CN102559898A

CN102559898A - 检测人α防御素1/3基因拷贝数的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102559898A
Application number: CN2012100119295A
Authority: CN
Inventors: 方向明; 舒强; 程宝莉; 陈齐兴; 金悦
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种检测人α防御素1/3基因拷贝数的试剂盒及方法，该试剂盒包括：第一组引物：目的基因实时荧光定量PCR扩增引物，碱基序列如SEQ ID NO.1和2所示；第一荧光探针：目的基因实时荧光定量PCR扩增荧光探针，中间的探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示；第二组引物：内参基因实时荧光定量PCR扩增引物，碱基序列如SEQ ID NO.4和5所示；第二荧光探针：内参基因实时荧光定量PCR扩增荧光探针，中间的探针碱基序列如SEQ ID NO.6所示；校样品DNA；实时荧光定量PCR反应液。采用本发明的试剂盒检测人α防御素1/3基因拷贝数，使用简单，方便快速，不需要构建标准曲线，敏感性、特异性高，可重复性好，检测效率高，可用于指导临床感染免疫性疾病风险预测。

Description

检测人α防御素1/3基因拷贝数的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物诊断技术领域，尤其涉及检测人α防御素1/3基因拷贝数的试剂盒及方法。

背景技术

防御素是一种内源性阳离子抗菌肽，相对分子质量为4-5KD、含有六个半胱氨酸残基和三对二硫键。根据多肽内二硫键排列的不同，防御素分为α防御素和β防御素两大类。编码α防御素的基因位于染色体8p22～23区域，存在拷贝数多态性(copy number polymorphism，CNP；copy numbervariation，CNV)。α防御素主要表达于中性粒细胞，具有促进中性粒细胞招募、增强巨噬细胞吞噬功能、调节补体活性、趋化树突状细胞和T细胞等生物学作用，在机体的天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥非常重要的作用。大量研究表明，α防御素基因表达异常或功能受损与各种感染免疫性疾病(如重症脓毒症和炎症性肠病等)的发生发展密切相关。在重症脓毒症中研究发现，α防御素蛋白血浆水平明显上升，并且与编码基因DEFA1/DEFA3拷贝数存在相关性，DEFA1/DEFA3拷贝数与重症脓毒症易感性密切相关。同时，研究表明DEFA1/DEFA3拷贝数与自身免疫性疾病——炎症性肠病的发生和发展密切相关。因此，研发快速、便捷、准确的DEFA1/DEFA3拷贝数检测试剂盒，建立DEFA1/DEFA3拷贝数检测新方法对医学研究和临床应用具有重要意义。

传统的测定基因拷贝数的方法之一是免疫印迹法(Southern Blot)。该方法经酶切、电泳后，将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，再与同位素标记的探针进行杂交显色，从而检测特定DNA分子的含量。该方法虽然准确可靠，但它需要大量DNA样品，过程复杂繁琐、费时费力，同时使用放射性同位素标记探针，具有放射性危害。另一测定方法是荧光探针杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)。其基本原理是通过荧光标记的DNA探针与待测样品的DNA进行原位杂交，根据荧光信号对样品进行分析并作出诊断。该方法需对细胞、组织样品进行固定，不适于检测大批量样本，容易出现非特异性的荧光杂交斑点，导致假阳性结果。多重可扩增探针杂交技术(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)是一种用于检测DNA拷贝数的新技术。该方法根据DNA序列制备若干具有通用引物的PCR产物作为可扩增探针组，经生物素标记的通用引物扩增后与固定在尼龙膜上待测的基因组DNA杂交，根据荧光信号的强度差异得到特定基因片段拷贝数的变化。该方法适合用于区分拷贝数少的样品，而对于区分多拷贝数的样品敏感性不够。多重连接探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技术是另一种检测基因拷贝数的方法。该方法是用两个荧光标记的寡核苷酸探针与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。最终经过毛细管电泳和激光诱导的荧光标志物来检测扩增产物。该方法不能检测染色体的平衡易位，而且不适合检测未知的点突变类型。

