CN102234684B - Braf基因突变检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括针对BRAF的V600E突变位点，分别设计的野生型和突变型ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的2种微球所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；用于扩增具有V600E突变位点的BRAF基因目标序列的扩增引物。本发明所制备的BRAF基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。

Description

BRAF基因突变检测特异性引物和液相芯片
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及BRAF基因突变检测特异性引物和液相芯片。
技术背景
鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-taf mourine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从Ras转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。研究表明，BRAF主要有两种突变类型：①11％的突变位于外显子11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等点突变；②89％的突变发生于外显子15上的激活区，其中约92％位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。
目前，已经建立的BRAF基因突变检测技术，主要是PCR-测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用较为广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20％-25％，远远不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度实际应用检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为实际应用所诟病。基于上述检测技术存在的问题，申请人前期成功开发的“BRAF基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法”(申请号：200910037357.6)检测方法操作简单，通过酶切富集排除了大量野生型序列造成的干扰，结果特异性好，灵敏度高，准确度达99％以上，但该方法涉及两轮PCR操作，较易造成污染，且杂交检测步骤探针较为接近(只有突变位点不同)，不便于多种基因突变位点并行检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供BRAF基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测BRAF基因的正常基因型和V600E突变型。
实现上述目的的技术方案如下：
一种BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括有，
(A)针对BRAF的V600E突变位点，分别设计的野生型和突变型的一对ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.25-SEQ ID NO.30中的任2种序列；所述特异性引物是来源于SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2或其反向互补序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14中的碱基序列，且特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的2种微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.36中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C)用于扩增具有V600E突变位点的BRAF基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38。
优选地，所述野生型的特异性引物为SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.7中的一条，所述突变型的特异性引物为SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.12中的一条；或所述野生型的特异性引物为SEQID NO.15～SEQ ID NO.19中的一条，所述突变型的特异性引物为SEQ ID NO.20～SEQ IDNO.24中的一条。
优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述间隔臂序列为5-10个T。
本发明的另一目的是提供一种用于BRAF基因突变检测的特异性引物。
具体技术方案如下：
用于BRAF基因V600E突变检测的特异性引物，所述特异性引物是来源于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或其反向互补序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14中的碱基序列，且特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所制备的BRAF基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现多个突变位点的并行检测。
2.本发明所设计的针对野生型和突变型的特异性ASPE引物，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，探针之间不存在非特异性结合，检测特异性及准确性高，检测结果与测序法吻合率达到100％。
3、本发明检测体系效果稳定可靠，特异性引物、Tag序列、扩增引物等组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
具体实施方式
实施例1BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对BRAF的V600E突变位点，分别设计野生型和突变型ASPE引物对。
BRAF基因突变检测的ASPE引物的设计要点为：
ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。其中，5’端为根据BRAF基因突变检测所设计的Tag序列，所设计的Tag序列在反应体系能最大限度的避免ASPE引物可能形成的二级结构，且Tag序列与Tag序列，Tag序列与特异性引物序列之间不发生交叉反应。Tag序列和特异性引物序列形成完整的ASPE引物，并使所有的ASPE引物能够在一个均一的反应体系中同步反应(即同一反应的缓冲环境，同一反应温度等)，完成并行检测。所设计的Tag序列具体如表5。3’端为根据BRAF基因突变检测所设计的特异性引物序列，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；其中针对V600E突变型的特异性引物序列，其3’端的最后3位碱基中的一个碱基应为突变位点；所述V600E野生型的特异性引物序列3’端的最后3个碱基应包含V600E位点。所述Tm值的计算方式为Tm＝(G+C)×4+(A+T)×2-4。
表1BRAF基因突变检测特异性引物的来源序列之一
Figure GSA00000109797000031
从上表序列中，斜体部分的A和T为突变位点。
根据上述的ASPE引物中特异性引物序列的设计要点，设计得到一系列的特异性引物序列，其中例举部分野生型和突变型特异性引物，如表2：
表2BRAF基因突变特异性引物序列之一
Figure GSA00000109797000041
同样，表1中BRAF基因突变检测特异性引物的来源序列的反向互补序列也可以用于设计ASPE的特异性引物，具体的来源序列如表3：
表3 BRAF基因突变检测特异性引物的来源序列之二
Figure GSA00000109797000042
表4 BRAF基因突变检测特异性引物序列之二
Figure GSA00000109797000043
Figure GSA00000109797000051
表5Tag序列
  SEQ ID NO.   Tag序列(5′-3′)
  25   TCAATCAATTACTTACTCAAATAC
  26   CTTTTACAATACTTCAATACAATC
  27   TGAATTGATGAATGAATGAAGTAT
  28   TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATT
  29   TGAAATGAATGAATGATGAAATTG
  30   GTTTATAGTGAAATATGAAGATAG
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如上述表5所示)，3’端为突变型或野生型特异性引物序列(如上述表2和4所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag序列与ASPE特异性引物可能形成的二级结构，选择的微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表6所示：
表6微球编号与微球上相应的anti-tag序列
  SEQ IDNO. 微球上对应的anti-tag序列(5′-3′) 微球编号
  31   GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA   19
  32   GATTGTATTGAAGTATTGTAAAAG   20
  33   ATACTTCATTCATTCATCAATTCA   25
  34   AATCCTTTCTTTAATCTCAAATCA   31
  35   CAATTTCATCATTCATTCATTTCA   56
  36   CTATCTTCATATTTCACTATAAAC   61
选择的6种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。
微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，并恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，并用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有检测位点的目标序列的引物
目标检测BRAF基因V600E位点。利用Primer5.0设计一对引物(见表7)，扩增出含有检测位点的目标序列。
表7扩增出具有突变位点的目标序列的引物
  SEQ ID   基因   类型   扩增引物(5′-3′)
Figure GSA00000109797000071
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用BRAF基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
  试剂   来源   终浓度  每250ml的用量
  MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 0.05M 2.44g
  5MNaOH   Fisher SS256-500   ---  5滴
2×Tm杂交缓冲液
  试剂   来源   终浓度  每250ml的用量
  1MTris-HCl，pH8.0   SigmaT3038   0.2M  50ml
  5M NaCl   Sigma S5150   0.4M  20ml
  Triton X-100   Sigma T8787   0.16％  0.4ml
过滤后贮存于4℃。ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》中关于DNA提取的方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计引物，PCR扩增出含有检测位点的目标序列，产物大小为190bp。引物序列(SEQ NO.37-38)见上述表7所示。
首先配制PCR引物工作液：分别取SEQ NO.37-38的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为PCR引物工作液。PCR反应体系如下：
10×缓冲液(含Mg2+)    5ul
dNTP(各2.5mmol/L)     4ul
Taq酶(5U/ul)          0.5ul
PCR引物工作液(各16.7pmol/mL)    6ul
模板DNA(10ng/ul)                1ul
ddH2O                           33.5ul
共                              50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取V600E相应的野生型和突变型ASPE引物(具体如表8所示)贮存液10ul于3支不同的1.5ml微量离心管中，分别加入10mmol/LTris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。
表8液相芯片制备的设计一
Figure GSA00000109797000081
ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液            2ul
MgCl2(50mmol/L)       0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L)                 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)    1ul
Tsp酶(5U/ul)                           0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)      1ul
酶切处理的PCR扩增产物                  5ul
ddH2O                                  10.ul
共                                     20ul
3个独立体系在同一个延伸反应程序中进行，程序为：96℃2min；94℃30s，52℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优的2种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以突变型检测荧光值(MFI)大于100为cut-off值，当突变型检测的MFI值大于100时，判定该样本为存在外显子15的V600E突变，否则判定该样本为野生型，检测结果如表9和表10所示。
使用本方法检测大量样本的BRAF基因突变，以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的BRAF基因突变检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的BRAF基因突变检测液相芯片能够准确地检测出BRAF基因的突变类型，且结果稳定可靠。
表9样本检测结果(MFI)
Figure GSA00000109797000101
表10样本BRAF基因突变检测结果分析
  样品号   液相芯片检测结果   测序结果
  Group1   Group2   Group3   Group1   Group2   Group3
  1   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  2   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  3   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  4   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  5   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  6   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  7   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  8   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变
  9   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变
  10   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  11   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  12   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  13   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变
  14   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  15   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  16   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  17   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  18   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  19   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  20   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
针对同一突变位点的3组ASPE引物对样品的检测，均取得一致的检测效果。根据上述ASPE引物设计要点分别设计的不同液相芯片，其特异性引物序列不同，而检测结果一致。其他类似情况的具体检测数据省略。
实施例3野生型和突变型特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)
以BRAF基因V600E位点突变的检测液相芯片为例，针对V600E野生型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，该特异性引物序列分别来源于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.13，而突变型ASPE引物3’端的特异性引物序列则分别相应地来源于SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.14，野生型和突变型ASPE引物5’端的Tag序列分别固定为SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32。具体设计如下表(表11)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表11液相芯片制备的设计
Figure GSA00000109797000121
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表12样本检测结果(MFI)
Figure GSA00000109797000122
  25   1983   58   1603   53   2457   46   1688   35   2459   41   1737   58
  26   2664   40   1831   36   2381   55   2037   52   2856   50   2911   44
  27   2063   50   1998   34   2457   37   2482   46   2402   68   2301   53
  28   2662   164   1617   134   1922   169   2630   139   1802   169   2797   150
  29   1617   40   2352   38   2160   58   2434   39   2148   64   1794   42
  30   2934   58   2096   34   2964   64   2530   56   1713   70   2871   74
  31   1592   30   1816   55   2719   56   1793   39   2387   39   2771   56
  32   1725   53   1742   34   2939   35   2371   66   2582   39   2807   62
  33   2328   38   2506   56   1733   36   2614   61   2143   73   2599   58
  34   1594   52   1922   37   1588   50   2472   57   1748   35   1745   30
  35   2431   361   2943   363   1748   359   1746   332   2744   372   1860   351
  36   2541   45   1980   61   2890   48   2552   40   1504   36   1689   70
  37   1907   41   1732   35   2699   33   2696   45   1996   31   2280   67
  38   1518   65   2732   43   1718   60   2483   68   2892   31   2435   73
  39   2835   48   2619   57   2621   55   2486   63   1882   35   2827   60
  40   2731   35   2735   31   2128   63   2599   36   2016   34   2117   41
表13样品液相芯片检测结果基因多态性分析
Figure GSA00000109797000131
  30   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  31   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  32   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  33   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  34   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  35   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变
  36   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  37   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  38   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  39   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  40   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
表14样本测序结果与基因多态性分析
Figure GSA00000109797000141
  35   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变
  36   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  37   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  38   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  39   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  40   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
针对同一突变位点的野生型和突变型特异性引物序列(野生型和突变型的特异性引物分别来源于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，或分别来源于SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)符合上述ASPE引物设计的要点，均可进行检测，且检测结果一致，结果稳定可靠，具体数据省略。
实施例4Tag序列及Anti-Tag序列的选择
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以BRAF基因V600E位点突变的检测液相芯片为例，针对V600E的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.30中的6条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.36。具体设计如下表(表15)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表15液相芯片制备的设计
Figure GSA00000109797000151
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表16样本检测结果(MFI)
Figure GSA00000109797000161
表17样本检测基因多态性分析
Figure GSA00000109797000162
