CN113930485A - 一种检测基因拷贝数变异的试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测基因拷贝数变异的试剂及其应用，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物序列和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物序列。本发明的检测基因拷贝数变异的试剂通过本发明方案的对引物和荧光探针的设计，可以高效准确的用于拷贝数变异的检测，检测敏感度高，重复性好，可检测低至0.25ng的样本。

Description

一种检测基因拷贝数变异的试剂及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学检测领域，具体涉及一种检测基因拷贝数变异的试剂及其应用。
背景技术
基因拷贝数变异(copy number variation，CNV)是指人类基因组DNA片段大小范围从kb到Mb的亚微观突变，主要表现为缺失或重复。CNV的形成机制主要包括DNA重组与DNA错误复制两大类。DNA重组主要包括非等位同源重组和非同源末端连接。非等位同源重组是不同基因组位置的同源序列交换导致的，主要发生在减数分裂过程中；与非等位同源重组不同的是，非同源末端连接不需要同源序列作为底物，并且可以在连接部位插入碱基。DNA错误复制发生在DNA复制叉停滞时，滞后链从一个复制叉上脱落，通过同源序列转移到另一个空间位置上接近的复制叉。根据复制叉的方向和位置，该情况可以导致正向或反向的缺失或重复，产生的CNV也可大可小。CNV广泛存在于正常人类基因组中，具有与寡核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)相似的特点，是人类遗传多样性与个体间遗传差异的一个重要原因，除了构成遗传多态性外，还是人类疾病的重要致病因素之一。CNV参与疾病的发病机制可能通过：(1)基因剂量效应，如一些剂量敏感性基因的缺失或重复导致疾病的发生；(2)改变基因产物的结构，如在基因的编码区发生缺失或重复会导致基因断裂或者产生新的融合基因；(3)位置效应，如启动子区、非翻译区、增强子区等基因内非编码区、基因间区发生缺失或重复，影响基因的表达量从而参与疾病的发生。因此，CNV是一种可能良性的、未知临床意义的或具有致病性的基因组改变。
CNV作为一种直接或间接参与疾病发生、发展的新型基因组结构变异形式，如何对其进行快速准确的检测具有非常重要的临床意义。目前，用来进行CNV研究的方法有比较基因组杂交芯片技术、荧光原位杂交技术、多重连接探针扩增技术、新一代测序技术和数字化PCR分析等。总的来说，当前的一些技术，不管是全基因组范围内的CNV研究方法还是候选的CNV研究方法，已相继应用到CNV的分子诊断中，在方法学研究方面虽然有一定进展，但其操作可行性、检测成本、检测效率等方面不能满足当前常规检测的需要。随着CNV致病机制的研究以及分子生物学技术的发展，进一步发展人类基因组CNV检测技术的需求显得格外迫切。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测基因拷贝数变异的试剂，能够快速准确检测出CYBA基因缺失导致的免疫缺陷。
本发明还提出上述试剂的应用。
本发明还提出一种非疾病治疗和诊断目的检测CYBA基因拷贝数变异的方法。
根据本发明的一个方面，提出了一种检测基因拷贝数变异的试剂，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物序列和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物序列。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的荧光探针。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针的5’端有荧光基团，3’端有荧光淬灭基团。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团选自VIC、FAM、TET、JOE和CY3中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括检测内参基因GAPDH的内参引物和内参探针。
在本发明的一些实施方式中，所述内参基因GAPDH的内参引物和内参探针包括核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示的上游引物和SEQ ID No.11所示的下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的荧光探针。
根据本发明方案第二方面提出了一种上述试剂的应用，所述应用为在制备检测CYBA基因拷贝数变异的试剂盒中的应用。
根据本发明的第三方面提出了一种非疾病治疗和诊断目的检测CYBA基因拷贝数变异的方法，所述方法包括以下步骤：提取样本DNA后使用上述能够检测CYBA基因拷贝数变异的引物和探针进行荧光定量PCR扩增反应。
