具体实施方式
实施例1KRAS基因突变检测液相芯片,主要包括有:
一、ASPE引物
针对KRAS基因Codon 12的正常基因型及六种突变型:G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V,Codon 13的正常基因型及六种突变型:G13R、G13S、G13C、G13A、G13D、G13V,以及Codon 61的正常基因型及三种突变型:N61H、N61L、N61K,分别设计特异性的引物序列。
KRAS基因突变检测的ASPE引物的设计要点为:
ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。其中,5’端为根据KRAS基因突变检测所设计的Tag序列,所设计的Tag序列在反应体系能最大限度的避免ASPE引物可能形成的二级结构,且Tag序列与Tag序列,Tag序列与特异性引物序列之间不发生交叉反应。Tag序列和特异性引物序列形成完整的ASPE引物,并使所有的ASPE引物能够在一个均一的反应体系中同步反应(即同一反应的缓冲环境,同一反应温度等),完成并行检测。所设计的Tag序列具体如表5。3’端为根据KRAS基因突变检测所设计的特异性引物序列,所述特异性引物的Tm值在52~58℃之间;其中针对各种突变型的特异性引物序列,其3’端的最后3位碱基中的一个碱基应为突变位点;所述Codon12、Codon13或Codon61野生型的特异性引物序列3’端的最后3个碱基应分别包含Codon12、Codon13或Codon61位点。所述Tm值的计算方式为Tm=(G+C)×4+(A+T)×2-4。
表1KRAS基因突变检测特异性引物的来源序列之一(□内为突变位点)
根据上述的ASPE引物中特异性引物序列的设计要点,设计得到一系列的特异性引物序列,其中例举部分野生型和突变型特异性引物,如表2:
表2KRAS基因突变检测特异性引物序列之一
同样的,表1中KRAS基因突变检测特异性引物的来源序列的反向互补序列也可以用于设计ASPE的特异性引物,具体的来源序列如表3:
表3KRAS基因突变检测特异性引物的来源序列之二
同样的,根据上述的ASPE引物中特异性引物序列的设计要点,由表3中特异性引物的来源序列设计得到一系列的特异性引物序列,其中例举部分野生型和突变型特异性引物,如表4:
表4KRAS基因突变检测特异性引物序列之二
表5Tag序列
SEQ ID NO. |
Tag序列(5′-3′) |
109 |
AATCAATCTTCATTCAAATCATCA |
110 |
CTTTAATCCTTTATCACTTTATCA |
111 |
AATCCTTTCTTTAATCTCAAATCA |
112 |
TTCAATCATTCAAATCTCAACTTT |
113 |
CTTTTCAAATCAATACTCAACTTT |
114 |
CTTTCTACATTATTCACAACATTA |
115 |
CAATTTACTCATATACATCACTTT |
116 |
AATCTTACCAATTCATAATCTTCA |
117 |
CTACTTCATATACTTTATACTACA |
118 |
CTTTCAATTACAATACTCATTACA |
119 |
TCAATCATAATCTCATAATCCAAT |
120 |
TACACATCTTACAAACTAATTTCA |
121 |
CAATTAACTACATACAATACATAC |
122 |
ATACCAATAATCCAATTCATATCA |
123 |
AATCATACCTTTCAATCTTTTACA |
124 |
TTCACTTTTCAATCAACTTTAATC |
125 |
AATCTTACTACAAATCCTTTCTTT |
126 |
TTACTTCACTTTCTATTTACAATC |
所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物序列,选择tag序列,最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构,选择的18种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表6所示:
表6微球编号与微球上相应的anti-tag序列
SEQ ID NO. |
微球上对应的anti-tag序列(5′-3′) |
微球编号 |
127 |
TGATGATTTGAATGAAGATTGATT |
16 |
128 |
TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG |
17 |
129 |
TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATT |
21 |
130 |
AAAGTTGAGATTTGAATGATTGAA |
23 |
131 |
AAAGTTGAGTATTGATTTGAAAAG |
27 |
132 |
TAATGTTGTGAATAATGTAGAAAG |
40 |
133 |
AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG |
56 |
134 |
TGAAGATTATGAATTGGTAAGATT |
61 |
135 |
TGTAGTATAAAGTATATGAAGTAG |
63 |
136 |
TGTAATGAGTATTGTAATTGAAAG |
43 |
137 |
ATTGGATTATGAGATTATGATTGA |
62 |
138 |
TGAAATTAGTTTGTAAGATGTGTA |
74 |
139 |
GTATGTATTGTATGTAGTTAATTG |
77 |
140 |
TGATATGAATTGGATTATTGGTAT |
70 |
141 |
TGTAAAAGATTGAAAGGTATGATT |
75 |
142 |
GATTGTAAATAGAAAGTGAAGTAA |
88 |
143 |
AAAGAAAGGATTTGTAGTAAGATT |
29 |
144 |
GATTAAAGTTGATTGAAAAGTGAA |
31 |
选择的18种微球购自美国Luminex公司,每种微球具有不同颜色编码。将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列,即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。
微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0),1mmol/LEDTA中,2-8℃避光保存。
三、扩增出含有检测位点的目标序列的引物
目标检测KRAS基因Codon 12和Codon 13均位于外显子2中,而Codon 61则位于外显子3。利用Primer5.0设计引物(见表7),扩增出含有检测位点的目标序列。检测Codon12与Codon13突变位点,当其特异性引物序列来源于SEQ ID NO.1~14时,使用SEQ IDNO.145~146扩增含有目标位点序列;当其特异性引物序列来源于SEQ ID NO.55~68时,使用SEQ ID NO.147~148扩增含有目标位点序列。检测Codon61突变位点均使用SEQ IDNO.149~150扩增含有目标位点序列。所设计的扩增引物对能够在同一PCR扩增条件下同步完成多重PCR反应,大大的提高了检测效率。
表7扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用KRAS基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) |
Sigma M-2933 |
0.05M |
2.44g |
5M NaOH |
Fisher SS256-500 |
--- |
5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
1MTris-HCl,pH8.0 |
SigmaT3038 |
0.2M |
50ml |
5M NaCl |
Sigma S5150 |
0.4M |
20ml |
Triton X-100 |
Sigma T8787 |
0.16% |
0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取:
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计引物,多重PCR一步扩增出具有检测位点的目标序列,产物大小分别为153bp(SEQ ID NO.145-146)、138bp(SEQ ID NO.149-150)。引物序列(SEQ ID NO.145-150)见上述表7所示。
首先配制PCR引物工作液:分别取SEQ ID NO.145-150的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为多重PCR引物工作液。PCR反应体系如下:
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 33.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃20s,56℃30s,72℃30s,30个循环;72℃10min;4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
详细步骤如下:
1.取7.5ul PCR反应后的产物,加入3ul ExoSAP-IT酶;
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min,灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液:分别取Codon12、Codon13和Codon61相应的野生型和突变型ASPE引物(具体如表8所示)贮存液10ul于3支不同的1.5ml微量离心管中,加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul,混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:其中,Group1和Group3以及Group5的检测,在一个反应系统中同时进行,即对Group1和Group3以及Group5并行检测。同时,Group2和Group4以及Group6的检测,也在同一个反应系统中同时进行,对Group2和Group4以及Group6并行检测。
表8液相芯片制备的设计一
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10.ul
共 20ul
反应程序为:96℃2min;94℃30s,52℃1min,72℃2min,30个循环;4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物,每组选择相应的最优的微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码;
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中;
