5：5’-ttgtggtagttggagctgt-3’ Seq ID No.5
KF6：5’-ttgtggtagttggagctgc-3’ Seq ID No.6
KF7：5’-ggtagttggagctggtga-3’ Seq ID No.7
KF8：5’-cattgcactgtactcctcttt-3’ Seq ID No.8
所述的下游通用引物为KRAS基因第12、13密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，以及KRAS基因第61密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，该序列对突变没有选择性，可扩增所有的KRAS基因。
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’ Seq ID No.9
KR2：5’-acccacctataatggtgaata-3’ Seq ID No.10
其中，KR1与KF1～KF7配对，KR2与KF8配对。
所述的探针包括封阻探针一条，KRAS基因特异性TaqMan荧光探针2条。
所述的封阻探针与KRAS基因第12、13、61密码子野生型序列互补，其5’端锁核酸修饰，提高封阻探针的对Taq DNA聚合酶5’端外切酶活性的耐受能力；3’端磷酸基团修饰，阻断其3’端延伸功能；突变位点至少1-2个碱基LNA修饰，提高封阻探针的单碱基识别能力，前面有+的碱基为锁核酸碱基。
KB1：5’-+gagct+g+gtg+gcgtagg-PO4-3’ Seq ID No.10
KB2：5’-+tactcctctt+ga+cctgctgt-PO4-3’ Seq ID No.12
KRAS基因特异性TaqMan荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。
Kp1：5’-ccttgacgatacagctaattc-3’ Seq ID No.13
Kp2：5’-aatatccaagagacaggtttc-3’ Seq ID No.14
所述的2×PCR反应液每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶，100～300μM dATP，100～300μMdCTP，100～300μM dGTP，80～300μM dTTP，40～150μM dUTP，0.25～2UUNG酶，1～4mMMgCl2等。优选的：0.5U DNA聚合酶，150μM dATP，150μM dCTP，150μM dGTP，100μM dTTP，50μM dUTP，0.5UUNG酶，2mM MgCl2。
所述阳性参比品为KRAS突变阳性序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入KRAS基因的人工质粒。
阴性参比品为KRAS野生型序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入KRAS基因的人工质粒。
本发明提供了一套KRAS基因突变的检测方法，具体来说包括以下步骤：
[1]根据COSMIC数据公布的人类KRAS基因为野生型基因序列，针对KRAS的突变热点设计特异性引物和探针。
[2]提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、血浆等。
[3]配制实时荧光PCR扩增反应体系。
[4]根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测KRAS基因突变情况：Ct值为0或大于35判为阴性：Ct值小于等于35判为阳性。当阴性参比品Ct值为0或大于40，阳性参比品Ct值大于24小于27时结果可信。
本发明采用了特异性引物选择性扩增KRAS基因突变序列，用高效封阻探针封闭野生型DNA序列对引物对突变型序列进行信号放大时可能造成的干扰，该方法具有以下优势：
[1]灵敏度高，可以检出低至5-10拷贝的突变；
[2]特异性强，5～20ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；
[3]检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
[4]稳定率高。通常肿瘤标本中突变的DNA模板序列的绝对数并不高，尤其是外周血循环血DNA，多数标本处于1％～10％之间，突变检测敏感度在1％左右的方法常常对其临界含量，也就是突变含量1％～5％的标本检测稳定性不佳。我们的方法可以检测低至0.01％～0.1％的突变，就大大保证了1％～10％之间标本的检测稳定性。
附图说明
图1为含封阻探针及不含封阻探针检测结果比较。
图2为KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因人工质粒。
A：DNA终浓度为5×103拷贝
B：DNA终浓度为5×104拷贝
具体实施方式
下面用具体的实施例来解释本发明的突出的特点和显著进步，但本发明决非仅局限于实施例。
实施例1：本发明提供的试剂盒检测KRAS基因人工质粒
1、人工质粒DNA纯化
用QIAprep Spin Miniprep(Qiagen)试剂盒纯化KRAS野生型和突变型人工质粒，方法如下：
取1.5mL菌液，8000rpm离心3min收集菌体，加入将含有RNase A酶的P1缓冲液250μL混匀，再加入相同体积的P2缓冲液，上下混匀至溶液变清(不要将反应时间超过5min)，加入350μL N3缓冲液，立刻混匀，13000rpm离心10min，上清液转移至QIAprep spin管中，13000rpm离心1min，弃液体；用0.5mL PB清洗一次，再加含无水乙醇的PE缓冲液0.75mL洗涤2次，将QIAprep spin移至新1.5mL离心管中，加50μL无菌水，静置1min，离心1min，收集滤液。
纯化后的质粒用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，用TE缓冲液稀释到DNA终浓度分别为1×104拷贝copies/μL、1×103拷贝copies/μL，突变质粒含量分别是0.01％、0.1％、1％、10％、100％。2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。
图2是用PCR反应结果，DNA总量为5×103拷贝可以检测低至0.1％的突变，DNA总量为5×104拷贝可以检测低至0.01％的突变。
实施例2：本发明提供的试剂盒检测新鲜组织标本
1、组织标本中基因组DNA纯化
用QIAamp DNA Mini(Qiagen)试剂盒纯化新鲜组织标本中的基因组DNA，方法如下：
取新鲜组织25mg以内用剪刀剪切样本至小碎片，放在1.5mL离心管中，加入180μL ATL，20μL蛋白酶K，混匀，56℃孵育1～3h至样本溶解，每小时振荡2～3次；加入200μL AL，振荡15秒，70℃孵育10min；然后加入200μL无水乙醇，振荡15秒，小心将液体(包括沉淀)移至试剂盒提供柱子中，不要污染管口，8000rpm离心1min后，将柱子新的2mL离心管中，小心加入500μL AW1缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液；小心加入500μL AW2缓冲液，13000rpm离心3min，柱子转移至新的1.5mL离心管中，全速离心1min，再将柱子转移至另一新的1.5mL离心管中，小心加入200μL AE或蒸馏水，室温静置1min，8000rpm离心1min，收集滤液。
纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，DNA浓度在20ng/μL～200ng/μL之间。
2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。
下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较，组织标本的试剂盒突变检出率与DNA测序结果相同。
实施例3：本发明提供的试剂盒检测血浆标本
1、血浆标本中基因组DNA纯化
收集80份结直肠癌患者和20份健康对照外周血标本5mL，2500rpm离心10分钟，吸取上清2mL用于循环游离DNA纯化。
用QIAamp DNA Blood Midi(Qiagen)试剂盒纯化血浆标本中的循环游离DNA，方法如下：
2mL血清(或全血)加入200μL PK和2mL AL，彻底混匀15秒，56℃孵育10min；加入2mL无水乙醇，彻底混匀15秒，将液体转移到QIAamp Midi Spin Column中，8000rpm离心2min，弃滤液；再离心一次，将柱子转移到另一收集管中，加入5mL AW1缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液，加入5mL AW2缓冲液，13000rpm离心1min，弃滤液，13000rpm离心3min，将柱子转移到一干净收集管中，加入100μL AE，室温放置1min，8000rpm离心1min，收集滤液为DNA标本。
纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，DNA浓度在6ng/μL～40ng/μL之间。
2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。
下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较，癌症患者中，试剂盒突变检出率高于DNA测序；正常人中没有检出突变，试剂盒与DNA测序结果相同。
Claims (4)
1.一种用于人KRAS基因突变检测试剂盒及其检测方法，其特征在于本试剂盒包含2×PCR反应体系、引物探针混合液、阳性参比品和阴性参比品；用于KRAS基因突变位点8对特异性扩增的引物、2条野生序列的高效封阻探针，2条KRAS基因特异性TaqMan荧光探针。
所述的两对突变特异性扩增引物序列为：
KF1：5’-acttgtggtagttggagcta-3’ Seq ID No.1
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF2：5’-acttgtggtagttggagctt-3’ Seq ID No.2
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF3：5’-acttgtggtagttggagctc-3’ Seq ID No.3
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF4：5’-ttgtggtagttggagctga-3’ Seq ID No.4
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF5：5’-ttgtggtagttggagctgt-3’ Seq ID No.5
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF6：5’-ttgtggtagttggagctgc-3’ Seq ID No.6
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF7：5’-ggtagttggagctggtga-3’ Seq ID No.7
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF8：5’-cattgcactgtactcctcttt-3’ Seq ID No.8
KR2：5’-acccacctataatggtgaata-3’ Seq ID No.10
所述的野生序列的封阻探针，前面有+的碱基为锁核酸碱基，序列为：
KB 1：5’-+gagct+g+gtg+gcgtagg-PO4-3’Seq ID No.11
KB2：5’-+tactcctctt+ga+cctgctgt-PO4-3’Seq ID No.12
所述的KRAS基因特异性TaqMan荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团，序列为：
Kp1：5’-ccttgacgatacagctaattc-3’ Seq ID No.13
Kp2：5’-aatatccaagagacaggtttc-3’ Seq ID No.14。
2.根据权利要求1说述的试剂盒的引物探针混合液，其特征在于引物浓度为1～5μM，优选2.5μM，探针浓度为0.5～3μM，优选1μM。
3.根据权利要求1说述的试剂盒的2×PCR反应体液每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶， 100～300μM dATP，100～300μM dCTP，100～300μM dGTP，80～300μM dTTP，40～150μM dUTP，0.25～2U UNG酶，1～4mMMgCl2等。优选的：0.5U DNA聚合酶，150μM dATP，150μM dCTP，150μM dGTP，100μM dTTP，50μM dUTP，0.5U UNG酶，2mM MgCl2。
4.根据权利要求1说述的试剂盒的检测方法，反应条件为：95℃预变性10min；随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s，共35个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510165672.2A CN106148498B (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | Kras基因突变检测试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510165672.2A CN106148498B (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | Kras基因突变检测试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106148498A true CN106148498A (zh) | 2016-11-23 |
| CN106148498B CN106148498B (zh) | 2020-05-12 |
Family
ID=57335738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510165672.2A Active CN106148498B (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | Kras基因突变检测试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106148498B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107151706A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-09-12 | 郴州市第人民医院 | 一种检测血浆游离dna中kras基因突变的试剂盒及方法 |