在本发明的一些实施方式中，所述样本为外周血样本。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增反应还使用上述内参基因GAPDH的内参引物和内参探针。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR扩增反应的体系包括：浓度为50-300nM的引物，浓度为50-300nM的探针，模板DNA0.5-200ng。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR扩增反应的体系包括：浓度为150-250nM的引物，浓度为150-250nM的探针，模板DNA10-50ng。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR扩增反应的体系包括：浓度为200nM的引物，浓度为200nM的探针，模板DNA10ng。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR扩增反应的体系还包括2×FastFire qPCRPreMix。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR的扩增条件为：93-96℃预变性3-10min；93-96℃变性25-35s，55-60℃退火延伸13-20s，采集荧光基团通道荧光信号，共计40-60个循环。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR扩增反应的条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火延伸15s，采集荧光基团通道荧光信号，共计40个循环。
根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：通过本发明方案制备得到的检测基因拷贝数变异的试剂通过本发明方案的对引物和荧光探针的设计，可以高效准确的用于Chr16 q24.2q24.3(88621282-88839560)(hg19)区域拷贝数变异的检测，检测敏感度高，重复性好，可检测低至0.25ng的样本。同时，本发明方案将CYBA基因缺失导致的免疫缺陷作为疾病模型所建立的分子诊断途径及分子诊断方法，不但能快速准确检测出CYBA基因缺失导致的免疫缺陷，还可为其它拷贝数变异遗传病的分子诊断方法学研究提供借鉴和参考。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的引物特异性验证电泳图；
图2为本发明实施例1中的单重qPCR筛选内参基因GAPDH引物和探针的实验结果图；
图3为本发明实施例1中的单重qPCR筛选目的基因Chr16-C引物和探针的实验结果图；
图4为本发明实施例1中的双重qPCR检测目的基因Chr16-C和内参基因GAPDH引物和探针的实验结果图；
图5为本发明实施例2中的双重qPCR检测目的基因Chr16-C和内参基因GAPDH荧光定量PCR体系扩增效率的实验结果图；
图6为本发明实施例2中的双重qPCR筛选目的基因Chr16-C和内参基因荧光定量PCR反应扩增效率一致性的实验结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1一种检测基因拷贝数变异的试剂
本实施例制备了一种检测基因拷贝数变异的试剂，包括荧光定量PCR引物和探针具体过程为：
1、荧光定量PCR引物和探针的设计与合成
本发明方案选择GAPDH基因作为△Ct值相对定量检测体系的内参基因。基因代表性DNA片段通过大量数据比对和筛选，选择位于人类12号染色体第6646711-6646853(hg19)，长度为143bp，GC含量为60％。选择DNA片段经序列比对，在人类基因组DNA中不存在同源序列。同时，以位于人类基因组16号染色体上88800825-88800927(hg19)作为方法学性能验证的目标基因序列，其影响的是细胞色素b-α亚单位(CYBA)基因，从而造成免疫缺陷疾病。根据引物和探针设计的基本原则，分别设计内参基因引物对GAPDH-F1、GAPDH-R1，探针GAPDH-P1；引物对GAPDH-F2、GAPDH-R2，探针GAPDH-P2。目标基因的引物对chr16-C-F1、chr16-C-R1，探针chr16-C-P1；引物对chr16-C-F2、chr16-C-R2，探针chr16-C-P2；引物对chr16-C-F3、chr16-C-R3，探针chr16-C-P3，引物对和荧光探针的核苷酸序列如表1所示，委托上海生工生物进行引物和探针的合成。
表1引物和探针核苷酸序列
Figure BDA0003352610420000051
Figure BDA0003352610420000061
2、引物和荧光探针的筛选
将正常人样本RHWLCNV29的gDNA作为模板，分别进行两套特异性引物探针的可行性实验，配制反应体系如下：12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix(购自ThermoFisher，货号4398886)、上下游引物各0.2μM/L，20ng gDNA，用ddH2O补齐体积至25μL。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃复性1min，72℃延伸30s共计35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。扩增完毕后，分别取5μLPCR产物，加1μL6XloadingBuffer(购自Takara)处理后，用2％的琼脂糖凝胶、120V电压、1XTAE电泳30分钟。