近年兴起的实时荧光定量PCR弥补了上述技术的不足。该方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后根据荧光信号对所测DNA样品进行定量分析。荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数定义为Ct值，Ct值与该样品的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越少，Ct值越大；起始拷贝数越多，Ct值越小。实时荧光定量PCR所使用的荧光化学物包括荧光染料和荧光探针两种。常用的荧光染料SYBR属于非特异性荧光标记，使用方便、灵敏，但对于DNA模板没有选择性，容易与非特异性双链DNA结合产生假阳性结果。荧光探针具有高度特异性，能有效避免荧光染料与引物二聚体产生的非特异性反应。实时荧光定量PCR的定量方法包括绝对定量和相对定量两种。绝对定量需要构建标准品，通过标准曲线来分析样品的模板绝对量，该方法复杂、耗时、成本高。采用2^-ΔΔCt法的相对定量法选择了表达量相对恒定的内参基因，用内参基因的数量进行标准化，通过测定样品目的基因与内参基因的Ct值差异计算目的基因表达量，不需要构建标准曲线，方法简便。实时荧光定量PCR所需DNA样品量小，简单快速，避免使用具有危害性的放射性同位素，且具有高敏感性，可重复性好，已广泛应用于临床疾病诊断，生物学和医学研究。

发明内容

本发明提供了一种检测人α防御素1/3基因拷贝数的试剂盒，解决了传统方法耗时长，成本高的问题。

一种检测人α防御素1/3基因拷贝数的试剂盒，包括：

第一组引物：目的基因实时荧光定量PCR扩增引物，碱基序列如SEQID NO.1和2所示；

第一荧光探针：目的基因实时荧光定量PCR扩增荧光探针，具体为：FAM-ACTGCTAACTCCATACTC-MGB，FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，中间的探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

第二组引物：内参基因实时荧光定量PCR扩增引物，碱基序列如SEQID NO.4和5所示；

第二荧光探针：内参基因实时荧光定量PCR扩增荧光探针，具体为：FAM-CAGCACATTCAAGCAGAT-MGB，FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，中间的探针碱基序列如SEQ ID NO.6所示；

校样品DNA；

实时荧光定量PCR反应液。

所述的校样品DNA为包含单拷贝的碱基序列如SEQ ID NO.7所示片段和碱基序列如SEQ ID NO.8所示片段的重组质粒，原始载体为pGEM-T-easy，浓度为20ng/μl。

上述试剂盒还可以包括阳性对照DNA，它同样是重组质粒DNA，原始载体为pGEM-T-easy，包含2个或4个拷贝的碱基序列如SEQ ID NO.7所示片段。

所述的实时荧光定量PCR反应液包括：荧光定量PCR反应缓冲液；dNTP混合液；MgCl₂；Taq DNA聚合酶。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测人α防御素1/3基因拷贝数的方法，包括：

(1)以校样品DNA为模板，分别利用第一组引物、第一荧光探针和第二组引物、第二荧光探针，进行实时荧光定量PCR扩增，并记录循环数(分别为Ct1和Ct2)；

(2)以待测人血清基因组DNA为模板，分别利用第一组引物、第一荧光探针和第二组引物、第二荧光探针，进行实时荧光定量PCR扩增，并记录循环数(分别为Ct3和Ct4)；

(3)计算得到人α防御素1/3基因的拷贝数，拷贝数＝2×2^-ΔΔCt，

其中，ΔΔCt＝(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)。

本发明提供了人α防御素1/3基因的特异性探针，碱基序列如SEQ IDNO.1、2或3所示。

本发明提供了人血清白蛋白基因的特异性探针，碱基序列如SEQ IDNO.4、5或6所示。

本试剂盒使用简单，方便快速，不需要构建标准曲线，敏感性、特异性高，可重复性好，能更有效检测DEFA1/DEFA3拷贝数，可用于指导临床感染免疫性疾病风险预测。

附图说明

图1为校样品DNA克隆载体pGEM-T-easy图谱；

图2为2∶1拷贝阳性对照克隆载体pGEM-T-easy图谱；

图3为4∶1拷贝阳性对照克隆载体pGEM-T-easy图谱；

图4为目的基因DEFA1/DEFA3扩增曲线；

图5为内参基因ALB扩增曲线；

图6为校样品DNA、2∶1阳性对照DNA、4∶1阳性对照DNA、样品DNA目的基因和内参基因实时定量PCR结果。

具体实施方式

一种检测DEFA1/DEFA3拷贝数的试剂盒，主要试剂包括：检测DEFA1/DEFA3位点的特异性荧光定量PCR引物(4μM/μl)；特异性DEFA1/DEFA3探针；内参基因ALB特异性荧光定量PCR引物(4μM/μl)；特异性ALB探针；校样品DNA；阳性对照DNA；荧光定量PCR反应液。