| CN107164543A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-09-15 | 上海长海医院 | Kras 作为胰腺癌中生物标志物的用途 |
| CN107447013A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-12-08 | 上海伯豪生物技术有限公司 | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 |
| CN108374008A (zh) * | 2018-05-07 | 2018-08-07 | 求臻医学科技（北京）有限公司 | 用于检测kras突变的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用 |
| CN108441562A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-08-24 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 检测Kras基因突变的引物、探针、试剂盒及应用 |
| CN109439756A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-08 | 广东腾飞基因科技股份有限公司 | 一种用于检测kras相关抗药性的试剂盒 |
| CN110592217A (zh) * | 2019-10-08 | 2019-12-20 | 湖南艾佳生物科技股份有限公司 | 一种检测外周血游离dna中kras基因突变的试剂盒及其应用 |
| CN110982886A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-10 | 武汉光谷联合医学检验所股份有限公司 | 一种人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234686A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-09 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种kras基因突变检测液相芯片 |
| CN102747158A (zh) * | 2012-07-16 | 2012-10-24 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 |
| CN102796811A (zh) * | 2011-05-26 | 2012-11-28 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 检测kras突变的试剂及方法 |
| CN102888466A (zh) * | 2012-10-30 | 2013-01-23 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | Kras基因突变检测试剂盒及检测方法 |
-
2015
- 2015-04-09 CN CN201510165672.2A patent/CN106148498B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234686A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-09 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种kras基因突变检测液相芯片 |
| CN102796811A (zh) * | 2011-05-26 | 2012-11-28 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 检测kras突变的试剂及方法 |
| CN102747158A (zh) * | 2012-07-16 | 2012-10-24 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 |
| CN102888466A (zh) * | 2012-10-30 | 2013-01-23 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | Kras基因突变检测试剂盒及检测方法 |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107164543A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-09-15 | 上海长海医院 | Kras 作为胰腺癌中生物标志物的用途 |
| CN107151706A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-09-12 | 郴州市第人民医院 | 一种检测血浆游离dna中kras基因突变的试剂盒及方法 |
| CN107447013A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-12-08 | 上海伯豪生物技术有限公司 | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 |
| CN107447013B (zh) * | 2017-08-31 | 2020-06-05 | 上海伯豪生物技术有限公司 | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 |
| CN108374008A (zh) * | 2018-05-07 | 2018-08-07 | 求臻医学科技（北京）有限公司 | 用于检测kras突变的引物对和探针的组合产品、组合物、试剂盒及其应用 |
| CN108441562A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-08-24 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 检测Kras基因突变的引物、探针、试剂盒及应用 |
| CN109439756A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-08 | 广东腾飞基因科技股份有限公司 | 一种用于检测kras相关抗药性的试剂盒 |
| CN110592217A (zh) * | 2019-10-08 | 2019-12-20 | 湖南艾佳生物科技股份有限公司 | 一种检测外周血游离dna中kras基因突变的试剂盒及其应用 |
| CN110982886A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-10 | 武汉光谷联合医学检验所股份有限公司 | 一种人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106148498B (zh) | 2020-05-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104946739B (zh) | Egfr基因突变检测试剂盒及其应用 | |