实验结果如1所示，图1为引物特异性验证电泳图实验结果图，在凝胶成像仪下观察扩增产物长度为单一的特异性目标产物，说明本发明方案设计的引物有效。
3、引物和探针的单重qPCR验证
反应体系：12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix(购自ThermoFisher，货号4398886)、上下游引物以及对应的探针(内参基因组包括引物对GAPDH-F1、GAPDH-R1，探针GAPDH-P1；引物对GAPDH-F2、GAPDH-R2，探针GAPDH-P2；目标基因组包括引物对chr16-C-F1、chr16-C-R1，探针chr16-C-P1；引物对chr16-C-F2、chr16-C-R2，探针chr16-C-P2；引物对chr16-C-F3、chr16-C-R3，探针chr16-C-P3引物对)各0.2μM/L，20ng gDNA，用ddH2O补齐体积至25μL。
反应条件：95℃10min预变性(Step 1)→95℃30sec(变性)，56℃15s(退火延伸，收集荧光)(Step2为40个循环)。根据TaqMan探针的荧光标记选择对应的检测通道。
实验结果如图2-3所示，从图中可以看出，根据扩增曲线显示的荧光值以及Ct值，可以得到内参基因GAPDH的最优引物探针组合为引物对GAPDH-F1、GAPDH-R1，探针GAPDH-P1；目标基因的最优引物探针组合为chr16-C-F3、chr16-C-R3，探针chr16-C-P3。
4、引物和探针的双重qPCR验证
反应体系为25μL，包含：12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix(购自ThermoFisher，货号4398886)、内参基因和目标基因检测的最优的上下游引物以及对应的探针各0.2μM/L，20ng gDNA，用ddH2O补齐体积至25μL。
反应条件为：95℃10min预变性(Step 1)→95℃30sec(变性)，56℃15s(退火延伸，收集荧光)(Step2为40个循环)。根据TaqMan探针的荧光标记选择对应的检测通道。qPCR扩增结束后，观察扩增曲线明显显示指数增长阶段和非指数平台阶段，荧光信号达到检测要求，并各PCR反应互不干扰。
实验结果如图4所示，结果表明本申请方案设计的qPCR引物后续进行实验可行，一个理想的多重PCR反应体系，不是单一PCR的简单叠加，要保证PCR反应的高扩增效率和准确性，必须保证多重PCR反应体系内各反应互不干扰。设计的双重qPCR反应，必须通过双重qPCR验证各PCR反应的有效性及独立性，互相间不存在干扰。
实施例2荧光定量PCR相关反应参数的优化
1、引物浓度的优化
实验步骤：将实施例1筛选得到的内参基因引物组GAPDH-F1、GAPDH-R1和目标基因chr16-C-F3、chr16-C-R3的两对引物工作液(10μM)分别按比例1:1混合，配制成浓度为5μM的引物对，每个反应体系分别加入引物0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5μL，使得引物对的终浓度分别为50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM。
反应体系：共25μL，包含：12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix(购自ThermoFisher，货号4398886)、内参基因和目标基因检测的上下游引物所设计的引物浓度梯度以及对应的探针各0.2μM/L，20ng gDNA，用ddH2O补齐体积至25μL。
反应条件为：95℃10min预变性(Step 1)→95℃30sec(变性)，56℃(退火延伸，收集荧光)(Step2为40个循环)。
根据TaqMan探针的荧光标记选择对应的检测通道。qPCR扩增完毕后，根据检测Ct值的变化规律确定合适的引物浓度。检测结果如表2所示。
表2不同引物浓度的检测Ct值
引物浓度(nM) 50 100 150 200 250 300
GAPDH 24.16 23.31 22.34 21.54 21.05 20.86
Chr16-C 30.12 29.06 28.36 27.46 26.98 26.42
实验结果如表2所示，从表中可以看出，GAPDH和Chr16-C的引物浓度为50nM～200nM，检测Ct值均明显随着引物浓度的增高而降低，但200nM～300nM，Ct值降低的速度很缓慢，因此，GAPDH和Chr16-C的引物浓度为200nM是最适合引物浓度。引物浓度是一个影响PCR反应的关键因素。如果浓度过低，会导致反应不完全；如果浓度过高，容易产生非特异性扩增产物。因此本申请方案选择的200nM引物浓度不仅经济实惠，而且反应特异性好。
2、TaqMan探针浓度优化
实验步骤：将实施例1得到的2种TaqMan探针(核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.12所示)工作液(10μM)按比例1:1混合，配制成浓度为(5μM)的混合液，每个反应体系加0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5μL，使得TaqMan探针终浓度分别为50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM。