根据GenBank中内参基因ALB和目的基因DEFA1/DEFA3相应序列(编号：ALB为NM000477.5，DEFA1为NM004084.3，DEFA3为NM005217.3)，选择长度为50～150bp的保守片段、采用Primer Express 2.0软件设计特异性探针和引物。特异性探针长度在16-25碱基之间，GC含量在30-80％，C含量高于G含量，退火温度(Tm值)为65-70℃，避免稳定的二聚体及发夹结构。根据探针设计3-4对合适的跨内含子的特异性引物，长度在18-23碱基，GC含量在40％～60％，Tm值较探针Tm值下降5-10℃，上下游引物Tm值接近，无引物二聚体和发夹结构。根据多次内参基因和目的基因荧光定量PCR试验结果，最终选择灵敏度最高、PCR扩增效率接近100％的目的基因和内参基因的探针和引物进行实验。具体地，所得到的探针和引物序列如下：

检测DEFA1/DEFA3位点的特异性荧光定量PCR上游引物序列为：

5’-CACCTGTCAGCTAGCATGTGACT-3’；

下游引物序列为：

5’-TGGGACAGGGAGAGCATGAG-3’；

特异性DEFA1/DEFA3探针序列为：

FAM-ACTGCTAACTCCATACTC-MGB，探针5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB，为淬灭基团；

内参基因ALB特异性荧光定量PCR上游引物序列为：

5’-TATCGACGACTCTTTACCCTGTCA-3；

内参基因下游引物序列为：

5’-CCAAAGTCCACACGGAATGC-3’；

特异性ALB探针序列为：

FAM-CAGCACATTCAAGCAGAT-MGB，探针5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB，为淬灭基团。

校样品DNA为将一个DEFA1/DEFA3基因PCR产物片段(SEQ IDNO.7)和一个ALB基因PCR产物片段(SEQ ID NO.8)插入克隆载体pGEM-T-easy中(如图1所示)，并将阳性克隆培养后提取质粒，测序验证后，制备浓度为20ng/μl的校样品DNA。

2∶1拷贝阳性对照DNA为将两个DEFA1/DEFA3基因PCR产物片段和一个ALB基因PCR产物片段插入克隆载体pGEM-T-easy中(如图2所示)，并将阳性克隆培养后提取质粒，测序验证后，制备成浓度为20ng/μl的2∶1拷贝阳性对照DNA。

4∶1拷贝阳性对照DNA为将四个DEFA1/DEFA3基因PCR产物片段和一个ALB基因PCR产物片段插入克隆载体pGEM-T-easy中(如图3所示)，并将阳性克隆培养后提取质粒，测序验证后，制备成浓度为20ng/μl的4∶1拷贝阳性对照DNA。

荧光定量PCR反应液包括：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各1.6μM，MgCl₂溶液1.25μM，Taq DNA聚合酶125U，2×荧光定量PCR反应缓冲液，总体积1000μl，供100个样本使用。

检测实例

一、待测个体样品准备

从外周静脉中抽取16例危重病人2ml全血放入EDTA抗凝管中。使用DNA提取试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)提取样品总DNA，使用紫外分光光度计对DNA进行定量。

二、DEFA1/DEFA3实时荧光定量PCR作用体系配制，共配制一十九管

第一管为校样品DNA DEFA1/DEFA3的扩增，取校样品DNA0.5μl，依次加入特异性DEFA1/DEFA3探针150nM，DEFA1/DEFA3上游引物和下游引物混合液2μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀；

第二管为2∶1拷贝阳性对照DNA DEFA1/DEFA3的扩增，取2∶1拷贝阳性对照DNA0.5μl，依次加入特异性DEFA1/DEFA3探针150nM，DEFA1/DEFA3上游引物和下游引物混合液2μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀；

第三管为4∶1拷贝阳性对照DNA DEFA1/DEFA3的扩增，取4∶1拷贝阳性对照DNA0.5μl，依次加入特异性DEFA1/DEFA3探针150nM，DEFA1/DEFA3上游引物和下游引物混合液2μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀；

第四管至第一十九管为待测样品DEFA1/DEFA3的扩增，取待测样品DNA10ng，依次加入特异性DEFA1/DEFA3探针150nM，DEFA1/DEFA3上游引物和下游引物混合液2μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀。

三、ALB实时荧光定量PCR反作用体系配制，共配制一十九管

第一管为校样品DNA ALB的扩增，取校样品DNA0.5μl，依次加入特异性ALB探针150nM，ALB上游引物和下游引物混合液各1μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀；

第二管为4拷贝阳性对照DNA ALB的扩增，取2∶1拷贝阳性对照DNA0.5μl依次加入特异性ALB探针150nM，ALB上游引物和下游引物混合液2μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀；

第三管为8拷贝阳性对照DNAALB的扩增，取4∶1阳性对照DNA0.5μl依次加入特异性ALB探针150nM，ALB上游引物和下游引物混合液2μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀；