3.微球于≥10000g离心1-2min;
4.弃去上清,微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中,涡旋混匀;
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25ul的ddH2O;
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50ul;
7.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃60s,37℃15min孵育杂交;
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min;
9.去上清,将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中;
10.微球于≥3000g离心2-5min;
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中,加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE);
12.37℃孵育15min,于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以突变型荧光值(MFI)大于100为cut-off值,当突变型检测的MFI值大于100时,判定该样本存在该突变类型,否则判定该样本为相应的野生型。检测结果如表9、表10、表11和表12所示。
使用本方法检测大量样本的KRAS基因突变,以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的KRAS基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的KRAS基因突变检测液相芯片能够准确地检测出KRAS基因的突变类型,且结果稳定可靠。
表11样本检测结果三(MFI)
表12样本KRAS基因突变检测结果分析
13 |
野生型 |
野生型 |
野生型 |
14 |
野生型 |
野生型 |
野生型 |
15 |
G12S突变 |
G12S突变 |
G12S突变 |
16 |
野生型 |
野生型 |
野生型 |
17 |
野生型 |
野生型 |
野生型 |
18 |
野生型 |
野生型 |
野生型 |
19 |
野生型 |
野生型 |
野生型 |
20 |
野生型 |
野生型 |
野生型 |
针对同一突变位点所设计的2组特异性引物序列对样品的检测,均取得一致的检测效果。根据上述ASPE引物设计要点分别设计的不同液相芯片,其特异性引物序列不同,而检测结果一致。其他类似情况的具体检测数据省略。
实施例3来源序列不同的野生型和突变型特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)
针对KRAS基因Codon12、Codon13和Codon61突变位点,分别设计野生型和突变型的ASPE引物3’端的特异性引物序列,检测Codon12、Codon13和Codon61突变的特异性引物序列分别是来源于SEQ ID NO1~18的SEQ ID NO.19~SEQ ID NO.54,或来源于SEQ IDNO.55~72的SEQ ID NO.73~SEQ ID NO.108。野生型和突变型ASPE引物5’端的Tag序列分别选自SEQ ID NO.109~126,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别选自SEQ ID NO.127~144。具体设计如下表(表13)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
其中,检测Codon12和Codon13时,当其特异性引物序列来源于SEQ ID NO.1~14时,使用SEQ ID NO.145~146扩增含有目标位点序列;当其特异性引物序列来源于SEQ IDNO.55~68时,使用SEQ ID NO.147~148扩增含有目标位点序列。检测Codon61突变位点的均使用SEQ ID NO.149~150扩增含有目标位点序列。
其中,Group1和Group3以及Group5的检测,在一个反应系统中同时进行,即对Group1和Group3以及Group5并行检测。同时,Group2和Group4以及Group6的检测,也在同一个反应系统中同时进行,对Group2和Group4以及Group6并行检测。
表13液相芯片制备的设计二
二、样品检测:采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测,检测结果如下:
表16样本检测结果三(MFI)
表17样本检测结果分析
针对同一突变位点的来源于SEQ ID NO.1~18或来源于SEQ ID NO.55~72的特异性引物序列,符合上述ASPE引物设计的要点,均可用于Codon12、Codon13和Codon61突变型检测,且检测结果一致,结果稳定可靠。其他类似情况的具体数据省略。
实施例4野生型和突变型特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)
分别以KRAS基因的Codon12、Codon13和Codon61中一个突变位点的检测液相芯片为例,针对Codon12、Codon13和Codon61的野生型设计ASPE引物3’端特异性引物序列,而Codon12、Codon13和Codon61突变型分别选取G12R、G13R、N61H突变位点,针对G12R、G13R、N61H位点的ASPE引物3’端的特异性引物序列分别选自SEQ ID NO.21-SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.50。Codon12、Codon13和Codon61的野生型Tag序列分别固定为:SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110和SEQ IDNO.111,其相应的突变型分别固定为:SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列为tag序列的互补序列,分别选自SEQ ID NO.127-SEQ ID NO.132。具体设计如下表(表18)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
其中,Group1和Group3以及Group5的检测,在一个反应系统中同时进行,即对Group1和Group3以及Group5并行检测。同时,Group2和Group4以及Group6的检测,也在同一个反应系统中同时进行,对Group2和Group4以及Group6并行检测。
表18液相芯片制备的设计三
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测,检测结果如下:
表20样本检测结果分析
针对同一突变位点的野生型和突变型特异性引物序列(其中,Codon12、Codon13、Codon61的野生型特异性引物分别选自SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.33-34和SEQ IDNO.47-48,针对其相应突变位点的特异性引物分别选自SEQ ID NO.21-32、SEQ ID NO.35-36和SEQ ID NO.49-50),所组成的液相芯片均可进行检测,且检测结果一致。同样的,根据上述ASPE引物设计的要点分别设计的来源于SEQ ID NO.1~18、或SEQ ID NO.55~72的特异性引物,均可进行检测,结果稳定可靠。其他类似情况的具体检测数据省略。
实施例5Tag序列及Anti-Tag序列的选择
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以KRAS基因Codon12中G12R位点突变的检测液相芯片为例,针对Codon12的野生型和G12R突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列,而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.109~SEQ ID NO.126中的6条,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.127~SEQ ID NO.144。具体设计如下表(表21)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表21液相芯片制备的设计四
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品61-80进行检测,检测结果如下:
表22样本检测结果(MFI)
表23样本检测结果分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片,ASPE引物运用上述所设计的不同的Tag序列,其结果依然稳定可靠,具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明的等效实施或变更,均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>一种KRAS基因突变检测液相芯片
<160>150
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgcctt 46
<210>2
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ataaacttgt ggtagttgga gctcgtggcg taggcaagag tgcctt 46
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgcctt 46
<210>4
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ataaacttgt ggtagttgga gcttgtggcg taggcaagag tgcctt 46
<210>5
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ataaacttgt ggtagttgga gctgctggcg taggcaagag tgcctt 46
<210>6
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ataaacttgt ggtagttgga gctgatggcg taggcaagag tgcctt 46
<210>7
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ataaacttgt ggtagttgga gctgttggcg taggcaagag tgcctt 46
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ttgtggtagt tggagctggt ggcgtaggca agagtgcctt 40