反应体系为25μL，包含：12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix(购自ThermoFisher，货号4398886)、内参基因和目标基因检测的上下游引物各0.2μM/L，以及对应的探针对应的各设计浓度梯度，20ng gDNA，用ddH2O补齐体积至25μL。
反应条件为：95℃10min预变性(Step 1)→95℃30sec(变性)，56℃(退火延伸，收集荧光)15s(Step2为40个循环)。根据TaqMan探针的荧光标记选择对应的检测通道。qPCR扩增完毕后，根据检测Ct值的变化规律确定合适的探针浓度，结果如表3所示。
表3不同TaqMan探针浓度的检测Ct值
TaqMan探针浓度(nM) 50 100 150 200 250 300
GAPDH 23.98 23.19 22.21 21.14 20.81 20.67
Chr16-C 29.89 29.24 28.38 27.06 26.78 26.35
实验结果如表3所示，从表中可以看出，GAPDH和Chr16-C基因的TaqMan探针浓度为50nM～200nM，Ct值随浓度的增加降低速度较快，GAPDH和Chr16-C基因的TaqMan探针浓度为200nM～300nM，Ct值降低的速度较为缓慢，因此，优选200nM为最适合TaqMan探针浓度。本申请方案优选得到的TaqMan探针浓度在降低了反应成本的同时实现了更好的反应特异性。
3、检测模板量的优化
实验步骤：在包含有12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix(购自ThermoFisher，货号4398886)、内参基因和目标基因检测的上下游引物以及对应的探针各0.2μM/L的25μL体系中，分别加200ng、100ng、50ng、10ng、5ng、1ng、0.5ng的模板量。
反应条件为95℃10min预变性(Step 1)→95℃30sec(变性)，56℃15s(退火延伸，收集荧光)(Step2为40个循环)，根据TaqMan探针的荧光标记选择对应的检测通道。qPCR扩增完毕后，所获得的检测Ct值如表5所示。
表5不同模板量的检测Ct值
Figure BDA0003352610420000091
实验结果如表5所示，从表中可以看出，根据检测Ct值的变化规律确定合适的检测模板量，一般认为最适合的模板量是检测Ct值在15～30之间对应的模板量，本发明方案模板量在5～200ng均符合要求，但综合考虑，后续选择10～50ng的模板量进行检测，优选10ng的模板量。在TaqMan实时荧光定量PCR体系中，如果模板量过多，容易增加非特异性产物；如果模板量过少，荧光定量检测Ct值滞后，而且受探针水解、Taq酶活性降低等各种因素的影响容易导致不理想的检测结果。因此选择合适的检测模板量，是双重qPCR体系扩增成功的保证。
4、荧光定量PCR体系扩增效率分析
(1)GAPDH和Chr16-C的扩增效率分析
对PCR组分及扩增条件优化后的荧光定量PCR体系进行综合评价与分析。具体的操作是在优化的25μL检测体系中，包含12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix、内参基因和目标基因检测的上下游引物以及对应的探针(内参基因GAPDH引物探针组合为引物对GAPDH-F1、GAPDH-R1，探针GAPDH-P1；目标基因的引物探针组合为chr16-C-F3、chr16-C-R3，探针chr16-C-P3)各0.2μM/L，分别加入200ng、100ng、50ng、10ng、5ng、1ng的模板量。反应条件为：95℃10min预变性(Step 1)→95℃30sec(变性)，56℃15s(退火延伸，收集荧光)(Step2为40个循环)，根据TaqMan探针的荧光标记选择对应的检测通道。qPCR扩增完毕后，分析各PCR反应的扩增效率。以模板量的log值作为横坐标，Ct值作为纵坐标，分别计算内参基因GAPDH和目标基因(Chr16-C)的扩增斜率(如图5所示)。通过扩增斜率计算各自的扩增效率，扩增效率E＝10-1/a，a为扩增曲线的斜率，将扩增效率用百分率表示，即每个循环扩增模板的百分比，将扩增效率E转换成百分率为：效率％＝(E-1)×100％。
实验结果如图5所示，从图中可以看出：GAPDH的扩增效率为92.89％，Chr16-C的扩增效率为99.13％，两者的扩增效率均在90～105％之间。
(2)GAPDH和Chr16-C的扩增效率一致性分析
分析方法：分别计算目的基因不同检测模板量(50ng、100ng、150ng、200ng、250ng)的△Ct值(△Ct＝Ct目的基因-Ct内参基因)。然后，以检测模板量为横坐标，△Ct值为纵坐标，绘制曲线且计算曲线斜率。
实验结果如图6所示，曲线斜率为0，可确定该检测体系的组分和扩增条件可用于后续检测。
实施例3准确度实验
本实施例以免疫缺陷为疾病模型，为了验证检测拷贝数变异的方法用于上述基因缺陷引起的疾病诊断的准确性，收集了30例经二代测序分析的已知基因型的EDTA抗凝外周血样本，其中包括29例正常基因型样本(来源于正常人群志愿者以及湖南省儿童医院)，1例Chr16 q24.2q24.3(88621282-88839560)x1(hg19)杂合缺失(因缺失影响了CYBA基因的功能从而引起免疫缺陷)的样本(来源于湖南省儿童医院)，所有样本均采用全血基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)(购自金麦格生物)提取gDNA，提取步骤严格参照试剂盒说明书进行。提取后的gDNA以无酶无菌水(购自北京索莱宝科技有限公司)稀释至10ng/μL。用本发明方案制备得到的试剂组合进行荧光PCR检测。