  41   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  42   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  43   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  44   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  45   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  46   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  47   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  48   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变
  49   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  50   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  51   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  52   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  53   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  54   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  55   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  56   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变   V600E突变
  57   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  58   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  59   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
  60   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型   野生型
以上结果表明，所采用的tag序列不同，检测特异性及准确性都很高，检测结果可靠，但第一组的信噪比最好。
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>BRAF基因突变检测特异性引物和液相芯片
<160>38
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
acccactcca tcgagatttc actgtagcta gaccaaaatc ac    42
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
acccactcca tcgagatttc tctgtagcta gaccaaaatc ac    42
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccactccatc gagatttca                              19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cccactccat cgagatttca                             20
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
acccactcca tcgagatttc a                    21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ccactccatc gagatttcac                      20
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccactccatc gagatttcac t                    21
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ccactccatc gagatttct                         19
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cccactccat cgagatttct                        20
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
acccactcca tcgagatttc t                              21
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ccactccatc gagatttctc                                20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccactccatc gagatttctc t                               21
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gtgattttggt ctagctacag tgaaatctcg atggagtggg t        42
<210>14
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
gtgattttggt ctagctacag agaaatctcg atggagtggg t        42
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
gattttggtct agctacagt                      20
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
tgattttggtc tagctacagt                      21
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gtgattttggt ctagctacag t                    22
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gattttggtct agctacagtg                      21
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gattttggtct agctacagtg a                    22
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
gattttggtct agctacaga                               20
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
tgattttggtc tagctacaga                              21
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
gtgattttggt ctagctacag a                            22
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
gattttggtct agctacagag                              21
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
gattttggtct agctacagag a                            22
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
tcaatcaatt acttactcaa atac                    24
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
cttttacaat acttcaatac aatc                    24
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
tgaattgatg aatgaatgaa gtat                    24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
tgatttgaga ttaaagaaag gatt                    24
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
tgaaatgaat gaatgatgaa attg                    24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
gtttatagtg aaatatgaag atag                    24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gtatttgagt aagtaattga ttga                    24
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
gattgtattg aagtattgta aaag                    24
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
atacttcatt cattcatcaa ttca                    24
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
aatcctttct ttaatctcaa atca                    24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
caatttcatc attcattcat ttca                  24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
ctatcttcat atttcactat aaac                  24
<210>37
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
tgcttgctct gataggaaaa tga                   23
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
gcctcaattc ttaccatcca ca                    22

Claims (4)

1.一种BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有，
(A)针对BRAF的V600E突变位点，分别设计的野生型和突变型ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ IDNO.25～SEQ ID NO.30中的任2条序列；所述特异性引物是：针对V600E野生型的选自SEQ IDNO.3～SEQ ID NO.7中的一条，针对V600E突变型的选自SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.12中的一条；或所述野生型的特异性引物选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.19中的一条，所述突变型的特异性引物选自SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.24中的一条；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的2种微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.36中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C)用于扩增具有V600E突变位点的BRAF基因目标序列的扩增引物，所述扩增引物为SEQID NO.37和SEQ ID NO.38。
2.根据权利要求1所述的BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述tag序列为SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26。
3.根据权利要求1-2任一所述的BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
4.根据权利要求3所述的BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
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