CN113337586A - 一种检测braf v600e位点的数字pcr反应体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用。所述反应体系包含BRAF V600E位点的特异性扩增引物和野生型、突变型探针，通过优化PCR扩增体系中引物探针的浓度比例，使得整个反应体系的灵敏度和稳定性大幅度提高。本发明适用于肿瘤组织、外周血、血浆等多种样本类型的检测，尤其在游离核酸等等微量样本中检测灵敏度高，结果准确可靠，具有较高的应用价值。

Description

一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用。

背景技术

BRAF基因位于人类染色体7q34，其功能编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。BRAF基因突变在肿瘤患者中最常见的突变是第15号外显子上的V600E突变。BRAF V600E突变可发生于多种肿瘤，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌以及肺癌等。研究表明，BRAF V600E突变预示Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌患者预后不良。NCCN指南推荐的Lynch综合征的检测策略中，推荐在DNA错配修复蛋白缺失的病例中进行BRAF基因突变检测。BRAF是甲状腺乳头状癌最为常见的基因突变，BRAF V600E突变可用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断。更重要的是，期和Ⅱ期临床试验证明携带BRAF V600E突变的黑色素瘤患者对BRAF激酶抑制剂威罗菲尼的响应效率超过50％，6个月总体生存期为84％。因此，BRAF基因突变检测已成为多种肿瘤临床诊治必需的检测项目。

有研究表明，肿瘤患者的血液、胸腹腔积液、脑脊液等体液中可以检测到的游离DNA含量远大于正常人，并且游离DNA表现出与肿瘤组织相同的生物学特性。随着肿瘤分子生物学研究的进展，游离DNA的检测及其生物学指标的研究已为临床肿瘤早期诊断、预后判断及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特意、无创或微创的分子生物学检测手段。

本申请提供了一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，检测灵敏度高，特异性好，在相关癌症的诊疗应用中有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，所述体系通过优化检测条件及引物浓度，最终实现了对多种类型样本的高效、准确和灵敏的检测，尤其是在微量核酸的检测中具有较高的优势，适用于肿瘤组织、外周血、血浆等多种样本类型的检测，尤其在游离核酸样本的检测中具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，包含引物探针混合物，所述引物探针混合物由一对检测BRAF V600E位点的特异性引物和一对检测BRAFV600E位点的特异性探针组成：

（1）所述特异性引物包括：

BRAF V600E正向引物：5’-GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA-3’，

BRAF V600E反向引物：5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-3’；

（2）所述特异性探针包括：

BRAF V600E野生型探针：5’-CTAGCTACAGTGAAATC-3’，

BRAF V600E突变型探针：5’-TAGCTACAGAGAAATC-3’。

优选地，所述野生型探针5’端具有VIC荧光基团修饰，突变型探针5’端具有FAM荧光基团修饰。

优选地，所述野生型探针和突变型探针的3’末端经过双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰以阻断探针在扩增过程中延伸。

更加优选地，所述探针的3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。

优选地，所述反应体系由10*引物探针混合物、ddPCR-酶反应液、模板DNA和去离子水组成。

例如，本发明中，若所述反应体系的总体积为20μL，则其中10×引物探针混合物2.0μL、dPCR-酶反应液10μL、模板DNA 1-8μL，去离子水补齐至20μL。

优选地，所述引物探针混合物的浓度分别为：

BRAF V600E正向引物浓度为5.5-8.0μmol/L；

BRAF V600E反向引物浓度为5.5-8.0μmol/L；

BRAF V600E野生型探针浓度为2.5-4.0μmol/L；

BRAF V600E突变型探针浓度为2.5-4.0μmol/L。

第二方面，本发明提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系的应用，所述反应体系用于检测血浆游离DNA 中BRAF V600E位点突变。

优选的，检测血浆游离DNA 中BRAF V600E位点突变方法包括如下步骤：

(1) 提取样本中的DNA；

(2) 采用由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、模板DNA和去离子水组成的反应体系配制扩增反应；

(3) 按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60-65℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；

(4) 通过数字PCR仪采集荧光信号，分析得到样本中的DNA的BRAF V600E位点的突变情况，计算突变比例信息。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明提供的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，具有较高的特异性和灵敏性，相比市场上其他公司的产品在特异性检测中灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；检测的假阳性率大幅度降低，检测结果准确可信；

（2）本发明提供的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，对于血浆游离DNA这一类低丰度的样本类型，检测成功率高，避免了反复检测、反复取样等实际问题，大幅度缩短检测周期，在临床检验中具有较高的应用价值。

（3）本发明提供的扩增体系操作简单，整个检测流程所需时间短，方便操作，结果直观，便于分析，检测结果更为准确、灵敏；本发明提供的反应体系可大规模用于分析临床样本，提供准确稳定的检测结果。