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ttgtggtagt tggagctggt cgcgtaggca agagtgcctt 40
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ttgtggtagt tggagctggt agcgtaggca agagtgcctt 40
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ttgtggtagt tggagctggt tgcgtaggca agagtgcctt 40
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ttgtggtagt tggagctggt gccgtaggca agagtgcctt 40
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ttgtggtagt tggagctggt gacgtaggca agagtgcctt g 41
<210>14
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ttgtggtagt tggagctggt gtcgtaggca agagtgcctt g 41
<210>15
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
gatattctcg acacagcagg tcaagaggag tacagtgcaa tgag 44
<210>16
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gatattctcg acacagcagg tcatgaggag tacagtgcaa tgag 44
<210>17
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gatattctcg acacagcagg tctagaggag tacagtgcaa tgag 44
<210>18
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gatattctcg acacagcagg taaagaggag tacagtgcaa tgag 44
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
ttgtggtagt tggagctggt 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
cttgtggtag ttggagctgg 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
acttgtggta gttggagctc 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ttgtggtagt tggagctcgt 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
ttgtggtagt tggagctagt 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
acttgtggta gttggagcta 20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
ttgtggtagt tggagcttgt 20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
acttgtggta gttggagctt 20
<210>27
<211>20
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<213>人工序列
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ttgtggtagt tggagctgct 20
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<211>20
<212>DNA
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<211>20
<212>DNA
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ttgtggtagt tggagctgat 20
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<211>20
<212>DNA
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cttgtggtag ttggagctga 20
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<211>20
<212>DNA
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ttgtggtagt tggagctgtt 20
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<211>20
<212>DNA
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cttgtggtag ttggagctgt 20
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<212>DNA
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<212>DNA
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>18
<212>DNA
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tggtagttgg agctggtc 18
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<212>DNA
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tggtagttgg agctggtag 19v
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tggtagttgg agctggttg 19
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<213>人工序列
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gtggtagttg gagctggtt 19
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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ggtagttgga gctggtgc 18
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<211>18
<212>DNA
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gtagttggag ctggtgcc 18
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<212>DNA
<213>人工序列
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tggtagttgg agctggtga 19
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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gtagttggag ctggtgac 18
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<212>DNA
<213>人工序列
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tggtagttgg agctggtgt 19
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<211>18
<212>DNA
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gtagttggag ctggtgtc 18
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tctcgacaca gcaggtcaa 19
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ttctcgacac agcaggtcat 20
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<213>人工序列
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ctcgacacag caggtcatg 19
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attctcgaca cagcaggtct 20
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
ctcgacacag caggtctag 19
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<212>DNA
<213>人工序列
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tattctcgac acagcaggta 20
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<211>20
<212>DNA
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<212>DNA
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<213>人工序列
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aaggcactct tgcctacgcc actagctcca actaccacaa gtttat 46