| CN106148498A (zh) | Kras基因突变检测试剂盒及其应用 | |
| CN102367478B (zh) | 用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104805208B (zh) | 用于检测人类kras基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN106399555A (zh) | 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒 | |
| CN106148521B (zh) | 一种多点突变单管快速检测方法及试剂盒 | |
| CN105803088B (zh) | 一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒 | |
| CN102154480B (zh) | 基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测试剂盒 | |
| US20200340062A1 (en) | Prognostic markers for cancer recurrence | |
| JP6438119B2 (ja) | ホットスポット変異の迅速かつ高感度の検出のための方法 | |
| CN106148497A (zh) | Braf基因突变检测试剂盒及其应用 | |
| CN105593378A (zh) | 用于在人ezh2基因中检测突变的方法和组合物 | |
| CN103773837A (zh) | 一种pik3ca基因突变荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN111808963A (zh) | 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法 | |
| Cao et al. | Genetic alterations in cfDNA of benign and malignant thyroid nodules based on amplicon-based next-generation sequencing | |
| CN109913482B (zh) | Pik3ca-i874r突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 | |
| CN105463111A (zh) | 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒 | |
| Yuan et al. | Quantification of VEGF mRNA expression in non-small cell lung cancer using a real-time quantitative reverse transcription-PCR assay and a comparison with quantitative competitive reverse transcription-PCR | |
| CN110373454A (zh) | 一种联合检测egfr基因突变的试剂盒及方法 | |
| WO2011079524A1 (zh) | 用于定量检测k-ras突变的试剂盒 | |
| CN109929929A (zh) | 用于人egfr基因突变检测的试剂盒及临床应用 | |
| CN104480215A (zh) | 一种基因联合检测方法及试剂盒 | |
| CN111154883B (zh) | 一种乳腺癌相关基因PIK3CA位点g.179220986A＞T突变体及其应用 | |
| CN104651492B (zh) | miRNA410‑在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用 | |
| CN110055258B (zh) | 一种乳腺癌相关基因ERBB2位点g.39717320G>A突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: SHANGHAI JIYUAN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Document name: Notification of Publication and of Entering the Substantive Examination Stage of the Application for Invention |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: SHANGHAI JIYUAN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Document name: the First Notification of an Office Action |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: SHANGHAI JIYUAN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Document name: Notification to Go Through Formalities of Registration |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: SHANGHAI JIYUAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Document name: Notification of Decision on Request for Restoration of Right |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Cao Jie Document name: payment instructions |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Cao Jie Document name: Notice of termination of patent right |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Cao Jie Document name: Notice of resumption of claim approval |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Cao Jie Document name: payment instructions |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Cao Jie Document name: payment instructions |