附图说明

图1为采用本发明检测的血液样本1在BRAF V600E位点的基因分型结果；

图2为采用本发明检测的血液样本2在BRAF V600E位点的基因分型结果；

图3为采用本发明检测的肿瘤组织样本1在BRAF V600E位点的基因分型结果；

图4为采用本发明检测的肿瘤组织样本2在BRAF V600E位点的基因分型结果；

图5为采用本发明检测的血浆游离DNA样本1在BRAF V600E位点的基因分型结果；

图6为采用本发明检测的血浆游离DNA样本2在BRAF V600E位点的基因分型结果；

图7为采用本发明检测的血浆游离DNA样本3在BRAF V600E位点的基因分型结果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

本项目所使用的数字PCR检测系统为微滴式数字PCR技术。该技术是将目标分子与油混合后通过微滴化处理，形成上万个纳米级的微滴，目标分子在微滴中进行PCR扩增反应。PCR扩增反应结束后，软件对每个微滴的荧光信号进行识别检测，其中有荧光信号的微滴读作1，没有荧光信号的微滴读作0，根据泊松分布的原理，计算出目标分子的初始浓度或者初始拷贝数，继而达到绝对定量的目的。

实施例1 BRAF V600E位点的数字PCR反应体系的设计与建立

1.引物探针组合的设计

首先，参照文献报道的BRAF V600E位点所在基因的GeneBank序列号，从NCBI核酸数据库找到该位点所对应的基因序列，在经研究确认的BRAF V600E突变位点上下游设计特异性扩增引物对，同时在覆盖突变位点核苷酸的情况下分别设计野生型和突变型特异性探针。

引物设计原则：本发明中用于检测BRAF V600E位点的引物对是由Primer5和NCBIBlast软件设计完成；引物长度在20-30个核苷酸之间，引物的GC含量在40%-60%之间，引物的Tm值≥60℃。各引物的Tm值大致接近，以确保引物对能在同一退火温度下高效扩增。设计完成后将各引物用NCBI Blast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够特异比对到目标区域。引物的扩增产物大小在70-120bp范围内。所设计的引物用Auto Dimer软件分析引物二聚体情况，确保特异性和避免二聚体的出现。

探针设计的原则：本发明中用于检测BRAF V600E位点的野生型和突变型特异性探针，在3’末端均经过修饰以阻断探针在扩增过程中延伸，同时3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。野生型探针5’端具有VIC荧光基团修饰，突变型探针5’端具有FAM荧光基团修饰。

野生型探针SEQ ID NO:3所示：5'-VIC-CTAGCTACAGTGAAATC-MGB-3'；

突变型探针SEQ ID NO:4所示：5'-FAM-TAGCTACAGAGAAATC-MGB-3'。

BRAF V600E位点扩增的特异性引物及探针序列如表1所示：

表1

2. 检测系统建立

2.1 将上述设计的引物探针按照不同的浓度比例配制10×引物探针混合物，具体的各引物和探针的浓度如表2所示：

表2

2.2 按照数字PCR反应体系配制扩增反应：其中dPCR-酶反应液10μL、10×引物探针混合物2.0μL、模板DNA 1-8μL和去离子水补齐至20μL。

2.3 使用Bio-Rad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR系统中的AutomatedDroplet Generator 微滴发生器对dPCR反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步PCR反应。

2.4 将微滴体系置于PCR仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。

2.5 将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取，根据实际读取到的FAM和VIC信号值对样本内BRAF V600E野生型和突变型模板进行数量统计，最终计算出该样本的实际检测拷贝数及突变比例结果，从而判断检测样本的阴阳性情况。

在建立BRAF V600E位点反应体系测试中，本发明使用了两例肿瘤病人外周血样本进行检测。血液样本使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit进行DNA提取，使用Qubit进行DNA浓度及质量检测，最后稀释成10ng/μL浓度，备用。

由图1和图2可知，根据数字PCR结果图谱，可以比较直观地观察到待检测样本在BRAF V600E位点的突变情况。

血液样本1（图1）的检测结果为BRAF V600E阳性，突变比例为19.21%，其中FAM检测的突变型信号copies为1298 copies/20μL；VIC检测的野生型信号copies为5460 copies/20μL。

血液样本2（图2）的检测结果为BRAF V600E阳性，突变比例为17.35%，其中FAM检测的突变型信号copies为466 copies/20μL；VIC检测的野生型信号copies为2220 copies/20μL。

本发明所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，使用双色荧光标记检测样本的野生型和突变型位点，可以在结果图谱中直观的观察到样本是否存在突变情况，并且根据数字PCR系统的统计学分析得到样本中实际存在的突变比例及突变拷贝数量信息，从而直观的判断检测样本的阴阳性结果。

实施例2 肿瘤组织样本的检测

选取了2例肿瘤组织样本，采用本发明的反应体系，对其DNA进行检测，具体操作步骤如下：

1. 肿瘤组织样本DNA提取

使用QIAGEN公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit分别对2例肿瘤组织（FFPE）样本进行DNA提取，使用Qubit进行DNA浓度及质量检测，最后稀释成10ng/μL浓度，备用。

2. PCR扩增

2.1 dPCR扩增体系配制

按照数字PCR反应体系配制扩增反应：其中dPCR-酶反应液10μL、10×引物探针混合物2.0μL、DNA模板1μL、去离子水7μL，补齐至20μL。

2.2 使用Bio-Rad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR系统中的AutomatedDroplet Generator 微滴发生器对dPCR反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步PCR反应。