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<213>人工序列
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aaggcactct tgcctacgcc acaagctcca actaccacaa gtttat 46
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aaggcactct tgcctacgcc agcagctcca actaccacaa gtttat 46
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<211>46
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aaggcactct tgcctacgcc atcagctcca actaccacaa gtttat 46
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<213>人工序列
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aaggcactct tgcctacgcc aacagctcca actaccacaa gtttat 46
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<212>DNA
<213>人工序列
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aaggcactct tgcctacgcc accagctcca actaccacaa 40
<210>63
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<212>DNA
<213>人工序列
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aaggcactct tgcctacgcg accagctcca actaccacaa 40
<210>64
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
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aaggcactct tgcctacgct accagctcca actaccacaa 40
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<211>40
<212>DNA
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aaggcactct tgcctacgca accagctcca actaccacaa 40
<210>66
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aaggcactct tgcctacggc accagctcca actaccacaa 40
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<213>人工序列
<400>68
caaggcactc ttgcctacga caccagctcc aactaccaca a 41
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<213>人工序列
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<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
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ctcattgcac tgtactcctc tagacctgct gtgtcgagaa tatc 44
<210>72
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
ctcattgcac tgtactcctc tttacctgct gtgtcgagaa tatc 44
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<212>DNA
<213>人工序列
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actcttgcct acgccacc 18
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>75
actcttgcct acgccacg 18
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<212>DNA
<213>人工序列
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ctcttgccta cgccacga 18
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<212>DNA
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cactcttgcc tacgccact 19
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>19
<212>DNA
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cactcttgcc tacgccaca 19
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<212>DNA
<213>人工序列
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actcttgcct acgccacaa 19
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<211>18
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<213>人工序列
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cactcttgcc tacgccag 18
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<213>人工序列
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actcttgcct acgccagca 19
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<211>19
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<213>人工序列
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<211>19
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<213>人工序列
<400>84
cactcttgcc tacgccatc 19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
gcactcttgc ctacgccaa 19
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<211>19
<212>DNA
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cactcttgcc tacgccaac 19
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<213>人工序列
<400>87
gcactcttgc ctacgcc 17
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
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cactcttgcc tacgcca 17
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggcactcttg cctacgcg 18
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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cactcttgcc tacgcgac 18
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<212>DNA
<213>人工序列
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aggcactctt gcctacgct 19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>92
gcactcttgc ctacgctac 19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>93
aggcactctt gcctacgca 19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
gcactcttgc ctacgcaac 19
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
aggcactctt gcctacgg 18
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
gcactcttgc ctacggca 18
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<213>人工序列
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ggcactcttg cctacgtca 19
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<212>DNA
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aaggcactct tgcctacga 19
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<213>人工序列