应用已优化的荧光定量PCR体系，对这些样本进行检测分析。荧光定量PCR体系包括，25μL的体系中引物对(内参基因引物对GAPDH-F1、GAPDH-R1；目标基因的引物对chr16-C-F3、chr16-C-R3)浓度为200nm，探针(内参基因探针GAPDH-P1；目标基因探针chr16-C-P3)浓度为200nM，模板DNA的量为10ng，12.5μLAmpliTaq GoldTM 360Master Mix，用ddH2O补齐体积至25μL。
反应条件为：95℃10min预变性(Step 1)→95℃30sec(变性)，56℃(退火延伸，收集荧光)(Step2为40个循环)。
△△Ct值＝待检样本的(Ct目的基因-Ct内参基因)-正常对照样本的(Ct目的基因-Ct内参基因)。
计算各样本的2-△△Ct。通过2-△△Ct值将所获得的Chr16-C基因序列相对拷贝数进行定量，再与二代测序分析结果进行对比分析，评价该检测体系的准确性。理论上，拷贝数为2的正常对照样本的2-△△Ct值为1，拷贝数为1的阳性样本，2-△△Ct值为0.5。根据统计结果：待检样本中2-△△Ct值为0.84-1.19的接近1，判为正常样本，Chr16-C的拷贝数为2；待检样本中2-△△Ct值为0.52的1例样本Chr16-C的拷贝数为1，判为Chr16-C缺失杂合样本。实验结果如表6所示，同时将样本进行测序，二代测序分析结果与检测结果相符，说明本发明提供的检测体系准确性好。
表6 30例样本检测的2-△△Ct数据分析结果
Figure BDA0003352610420000111
Figure BDA0003352610420000121
实施例4敏感性实验
采用实施例3中的RHWLCNV28样本gDNA，随后，将该样本进行逐步稀释，分别获得100ng/μL、50ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL的gDNA浓度梯度。应用实施例3中的荧光定量PCR体系，对上述7种浓度gDNA进行检测，根据所获得的检测Ct值，以10ng的正常人样本RHWLCNV29的检测浓度为参考品，进行数据分析。
表7阳性样本浓度敏感性检测的2-△△Ct数据分析结果
Figure BDA0003352610420000122
实验结果如表7所示，即使gDNA浓度低至0.25ng，样本的检测结果2-△△Ct值也能接近理论值(见表7)，得到相符的检测结论。
实施例5重复性实验
采用实施例3中的正常样本RHWLCNV01和RHWLCNV28的gDNA进行体系重复性测试，测试体系的引物浓度、TaqMan探针浓度、模板量均采用实施例3中的荧光定量PCR体系的参数进行体系批内精密度和批间精密度分析，重复检测次数分别为10次。根据所获得的检测Ct值，进行数据分析，并分别计算目的基因Chr16-C的2-△△Ct均值、标准差(SD)以及变异系数(CV)。结果如表8所示。
表8
Figure BDA0003352610420000131
实验结果如表8所示，从表中可以看出，本发明方案重复性试验的标准差在0.03至0.08之间，变异系数在5.36至7.62之间，用本发明方案制备的试剂采用荧光定量PCR检测进行检测得到的结果具有极高的稳定性和可重复性。
综上所述，本发明设计的内参基因和目标基因的引物、探针以及优化的反应体系，均满足Chr16 q24.2q24.3(88621282-88839560)(hg19)区域拷贝数变异的检测，且检测敏感度高，重复性好。因此，本发明提供了一种快速简便、简单实用、高灵敏度、高通量低成本的拷贝数变异的检测手段及试剂盒。
CNV的致病机制是以疾病相关基因的缺失或重复为基础，疾病相关基因的缺失或重复是疾病的诊断依据。所以，只要能准确分析疾病相关基因的缺失或重复情况，即疾病相关基因拷贝数变异的快速分子诊断，则可实现对疾病的诊断。因此，本发明以“Taqman探针的荧光定量PCR检测相对拷贝数”作为分子诊断方法，建立一种灵敏、快捷、准确、简单实用、高通量、低成本、自动化的分子诊断方法。本发明以免疫缺陷(16号染色体上CYBA基因的缺失)为疾病模型，CYBA基因编码还原型辅酶叶绿醇，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)[NAD(P)H]氧化酶的一个重要亚单位。NAD(P)H氧化酶参与的催化过程是血管平滑肌细胞和内皮细胞氧自由基最重要的来源途径。由氧自由基诱发的氧化应激反应，参与了高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管病的发生发展。CYBA基因位于第16号染色体16q24位置，全长7760bp，含8个外显子，mRNA长688nt，编码由195个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明以该疾病模型所建立的分子诊断途径及分子诊断方法，不但能快速准确检测出CYBA基因缺失导致的免疫缺陷，还可为其它拷贝数变异遗传病的分子诊断方法学研究提供借鉴和参考。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 人和未来生物科技(长沙)有限公司