2.3 将微滴体系置于PCR仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。

2.4 将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取。根据实际读取到的FAM和VIC信号值对2例样本进行信号统计，最终计算出该样本的实际检测拷贝数及突变比例结果，从而判断检测样本的阴阳性情况。

由图3和图4可知，根据数字PCR结果图谱，检测的两例肿瘤组织DNA的检测结果如下：

肿瘤组织样本1（图3）的BRAF V600E位点为阳性，突变比例为10.05%，其中FAM检测的突变型信号copies为424 copies/20μL；VIC检测的野生型信号copies为3795 copies/20μL。

肿瘤组织样本2（图4）的BRAF V600E位点为阴性，其中FAM检测的突变型信号copies为0 copies/20μL；VIC检测的野生型信号copies为7600 copies/20μL。

实施例3 血浆游离核酸样本的检测

选取了3例肿瘤病人的血浆样本，采用本发明的反应体系，对其血浆cfDNA进行检测，具体操作步骤如下：

1. 血浆cfDNA提取

使用Applied Biosystems公司的MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit分别对3例肺癌病人的血浆样本cfDNA提取，然后使用Qubit进行cfDNA浓度和质量检测。

2. PCR扩增

2.1 dPCR扩增体系配制

按照数字PCR反应体系配制扩增反应：其中dPCR-酶反应液10μL、10×引物探针混合物2.0μL、cfDNA模板8μL，总体积为20μL。

2.2 使用Bio-Rad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR系统中的AutomatedDroplet Generator 微滴发生器对dPCR反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步PCR反应。

2.3 将微滴体系置于PCR仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。

2.4 将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取。

由图5、图6和图7可知，根据数字PCR结果图谱，检测的3例肿瘤病人的血浆游离DNA的检测结果如下：

血浆游离DNA样本1（图5）的BRAF V600E位点为阳性，突变比例为0.86%，其中FAM检测的突变型信号copies为42 copies/20μL；VIC检测的野生型信号copies为4820 copies/20μL。

血浆游离DNA样本2（图6）的BRAF V600E位点为阳性，突变比例为0.50%，其中FAM检测的突变型信号copies为5.6 copies/20μL；VIC检测的野生型信号copies为1104 copies/20μL。

血浆游离DNA样本3（图7）的BRAF V600E位点为阳性，突变比例为0.63%，其中FAM检测的突变型信号copies为5.4 copies/20μL；VIC检测的野生型信号copies为850 copies/20μL。

综上所述，本发明提供的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，特异性好，灵敏性高，相比市场上其他公司的产品在特异性检测中灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；检测的假阳性率大幅度降低，检测结果准确度高。同时，该反应体系对于游离核酸等微量样本中检测成功率高，避免了反复检测、反复取样等实际问题，大幅度缩短检测周期，在临床检验中具有较高的应用价值。

序列表

<110> 远辰生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用

<130> 20210701

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gaagacctca cagtaaaaat aggtga 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

acaactgttc aaactgatgg gacc 24

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ctagctacag tgaaatc 17

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tagctacaga gaaatc 16

Claims (7)

1.一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，包含引物探针混合物，其特征在于，所述引物探针混合物由一对检测BRAF V600E位点的特异性引物和一对检测BRAF V600E位点的特异性探针组成：

（1）所述特异性引物的序列，其特征在于：

BRAF V600E正向引物：5’-GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA-3’，

BRAF V600E反向引物：5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-3’；

（2）所述特异性探针的序列，其特征在于：

BRAF V600E野生型探针：5’-CTAGCTACAGTGAAATC-3’，

BRAF V600E突变型探针：5’-TAGCTACAGAGAAATC-3’。

2.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，其特征在于，所述野生型探针5’端具有VIC荧光基团修饰，突变型探针5’端具有FAM荧光基团修饰。

3.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，其特征在于，所述野生型探针和突变型探针的3’末端经过双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰以阻断探针在扩增过程中延伸；优选地，所述探针的3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。

4.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、模板DNA和去离子水组成。

5.根据权利要求4所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，其特征在于，所述引物探针混合物的浓度分别为：

BRAF V600E正向引物浓度为5.5-8.0μmol/L；

BRAF V600E反向引物浓度为5.5-8.0μmol/L；

BRAF V600E野生型探针浓度为2.5-4.0μmol/L；

BRAF V600E突变型探针浓度为2.5-4.0μmol/L。

6.根据权利要求4或5所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系的应用，其特征在于，所述反应体系用于检测血浆游离DNA中 BRAF V600E位点突变。

7.根据权利要求6所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系的应用，其特征在于，检测血浆游离DNA中 BRAF V600E位点突变方法包括如下步骤：

(1) 提取样本中的DNA；

(2) 采用由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、模板DNA和去离子水组成的反应体系配制扩增反应；

(3) 按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60-65℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；

(4) 通过数字PCR仪采集荧光信号，分析得到样本DNA中 BRAF V600E位点的突变情况，计算突变比例信息。

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