第四管至第二十一管为待测样品ALB的扩增，取待测样品DNA10ng，依次加入特异性ALB探针150nM，ALB上游引物和下游引物混合液2μl，荧光定量PCR反应液10μl，无菌去离子水补至20μl，混匀。

四、实时荧光定量PCR反应条件

目的基因DEFA1/DEFA3和内参基因ALB的荧光定量PCR反应条件为：

95℃3min；

95℃30s，54℃30s，72℃30s，40个循环。

72℃1min。

五、数据分析

校样品DNA、2∶1阳性对照DNA、4∶1阳性对照DNA、样品DNA的目的基因和内参基因实时定量PCR反应均重复3次。PCR反应结束后，在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，使用SDS Software 2.4软件分析数据，得到目的基因DEFA1/DEFA3(图4)和内参基因ALB(图5)的扩增曲线。计算校样品DNA、2∶1阳性对照DNA、4∶1阳性对照DNA和样品DNA的目的基因和内参基因的Ct平均值，用校样品DNA目的基因的Ct平均值(Ct1)减去校样品DNA内参基因的Ct平均值(Ct2)，得到ΔCt1，即ΔCt1＝Ct1-Ct2；用样品DNA目的基因Ct平均值(Ct3)减去样品DNA内参基因的Ct平均值(Ct4)，得到ΔCt2，即ΔCt2＝Ct3-Ct4，然后用ΔCt1减去ΔCt2，得到ΔΔCt，即ΔΔCt＝ΔCt1-ΔCt2。最终，样品DNA量相对于校样品量通过公式2^-ΔΔCt计算得到。

2^-ΔΔCt＝2^{-(ΔCt1-ΔCt2)}＝2^{-[(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)]}

校样品DNA中DEFA1/DEFA3和ALB片段均为1，因此DEFA1/DEFA3与ALB的拷贝数比值为1；2∶1拷贝阳性对照DNA中，DEFA1/DEFA3片段为2个，ALB片段为1个，因此DEFA1/DEFA3与ALB的拷贝数比值为2；4∶1拷贝阳性对照DNA中，DEFA1/DEFA3片段为4个，ALB片段为1个，因此DEFA1/DEFA3与ALB的拷贝数比值为4。由于人体染色体为二倍体，细胞中染色体以成对的方式存在，一条来自父亲，一条来自母亲，且形态、大小、结构相同，因此，校样品DNA相当于人2拷贝数DNA，2∶1拷贝阳性对照DNA相当于人4拷贝数DNA，4∶1拷贝阳性对照DNA相当于人8拷贝数DNA。样品DNA实际拷贝数为：

样品DNA实际拷贝数＝2×2^-ΔΔCt

校样品DNA、2∶1阳性对照DNA、4∶1阳性对照DNA、样品DNA目的基因和内参基因实时定量PCR结果见图6。根据校样品DNA、2∶1拷贝阳性对照DNA和4∶1拷贝阳性对照DNAPCR反应结果，采用2×2^-ΔΔCt公式计算得出拷贝数分别为2、4和8，因此认为本次实时荧光定量PCR反应结果准确可靠。

根据病人携带的DEFA1/DEFA3拷贝数量，可以判断该病人重症脓毒症发生的易感性。当DEFA1/DEFA3拷贝数大于8时，重症脓毒症易感性明显增加。

Claims

1.一种检测人α防御素1/3基因拷贝数的试剂盒，包括：

第一荧光探针：目的基因实时荧光定量PCR扩增荧光探针，中间的探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

第二荧光探针：内参基因实时荧光定量PCR扩增荧光探针，中间的探针碱基序列如SEQ ID NO.6所示；

校样品DNA；

实时荧光定量PCR反应液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括阳性对照DNA。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校样品DNA为包含单拷贝的碱基序列如SEQ ID NO.7所示片段和碱基序列如SEQ IDNO.8所示片段的重组质粒。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR反应液包括：荧光定量PCR反应缓冲液；dNTP混合液；MgCl₂；Taq DNA聚合酶。

5.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测人α防御素1/3基因拷贝数的方法，包括：

(1)以校样品DNA为模板，分别利用第一组引物、第一荧光探针和第二组引物、第二荧光探针，进行实时荧光定量PCR扩增，并记录循环数；

(2)以待测人血清基因组DNA为模板，分别利用第一组引物、第一荧光探针和第二组引物、第二荧光探针，进行实时荧光定量PCR扩增，并记录循环数；

(3)计算得到人α防御素1/3基因的拷贝数。

6.人α防御素1/3基因的特异性探针，其特征在于，碱基序列如SEQID NO.1、2或3所示。

7.人血清白蛋白基因的特异性探针，其特征在于，碱基序列如SEQ IDNO.4、5或6所示。