<120> 一种检测基因拷贝数变异的试剂及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactccgaat tagaacacag tccttg 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttctcttc catccagttc aacaag 26
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccccagca tgcacctgac caca 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttggcact cacgttctcc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggaagcg tggctgtg 18
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccccatgc agtgactaga aagcctgtgt 30
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtcctagg agggtgactg cc 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcccatcgat gcctgtca 18
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtctagtg gagaggatgt ttggtcaggc ag 32
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatgtgggga gtacgctgca 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggcagggat gatgttctgg ag 22
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctcactcct tttgcagacc acagtccatg 30
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggcaactt ggcaaatcaa a 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agggcaggag taaaggtcag aaat 24
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcccacccc ttctctaagt ccctcc 26

Claims (10)

1.一种检测基因拷贝数变异的试剂，其特征在于，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物序列和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物序列。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述荧光探针的5’端有荧光基团，3’端有荧光淬灭基团；所述荧光基团选自VIC、FAM、TET、JOE和CY3中的一种；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中的一种。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括检测内参基因GAPDH的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述内参基因GAPDH的引物和内参探针包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的上游引物和SEQ ID No.11所示的下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的荧光探针。
6.权利要求1-5任一项所述的试剂在制备检测CYBA基因拷贝数变异的试剂盒中的应用。
7.一种非疾病治疗和诊断目的检测CYBA基因拷贝数变异的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：提取样本DNA后使用如权利要求1-5任一项所述的试剂进行荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果确定是否样本是否存在CYBA基因拷贝数变异。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增反应的体系包括：浓度为50-300nM的引物，浓度为50-300nM的探针，模板DNA0.5-200ng。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增反应的体系包括：浓度为150-250nM的引物，浓度为150-250nM的探针，模板DNA10-50ng。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的扩增条件为：93-96℃预变性3-10min；93-96℃变性25-35s，55-60℃退火延伸13-20s，采集荧光基团通道荧光信号，共计40-60个循环。
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