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ggcactcttg cctacgaca 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
attgcactgt actcctcttg 20
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
cattgcactg tactcctctt g 21
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
tcattgcact gtactcctca 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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cattgcactg tactcctcat 20
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>105
tcattgcact gtactcctct a 21
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>106
attgcactgt actcctctag 20
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>107
cattgcactg tactcctctt t 21
<210>108
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>108
attgcactgt actcctcttt a 21
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>109
aatcaatctt cattcaaatc atca 24
<210>110
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>110
ctttaatcct ttatcacttt atca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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aatcctttct ttaatctcaa atca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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ttcaatcatt caaatctcaa cttt 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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cttttcaaat caatactcaa cttt 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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ctttctacat tattcacaac atta 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>115
caatttactc atatacatca cttt 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>116
aatcttacca attcataatc ttca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>117
ctacttcata tactttatac taca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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ctttcaatta caatactcat taca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tcaatcataa tctcataatc caat 24
<210>120
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tacacatctt acaaactaat ttca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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caattaacta catacaatac atac 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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ataccaataa tccaattcat atca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>123
aatcatacct ttcaatcttt taca 24
<210>124
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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ttcacttttc aatcaacttt aatc 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>125
aatcttacta caaatccttt cttt 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>126
ttacttcact ttctatttac aatc 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>127
tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
<210>128
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tgataaagtg ataaaggatt aaag 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>129
tgatttgaga ttaaagaaag gatt 24
<210>130
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>131
aaagttgagt attgatttga aaag 24
<210>132
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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taatgttgtg aataatgtag aaag 24
<210>133
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>133
aaagtgatgt atatgagtaa attg 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>134
tgaagattat gaattggtaa gatt 24
<210>135
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>135
tgtagtataa agtatatgaa gtag 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>136
tgtaatgagt attgtaattg aaag 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>137
attggattat gagattatga ttga 24
<210>138
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>138
tgaaattagt ttgtaagatg tgta 24
<210>139
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>139
gtatgtattg tatgtagtta attg 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>140
tgatatgaat tggattattg gtat 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tgtaaaagat tgaaaggtat gatt 24
<210>142
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>142
gattgtaaat agaaagtgaa gtaa 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>143
aaagaaagga tttgtagtaa gatt 24
<210>144
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>144
gattaaagtt gattgaaaag tgaa 24
<210>145
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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ataaacttgt ggtagttgga gct 23
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>146
gtatcaaaga atggtcctgc ac 22
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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actggtggag tatttgatag tgt 23
<210>148
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>148
gattctgaat tagctgtatc gtc 23
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>149
atccagactg tgtttctccc tt 22
<210>150
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>150
agtcctcatg tactggtccc t 21